Xác định mối quan hệ di truyền của cam bố hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THÁI THÙY
Tên đề tài:
XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC
GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2015 - 2019

THÁI NGUYÊN, 2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THÁI THÙY

Tên đề tài:
XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC
GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: 47 - CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2015 - 2019

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Duy
TS. Nguyễn Tiến Dũng

THÁI NGUYÊN, 2019


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này tôi nhận được sự chỉ dẫn tận tình của Thầy TS
Nguyễn Văn Duy – Trưởng khoa CNSH-CNTP Trường Đại học Nông lâm Thái
Nguyên về phương pháp nghiên cứu, phân tích kết quả,…và tạo điều kiện thuận lợi
trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn và tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
thầy giáo TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình hướng dẫn, trực tiếp chỉ bảo kĩ năng
làm việc và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận
này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Tiến Dũng và cán bộ phòng thí nghiệm Thực hành Sinh học phân tử và các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã hướng dẫn kĩ năng làm việc,
tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè những người
đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận.
Trong quá trình thực tập, cũng như trong quá trình làm báo cáo thực tập, khó
tránh khỏi sai sót. Đồng thời do trình độ lí luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn
hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận
được ý kiến đóng góp của thầy, cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày

tháng

Sinh viên

Nguyễn Thị Thái Thùy

năm 2019


ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1: các loài cam,quýt có ý nghĩa trong thực tiễn ................................................. 4
Bảng 2. 2: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh
dưỡng, NXB Y học, năm 2007) .......................................................................................... 6
Bảng 2. 3: Diện tích, sản lượng cam ở Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017) ..... 7
Bảng 3. 1: Kết quả thu thập mẫu................................................................................... 16
Bảng 3. 2: Trình tự các mồi ISSR sử dụng ................................................................... 17
Bảng 3. 3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu......................................................... 17
Bảng 3. 4: Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài ........................................ 17
Bảng 4. 1: Hệ số tương đồng di truyền cuả 32 mẫu cam nghiên cứu ........................... 37


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn nhất thế giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn
vị:nghìn tấn). .......................................................................................................................... 7
Hình 3. 1: Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình trong PCR -ISSR............... 20
Hình 4. 1: kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số của các mẫu cam. ................................. 22
Hình 4. 2: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T1 .................................. 23
Hình 4. 3: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T2 .................................. 24
Hình 4. 4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T3 .................................. 25
Hình 4. 5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPT-01 .................................... 26

Hình 4. 6: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPM-13 .................................. 27
Hình 4. 7: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-17 ................................... 28
Hình 4. 8: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPQ-18 ................................... 29
Hình 4. 9: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-08 ................................... 30
Hình 4. 10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPB-18 ................................. 31
Hình 4. 11: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-04 ................................. 32
Hình 4. 12: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPC-08 ................................. 33
Hình 4. 13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPO-04 ................................. 34
Hình 4. 14: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-16 ................................. 35
Hình 4. 15 sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 32 mẫu cam nghiên cứu (coefficient: hệ số
tương đồng di truyền) ........................................................................................................... 38


iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

Bp

Base pair - Cặp bazơ nitơ

cs

Cộng sự

CTAB

Cetyl trimetyl ammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO

Food and Agriculture Organization

ISSR

Inter - simple sequence repeat

NTSYSpc

Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

SSR

Simple sequence repeat

TAE

Tris - acetate - EDTA

TE

Tris – EDTA


v

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... I
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ II
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................III
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... IV
PHẦN 1.............................................................................................................................1
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................................1
1.1Đặt vấn đề .....................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài .....................................................................................................2
1.2.1 Mục tiêu tổng quát....................................................................................................2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................................2

1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ....................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .....................................................................................2
PHẦN 2.............................................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................................3
2.1. Tổng quan về cây cam, quýt.......................................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại ...........................................................................................3
2.1.1.1. Nguồn gốc ...........................................................................................................3
2.1.1.2. Phân loại ...............................................................................................................3
2.1.2 Giá trị cây cam, quýt ................................................................................................4
2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam quýt trên thế giới ................................................6
2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt trên thế giới .............................................6
2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam ........................................................7
2.3. Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền ................................8
2.3.1. kỹ thuật RAPD ........................................................................................................8
2.3.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD ...............................................................................8
2.3.2. Kĩ thuật ISSR ..........................................................................................................9
2.3.2.1. Giới thiệu về kĩ thuật ISSR ..................................................................................9
2.3.3. Một số kĩ thuật khác ..............................................................................................10
2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong nước
.........................................................................................................................................11
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................................11


vi

2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..........................................................................13
PHẦN 3...........................................................................................................................15
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................15
3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu .........................................................15

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................15
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ...............................................................................................16
3.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ..................................................................16
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................16
3.2.2. Thiết bị nghiên cứu................................................................................................17
3.2.3. Hóa chất.................................................................................................................17
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................18
3.4. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................18
3.4.1. Phương pháp tách chiết DNA................................................................................18
3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số .........................19
3.4.3. Phương pháp RAPD, ISSR...................................................................................19
3.4.4 Phương pháp phân tích đa hình ..............................................................................20
3.5. Các phương pháp xử lý số liệu .................................................................................21
PHẦN 4...........................................................................................................................22
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................................................22
4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá cam ................................................................22
4.2. Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD, ISSR ......................22
4.2.1. Phân tích các đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi. ................23
4.3. Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống camnghiên cứu dựa trên giản đồ phả
hệ DNA............................................................................................................................36
4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loài cam dựa trên các giống đã nghiên cứu. ...........38
PHẦN 5...........................................................................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................41
5.1. Kết luận ....................................................................................................................41
5.2. Kiến nghị ..................................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................43
PHỤ LỤC I.....................................................................................................................47


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1Đặt vấn đề
Cây cam (citrus sinensis (L.) Osbeck) thuộc họ Prtaceae là một trong những
loại cây ăn quả lâu năm có hương vị thơm ngon giá trị dinh dưỡng cao được nhiều
người ưa chuộng. Trong thành phần quả cam chưa nhiều vitamin như: vitamin A,
B1, C, B9; chất xơ, các chất khoáng vi lượng; chứa chất chống oxy hóa có tác dụng
lớn trong chống khối u, chống viêm [2]. Một số nghiên cứu của Bùi Huy Đáp
(1960)[4], Trần Thế Tục năm 1977 [10], Nguyễn Minh Châu (2009)[2] đã cho thấy,
Việt Nam có nguồn gen cây có múi khá đa dạng với nhiều vùng trồng cam nổi tiếng
truyền thống như Tuyên Quang (cam sành Hàm Yên), Bắc Giang (cam sành Bố Hạ),
Hà Giang (cam sành), Hòa Bình (cam Cao Phong), Nghệ An (cam Vinh), Hà Tĩnh
(cam Bù), Yên Bái (cam canh),...
Cam Bố Hạ từ lâu đã trở thành thương hiệu nổi tiếng được người tiêu dung
trong cả nước biết đến và đã từng trở thành một trong những cây kinh tế mũi nhọn
của tỉnh Bắc Giang. Tuy nhiên, qua thời gian vùng cam Bố Hạ với những giống cam
quý đặc sản đang dần bị thoái hóa và bị mất đi do nhiều nguyên nhân, Nông trường
cam Bố Hạ đã bị giải thể. Nhóm nghiên cứu đề tài “Bảo tồn, khai thác và phát triển
nguồn gen cam Bố Hạ, Bắc Giang” đã điều tra và thu thập được một số cây cam Bố
Hạ tại khu vực trồng cam Bố Hạ trước đây. Việc đánh giá đa hình di truyền, xây
dựng cây phát sinh chủng loài của các cây cam Bố Hạ này là cần thiết nhằm cung
cấp các thông tin, ứng dụng trong công tác nghiên cứu bảo tồn, khai thác và phát
triển nguồn gen quý này, góp phần vào sự phát triển kinh tế, xã hội của người dân
tỉnh Bắc Giang.
Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng rất phổ biến để đánh giá đa
dạng di truyền trên cam, quýt như ISSR, SSR, RAPD… Đây là cơ sở khoa học và
thực tiễn để quan trọng để ứng dụng trong việc xác định mối quan hệ của cam Bố Hạ
với các giống cam khác của đề tài:”Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố
Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử”.

2

1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Xác định mối quan hệ di truyền giữa cam Bố Hạ, Bắc Giang với một giống cam
khác bằng chỉ thị phân tử DNA.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
-Tách chiết được DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản
ứng RAPD, ISSR.
- Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ
thuật RAPD và ISSR.
-Phân tích được mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam thu
thập dựa triên sơ đồ phả hệ DNA.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về việc ứng
dụng chỉ thị phân tử xây dựng cây phát sinh chủng loài cam.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm những tài liệu khoa
học, phục vụ cho công tác giảng dạy cũng như nghiên cứu trên cây cam ở nước ta.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với các giống cam khác là cơ sở để
thực hiện các biện pháp bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, khôi
phục lại thương hiệu cam nổi tiếng này và góp phần nâng cao đời sống kinh tế, xã
hội cho người dân tỉnh Bắc Giang.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây cam, quýt
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
2.1.1.1. Nguồn gốc
Cây cam đã được biết đến rất lâu khoảng 2200 năm trước công nguyên ở Trung
Quốc nhưng một số người lại cho rằng cây cam có nguồn gốc từ dãy Himalayas (Ấn
Độ). Cam được trồng phổ biến ở Ấn Độ, sau đó lan rộng về phía đông, và đến cả
vùng Đông Nam Á. Vào khoảng thế kỷ thứ 3 trước công nguyên, cây cam được đưa
đến Châu Âu và nó lan ra tới cả vùng Địa Trung Hải. Sau đó, cây cam được
Columbus mang đến Châu Mỹ. Những năm sau đó, những người làm vườn ở Châu
Mỹ và Châu Âu đã đem cây cam đến Châu Úc và Châu Phi. Ngày nay cây cam được
trồng rất phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới [9].
Giống Cam ngọt (Citrus sinensis Osbeck) được xác định có nguồn gốc ở miền
Nam Trung Quốc, Ấn Độ và miền nam Indonesia. Sau đó được mang đến trồng ở
Châu Âu, Địa Trung Hải và Châu Phi vào thế kỷ 13 đến thế kỷ XVII [1].
Giống cam Washington Navel trên thế giới hay có tên gọi cam Navel ở Việt
Nam được cho là dạng đột bến tự nhiên từ một giống cam ngọt, giống này được phát
hiện ở Bhia Brail, lần đầu tiên được trông ở Úc năm 1928, ở Florida (Mỹ) năm
1835, ở California năm 1970 và nó nổi tiếng ở Washington D.C. Sau đó được trồng
khắp các vùng trồng cam, quýt trên thế giới[8].
Theo một số tài liệu nghiên cứu, cam, quýt có nguồn gốc ở miền Nam châu Á,
sự lan trải của cam, quýt trên thế giới gắn liền với lịch sử buôn bán đường biển và
các cuộc chiến tranh trước đây.
2.1.1.2. Phân loại
Cam quýt thuộc: Giới Plantae
Bộ Rutales
Họ Rutaceae
Chi Citrus

4

Được phân chia làm 130 giống (genera) nằm trong các họ phụ khác nhau [9].
Hiện nay có hai hệ thống phân loại đang được nhiều người áp dụng. Theo Tanaka
(Nhật Bản) cam quýt gồm 160-162 loài. Tanaka đã quan sát, ghi chép tỉ mỉ đặc điểm
hình thái của các giống đã biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống
mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên loài đã phát sinh ra chúng
và kết thúc bằng chữ ‘Horticuluture” [9]. Swingle lại chia cam quýt ra làm 16 loài
[9]. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn phải sử dụng hệ thống phân loại của Tanaka để
gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết tới từng giống. Theo
Tanaka có 10 nhóm quan trọng nhất trong nhóm True citrus group, đây là những
loài được trồng phổ biến và có ý nghĩa với con người. Danh sách nhóm quan trọng
này được trình bày trong bảng 2.1[9].

STT

Tên loài

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

1

C.sisnensis Osbeck

Sweets Orange

Cam ngọt

2

C.aurantium L.

Sour Orange

Cam chua

3

C.reticulata Blanco

Mandarin

Quýt

4

C.limon Osbeck

Lemon

Chanh núm

5

C.medica L.

Citron

Chanh yên

6

C.aurantifolia Swingle

Lime

Chanh vỏ mỏng

7

C.trifolia L.

Trioliate

Chanh đắng

8

C.grandis L.

Shadock

Bưởi

9

C.paradishi L.

Pomelo

Bưởi chùm

10

C.fortunenna.

kumquat

Quất

Bảng 2. 1: các loài cam,quýt có ý nghĩa trong thực tiễn
2.1.2 Giá trị cây cam, quýt
Cam,quýt là một trong những sản phẩm có giá trị và được nhiều người ưa
chuộng, nó mang lại nguồn dinh dưỡng quý cho con người. Không chỉ có ý nghĩa về
kinh tế, nguồn dinh dưỡng mà cam quýt còn có giá trị cao về dược liệu. Các sản
phẩm của cây cam, quýt hiện nay cung cấp cho thị trường trong nước và ngoài nước
góp phần vào tăng trưởng nền kinh tế.


5

Giá trị dinh dưỡng: Quả cây có múi có rất nhiều chất dinh dưỡng nên giá trị sử
dụng rất cao.
Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng
Nước

88,8 g

Vitamin E

0,18 mg

Năng lượng

38 KJ

Beta - caroten

71 µg

Protein

0,9 g

Alpha - caroten

11 µg

Lipid

0,1 g

Beta - cryptoxanthin

116 µg

Glucid

8,3 g

Lutein + Zeaxanthin

129 µg

Celluloza

1,4 g

Purin

19 mg

Tro

0,5 g

Lysin

43 mg

Đường tổng số

9,35 g

Methionin

12 mg

Canxi

34 mg

Tryptophan

6 mg

Sắt

0,4 mg

Phenylalanin

30 mg

Magie

10 mg

Threonin

12 mg

Mangan

0,52 mg

Valin

31 mg

Phospho

23 mg

Leucin

22 mg

Kali

108 mg

Isoleucin

23 mg

Natri

4 mg

Arginin

52 mg

Kẽm

0,22 mg

Histidin

12 mg

Đồng

140 µg

Cystin

10 mg

Vitamin C

40 mg

Tyrosin

17 mg

Vitamin B1

0,08 mg

Alanin

51 mg

Vitamin B2

0,03 mg

Acid aspartic

114 mg

Vitamin PP

0,2 mg

Acid glutamic

99 mg

Vitamin B5

0,25 mg

Glycin

83 mg

30 µg

Prolin

46 mg

0,89 µg

Serin

23 mg

Folat
Vitamin H


6

Bảng 2. 2: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế
Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007)
Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm, nhanh
cho thu hoạch. Một số giống cho thu hoạch ngay ở năm thứ 2. Ở nước ta, năng suất
trung bình của cam, quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đạt tới 16 tấn/ha. Cây cam, quýt có
thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15-30 năm nên mang lại giá trị kinh tế
cao [9].
Giá trị dược liệu và công nghiệp: Ở nhiều nước, người ta dùng các loại quả
thuộc cho Citrus làm thuốc chữa bệnh. Thế kỷ XVI, người Trung Quốc và người Ấn
Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa bệnh phổi và bệnh
chảy máu dưới da. Ở Mỹ, vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng
quả cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường. Ở nước ta, nhân
dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu [9].
Giá trị về môi trường sinh thái: Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt
tiết ra oxy trong không khí làm không khí trở nên trong lành. Trong những chừng
mực nhất định các chất bay hơi từ cây cam, quýt có tác dụng diệt một số loài vi
khuẩn làm cho không khí trở nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn.
Cam, quýt trồng trên các đồi đất bên cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh
đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có

ý nghĩa lớn trong việc làm giảm quá trình xói mòn, rửa trôi đất. Ở vùng trung du và
miền núi cam, quýt được trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống
VAC (vườn – ao – chuồng) và VACR (vườn – ao – chuồng – rừng) là phương thức
canh tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu
điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững [9].
2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam quýt trên thế giới
2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt trên thế giới
Trong suốt mấy thế kỷ qua, ngành sản xuất cam quýt trên toàn thế giới không
ngừng tăng nhanh và mức tiêu thụ quả của thị trường thế giới cũng ngày một cao
hơn do trồng cam quýt chóng được thu hoạch và lãi suất luôn cao. Trên Thế giới,
sản xuất cây có múi là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu


7

tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15kg quả/năm. Hiện có 75 nước
trồng cam quýt với diện tích và sản lượng tăng đáng kể [9].

Hình 2. 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn nhất thế giới năm 2018/19 (nguồn
[5])(đơn vị:nghìn tấn).
Brazil là nước sản xuất, xuất khẩu trái cam và nước cam hàng đầu trên thế giới,
sản xuất khoảng 30% sản lượng của thế giới. 94% sản lượng cam của đất nước này
tập trung ở bang Sao Paulo. Năm 2018/19 sản lượng cam của Brazil 16 triệu tấn,
tiêu thụ tươi khoảng 5 triệu tấn và tiêu thụ khác khoảng 11 triệu tấn. Tiếp theo là
Trung Quốc, EU, ba quốc gia hàng đầu này dự kiến sẽ tiếp tục mở rộng sản xuất
nhưng với tốc độ chậm hơn.
2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam
Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có điều kiện tự nhiên
thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển các cây có múi. Trong những năm gần đây
Chính phủ, các địa phương, cũng đã có nhiều quan tâm đến sự phát triển của cây

cam.
Chỉ tiêu
Năm 2015 Năm2016
Năm 2017
Diện tích trồng (x1000 ha)
78,5
85,4
97,5
Diện tích cho sản lượng (x1000 ha)
58,4
48,4
64,7
Sản lượng (x 1000 tấn)
758,9
727,4
799,5
Bảng 2. 3: Diện tích, sản lượng cam ở Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê
2017)


8

Theo Tổng cục Thống kê, năm 2017 sản lượng cây ăn quả tăng cả về diện tích
và sản lượng. Sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước;
bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4%; quýt đạt 175,5 nghìn tấn, tăng 6,3%. Tốc độ
và tỷ lệ % tăng trưởng trên thể hiện rõ ưu thế và xu hướng thị trường của cây cam và
bưởi. Tuy nhiên, tổng sản lượng quả có múi cả nước mới đạt thấp, khoảng 1.519.400
tấn; tính bình quân đầu người năm 2017 mới đạt trung bình khoảng 16kg (tính trên
dân số khoảng 95 triệu người) [14].
2.3. Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền

2.3.1. kỹ thuật RAPD
2.3.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD
Kĩ thuật RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại
ngẫu nhiên. Chỉ thị phân tử RAPD dựa trên kĩ thuật PCR với sự bắt cặp ngẫu nhiên
của các đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước với mạch
khuôn, nhân những đoạn có trình tự bổ sung với trình tự mồi. Mồi sử dụng cho phản
ứng RAPD là các mồi ngẫu nhiên có nhiệt độ kéo dài mồi thấp từ 34 - 370C. Mặc dù
là mồi ngẫu nhiên nhưng vẫn phải đủ 2 tiêu chí là tỉ lệ G/C tối thiểu là 40% và
không có trình tự các base đầu xuôi và ngược giống nhau[7].
Kĩ thuật RAPD gồm 3 bước
- Tách chiết DNA tổng số.
- Thực hiện phản ứng PCR nhân gene, điện di trên gel agarose hay gel
polyacrylamide.
- Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc,
phân tích nhóm UPGMA, lập sơ đồ cây) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi
hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.Sản phẩm PCR - RAPD thường
được điện di trên gel agarose 1,5 - 2% hay điện di trên gel polyacrylamide.
2.3.1.2. Những ưu điểm và nhược điểm của kĩ thuật RAPD so với các kĩ thuật sinh
học phân tử khác
Ưu điểm:
Về mặt kĩ thuật: Kĩ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần
thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và có thể ứng dụng cho các loài khác


9

nhau với các mồi chung, thao tác đơn giản và dễ thực hiện, chất lượng. DNA khuôn
không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao [9].
Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kĩ thuật RAPD thường được sử dụng
kết hợp với những kĩ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện

chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.
Nhược điểm:
Với những ưu điểm trên RAPD vẫn còn có những hạn chế nhất định như sản
phẩm PCR không ổn định giữa những lần nghiên cứu do đặc điểm của mồi là ngẫu
nhiên và ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp, phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, đôi khi kết
quả không lặp lại được và chỉ tạo ra được các chỉ thị trội do đó không phân biệt
được các cá thể đồng hợp với các cá thể dị hợp[7].
2.3.1.3. Ứng dụng của kĩ thuật RAPD
Các nghiên cứu cho thấy kĩ thuật RAPD là một phương pháp rất hiệu quả trong
việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di
truyền. Kĩ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây
khác nhau, xác định sự đa hình di truyền của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô
sẹo, phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể
để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc phân loại.
Chỉ thị RAPD còn là công cụ hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để
phân biệt các giống hay loài khác nhau. Sun và cs (2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD
để phân tích tính đa hình DNA của 35 giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB
(Fusarium hesd blight) và phát hiện ra 3 chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng
bệnh FHB[16].
Orozco và cs (1994) đã ứng dụng kĩ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di
truyền và tiến hóa của các giống cà phê được lai tạo từ các loài bố, mẹ ở các vùng
sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có đặc
tính quý[35].
2.3.2. Kĩ thuật ISSR
2.3.2.1. Giới thiệu về kĩ thuật ISSR
Kĩ thuật ISSR được định nghĩa là kĩ thuật dựa trên PCR dùng để nhân đoạn
gene nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt nhau và ngược chiều nhau. Kĩ thuật này sử


10

dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus
đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau. Các tiểu
vệ tinh sử dụng như mồi trong kĩ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide. Các
mồi sử dụng có thể không phải mồi neo hoặc là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4
nucleotide thoái hóa kéo đến các chuỗi bên cạnh. Kĩ thuật ISSR được sử dụng rất
rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong
quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gene, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc,
xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai[7].
Kỹ thuật ISSR có một số lợi thế hơn so với các kỹ thuật khác là có thể phân biệt
được các kiểu gen gần và không cần thông tin về trình tự gen của cây nghiên cứu.
Giống như RAPD, ISSR là kỹ thuật nhanh, dễ tiến hành. Nó ưu việt hơn RAPD là
cho nhiều thông tin và có thể lặp lại ở các thí nghiệm do mồi dài hơn. Nhược điểm
chủ yếu của ISSR là tạo ra các chỉ thị trội và sự dị đồng nhất của các sản phẩm nhân
bản do sự di chuyển đồng thời [7].
2.3.3. Một số kĩ thuật khác
Kĩ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kĩ thuật AFLP được sử dụng để phát hiện đa hình DNA. Phân tích AFLP được
kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi hay còn gọi là
chuỗi tiếp hợp để nhân chọn lọc các phân đoạn DNA được cắt hạn chế. Các cặp mồi
thường tạo được từ 50 đến 100 băng trong một phân tích. Số lượng băng phụ thuộc
vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kĩ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA
từ bất kì nguồn gốc nào. Kĩ thuật này có một số ưu điểm như: có độ tin cậy và lặp lại
cao; không cần thông tin về trình tự DNA của cơ thể nghiên cứu; cho nhiều thông
tin do có khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp mồi trên một
gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ
liệu để so sánh. Có thể dùng phân biệt các cá thể rất gần nhau, lập bản đồ
genome[16].
Kĩ thuật đa hình tiểu vệ tinh được nhân bản ngẫu nhiên (Randomly
Amplified Microsatellite Polymorphism - RAMP)

Kĩ thuật này sử dụng mồi được đánh dấu chứa đầu 5' neo và đầu 3' lặp lại để
nhân DNA genome với sự có mặt hoặc vắng mặt các mồi RAPD. Sản phẩm nhận


11

được phân tách trên gel polyacrylamide biến tính. Do mồi lặp lại được đánh dấu nên
chỉ có sản phẩm của mồi neo được xác định. Nhiệt độ bắt cặp của mồi neo thường
cao hơn mồi RAPD 10 - 15oC. Vì vậy, ở nhiệt độ bắt mồi cao chỉ có mồi neo được
kéo dài hiệu quả. Ở các chu kì PCR với nhiệt độ bắt mồi thấp, cả hai mồi neo và mồi
RAPD đều kéo dài. Do đó, chương trình PCR được thiết lập sao cho có sự chuyển
giữa nhiệt độ bắt mồi cao xuống thấp trong quá trình phản ứng. Hầu hết các phân
đoạn nhận được chỉ với các mồi RAMP sẽ biến mất khi có các mồi RAPD và các
mẫu băng khác nhau nhận được bởi cùng một mồi RAMP và các mồi RAPD khác
nhau cho thấy các mồi RAPD cạnh tranh với mồi RAMP trong chu kì nhiệt độ bắt
mồi thấp. RAMP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây
như lúa mạch[35]và đào[37]
Kĩ thuật đa hình độ dài các chuỗi đơn giản (Single Sequence Length
Polymorphism - SSLP)
Là kĩ thuật chỉ thị tạo các chuỗi lặp lại với độ dài khác nhau nằm giữa hai gene.
Các chuỗi có độ dài khác nhau là do số lượng trình tự lặp lại trong chuỗi khác nhau
do trong quá trình trao đổi chéo không cân hoặc do sự giảm nucleotide trong quá
trình sao chép. Cả hai quá trình này đều có thể dẫn đến giảm hoặc tăng số lượng đơn
vị lặp lại trong genome. Sự khác nhau về độ dài của SSLP được sử dụng để đánh giá
sự thay đổi di truyền giữa các cá thể trong loài. Kĩ thuật SSLP được tiến hành bằng
các cặp mồi đặc hiệu nhân bản các chuỗi đơn giản nằm giữa hai gene, sản phẩm
PCR được phân tách trên gel polyacrylamide [7].
2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và
trong nước
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tính đa dạng di truyền của chi Citrusbằng
các chỉ thị sinh học phân tử trên thế giới.
Abkenar và cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử và
khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật. Đối tượng nghiên cứu gồm 31
loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài “Yuzu” và 21 loài họ
hàng. Sử dụng 27 mồi kết quả có 108 chỉ thị được tạo thành, 76 chỉ thị là đa hình,
trung bình là 2,8 chỉ thị trên một mồi. Cây phân loại cho thấy các loại cam chua rất


12

khác với các loài “Yuzu” và họ hàng của chúng. Các loài “Yuzu” có mối quan hệ
gần gũi nhau, tuy nhiên sự đa dạng di trền ở các loài khá cao, biểu lộ các nguồn gốc
khác nhau của chúng. Trong nghiên cứu này, một số mồi RAPD có thể giúp phân
biệt giữa các loại cây trồng gần gũi như OPA-17, OPE-20 chỉ có ở “Kabosu” mà
không có ở “Aka Kabosu”, mồi OPA-20, OPB-05 và OPE-16 phân biệt các cây chỉ
có ở “Aka kabosu” mà không có ở “Kabosu” [15].
Dehesdtani và cs (2007) đánh giá đa dạng di truyền của các cây cam ngọt
(Citrus sinensis Navel) trồng ở Mazandaran (Iran) bằng chỉ thị RAPD với 21 mồi
ngẫu nhiên và 52 mẫu lá của các cây có ba hình thái quả khác nhau là: vỏ nhẵn, vỏ
nhám và nửa nhám. Bốn mồi đã tạo ra các băng đa hình có tính lặp lại. Trong số các
băng tạo ra từ 4 mồi có 70,13% là băng đa hình, sự đa hình di truyền cao nhất là ở
nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám [20].
C. Martasari, Karsinah và Reflinur (2012) đã nghiên cứu mô tả 20 giống Siam
của Indonesia từ 9 tỉnh bởi hình thái học và các dấu hiệu ISSR. Kết quả cho thấy có
sự khác nhau về hình dạng, màu sắc, độ dầy của vỏ và hương vị của quả chín. Sơ đồ
cây được tạo ra từ các băng DNA cho thấy một sự thoái hóa của 20 giống Siam đã
chia thành bốn nhóm. Nhóm A bao gồm 9 giống (Lumajang, Banjar 2, Candi,
Tulungagung, Mamuju, Tapin và Ponorogo). Nhóm B có 5 giống (Batola, Tlekung,
Pontianak 2, Bangkinang và Madu). Nhóm C hình thành bởi 1 giống duy nhất là

Banyuwangi. Nhóm cuối cùng D có 5 giống (Jember, Kintamani, Pati, Jambi, Banjar
2). Mỗi nhóm có sự giống nhau hình thái và quả [29].
Năm dòng khác nhau của loài cam chua (Citrus aurantium L.) biểu hiện những
khác biệt có ý nghĩa về hình thái học đã được xác định bằng các chỉ thị phân tử phát
triển từ kĩ thuật PCR là ISSR và RAPD. De Pasquale và cs (2006) đã phân tích các
mẫu nghiên cứu với 11 mồi ISSR và 6 mồi RAPD (OPH04, OPAT14, OPH15,
OPM04, OPO14 và OPN14)[22].
Naz và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu tính chất phân tử và mối quan hệ di
truyền giữa các giống Citrus khác nhau ở Pakistan. Mối quan hệ di truyền giữa 17
giống cam, quýt thương mại quan trọng, bao gồm những giống địa phương và một
số giống lai đã được đánh giá bằng kỹ thuật RAPD với 15 mồi được lựa chọn trong
số 25 mồi. Tổng số 188 băng với 153 băng đa hình, trung bình 13 băng mỗi mồi. Hệ


13

số Jaccard đã được sử dụng để phân tích sự tương đồng di truyền hoặc không giống
nhau giữa các giống. Cây phân loại đã tách 17 giống cam quýt thành 4 cụm chính,
giá trị tương đồng di truyền quan sát thấy là 0,66 với hai giống Kinnow và kinnow
không hạt (Mandarin), và hai giống Meiwa và Marumi (quất) cho thấy giá trị khác
biệt tối đa (0,85). Sự khác biệt về di truyền giữa các giống cam quýt cao nghiên cứu
này cho thấy rằng chúng không có nguồn gốc tương tự nhau [33].
Hai chỉ thị phân tử RAPD và SSR đã được M. Lamine et al. (2015) sử dụng để
đánh giá tính đa dạng di truyền của mười chín giống cam ngọt Tunisia. Cây phát
sinh chủng loài cho thấy rằng tất cả các mẫu nghiên cứu đã được phân biệt với mức
độ phân lớp khác nhau trong các cụm. Những kết quả này sẽ có ý nghĩa đối với việc
tạo ra và bảo tồn giống của Maltaise [26].
Ebtsam M. Hamza (2013) đánh giá đa dạng di truyền của một số giống cây
Citrus ở Ai Cập dựa vào chỉ thị microsatellite và RAPD. Kết quả phân tích chứng
minh sự tương đồng di truyền và mối quan hệ giữa 5 giống thuộc Citrus[24].

2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Nguyễn Văn Giang và cs (2013) đã nghiên cứu đa dạng di truyền ở cây khoai
môn - sọ sử dụng 5 chỉ thị RAPD và 5 chỉ thị SSR với 60 mẫu giống khoai môn - sọ
được thu thập tại các địa phương khác nhau. Sáu mươi mẫu giống khoai môn - sọ
được phân thành 12 nhóm với hệ số tương đồng là 0,8. Kết quả trong nghiên cứu
này có thể sử dụng trong công tác bảo tồn cũng như lai chọn tạo giống khoai môn sọ
mới [23]
Vũ Huyền Trang và cs năm 2014 sử dụng chỉ thị phân tử ISSR để đánh giá đa
dạng quần thể dó bầu (Aquilaria crassna Pierre). Trong nghiên cứu này, 91 mẫu dó
bầu được thu thập tại các tỉnh phía Bắc và Nam Việt Nam. Kết quả phân tích thu
được 2 nhóm chính với hệ số tương đồng Jaccard nằm trong khoảng 0,34 - 0,92, hệ
số sai khác di truyền quần thể Nei Gst = 0,3324 và hệ số trao đổi gene quần thể
(gene flow) Nm = 1,0044. Các kết quả được phát hiện có ý nghĩa cho công tác chọn,
tạo giống và bảo tồn giống sau này[8].
Vũ Văn Hiếu và cs (2015) đã phân tích đa dạng di truyền của các giống cam
Sành tại Hà Giang. Trong nghiên cứu này, sử dụng hai chỉ thị di truyền RAPD và
ISSR. Kết quả đã chỉ ra 25 mồi RAPD và 5 mồi ISSR sử dụng đều cho đa hình


14

(chiếm 100%), tuy nhiên số băng đa hình trên từng mẫu cho sự biến động lớn. Hệ số
tương đồng di truyền của 39 dòng cam sành dao động trong khoảng 0,62 - 0,98. cây
phân loại di truyền chia các giống cam nghiên cứu thành 5 nhóm chính[5].
Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đã được
Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái và phân
tử. Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao, Kiên Giang chia
làm 5 nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh và hạnh. Chỉ thị phân tử chia thành 4
nhóm: bưởi, cam - quýt, chanh và hạnh. Kết quả phân tích cho thấy khoảng cách di
truyền giữa các nhóm biến động từ 0 - 43%[6].

Trần Thị Việt Tanh và cs (2018) tiến hành phân tích đa dạng di truyền quần thể
cá Đối Mục (Mugil Cephalus L.) ở Việt Nam bằng chỉ thị SSR đã xác định tính đa
dạng di truyền cao của cá Đối mục Việt Nam trên cơ sở phân tích 12 locus
microsatellite (SSR) theo đó đã ghi nhận được tổng số 35 allele cho tất cả các locus
nghiên cứu, 10/12 locus cho kết quả đa hình, chỉ số PIC trung bình cho từng chỉ thị
là 0,2889 (0,0289-0,5918). Hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các
khu vực: Vịnh Bắc bộ là 0,951, miền Trung là 0,929, miền Nam là 0,947. Trong
khi giá trị hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He > 0,5) các chỉ số dao động giữa từng
khu vực Vịnh Bắc Bộ (0,508), khu vực miền Trung (0,525) và khu vực miền Nam
(0,518). Mặt khác hệ số sai khác di truyền giữa các khu vực (Fst) là 0,0216,
điều này cho phép nhận định mức độ đa dạng di truyền quần thể cá Đối mục
Việt Nam giữa các khu vực là chưa đáng lo ngại về vấn đề suy thoái nguồn gen[10].
Nguyễn Thị Hường; Nguyễn Văn Việt; Phạm Quang Trung; Trần Việt Hà
(2018) với đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền của một số dòng trà hoa vàng Tam
Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật RAPD”đã phân tích đa
dạng di truyền của 10 mẫu trà hoa vàng Tam Đảo bằng 15 mồi RAPD cho thấy:
Tổng số băng thu được là 635 trong đó có 212 phân đoạn RAPD đa hình. Hệ số
tương đồng di truyền Jaccard giữa 10 hệ gen nghiên cứu thu được từ 15 mồi RAPD
dao động từ 0,73 đến 1,0. Trong đó, mẫu số CtHN9 có mức đa dạng cao nhất trong
10 mẫu Trà hoa vàng nghiên cứu, đây là nguồn gen tốt phục vụ cho công tác bảo tồn
và phát triển loài Trà hoa vàng Tam Đảo[1].


15

Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
32 mẫu cây có múi được sử dụng trong đề tài được trình bày trong bảng 3.1

dưới đây.
STT

Tên mẫu

Ký hiệu

1

Cam sành Bố Hạ số 1

A

2

Cam Sành Bố Hạ số 2

B

3

Cam Sành Bố Hạ số 5

C

4

Cam chanh Bố Hạ

5

Quýt sen

QS

6

Cam V2

V2

7

Chấp

CH

8

Cam Vinh

CV

9

Cam chanh

CC

10

Cam chín sớm, ít hạt BH

BH

11

Quýt ngọt

QN

12

Quýt Ôn Châu

QO

13

Cam Xã Đoài-Cao Phong

CP

14

Cam Xã Đoài-Nghệ An

NA

15

Cam C36

C36

16

Chín muộn V2

CN

17

Chín sớm

CS

18

Cam canh

C2

19

Cam sành Hà Giang

HG

20

Cam ruột đỏ cara

Cr

Địa điểm lấy mẫu

Huyện Yên Thế Tỉnh Bắc Giang

CBH

Trường Đại học Nông
Lâm – Đại học Thái
Nguyên

Trung tâm Nghiên
cứu và Phát triển cây
có múi – Viện nghiên
cứu Rau Quả Trung
Ương.


16

21

Cam Sành Hàm Yên So2-1

S2-1

22

Cam Sành Hàm Yên So3-1

S3-1

23

Cam Sành Hàm Yên So14-2

S14-2

24

Cam Sành Hàm Yên So12-2

S12-2

25

Cam Sành Hàm Yên So13-3

S13-3

26

Cam Sành Hàm Yên So1-5

S1-5

27

Cam Sành Hàm Yên So20-3

S20-3

28

Cam Sành Hàm Yên So4-4

S4-4

29

Cam Sành Hàm Yên So9-2

S9-2

30

Cam Sành Hàm Yên So17-2

S17-2

31

Cam Sành Hàm Yên So19-3

S19-3

32

Cam sành CS 1-1

CS1-1

Thu tập tại Trung tâm
cây ăn Quả
Hàm
Yên, Tuyên Quang
được lưu giữ tại
Trường Đại học Nông
Lâm – Đại học Thái
Nguyên

Bảng 3. 1: Kết quả thu thập mẫu
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Ứng dụng chỉ thị phân tử, xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với một số
giống được trồng phổ biến ở Việt Nam
3.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Các mồi sử dụng nghiên cứu được thiết kế dựa trên nghiên cứu của tác giả
Oliveira E.C và cs năm 2010 [34] và được đặt sản xuất tại doanh nghiệp công nghệ
sinh học Hàn Quốc Macrogen. Thông tin của mồi được trình bày trong bảng 3.2:
STT
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
11

Kí hiệu mồi
ISSR - T1
ISSR - T2
ISSR - T3
OPT - 01
OPA - 04
OPO - 04
OPA - 08
OPC - 08
OPM - 13
OPG - 16
OPG - 17

Trình tự (5’ - 3’)
(GT)6CC
(CT)6TG
(AC)6CG
GGGCCACTCA
AATCGGGCTG
AAGTCCGCTC
GTGACGTAGG
TGGACCGGTG
(GGT)2 CAAG

AGCG(TCC)2
ACGACC(GA)2

Giá trị Tm (oC)
43,7
40,8
43,7
34,0
32,0
32,0
32,0
34,0
32,0
34,0
32,0


17

12
13

OPB - 18
C(CA)2GCAGT
OPQ - 18
GGGCCACTCA
Bảng 3. 2: Trình tự các mồi ISSR sử dụng

32,0
34,0

3.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị được thống kê trong bảng 3.3.
STT
1
2
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Tên thiết bị
Nguồn gốc xuất xứ
Bộ điện di
Scie - Plas Ltd - Anh
Máy chụp gel
Gel logic 1500 - Kodak Máy đo pH
F - 51 BW - horiba - Japan
Nồi hấp khử trùng
HV - 110 - Hirayama - Japan
Cân điện tử
TE214S – Startorius, Đức
Máy ly tâm
Eppendorf - CHLB Đức

Tủ lạnh -200C;-800C
Super freezer Eco 130 - Ficchetti - Italia
Máy vontex
Vontex Genius3 - IAKGenmany/China
Máy spindown
E - centrifuge - Wealtex - Taiwan/USA
Bể ủ nhiệt
Techne - OSI
Bộ cối chày sứ
Việt Nam
Máy PCR
Amplied Biosystems USA/Singapore
Bảng 3. 3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

3.2.3. Hóa chất
Các hóa chất chuyên dụng sử dụng cho phân tích sinh học phân tử đều ở
dạng tinh khiết. Danh mục các hóa chất được trình bày trong bảng 3.4.
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

13
14
15
16
17

Tên hóa chất
Hãng sản xuất
Proteinase K
Thermo scientific
Ethanol
Merck
Chloroform
Merck
Isoamin alcohol
Merck
Tris Base
Merck
Acid Acetic
Merck
EDTA
Merck
Loading Dye
Merck
Agarose
Bio neer
Ethidium bromide
Merck
β - Mecapton ethanol
Merck

Isopropanol
Thermo scientific
Taq polymerase 1U/µl
Thermo scientific
Buffer Taq polymerase
Thermo scientific
NaCl
Fermentas
dNTPs
Thermo scientific
DNA ladder 1kb
Thermo scientific
Bảng 3. 4: Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài