HUONG DAN SỬ DỤNG máy UPLC

QUY TRÌNH SỬ DỤNG MÁY ACQUITY ULPC H-CLASS
1.

Chuẩn bị dung môi

Kênh A: Nước
Kênh B: MeOH
Kênh C: Acetonitril
Kênh D: Hệ đệm (nếu có)
Seal wash: MeOH - H2O (10:90)
Needle wash: MeOH - H2O (90:10)
Yêu cầu


Nước là nước cất 2 lần và các dung môi đệm cần lọc qua màng 0,2 μm (cellulose acetate
hoặc nitrat), nước sử dụng không quá 3 ngày.



Mẫu: cần được lọc qua màng 0,22 μm, màng lọc chịu dung môi pha mẫu.



Acetonitril và MeOH (Merck) nguyên chai thì không cần lọc.



Các đầu lọc không được khô mà luôn cắm ngập trong dung môi. Nếu không dùng máy trong
thời gian dài thì bảo quản trong methanol hoặc acetonitril – nước (9:1).



Chai dung môi phải siêu âm đuổi khí trong 10-15 phút.



Đặt bình vào đúng vị trí, đầu hút dung môi phải ngập trong dung môi.



Khoảng nồng độ phù hợp cho một số acid thông dụng (lưu ý loại cột sử dụng có thể chịu
được khoảng pH bao nhiên)

2.

Chuẩn bị máy

Bật công tắc Máy tính, Quaternary Solvents Manager, Sample Manager, PDA Detector.
Chờ máy khởi động xong.
Khởi động phần mềm ACQUITY console.
2.1.

Prime kênh dung môi sẽ chạy

* Vào Quaternary Solvent Manager  control  prime solvents
1


- Bấm chọn kênh dung môi để prime (có thể chọn lần lượt các kênh hay toàn bộ các kênh cùng lúc)
- Khai báo thời gian (khoảng 2-4 phút), khai báo flow rate (~ 4 ml/p) và bấm Start.
Prime seal wash

2.2.

* Vào Quaternary Solvent Manager  control  prime seal wash
- Máy sẽ tự động prime, rửa trong khoảng 2-4 phút
Wash needle

2.3.

* Vào Sample Manager  Control  Wash needle
3. Những lưu ý chung trong quá trình chạy máy

Cột

3.1.

Cân bằng cột
-

Với pha động không có đệm thì chỉ cần cân bằng cột bằng pha động ít nhất 10 lần thể tích cột.

-

Với pha động có đệm thì phải cân bằng cột bằng pha động có nước với ít nhất 5 lần thể tích cột,
sau đó mới cân bằng bằng pha động có đệm. (ví dụ: 60% MeOH/H2O rồi 60% MeOH/đệm)

-

Bảo quản cột: nên bảo quản cột trong MeOH: H2O (70:30), không nên bảo quản cột trong
dung dịch đệm. nếu chạy đệm thì rửa cột với ít nhất 10 lần nước rồi chuyển dung môi bảo quản.

Chuẩn bị mẫu

4.2.

-

Mẫu cần được lọc qua màng lọc 0,22 μm, lưu ý lựa chọn màng lọc chịu được dung môi pha
mẫu.
Hệ thống bơm

4.3.

-

Phải đảm bảo áp suất Degas luôn nằm dưới ngưỡng 0,9 psi

-

Bơm có thể đảm bảo tốc độ dòng 1 mL/p (ở áp suất 15000 psi) tới 2 mL/p (9000 psi)

2


5.

Khởi động Empower

- Khởi động phần mềm Empower 3 với (user name: system; password: manager)
- Configure the system: Thay đổi cấu hình máy và muốn tạo project mới
- Run sample: Chạy mẫu

- Browse projects: Xem lại mẫu đã chạy

3


6.

Tạo project mới (Configure the system)

Tạo project mới

- Nhấp chọn Configure the System được cửa sổ bên dưới.
1. Tạo Project mới
Vào Menu file > New > Project  khởi tạo một project mới hoặc project con từ project sẵn có.
2. Chọn thư mục mẹ cho project >
Next

4


3. Tablespace: Bỏ chọn FullAudit
Trailsupport > Next

4. Option: Chọn Photo Diode Array và
System Suitability > Next

5. Access Control:
- Chọn Owner only > Next

5

6. Copy selection
Chọn Project để copy những chương trình
vào project của mình. > Next

7. Name Entry
Gõ tên Project vào Project name. > Finish

NHƯ VẬY ĐÃ HOÀN THÀNH XONG BƯỚC TẠO 1 PROJECT MỚI

6


7.

Tạo METHOD SET

Từ cửa sổ Empower 3 chọn Run Samples,
chọn Project  Ok
Màn hình xuất hiện như bên:

Lưu ý: để chạy được mẫu, ban đầu phải có 1 Method set gồm: Instrument method (rất quan trọng),
Processing method và Report method. Method set này có thể có sẵn hoặc được tạo mới.
Vào Menu Edit > New method set > chọn “Yes” nếu bạn muốn tạo 1 method set hoàn toàn mới
hoặc “No” nếu bạn tạo cái mới từ việc edit cái cũ (sẽ đỡ mất thời gian hơn)

Sau khi chọn “Yes”  Xuất hiện hộp thoại New Method set: Select Instrument Method
7.2.

Tạo Instrument method

bằng cách edit cái cũ hoặc create new (ở
trang tiếp theo).

7




Thông số về Detector PDA
Chọn Chương trình cho PDA

Chọn Range bước sóng cần đo



Thông số về hệ thống bơm QSM
Chọn Max Pressure
limit:
< =15.000 psi

Chọn kênh dung môi

Chương trình tốc dộ dòng



Thông số về hệ thống mẫu Sample

manager

Chọn chương trình
rửa kim

8


7.3.

Chọn processing/Report/Export method

Chọn processing có sẵn, edit lại hoặc có thể bỏ
trống bằng cách chọn (No processing / No

Chọn chương trình
nhiệt độ

Reporting/ No Exporting)

Nhập tên của Method set vào ô “Method set
name”
Lưu y: Nên lưu tên của Instrument Method
giống tên của Method set để có thể dễ dàng tìm
kiếm

9


Run samples

8.

Từ hộp thoại khởi động phần mềm Empower 3.0 > Run Sample

Chọn instrument
method để setup

Các thông số cần lưu ý:
Plate/well: nguyên tắc khai báo “Khay:Hàng,cột”. Ví du: 1:D,2

-

Nếu chạy lần đầu thì cần define Plates bằng cách vào edit > plates > Chọn 1 mẫu define phù hợp và
OK.
-

Inject Volumn: thể tích tiêm mẫu, khoảng 0,5 – 10 μl.

-

Sample name: tên mẫu

-

Function: chọn function phù hợp, có thể chọn inject samples nếu chạy mẫu hoặc

equilibrate nếu muốn cân bằng cột.
-

Method set/report method: chọn 1 method phù hợp để chạy.

-

Run time: chọn thời gian chạy tùy vào thời gian đã set chạy trong Instrument method.

-

Lưu tên của Sample set để lần chạy kế tiếp chỉ cần chỉnh sửa danh sách mẫu chạy.

Bấm run: các chế độ chạy:
-

Chạy toàn bộ mẫu của sample set

-

Chạy những mẫu được đánh dấu
10


Nếu muốn dừng chương trình chạy, bấm Stop
Các chế độ: - Dừng ngay lập tức
-

Dừng sau khi chạy hết vial….

Xem kết quả:
(tóm tắt bước cần thiết để xem sắc kí đồ và phổ UV)
Sau khi chạy xong:

-

Prime lại kênh pha đệm với Nước,

-

Rửa cột

-

Tắt đèn

-

Tắt máy

-

Ghi sổ

Nếu cần sự trợ giúp hoặc có sự cố xảy ra đề nghị báo ngay cho người quản lí máy….
9. Xem kết quả và tạo Processing method

Từ hộp thoại khởi động phần mềm Empower 3.0 → Browse Project → chọn Project chứa dữ liệu
muốn xử lý.

Sau khi chọn một Project, sẽ xuất hiện Project window như sau:
11

Chọn tab Injections sẽ xuất hiện các mẫu đã tiêm, hoặc chọn tab Channels để xuất hiện các kênh
(nếu sử dụng nhiều bước sóng trong chương trình chạy 2D).

XEM KẾT QUẢ
Trong tab Channels, chọn mẫu cần xem, nhấn chuột 2 lần, hoặc chọn icon

hay vào Tool →

View. Cửa sổ Review xuất hiện.
Từ khung Extract Choices list in Review, chọn Max Plot để hiện sắc ký đồ ở max plot. Nếu muốn
trích xuất sắc ký đồ ở bước sóng bất kỳ, gõ bước sóng đó vào ô này.

12


Ví dụ: Nếu muốn trích sắc ký đồ ở 254 nm, gõ 254 vào.

13


TẠO PROCESSING METHOD
Chọn mẫu cần tạo Processing method, hộp thoại Review xuất hiện, chọn Icon Processing Method
Wizard.

Hộp thoại Processing Method Wizard xuất hiện, thực hiện theo các bước sau để bắt đầu tạo
Processing method:
* Chú ý: Nên tạo Processing method với mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất. Sau đó mới áp dụng
Processing này với các mẫu có nồng độ cao hơn.
1. Chọn Create a New Processing Method
2. Nhấn OK

3. Trong ô Processing Type, chọn LC
4. Trong ô Intergration Algorithm, chọn ApexTrack
5. Đảm bảo không chọn ô Use Processing Method Wizard
6. Nhấn OK

14


Chọn Create a New
Processing Method

Nhấn OK

Bỏ chọn ô này
Nhấn OK

7. Chọn vùng sắc ký đồ muốn phân tích (integrate) bằng cách nhấn và kéo chuột trên sắc ký đồ
→ nhấn Next

15


8. Đặt Peak Width và Threshold → Next.
Chú ý: Ở bước 4, khi chọn thuật toán phân tích (Intergration Algorithm) là ApexTrack thì
phần mềm sẽ tự động xác định Peak Width và Threshold.

9. Đặt Minimum Area hoặc Minimum Height để loại bỏ những peak không muốn phân tích.
Nhấp chuột vào peak thấp nhất muốn phân tích. Peak sẽ chuyển thành màu đỏ.
Nhấp chuột vào ô Minimum Height/Minimum Area: Giá trị xuất hiện trong ô là 95%
chiều cao/diện tích thật của peak được chọn → Next.

16


10. Chọn các nội dung sau:

- Select the method of quantitation: Area
- Select component information: Amount
- Select the calibration curve fit type: Linear

→ Next

11. Hộp thông báo sau xuất hiện → chọn No

12. Đặt tên cho các peak → Next.

17


13. Chọn External Standard Calibration → Next

18


14. Đặt tên cho Processing Method vừa tạo trong ô Method Name → Finish

Nhấn vào tab Results → Update để hiện các kết quả.

19

10. Cài đặt Processing method đã tạo cho method set

Thực hiện các bước như sau:

Tên của Method set và Processing method xuất hiện trên Method Bar cho biết Processing method
đang được mở.
1. Nhấn vào Method Set tool để xuất hiện các nội dung của Method set
2. Tên của Processing method xuất hiện trong khung Default Processing method
3. Đóng của sổ Method Set
4. Chọn File → Save as → Method Set
* Chú ý: Mặc dù tên của Processing method tự động xuất hiện trong Method set nhưng vẫn phải
lưu lại method set.
11. Kiểm tra tinh khiết peak

Trước khi kiểm tra tinh khiết peak phải tạo Processing method.
1. Trong cửa sổ Review, nhấp vào biểu tượng
xuất hiện cửa sổ Review Main.

hoặc chọn Window → Main window để

2. Nhấp vào biểu tượng
hoặc chọn Process → Apply Method Set để trích xuất và xử lý
kênh được chọn trong Method set đã tạo.
3. Chọn tab Peaks ở phía dưới cửa sổ Review Main để hiện các kết quả tinh khiết peak.
Peak được xem là tinh khiết khi giá trị Purity Angle < Purity Threshold

20

Có nhiều cách để xem kết quả, có thể sử dụng Spectrum Index hoặc xem trong của sổ Results.
 Spectrum Index
1. Hiện Spectrum Index tool: nhấp chuột phải vào toolbar, chọn Spectrum Index; hoặc
chọn View → Toolbar → Spectrum Index.

21


2. Nhấp
(Maximum impurity – Pass 1) để hiện phổ ít tính khiết nhất trong vùng
Spectrum Index. Phổ UV hiện trên vùng này được trích tại vị trí nét đứt trên sắc ký
đồ.

3. Zoom vào từng peak để xem sự trùng khít của phổ UV từ 2 vị trí được trích xuất từ
một peak.

Peak 1
Không trùng khớp

Peak 2
Không trùng khớp

Peak 3
Trùng khớp

 Cửa sổ result
1. Nhấp

hay chọn Windows → Results Window để hiện cửa sổ Results.

22


2. Nhấp vào tab Purity ở khung trên cùng và tab Purity Plot ở khung cuối cùng.
-

Purity Plot sẽ hiện sắc ký đồ của peak đã chọn và các đường thể hiện Purity Angle,
Purity Threshold.

-

Purity sẽ hiện thông tin về độ tinh khiết của các peak. Chọn peak trong khung the Peak
list.

23


-

Để xuất hiện điểm không tinh khiết trên Purity plot, nhấn chuột phải ở Purity Plot,
chọn Properties để mở hộp thoại Plot Properties.

-

Trong tab Purity, chọn Annonate Peak Apex/Max. Impurity

-

Lúc này trong vùng Purity Plot xuất hiện điểm không tinh khiết nhất được đánh dấu
bằng chữ “M”, đỉnh của peak được đánh dấu bằng một đường thẳng vuông góc với

đường nền.

24