Phát hiện đột biến gene Dystrophin bằng các phương pháp sinh học phân tử trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker

TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GENE DYSTROPHIN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ TRÊN BỆNH NHÂN LOẠN DƯỠNG CƠ
DUCHENNE/BECKER
Ngô Mạnh Tiến*, Nguyễn Thị Phương Mai*, Nguyễn Thị Mai Hương*,
Lý Thị Thanh Hà*, Ngô Thị Tuyết Nhung*, Ngô Diễm Ngọc*,
Nguyễn Ngọc Khánh**, Bùi Phương Thảo**, Vũ Chí Dũng**
Khoa Di truyền và SHPT, Bệnh viện Nhi TW

*

Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh viện Nhi TW

**

TÓM TẮT
Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ
biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống. Mục tiêu: Xác định đột biến trên gene
Dystrophin. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên 564 bệnh
nhân được chẩn đoán nghi ngờ mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne từ năm 2005 đến 12-2014 tại
Bệnh Viện Nhi Trung ương. Phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gene Dystrophin bằng
kỹ thuật Multiplex PCR và kỹ thuật MLPA (Multiplex Liation-dependent Probe Amplification).
Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện được 172/564 (30.5%) trường hợp bị đột
biến mất đoạn và lặp đoạn, trong đó 157/564 (27.8%) trường hợp đột biến mất đoạn bằng kỹ
thuật Multiplex PCR. Những trường hợp không phát hiện thấy đột biến, được thực hiện tiếp kỹ
thuật MLPA phát hiện 6 trường hợp đột biến mất đoạn và 9 trường hợp đột biến lặp đoạn. Vị trí
đột biến mất đoạn tập trung ở vùng hotspot của gene Dystrophin, gồm các đột biến trong vùng
trung tâm (exon 45-52) chiếm 61,1% và vùng đầu 5’ (exon 1-19) chiếm 29,3%, đột biến trên các
vùng còn lại chiếm 9.63% (không đặc hiệu). Kết luận: Kỹ thuật Multiplex PCR và kỹ thuật MLPA
phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gene Dystrophin có độ nhạy và độ đặc hiệu cao,

hiệu quả trong chẩn đoán di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne.
Từ khóa: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR).
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD)/ Loạn dưỡng
cơ Becker (BMD) là nhóm bệnh di truyền lặn liên
kết giới tính do đột biến trên gene Dystrophin

và gây suy yếu cơ một cách tuần tiến dẫn đến tàn
tật và tử vong do suy tim và bội nhiễm phổi. Các
dấu hiệu lâm sàng của bệnh được nhận biết ở giai
đoạn trẻ từ 2 đến 3 tuổi. Các bệnh nhân được coi
như mắc thể nặng nếu phải ngồi xe lăn, mất khả

(DMD). DMD là một trong những bệnh thần kinh

năng tự đi lại trước tuổi 12 (1). Bệnh loạn dưỡng

cơ phổ biến ở trẻ em với tỷ lệ mắc 1/3500 trẻ trai

cơ Becker (BMD) là thể trung gian của bệnh DMD

đẻ sống (1). Bệnh DMD có đặc trưng là thoái hoá

với thời kỳ khởi phát bệnh muộn hơn và có tiến

62


PHẦN NGHIÊN CỨU
triển lâm sàng chậm hơn. Tỷ lệ mắc bệnh BMD

khoảng 1/18,500 trẻ trai đẻ sống (2).
Gene Dystrophin (DMD) là một trong những
gene lớn nhất trong bộ gene người, nằm trên cánh

Nghiên cứu sử dụng phương pháp hồi cứu,
thực hiện trên 564 bệnh nhân nam từ 5 tháng đến
19 tuổi mắc DMD được điều trị tại Bệnh viện Nhi
trung ương từ 12/2005 đến 01/2015.

ngắn của nhiễm sắc thể X (Xp21) có độ lớn 2.4Mb.

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân dựa trên các tiêu

Gene DMD gồm 79 exon, mã hóa cho protein

chuẩn cổ điển của Duchenne đã mô tả bao gồm:

dystrophin có độ lớn 427kDa. Đây là loại protein

trẻ trai; giảm vận động, yếu cơ gốc chi (dấu hiệu

màng bao cơ, chủ yếu tập trung ở cơ xương và cơ

Gowers), teo cơ gốc chi nhiều vị trí, đối xứng hai

tim. Một lượng nhỏ protein Dystrophin tập trung

bên, bắp chân phì đại đối xứng hai bên, điện cơ

ở các tế bào thần kinh của não. Ở những bệnh

đồ có hình ảnh tổn thương nguồn gốc sợi cơ; men

nhân DMD, protein dystrophin thường không

creatine kinase huyết thanh tăng cao trên 20 lần

biểu hiện, trong khi đó bệnh nhân BMD thường

so với trị số bình thường (13).

có khoảng 10-40% lượng protein dystrophin. Các
đột biến có thể xảy ra trên gene là đột biến mất
đoạn, đột biến điểm, chuyển đoạn và mất đoạn
nhỏ. Mất đoạn và lặp đoạn là loại đột biến hay

2.2. Phương pháp
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm: 2ml máu ngoại vi chống
đông EDTA vô trùng.

gặp nhất, chiếm khoảng 65% trong số các đột

2.2.2. Tách chiết DNA từ máu ngoại vi

biến (3-5). Trong đó, đột biến mất đoạn hay xảy ra

DNA đước tách chiết theo QiaAmp DNA blood

trong vùng “hot spots” của gen, chủ yếu từ exon

mini kit (QiAgen). Nồng độ và độ tinh sạch DNA

44 đến exon 52 và từ exon 2 đến exon 19 (6).

được xác định trên máy Biophotometter plus

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai

(Eppendorf), các mẫu đạt độ tinh sạch OD (bước

phương pháp Multiplex PCR và MLPA để phát

sóng 260/280) 1,8-2.0 sẽ được sử dụng làm các

hiện các đột biến gene DMD trên 564 bệnh nhân

phản ứng tiếp theo.

nghi ngờ mắc bệnh DMD/BMD đến khám và điều

2.2.3. Phản ứng Multiplex PCR

trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương trong từ năm

Kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện sự mất đoạn

2005 đến năm 2015.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

của 25 exon đặc hiệu tập trung ở vùng “hotspots”
của gene. 25 exon này được chia thành 3 bộ
Multiplex A, B, C. Trình tự mồi được thiết kế theo
Chamberlain và cộng sự (7).

63


TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3
Bảng 1. Các exon của Multiplex A, B, C
Multiplex A

Multiplex B

Mutiplex C

Exon

Kích thước (bp)

Exon

Kích thước (bp)

Exon

Kích thước (bp)

45

547

Pm

535

49

439

48

506

3

410

Pb

332

19

459

43

357

16

290

17

416

50

271

41

270

51

388

13

238

32

253

8

360

6

202

42

195

12

331

47

181

34

171

44

268

60

139

4

196

52

113

Chu trình nhiệt được tiến hành với các điều

được trộn kỹ với 30µL PCR buffer và mồi, sau đó

kiện sau: 950C, 3 phút; [950C, 30s; 500C, 30s; 720C,

phản ứng PCR được thực hiện ở điều kiện luân

1 phút] x 30 chu kỳ.

nhiệt PCR. Các đầu dò nếu không được ghép nối

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose

với nhau thì chỉ mang 1 primer cho nên không

3%, nhuộm bằng Ethidium và nhận định kết quả

được khuếch đại. Sản phẩm sau khuếch đại được

dưới đèn UV.

điện di phân tách đoạn trên hệ thống ABI 3130.

2.2.4. Phản ứng MLPA
Kỹ thuật MLPA (MRC-Holland, Hà Lan) thực
hiện bằng cách sử dụng bộ đầu dò thương mại

Dữ liệu được phân tích trên phần mềm Coffalyser.
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

trong 5µL buffer AE được biến tính ở 98oC trong 5

3.1. Phát hiện đột biến bằng kỹ thuật Multiplex
PCR

phút, trộn với 3µL hỗn hợp probe và MLPA buffer.

Nhóm nghiên cứu sàng lọc đột biến mất đoạn

Phản ứng lai: hỗn hợp DNA và probe này sau đó

trên 564 trường hợp bằng kỹ thuật Multiplex

được ủ tại 95oC trong 1 phút và 60oC trong 12 giờ

PCR đã phát hiện 157/564 (27.8%) bệnh nhân có

hoặc qua đêm. Phản ứng nối: hỗn hợp DNA và

đột biến mất đoạn. Trong đó có 96/157 (61.1%)

probe được cho thêm với 32µL hỗn hợp Ligase-65

bệnh nhân mất đoạn vùng hot spot trung tâm (từ

và buffer ở 54oC trong 15 phút và bất hoạt ở 980C

exon 45-52); 46/157 (29.3%) bệnh nhân mất đoạn

trong 5 phút. Phản ứng PCR: sản phẩm sau nối

vùng exon 3-19.

P034 và P035. 50-200ng DNA của mẫu pha loãng

64


PHẦN NGHIÊN CỨU
Bảng 2. Tỷ lệ mất đoạn vùng hot spots
Stt

Vị trí của gene có mất đoạn

N (%)

1

Exon 3 – 19

46 (29.3)

2

Exon 32 – 44

15 (9.6)

3

Exon 45 – 52 (vùng hospot)

96 (61.1)

Tổng số

157 (100)

Hình 1. Kết quả điện di multiplex PCR trên agarose
Giếng 1: marker 100bp; Giếng 2a, 2b, 2c: mẫu chứng mất đoạn exon 3-44; Giếng 3a, 3b, 3c: mẫu
chứng không mất đoạn; Giếng 4a, 4b, 4c: bệnh nhân mất đoạn exon 41, 42, 43; Giếng 5a, 5b, 5c: bệnh
nhân không mất đoạn; Giếng 6a, 6b, 6c: bệnh nhân mất đoạn exon 12, 13; Giếng 7a, 7b, 7c: mẫu không
chứa DNA.
3.2. Phát hiện đột biến bằng kỹ thuật MLPA

đoạn, trong đó có 3 trường hợp bị đột biến

61 bệnh nhân không tìm thấy đột biến mất

mất đoạn 1 exon, 1 trường hợp đột biến mất

đoạn bằng kỹ thuật Multiplex PCR được thực

đoạn ngoài vùng hotspots (exon 65-74), và

hiện tiếp kỹ thuật MLPA để phát hiện các đột

09/61 (14.75%) bệnh nhân có đột biến lặp

biến mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn. Kết quả

đoạn, trong đó có 4 trường hợp chỉ có đột

có 06/61 (9.84%) bệnh nhân bị đột biến mất

biến lặp đoạn 1 exon.

65


TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3
Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện đột biến gene DMD bằng kỹ thuật MLPA
Stt

Dạng đột biến

N (%)

1

Mất đoạn

6 (9.84%)

2

Lặp đoạn

9 (14.75%)

3

Không phát hiện đột biến

46 (75.41%)

Tổng số

61 (100%)

Hình 2. Điện di mao quản bộ P034 - DMD
2a: Mẫu đối chứng không có đột biến (NC). 2b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 44-50

66


PHẦN NGHIÊN CỨU

Hình 3. Điện di mao quản bộ P035 - DMD
3a: Mẫu đối chứng không có đột biến (NC). 3b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 51-60
4. BÀN LUẬN

Có nhiều phương pháp phát hiện đột biến gene
Dystrophin như PCR, Southern blot, PCR định
lượng, FISH (fluorescence in situ hybridization)
và giải trình tự xác định đột biến điểm… Tuy

một phản ứng có độ đặc hiệu cao và ít tốn kém.
Nhận biết đột biến mất đoạn của 25 exon đặc
hiệu trong vùng “hotspots” có thể phát hiện được
98% trong tổng số đột biến mất đoạn của gene
Dystrophin (6). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã

nhiên, có hai phương pháp phổ biến và hiệu quả

phát hiện 157/564 (27,8%) bệnh nhân có đột biến

thường được sử dụng để phát hiện các đột biến

mất đoạn, trong đó 96/157 (61,1%) bệnh nhân chủ

mất đoạn và lặp đoạn trên gene DMD là phương

yếu mất đoạn ở vùng hotspots (Exon 45-52).

pháp Multiplex PCR và MLPA.

Phương pháp MLPA (Multiplex ligation-

Phương pháp Multiplex PCR là phương pháp

dependent probe amplification) là phương pháp

sàng lọc mất đoạn 25 exon vùng hot spot. Đây là

cho phép khuếch đại nhiều đoạn gene khác nhau

phương pháp nhân đoạn nhiều exon trong cùng

với chỉ một cặp mồi duy nhất. Mỗi một đầu dò

67


TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3
5. KẾT LUẬN

(probe) bao gồm 1 cặp mồi (primer), cặp mồi này
sẽ bắt cặp từ hai đầu của vùng gene quan tâm,
sau đó hai cặp mồi này sẽ được nối lại với nhau
thành một trình tự đích hoàn chỉnh. Phương pháp
MLPA là phương pháp cho phép sàng lọc sự mất
đoạn và lặp đoạn của 79 exon được chia làm hai
bộ P034-P035 (8). Với những bệnh nhân có triệu
chứng lâm sàng điển hình nhưng không phát
hiện đột biến trên 25 exon vùng hot spots, chúng
tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật MLPA để phân tích

- Sự kết hợp giữa hai phương pháp Multiplex
PCR và MLPA đã phát hiện được 172/564 (30.5%)
bệnh nhân DMD/BMD có đột biến mất đoạn hoặc
lặp đoạn. Các đột biến xảy ra chủ yếu nằm ở vùng

hot spots.
- Kỹ thuật Multiplex PCR và MLPA là các kỹ
thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, làm tăng tỷ
lệ phát hiện đột biến trên gene DMD.

gene DMD, kết quả phát hiện thêm 06/61 (9,84%)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

bệnh nhân bị đột biến mất đoạn và và 09/61
(14,75%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn.
Theo nghiên cứu của Prior và cộng sự thì tỷ lệ
đột biến mất đoạn của gene Dystrophin là 70%

1. Emery AE. Population frequencies of
inherited

neuromuscular

diseases--a

world

survey. Neuromuscul Disord. 1991;1(1): 19-29.

(306 ca DMD và 55 ca BMD có đột biến mất đoạn)

2. Bushby KM, Thambyayah M, Gardner -

và đột biến chủ yếu tập trung ở vùng “hos pots” ,

Medwin D. Prevalence and incidence of Becker

chiếm tỷ lệ khoảng 80% (9). Yuge và cộng sự (10)

muscular dystrophy. Lancet. 1991;337(8748):

đã nghiên cứu trên 138 bệnh nhân DMD với kết

1022-4.

quả có 62% bệnh nhân bị mất đoạn, trong đó có

3. Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco

68% bệnh nhân mất đoạn ở vùng hospot. Nhờ

AP, Feener C, Kunkel LM. Complete cloning of the

sử dụng kết hợp các phương pháp MultiplexPCR

Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and

và MLPA, Janssen và cộng sự đã phát hiện 53%

preliminary genomic organization of the DMD

tổng số bệnh nhân có đột biến mất đoạn và lặp

gene in normal and affected individuals. Cell.

đoạn (11). Nghiên cứu của Zimowski và cộng sự

1987;50(3): 509-17.

(12) phát hiện 134/180 bệnh nhân (73.9%) bệnh

4. Forrest SM, Cross GS, Flint T, Speer A,

nhân có mất đoạn gene DMD bằng phương

Robson KJ, Davies KE. Further studies of gene

pháp MLPA. Trong nghiên cứu của chúng tôi,

deletions that cause Duchenne and Becker

kết hợp giữa haiphương pháp Multiplex PCR và

muscular dystrophies. Genomics. 1988;2(2): 109-

MLPA đã tăng tỷ lệ phát hiện đột biến từ 27.8%

14.

lên 30.5% và làm đa dạng khả năng phát hiện

5. Den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker

các loại đột biến như mất đoạn lớn, mất đoạn

E, Blonden LA, Ginjaar HB, Wapenaar MC, et al.

nhỏ, lặp đoạn… Sự khác nhau về tỷ lệ mất đoạn

Topography of the Duchenne muscular dystrophy

của gene Dystrophin có thể phụ thuộc vào số

(DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases

lượng các exon được phân tích và số lượng mẫu

reveals 115 deletions and 13 duplications. Am J

nghiên cứu.

Hum Genet. 1989;45(6): 835-47.

68


PHẦN NGHIÊN CỨU
6. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM.

Becker muscular dystrophy using CDNA probes

Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions

and the polymerase chain reaction method. Life

by polymerase chain reaction. Hum Genet.

Sci. 1999;65(9): 863-9.

1990;86(1): 45-8.

11. Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch

7. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE,
Nguyen PN, Caskey CT. Deletion screening of
the Duchenne muscular dystrophy locus via
multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res.
1988;16(23): 11141-56.
8. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R,
Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative
quantification of 40 nucleic acid sequences by
multiplex ligation-dependent probe amplification.
Nucleic Acids Res. 2002; 30(12): e57.
9. Prior TW, Bridgeman SJ. Experience and

A, Zschocke J. MLPA analysis for the detection
of

deletions,

duplications

and

complex

rearrangements in the dystrophin gene: potential
and pitfalls. Neurogenetics. 2005;6(1): 29-35.
12. Zimowski JG, Massalska D, Holding M,
Jadczak S, Fidzianska E, Lusakowska A, et al. MLPA
based detection of mutations in the dystrophin
gene of 180 Polish families with Duchenne/Becker
muscular dystrophy. Neurologia i neurochirurgia
polska. 2014;48(6): 416-22.

strategy for the molecular testing of Duchenne

13. Katharine Bushby, Richard Finkel, David

muscular dystrophy. J Mol Diagn. 2005;7(3): 317-

J Birnkrant, et al. Diagnosis and management

26.

of Duchenne muscular dystrophy, part 1:
10. Yuge L, Hui L, Bingdi X. Detection of gene

diagnosis, and pharmacological and psychosocial

deletions in Chinese patients with Duchenne/

management. Lancet Neurol. 2010 Jan; 9(1): 77-93.

ABSTRACT
DETECTION MUTATION IN DYSTROPHIN GENE USING MOLECULAR TECHNIQUES
IN DUCHENNE/BECKER PATIENTS
Ngo Manh Tien*, Nguyen Thi Phuong Mai*, Nguyen Thi Mai Huong*, Ly Thi Thanh Ha*, Ngo Thi
Tuyet Nhung*, Ngo Diem Ngoc*, Nguyen Ngoc Khanh**, Bui Phuong Thao**, Vu Chi Dung**
*
**

Human Genetics Department, National Hospital of Peadiatrics, Hanoi, Vietnam

Endocrinology-Metabolic-Genetic Department, National Hospital of Pediatrics, Hanoi, Vietnam

Overview: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic neuromuscular
diseasesat the rate of 1 out of 3500male live births. Goal: Detecting mutation in Dytrophin gene.
Patients and Method: 564 patients suspected of Duchenne muscular dystrophy (DMD) were collected
from 2005 to 12-2014 at National Hospital of Pediatrics. The detection of deletion and dulication
mutation in Dystrophin gene were identified by Multiplex PCR technique and MLPA technique
(Multiplex Liation-dependent Probe Amplification). Results: In this study, we have discovered

69


TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3
172/564 (30.5%) cases of deletion and duplication mutations, in which 157/564 (27.8%) cases of
deletion mutations by multiplex PCR technique. The remaining cases are 6 cases deletion and 9 cases
duplication mutation by MLPA technique. Most of the mutation arelocated in the hotspot of the
Dystrophin gene, including mutations in the central genomic region for (exon 45-52) 61.1% and in the
5’ region (exon 3-19) 29.3%, following is the remaining of the gene 9.6% (respectively). Conclusion:
Multiplex PCR technique and MLPA technique detect deletions and duplication mutations in the
Dystrophin gene, have high sensitivity and specificity and efficiency in diagnosing genetic Duchenne

muscular dystrophy díseases.
Keywords: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR).

70