Định danh nấm Phytophthora spp. bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * * * *






NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH


ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ



LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC







Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * *





ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ


LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC





Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH
KS. TRỊNH THỊ PHƢƠNG VY KHÓA: 2002 - 2006





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
* * * * *





IDENTIFYING Phytophthora spp. BY MOLECULAR
TECHNOLOGIES

GRADUATION OF THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY




Professor: Student:
PhD. LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH
Bs. TRINH THI PHUONG VY TERM: 2002 - 2006

HCMC, 8/2006

iv
LỜI CẢM ƠN

- Em xin chân thành gửi lời cảm ơn của mình đến cán bộ giáo viên Trường Đại
Học Nông Lâm, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực
hiện đề tài này.
- Em rất biết ơn sự hướng dẫn của thầy Tiến sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ sư Trịnh Thị
Phương Vy, Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời
gian thợc hiện đề tài.
- Cảm ơn thầy cô, anh chị giảng viên Phòng Công Nghệ Sinh Học – Trung tâm
Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em
hoàn thành đề tài.
- Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn thực tập đề tài tại Trung tâm Phân Tích Thí
Nghiệm Hóa Sinh, đặc biệt là các bạn nhóm Bảo Vệ Thực Vật trong thời gian
qua đã tận tình giúp đỡ.
- Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 28 đã cùng tôi chia sẽ những kỉ
niệm buồn vui trong suốt thời gian bốn năm học vừa qua.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006
Sinh viên
Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh

v
TÓM TẮT

Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh, Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. “
ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN

TỬ ”.
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn
KS. Trịnh Thị Phương Vy
Nấm Phytophthora được xem là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu
cho nền kinh tế nông nghiệp nước ta hiện nay. Dựa trên một số kết quả đạt được từ
những nghiên cứu trước đây về hình thái và sinh thái của giống nấm này, chúng tôi đã
đề nghị qui trình định danh giống nấm này trên cơ sở cấu trúc di truyền của chúng.
Mục đích của đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm
khuếch đại và xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2. Kết quả của đề tài
tạo cơ sở cho những nghiên cứu điều tra và kiểm soát mầm bệnh Phytophthora ở nước
ta.
Sau khi thực hiện toàn bộ qui trình, chúng tôi thu được một số kết quả sau:
- Sản phẩm khuếch đại trong vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm trên
tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai là 900 bp. Trong khi sản phẩm khuếch
đại của hai mẫu nấm trên địa lan cho band 800 bp hoặc 900 bp hoặc cả hai
band trên.
- Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan cho thấy trình tự của toàn vùng
ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp. Trong đó vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng
5,8S là 160 bp và vùng ITS2 là 420 bp.

vi
MỤC LỤC
.......o0o.......

Trang

Lời cảm ơn ............................................................................................................ iv
Tóm tắt ................................................................................................................... v
Mục lục ................................................................................................................. vi
Danh mục các hình .............................................................................................. ix

Danh mục các bảng................................................................................................ x
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... xi
1. Giới thiệu ........................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 2
1.2 Mục đích – yêu cầu của đề tài ......................................................................... 2
1.2.1 Mục đích của đề tài ....................................................................................... 2
1.2.2 Yêu cầu của đề tài ......................................................................................... 2
1.2.3 Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2
1.2.4 Đối tượng của đề tài ..................................................................................... 2
2. Tổng quan .......................................................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về giống Phytophthora ................................................................... 3
2.1.1 Cây tiến hoá của Phytophthora .................................................................... 4
2.1.2 Chu kì sống của Phytophthora ..................................................................... 4
2.1.3 Phân lập Phytophthora từ các bôl phận nhiễm bệnh của cây ....................... 5
2.1.4 Một số môi trường phân lập Phytophthora từ mô bệnh ............................... 6
2.1.5 Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora ................................................ 6
2.1.6 Phân biệt nấm Pythium và nấm Phytophthora ............................................. 7
2.2 Một số bệnh Phytophthora được nghiên cứu tại Việt Nam ............................ 7
2.2.1 Cà chua và khoai tây ..................................................................................... 8
2.2.2 Khoai sọ ........................................................................................................ 8
2.2.3 Dứa ............................................................................................................... 8
2.2.4 Họ cam chanh ............................................................................................... 8
2.2.5 Sầu riêng ...................................................................................................... 9

vii
2.2.6 Mận ............................................................................................................... 9
2.2.7 Cao su ......................................................................................................... 10
2.3 Các kỹ thuật phát hiện và định danh Phytophthora ...................................... 11
2.3.1 Kỹ thuật quan sát hình thái trên môi trường nuôi cấy ................................ 11
2.3.2 So sánh sự tương xứng giữa sinh sản và sinh dưỡng ................................. 12

2.3.3 Kỹ thuật protein profile .............................................................................. 12
2.3.4 Isozyme ....................................................................................................... 13
2.3.5 Huyết thanh học và kit chuẩn đoán ............................................................ 13
2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) ............... 14
2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting ..................................... 14
2.3.8 Sự lai DNA-DNA ....................................................................................... 15
2.3.9 Kỹ thuật PCR và RAPD ............................................................................. 15
2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora ........................ 15
2.4.1 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước .................................................. 15
2.4.2 Công trình nghiên cứu trong nước.............................................................. 17
2.5 Một số lưu ý trước khi thực hiện thí nghiệm ................................................. 18
2.5.1 Sơ lược về trình tự ITS ............................................................................... 18
2.5.2 Danh mục các loài Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam .................... 19
3. Vật Liệu và phương pháp ................................................................................ 21
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .......................................................... 21
3.1.1 Thời gian thực hiện ..................................................................................... 21
3.1.2 Địa điểm thực hiện ..................................................................................... 21
3.2 Vật liệu và hoá chất ....................................................................................... 21
3.2.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ...................................................................... 21
3.2.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 22
3.2.3 Điện di ........................................................................................................ 22
3.2.4 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 23
3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 23
3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ....................................................................... 23
3.3.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 24
3.3.3 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 26
3.3.4 Kỹ thuật giải trình tự .................................................................................. 28

viii
3.3.5 Xử lý kết quả giải trình tự .......................................................................... 29

4. Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 30
4.1 Quá trình tăng sinh và nhân sinh khối ........................................................... 30
4.2 Quá trình ly trích .......................................................................................... 30
4.3 Quá trình PCR ............................................................................................... 31
4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................. 35
4.5 Xử lý kết quả giải trình tự ............................................................................. 36
5. Kết luận và đề nghị .......................................................................................... 44
6. Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 45
7. Phụ lục ............................................................................................................. 47

ix
Danh sách các hình


Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora .............................................................. 4
Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng ............... 10
Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome ............................................. 18
Hình 4.1. Sản phẩm của qui trình 1 ..................................................................... 31
Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2 ........................................................ 31
Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn ................................................................. 32
Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR ........................................................................ 33
Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai ................................................................... 34
Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự ................................... 36
Hình 4.7. Cây phát sinh loài của hai mẫu địa lan ................................................ 40

x
Danh sách các bảng


Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora…………………………………..4

Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam ..... 19
Bảng 3.1. Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l ..................................... 26
Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l ...................................... 27
Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ........................................................... 27
Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen được dùng để so sánh ............... 37
Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 ........... 38
Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 ..................... 40
Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan 42

xi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp: base pair
Kbp Kilobase pair
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: 3’- Deoxyribonucleoside- 5’-
triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid
PCR: Polymerase Chain Reaction
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA
RNA: Ribonucleic acid
rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TAE: Tris Acetate EDTA
Taq: Thermus aquaticus

UV: Ultraviolet (light)
w/v: Weight for volume




1
Phần 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề:
Nấm Phytophthora được xem là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho
cây do sức tàn phá mãnh liệt của nó. Nó gây ra những căn bệnh như: bệnh thối
rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá, thối trái và đặc biệt nguy hiểm là bệnh mốc
sương trên khoai tây. Việc phân lập và định danh nấm Phytophthora để tìm ra
các phương cách phòng trừ hữu hiệu là một nhu cầu cấp thiết. Hiện nay, người
ta chỉ định danh được khoảng 60 loài Phytophthora chính thức được phân bố
trên nhiều ký chủ ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới. Các loài
Phytophthora này đặc biệt phát triển mạnh ở các nước có khí hậu nhiệt đới và
cận nhiệt đới trong đó có Việt Nam.
Những nghiên cứu về Phytophthora ở Việt Nam chỉ nhằm mục đích phát
hiện sự lây lan và phát triển bệnh. Mặt khác, do đặc tính của các loài
Phytophthora gần giống nhau và rất biến đổi cho nên các kỹ thuật định danh
trước đây (chẳng hạn như kỹ thuật quan sát hình thái) không thể định danh
được một số loài.
Ngày nay, dựa trên những tiến bộ khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là
những tiến bộ về các kỹ thuật sinh học phân tử ta có thể giải quyết những khó
khăn trên. Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với các kỹ thuật như: kỹ thuật
PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự,…. tác động lên cấu
trúc phân tử DNA của các loài nấm từ đó cho phép việc định danh chúng một
cách chính xác hơn. Với sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và
được sự hướng dẫn của Tiến Sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ Sư Trịnh Thị Phương Vy ( Bộ

môn Bảo Vệ Thực Vật- Khoa Nông Học). Chúng tôi đã thực hiện đề tài ”
ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora bằng các
kỹ thuật sinh học phân tử.






2
1.2. Mục đích – yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục đích của đề tài
Định danh nấm Phytophthora.bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Cụ thể
là sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1 và
ITS2 trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora. Sau đó dùng kỹ thuật đọc
trình tự để định danh các mẫu nấm trên.
1.2.2 Yêu cầu của đề tài
- Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây trồng
ở một số vùng khác nhau.
- Phát hiện đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và
ITS5.
- Sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm đã phân lập ở trên.
1.2.3 Giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ thực hiện được trên các mẫu nấm phân lập được ở một số cây trồng
thuộc vùng Đông Nam Bộ. Do đó, đề tài chỉ định danh được ở một mức độ giới
hạn các loài nấm Phytophthora ở Việt Nam.
1.2.4 Đối tƣợng của đề tài
Các mẫu nấm được lấy từ nhiều loại cây khác nhau như: Tiêu, Sầu Riêng, các
loại Lan tại các tỉnh như: Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu.

3
Phần 2. TỔNG QUAN

2.1. Giới thiệu về giống Phytophthora
Tên của giống nấm bệnh Phytophthora có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp (Phyto có
nghĩa là thực vật; phthora có nghĩa là vật phá hoại ). P.infestans còn được biết như
loài nấm gây nên nạn mất mùa khoai tây ở Ailen. Nó đã phá hoại trên diện rộng những
vụ mùa chính của khoai tây trong suốt hai năm 1845 và 1846. Căn bệnh này đã gây
nên tác hại nghiêm trọng về kinh tế và xã hội cho đất nước này, đó là nạn đói và sự ra
đi của hai triệu cư dân. Sau đó vài thập kỷ nó lại gây nên một cuộc tranh cải lớn về
bệnh tàn lụi muộn, Anton de Bary cũng như Rev. Miles Joseph Berkeley trước đó đã
khẳng định: giống nấm này có thể là nguyên nhân chính gây nên bệnh tàn lụi muộn.
Và cho đến năm 1876 nó có tên là Phytophthora infestans (Bary). Bệnh Phytophthora
đã được nghiên cứu sâu ở châu Âu. Tuy nhiên đây lại là bệnh khá phổ biến ở vùng
nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan
trọng ở những vùng này: như bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối
trái.
Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn thuộc lớp Oomycetes, có mặt khắp
mọi nơi trên thế giới và có hơn 1.000 cây kí chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở
thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi P. cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt
đới thì P. palmivora, P. parasitica và P. citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới; P.infestans, P.syringae và P.fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn
đới.


4
Hình 2.1. Chu kì sống của Phytophthora
(SI-AMMOUR, 2002)

2.1.1. Cây tiến hóa của Phytophthora (Andre
’
Drenth, 2001)
Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora

Ngành Lớp Bộ Họ Giống
Chromista Oomycetes Lagenidiales
Leptomitales
Saprolegniales Saprolegniaceae Achlya
Saprolegnia
Peronosporales Pythiaceae Pythium
Phytophthora
Peronosporaceae Bremia
Peronospora
Albuginaceae Albugo

2.1.2. Chu kì sống của phytophthora

5
Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty
(Mycelium) của nó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những
bào tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia).
Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm.
Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau
(Heterokont flagella). Những bào tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng
giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng
hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào
tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính.
Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực (Antheridium - bộ phận sinh sản đực) và túi
noãn ( Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao
tử đực và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora.
Giai đoạn lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi
thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau
khi được thụ tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của
trứng với một hay nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao gồm một số loài
nấm dị tản (Heterothallic)(có hai kiểu lai A1và A2) chẳng hạn như P.infestans. Số còn
lại là những loài nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri.
2.1.3. Phân lập Phytophthora từ các bộ phận nhiễm bệnh của cây
Các loài Phytophthora chỉ tấn công trên các bộ phận khỏe mạnh của cây bao
gồm cả rễ. Do đó, mầm bệnh có thể hiện diện khi không có dấu hiệu rõ ràng. Các loài
Phytophthora khó phân lập từ các mô hoại tử bởi vì các mô này thường che giấu nhiều
mầm bệnh thứ cấp. Sự phân lập thành công các loài Phytophthora từ mô bệnh bao
gồm sự lựa chọn cẩn thận các mô bị lây nhiễm mới nhất. Cho nên, muốn thu được

mẫu tốt nhất từ những bộ phận này ta nên lấy mẫu từ mép của một vết thương đang
phát triển nhanh. Mẫu mô lá hay thân lý tưởng được chọn cho việc phân lập nên chứa
cả phần bệnh và phần mô khỏe. Mô thu được sau đó được xử lý vô trùng bề mặt rồi
chuyển sang môi trường chọn lọc thích hợp (A. Drenth và B. Sendall, 2004).






6
2.1.4. Một số môi trƣờng phân lập Phytophthora từ mô bệnh
- Môi trường 3-P dùng để phân lập mô mới nhiễm bệnh .
- Môi trường 3-P + 10 mg/ml pimaricin dùng để phân lập trên mô cây già hay đất.
- Môi trường Hymexazol-25 và Hymexazol-50 hạn chế sự phát triển của Pythium
đồng thời cũng hạn chế sự phát triển của một số loài Phytophthora.
- Môi trường P10VP phân lập Phytophthora từ đất và mô bị bệnh.
- Môi trường P10ARP và P5ARP là những môi trường dùng để phân lập hầu hết các
loài Phytophthora.
2.1.5. Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora
Ta có thể xác định một số loài Phytophthora thông qua một số đặc điểm hình
thái sau (A. Drenth và B. Sendall, 2004):
- Túi bào tử
Hình thái túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, chiều rộng,…),
hệ gai của túi, tính rụng sớm của chúng.
Chiều dài của cuống trên túi bào tử.
Sự tăng sinh của túi bào tử.
Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử sinh ra.
Một số loài Phytophthora tạo ra bào tử ngay trên môi trường Agar, trong khi
nhiều loài khác cần dược nuôi cấy trong nước, dung dịch muối khoáng và dịch trích từ

đất pha loãng trước khi chúng tạo ra bào tử. Điều quan trọng hơn là sự tạo ra bào tử
trên Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng.
- Chlamydospore và sự trương phồng sợi nấm:
Chlamydospore là một bào tử vách dày có chức năng như một bào tử nghỉ. Chúng có
thể chỉ là một đốt (nằm giữa sợi nấm) hoặc ở tận cùng (nằm ở cuối sợi nấm). Hình thái
của chlamydospore không khác biệt nhiều giữa các loài. Tuy nhiên sự hiện diện (trên
P. palmivora) hay sự vắng mặt (trên P. hevae) của chlamydospore có thể xác định ở
mức độ loài.
- Cấu trúc sinh sản hữu tính:
Khoảng một nửa các loài Phytophthora ở dạng đồng tản (homothallic) chúng sẽ sản
xuất bộ phận sinh sản đực, bộ phận sinh sản cái và bào tử động trên cùng một môi
trường. Phần còn lại là dạng dị tản (heterothallic) với hai kiểu lai A1 và A2. Dạng dị
tản tạo ra túi giao tử (túi giao tử đực và túi noãn) chỉ khi có sự hiện diện của một dòng


7
phân lập mọc đối trên cùng môi trường.Việc xác định loài nấm thuộc nhóm đồng tản
hay dị tản phụ thuộc vào túi bào tử đực của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực
nằm quanh thân túi noãn) hay paragynuos (túi giao tử đực nằm tiếp theo túi noãn).
2.1.6. Phân biệt nấm Pythium và nấm Phytophthora
Khi phân lập các loài nấm Phytophthora, một trong những vi sinh vật mà
chúng ta thường đối mặt là Pythium. Phytophthora và Pythium đều thuộc họ
Pythiaceae và chúng có mối quan hệ di truyền rất gần nhau. Sự khác nhau giữa hai
giống này bao gồm sự khác nhau về cách tạo ra bào tử động: Ở Phytophthora bào tử
động được sản xuất bên trong túi bào tử. Ở Pythium, bào tử động phát triển bên trong
nang được sản xuất bởi túi bào tử. Đây là đặc điểm quan trọng nhất dùng để phân biệt
Phytophthora và Pythium. Các đặc điểm khác chỉ từ đặc điểm này mà ra.
2.2. Một số bệnh Phytophthora đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam
Những thông tin chính quan tâm đến sự hiện diện, sự phân bố của bệnh
Phytophthora ở việt Nam được điều tra và kiểm soát bởi Viện Bảo Vệ Thực Vật Quốc

Gia ở Hà Nội. Từ những kết quả điều tra và những nghiên cứu ngoài đồng, 13 loài
Phytophthora đã được tìm thấy ở Việt Nam. Sau đây là những thông tin về bệnh
Phytophthora trên một số cây trồng chính tại Việt Nam theo ghi nhận của Thanh,
Ngo, Viên và Andre’ Drenth năm 2004.
2.2.1. Cà chua và khoai tây
Bệnh tàn lụi lá là bệnh chính trên nhóm cây trồng này. Được nghiên cứu ở
vùng đồng bằng sông Hồng trong những năm 1960. Tác nhân gây bệnh là
Phytophthora infestans và bệnh xuất hiện hàng năm từ tháng 12 đến tháng 3 khi điều
kiện khí hậu lạnh và ẩm; gây mất mùa 30 – 70%, trong trường hợp xấu bệnh gây mất
mùa toàn bộ (Vũ, 1973). Điều đáng lưu ý là phạm vi ảnh hưởng của bệnh cao hơn
mức trung bình ở những vùng đất sét. Bệnh dược khống chế bằng phun 1% Bordeaux.
Ngoài ra thuốc diệt nấm Maneb và Zineb 0,2 – 0,3% a.i. cũng được xem là có hiệu
quả phòng chống P. infestans cao.
2.2.2. Khoai sọ
Bệnh tàn lụi lá gây ra bởi P. colocasiae được xem là bệnh chính trên khoai sọ ở
Bắc Việt Nam. Bệnh được báo cáo đầu tiên bởi Roger (1951). Nhiệt độ ấm (24 –
30
0
C) và ẩm độ cao là yêu cầu cho bệnh lan rộng. Bệnh xuất hiện hằng năm, bắt đầu


8
vào giữa tháng 4, tháng 5 và cao điểm ở tháng 7, tháng 8 khi nhiệt độ ổn định ở 27 –
29
0
C, lượng mưa trung bình trong tháng ở mức 201 – 308 mm.
2.2.3. Dứa
Bệnh thối nõn dứa là một trong những bệnh chính gây mất năng suất dứa. Bệnh
được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng dứa trên khắp đất nước gồm Thừa Thiên Huế,
Nghệ An, Hà Tây, Bắc Giang, Thanh Hóa và Ninh Bình. Giống dứa cayenne mẫn cảm

với bệnh hơn các giống dứa khác. Một điều thú vị là ở những vùng có pH đất thấp (3,5
– 4,2) như Tiền Giang và Tp. Hồ Chí Minh, bệnh thối nõn dứa không được tìm thấy.
Tuy nhiên, điều này không rõ là do pH thấp hoặc là do một yếu tố khác.
Tác nhân gây bệnh là P. cinnamomi và P. nicotianae, điều này được chứng
minh bởi các thí nghiệm trong nhà kính được kiểm soát tại Viện BVTV quốc gia ở Hà
Nội năm 2001 (Ngô và cộng sự, 2001).
2.2.4. Cây cam quýt
Phytophthora citrophthora được báo cáo đầu tiên trên cam ở đồng bằng sông
Cửu Long trong những năm 1950 và không được theo dõi mãi đến những năm 1970,
khi bệnh có mặt ở tất cả các vùng trồng cam quýt, như vùng Thanh Trà ở Thừa Thiên
Huế, Ninh Bình ở Tiền Giang.
P. citrophthora tấn công thân và quả, với các biểu hiện triệu chứng, làm chảy
nhựa và thối quả. Sự phát triển nhanh trong mùa mưa, nguy hiểm nhất là vào tháng 7
và tháng 8. Vào tháng 3 năm 2002, tỷ lệ mắc bệnh trên cam ở Cao Phong – Hòa Bình
là 10% nhưng sau đó đã tăng lên 20 – 30% vào tháng 8. Quýt bị ảnh hưởng nhiều hơn,
với nhiều vườn đã bị mất năng suất và chết cây. Những mẫu lấy từ mô cây cam quýt
bị loét thân ở tỉnh Tiền Giang được nhận biết là P. nicotianae (A. Drenth, thông tin
chưa công bố).
2.2.5. Sầu riêng
Sầu riêng (Durio zibethinus Murr) là một trong những cây ăn trái được ưa thích
nhất ở miền Nam Việt Nam và diện tích trồng sầu riêng ngày càng được mở rộng do
trồng chúng có hiệu quả kinh tế hơn các cây trồng khác.
P. palmivora là tác nhân gây bệnh ở sầu riêng, bao gồm thối rễ, loét thân, thối
trái và rụng lá. Nó được tìm thấy trong tất cả các vùng trồng sầu riêng ở những vùng
cả miền Nam và miền Trung Việt Nam. Trong năm 2001, bệnh đã ảnh hưởng đến cả
các vùng thấp trồng sầu riêng và đặc biệt nghiêm trọng ở tỉnh Quảng Nam. Trong


9
3075 cây trồng ở xã Quế Trung, có 2138 cây bị chết do P. palmivora, gây thiệt hại

kinh tế 15 tỉ đồng VND (1,5 triệu USD). Những nơi khác, bệnh đã được tìm thấy phổ
biến nhất ở Cái Bè, Tiền Giang, với 24,6% cây bị nhiễm bệnh. Tỷ lệ mắc bệnh có liên
quan với tuổi cây, những cây hơn 10 tuổi là mẫn cảm với bệnh nhất.
2.2.6. Mận
Trong những năm gần đây bệnh đốm đen trên mận (Prunus salicilas) đã làm
giảm lượng thu hoạch một cách đáng kể ở tỉnh Bắc Hà và Mộc Châu. Phytophthora
cactorum được nhận biết là tác nhân gây bệnh. Ở Bắc Hà vào tháng 3 năm 1996, bệnh
gây thiệt hại nghiêm trọng trên 300ha mận làm mất mùa 20%. Suốt những năm 1997
và 1998, bệnh lan rộng ít hơn nhưng mức độ tàn phá thì mãnh liệt hơn, với những
vướn bị đốm đen thì mất mùa trên 50%.
Triệu chứng bệnh trên mận là những điểm úng nước màu trắng xám trên trái
non, phát triển thành những đốm đen trũng với rìa mép màu nâu. Trong vài trường
hợp bệnh nặng, toàn bộ trái bị khô quắt lại và rụng khỏi cây. Những đốm trũng được
bao phủ bởi những sợi nấm trắng trong điều kiện ẩm ướt, P. cactorum được phân lập
từ những đốm đen trong điều kiện này.
Nhiệt độ mát (nhiệt độ ngày 14 – 18
0
C), chênh lệch nhiệt độ ngày đêm cao, ẩm
ướt và có sương mù được xem là điều kiện lý tưởng cho P. catorum lây nhiễm. Do vật
bệnh tăng nhanh vào tháng 3 và đầu tháng 4, chậm dần khi nhiệt độ tăng dần lên gần
cuối tháng. Và cây mận chưa trưởng thành mẫn cảm với bệnh đốm đen hơn cây mận
đã trưởng thành. Vào tháng 3 năm 1998, ở tỷ lệ bệnh trên cây mận hai năm tuổi là
10% trong khi trên cây mận bốn năm tuổi là 2,1%.
2.2.7. Cao su
Trong những năm 1960, bắt đầu có những nghiên cứu quan tâm đến bệnh trên
cao su ở Việt Nam. 19 bệnh ảnh hưởng đến cao su ở Việt Nam, rụng lá, sọc đen và
loét thân gây ra bởi các loài Phytophthora. P. palmivora được phân lập từ khoảng
70% cây cao su bị bệnh sọc đen, trong khi P. botryosa được tìm thấy trên 75 – 80% từ
lá và trái của những cây cao su bị rụng lá. Cả hai loài P. palmivora và P. botryosa
được biết là tác nhân gây bệnh trên cao su ở tất cả các vùng trồng trên đất nước.

10




















2.3. Phát hiện và định danh Phytophthora
Hiện nay để phát hiện Phytophthora, người ta dựa trên nhiều kỹ thuật khác
nhau
2.3.1. Kỹ thuật quan sát những đặc điểm về hình thái của Phytophthora trên môi

trƣờng nuôi cấy
Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử
dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây
bệnh.
Những đặc điểm hình thái làm cơ sở để nhận biết nấm Phytophthora bao gồm:
hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng; hình thái túi bào tử; sự hiện diện của bào
tử vách dày và sợi nấm trương phồng; sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức
hữu tính là cùng tản hay khác tản
Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng;
(1) Loét thân cây ca cao do P.palmivora; (2) Thối rễ tiêu do P.capsici; (3) Tổn
thƣơng thân cà chua do P.infestans; (4) Thối nõn dứa do P.nicotianae



11
Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8
juice, cà rốt agar, lima bean agar.
Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái
đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ
phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường
nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora.
Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài
P. capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự
hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấm
xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi
trường nuôi cấy.
Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Nó không phải là
giải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và
Irwin, 2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng
thời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh học

phân tử. Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định
danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C. Correll. Genetic,
Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of
Soilborne Plant-Pathogenic Fungi)
2.3.2. So sánh sự tƣơng đồng về sinh sản và sinh dƣỡng
Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định
và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kỹ thuật
so sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu
quần thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau không
nhiều về di truyền và cơ chế.
Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó
khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường
thuần khiết; tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhau
của các loài định sẵn có thể không có giá trị; một số cá thể trong quần thể nấm có thể
không có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kì những chủng
kiểm tra đã biết.


12
So sánh về sinh dưỡng, hay thể dị hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm về
mối liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài. Kỹ thuật này đơn giản dựa
vào khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau, nó rất giống với sự đánh
giá những đặc điểm di truyền khác.
Kỹ thuật này được sử dụng như một kỹ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong
các loài nấm, đột biến dinh dưỡng – sinh trưỡng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit ).
2.3.3. Kỹ thuật protein profile
Điện di protein hòa tan trong ứng dụng ở cấp độ loài và dưới loài. Kỹ thuật này
bao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính., phân tách trên gel
polyacrylamide bằng điện di, nhuộm màu để kiểm tra sản phẩm protein phân tách. Kỹ
thuật này được áp dụng trên nhiều giống nấm bệnh có nguồn gốc từ đất (soilborne).

2.3.4. Isozymes
Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các
mẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có
rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Các
enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide, hoặc màng cellulose acetate
cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữa
enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện
diện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ giữa trong cấu hình acid amino có thể thay đổi
trong cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của những
enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhaubao gồm những điều kiện trên sinh vật
như tốc độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch
nhuộm,và chuẩn bị mẫu.
Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian
chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột
2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán
Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có
nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng
để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần
phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các
protein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải


13
với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền
là mô cây hay đất.
Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán và phát hiện
ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay các
chủng đặc biệt.
Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vào
kỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự

cần thiết của các chẩn đoán nhanh và chính xác. Những phát hiện nhanh thường cần
thiết khi điều đó cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệt
nấm. Các kit chuẩn đoán thông thường nhằm cung cấp hai mục đích: chẩn đoán và
nghiên cứu. Câu hỏi được đặt ra là các kit này có hiệu quả như thế nào khi quản lí
bệnh.
2.3.6. Phân tích đa dạng độ dài các đoạn đoạn đƣợc phân cắt (RFLP)
Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng để
xác định mối quan hệ phân loài của nấm. Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau: ly
trích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome; sử dụng enzyme cắt để phân cắt các
đoạn DNA; điện di phân tích các đoạn DNA trên gel agarose; thu hình các đoạn DNA
bằng cách nhuộm với ethidium bromide hoặc chuyển các đoạn DNA sang màng
nitrocellulose hay màng nylon (kỹ thuật Southern blot) và đánh dấu với các probe có
đánh dấu hay không đánh dấu phóng xạ lai với các các đoạn DNA. Blot sau khi lai
được chuyển qua phim rửa hay giấy nhạy cảm với hóa chất. Sự khác nhau về kích cở
các đoạn đa dạng là sự đa dạng di truyền (sự mất đoạn cắt, lặp lại đoạn, hay thêm đoạn
DNA).
Giá cả để thực hiện phản ứng RFLP cao nhưng giá cả sẽ giảm, và ứng dụng
của phản ứng này tăng khi thay thế các probe đánh dấu phóng xạ thành các probe
không đánh dấu. Phân tách RFLP thường dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên
DNA ribosome (rDNA) và DNA ti thể ở mức độ loài hay dưới loài .
2.3.7. Kỹ thuật dùng probe acid nucleic, DNA fingerprinting và Molecular
karyotyping
Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh. Một đoạn
DNA giới hạn được clone dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm
P.parasitica ( Goodwin và cộng sự, 1989). Hiệu quả của các probe acid nucleic khi


14
xác định các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa
dạng di truyền hiện diện trong các loài đã biết.

Một ứng dụng khác của các probe acid nuceic gần đây là việc sử dụng các
probe DNA minisatellite trong kỹ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cộng sự,
1985). Các probe rất nhỏ được sử dụng trên nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo
dỏi phả hệ, chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm.
Minisatellite probe, probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới
loài và cả những dòng clone.( Rodriguez, 1989).
2.3.8. Sự lai DNA-DNA
Sự lai DNA-DNA (DNA-DNA hydridization) được ứng dụng ở một mức độ
giới hạn trong quá trình phân loại nấm bệnh trên. Qui trình thực hiện gồm: tách DNA
của dòng phân lập; trộn với DNA từ chủng khác hay loài khác nhằm mục đích cho
chúng sáp nhập lại; mức độ sáp nhập của chúng phụ thuộc vào sự tương đồng hay
giống nhau giữa các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật này không được sử dụng rộng
rãi bởi vì giá cả của bộ dụng cụ thực hiện thí nghiệm cao, tuy nhiên tỉ lệ tương đồng
giữa các loài thường rất đáng kể.
2.3.9. Kỹ thuật PCR và RAPD
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa
vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác đinh mối quan hệ phát sinh
loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim
và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990). PCR bao gồm enzyme khuếch đại một
trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại
không mã hóa ITS ( Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có
giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài
(Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao
của các loài và các chủng có thể được so sánh. PCR rất có giá trị trong việc xác định ở
mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt.
Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA) được phát triển (William và cộng sự, 1990). RAPD nhằm sử dụng
những cặp mồi khoảng 10 base để nhận ra nhiều đoạn DNA khác nhau trên toàn DNA
sinh vật (đoạn lớn nhất có kích thước khoảng 1kb). Sự xuất hiện, vắng mặt và sự khác
nhau về các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng.