Thẩm định quy trình định lượng cafein trong trà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC

O C O THỰC TẬP
ĐỊNH LƯỢNG CAFEIN TRONG TRÀ BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Học viên: Lê Nguyễn Phúc Hiền
Lớp: CH DL-DCT (2017-2019)

TPHCM – 04/2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC

O C O THỰC TẬP
ĐỊNH LƯỢNG CAFEIN TRONG TRÀ BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Cô hướng dẫn: TS. Trần Thị Vân Anh
Học viên: Lê Nguyễn Phúc Hiền
Lớp: CH DL-DCT (2017-2019)

TPHCM – 04/2019

MỤC LỤC


MỤC LỤC ................................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. iii
I.

Quy trình chuẩn bị mẫu. ....................................................................................... 1
1.1.

Mẫu thử (mẫu trà B) ...................................................................................... 1

1.2.

Mẫu chuẩn ..................................................................................................... 2

1.3.

Điều kiện sắc ký ............................................................................................ 2

II.

Các kết quả khi phân tích .................................................................................. 2
2.1.

Kiểm tra độ tinh khiết của chất chuẩn. .......................................................... 2

2.2.

Xây dựng đường thẳng tuyến tính ................................................................. 3

2.3.

Xác định hàm lượng cafein trong mẫu thử.................................................... 5

III.

Kế hoạch thực hiện việc thẩm định quy trình định lượng cafein trong trà ....... 6

3.1.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống ............................................................... 6

3.2.

Tính đặc hiệu ................................................................................................. 7

3.3.

Khoảng tuyến tính ......................................................................................... 8

3.4.

Khảo sát độ lặp lại ....................................................................................... 10

3.5.

Khảo sát độ đúng ......................................................................................... 10

ii


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Quy trình chuẩn bị mẫu thử. ........................................................................ 1
Hình 1.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (nồng độ 500 µg/ml). ................................................ 2
Hình 1.3. Đồ thị đường chuẩn của cafein .................................................................... 4
Hình 1.4. Sắc ký đồ của dãy dung dịch cafein chuẩn. ................................................. 4
Hình 1.5. Sắc ký đồ của của mẫu thử (B2). ................................................................. 6

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Kết quả khảo sát độ tuyến tính .................................................................... 3
Bảng 1.2. Hàm lượng cafein trong mẫu thử ................................................................ 5
Bảng 1.3. Kết quả định tính cafein .............................................................................. 5
Bảng 1.4. Khảo sát tính tương thích hệ thống ............................................................. 7
Bảng 1.5. Khảo sát độ đặc hiệu ................................................................................... 8
Bảng 1.6. Kết quả khảo sát độ tuyến tính .................................................................... 9
Bảng 1.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định lượng cafein ..................... 10
Bảng 1.8. Kết quả khảo sát độ đúng .......................................................................... 11

iii


I.

Quy trình chuẩn bị mẫu.

1.1. Mẫu thử (mẫu trà B)
-

Mẫu trà phơi khô được xay nhuyễn và rây qua rây 0,2 mm.

-

Cân chính xác 100 mg bột trà đã rây cho vào ống nghiệm có nắp vặn,
thêm 10 mL nước sôi, nhúng ống nghiệm vào bếp cách thủy 95 0C trong
vòng 15 phút, sau đó siêu âm ở 40 ℃ trong vòng 15 phút.

-

Để lắng, lọc qua bông, dùng pipet pasteur chuyển dịch chiết vào bình định
mức 25 mL.

-

Tiếp tục chiết thêm 1 lần với điều kiện tương tự.

-

Lần thứ 3 chiết với 5 mL nước và thực hiện các điều kiện chiết như 2 lần
đầu.

-

Bổ sung nước cho đủ 25 mL, lắc đều.

-

Lọc mẫu qua màng lọc 0,22 μm.

Hình 1.1. Quy trình chuẩn bị mẫu thử.

1


1.2. Mẫu chuẩn
Tiến hành pha dung dịch chuẩn: pha 10 ml dung dịch cafein chuẩn trong nước
cất 2 lần có nồng độ là 1 mg/ml (dung dịch A). Từ dung dịch A pha các dung
dịch chuẩn có nồng độ là 500, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml.
1.3. Điều kiện sắc ký
-

Cột sắc kí: Diamonsil.

-

Pha động: H2O : MeOH (65:15) isocratic trong 6 phút, rửa cột với tỉ lệ
H2O: MeOH (10:90) trong 4 phút.

-

Giữa 2 lần chạy cân bằng cột trong 5 phút.

-

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

-

Thể tích tiêm mẫu: 10 μl.

-

Bước sóng phát hiện: 273 nm.

-

Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.

II. Các kết quả khi phân tích
2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của chất chuẩn.
Tiêm dung dịch chuẩn 500 μg/mL với chương trình chạy có bước sóng phát
hiện 200-400 nm.
Thời gian lưu: 5,006
(phút)
Diện
tích
14927678

peak:

Độ tinh khiết: 100%

Hình 1.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (nồng độ 500 µg/ml).

2

2.2. Xây dựng đường thẳng tuyến tính
Tiêm 6 dung dịch chuẩn với dãy nồng độ như trên. Tiến hành xây dựng đường
thẳng tuyến tính.
Bảng 1.1. Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Mẫu
Nồng độ mẫu chuẩn Diện tích peak mẫu
chuẩn
(µg/ml)
chuẩn
1
507
14723817
2
304.2
8955565
3
7517930
253.5
4
126.75
4138680
5
50.7
1524762
6
10.14
345833
Phương trình tuyến tính là: y = 28822x +185440

Độ tương quan: R2 = 0,9991.

Phân tích dữ liệu hồi quy:
Phương trình hồi quy có dạng: y = ax + b


F =4427,689 > F 0,05 nên tồn tại phương trình hồi quy.



P-value của Intercept (tung độ góc b) = 0,186 > 0,05 nên sự tồn tại của b
không có ý nghĩa thống kê.



P-value của X Variable (hệ số góc a) < 0,05 nên sự tồn tại của a có ý nghĩa
thống kê.



Do đó, phương trình hồi quy của cafein chuẩn sẽ là: y = 28822x
3


Hình 1.3. Đồ thị đường chuẩn của cafein

Hình 1.4. Sắc ký đồ của dãy dung dịch cafein chuẩn.
Độ tinh khiết của chất chuẩn đạt 100 %.

4

2.3. Xác định hàm lượng cafein trong mẫu thử.
Tiến hành tiêm các mẫu thử (mẫu trà B).
Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ và diện tích peak cafein chuẩn, tiến hành
tính hàm lượng cafein có trong mẫu trà phân tích.
Phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 28822x
Nồng độ cafein trong mẫu thử (µg/ml) =
Ban đầu cân 100 mg bột trà, chiết và bổ sung đủ 25 ml dung dịch thử, nên hàm
lượng cafein X (µg) trong 1 mg bột trà được tính như sau:
X=

(µg/mg) hay (mg/g)
Bảng 1.2. Hàm lượng cafein trong mẫu thử

Mẫu
tR (phút) Diện tích peak mẫu thử Hàm lượng cafein (mg/g
(B)
(µV*sec)
nguyên liệu khô)
1
4,902
3514384
30,483
2
4,944
3495720
30,322
3
4,962

3495780
30,322
TB
4,936
3501961,333
30,376
Hàm lượng cafein trong mẫu trà B: XB = 30,376 (mg/g)
Vậy trong 100 mg bột trà đem chiết với quy trình này thu được 3,0376 mg
cafein
Nồng độ Cafein trong mẫu trà B: 3,0376 %
Bảng 1.3. Kết quả định tính cafein
Mẫu
Thời gian lưu của peak cafein (phút)
Chuẩn
5,006
B1
4,902
B2
4,944
B3
4,962
Trung bình
4,95 ± 0.043
Kết quả được trình bày trong Bảng 1.3 cho thấy mẫu chuẩn và thử có thời gian
lưu giống nhau, giá trị tR là 4,95 ± 0.043 (phút).

5


Thời gian lưu: 4.944 (phút). Diện tích peak: 3495720. Độ tinh khiết: 99,9 %

Hình 1.5. Sắc ký đồ của của mẫu thử (B2).
III. Kế hoạch thực hiện việc thẩm định quy trình định lượng cafein
trong trà
Các chỉ tiêu điển hình trong thẩm định cần được xem xét:
-

Kiểm tra tính tương thích hệ thống

-

Tính đặc hiệu

-

Tính tuyến tính

-

Độ lặp lại

-

Độ đúng

3.1.

Kiểm tra tính tương thích hệ thống

Mục đích: Thẩm định hệ thống có phù hợp với quy trình hay không.
Tiến hành: tiêm cùng một mẫu cafein (mẫu chuẩn hay mẫu thử đều được) 6

lần vào hệ thống với điều kiện sắc ký đã chọn và ghi nhận sắc ký đồ.
Tổng hợp, ghi nhận các thông số (thời gian lưu và diện tích peak) dựa vào
bảng 1.5. Tính toán kết quả để xét độ lệch của các thông số.

6


Bảng 1.4. Khảo sát tính tương thích hệ thống
Mẫu chuẩn
tR (phút)
Diện tích peak
1
2
3
4
5
6
TB
SD
RSD (%)
Kết quả phân tích cần so sánh: RSD của thời gian lưu và diện tích peak.
Nếu RSD < 2 % thì cho thấy quy trình đạt tính tương thích hệ thống.
3.2.

Tính đặc hiệu

Mục đích: Đánh giá chắc chắn sự có mặt của chất cần phân tích (ở đây là
cafein) khi có sự hiện diện của các thành phần khác có thể có trong mẫu thử.
Tiến hành:
-

Mẫu trắng: Ở đây, quy trình chiết dùng nước cất để chiết cafein trong, mẫu
trắng là dung môi pha mẫu nên mẫu trắng ở đây là nước cất.

-

Mẫu thử: Cân 100 mg bột trà, tiến hành chiết và chuẩn bị mẫu như quy
trình trên.

-

Mẫu chuẩn: dùng dung dịch chuẩn có nồng độ C4 = 126.75 (µg/ml) (mẫu
chuẩn số 4 trong dãy nồng độ dung dịch chuẩn), vì mẫu này có nồng độ gần
giống với nồng độ cafein trong mẫu thử. Nếu muốn pha loãng (trong các
trường hợp khác có chênh lệch nhiều) thì tiến hành như sau:

Trong 100 mg bột trà (mẫu B) đem chiết với quy trình này thu được 3,0376 mg
cafein, có nồng độ =

=

= 121,503 (µg/ml)

Vậy tiến hành pha mẫu chuẩn có nồng độ là 121,503 (µg/ml) bằng cách pha
loãng từ dung dịch chuẩn có nồng độ C4 = 126.75 (µg/ml) (mẫu chuẩn số 4
trong dãy nồng độ dung dịch chuẩn) bằng bình định mức 5 ml.

7

V4 = (121,503*5)/126,75 = 4,793 (ml).
Lấy 4,793 ml dung dịch chuẩn (mẫu 4) cho vào bình định mức 5 ml, thêm nước
cất đến vạch, ta có được mẫu chuẩn có nồng độ 121,503 (µg/ml).
-

Mẫu thử thêm chuẩn: Thường để thấy sự chênh lệch về diện tích peak rõ
ràng, ta sẽ thêm một lượng chất chuẩn gấp đôi lượng chất cần định lượng (ở
đây là cafein) có trong mẫu thử  thêm 1ml dung dịch mẫu chuẩn có nồng
độ 507 (µg/ml) (mẫu 1) vào 2 ml dung dịch mẫu thử có nồng độ 121,503
(µg/ml)  thu được dung dịch mẫu thử thêm chuẩn có nồng độ là 250
(µg/ml) (đáp ứng yêu cầu)  lọc, chuẩn bị tiêm mẫu vào hệ thống.

Tiến hành tiêm và chạy mẫu trắng, mẫu cafein chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm
chuẩn vào hệ thống với cùng điều kiện phân tích đã chọn ban đầu.
Ghi nhận kết quả theo bảng 1.6. So sánh peak của mẫu trắng với peak của mẫu
chuẩn, so sánh diện tích peak của mẫu chuẩn, mẫu thử, và mẫu thử thêm
chuẩn. So sánh thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử.
Bảng 1.5. Khảo sát độ đặc hiệu
STT Mẫu

tR (phút)

Diện
peak

tích

Mẫu trắng (dung môi: nước
cất)
2

Chuẩn
3
Thử
4
Thử thêm chuẩn
Kết quả phân tích cần đạt các điều kiện sau: mẫu trắng không có peak trùng
1

với peak cafein chuẩn. Mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn có thời
gian lưu giống nhau. Mẫu thử thêm chuẩn do nồng độ tăng lên nên có diện tích
peak lớn hơn diện tích peak của mẫu chuẩn.
3.3.

Khoảng tuyến tính

Chuẩn bị dãy nồng độ dung dịch chuẩn: 500 µg/ml, 300 µg/ml, 250 µg/ml,
125 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml; tiến hành phân tích với hệ thống HPLC.

8


Ghi nhận các thông số theo bảng 1.7. Từ các thông số: nồng độ mẫu chuẩn
(µg/ml) và diện tích peak (µV*sec). Dùng phần mềm excel xuất phương trình
hồi quy tuyến tính và giá trị R2.
Bảng 1.6. Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Mẫu Nồng độ mẫu chuẩn Diện tích peak (µV*sec)
(µg/ml)
1
2
3

4
5
6
Nhận xét: với giá trị R2 nằm trong khoảng giới hạn 0,9995 ≤ R2 ≤ 1 cho thấy
có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak.
Giới hạn phát hiện: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu co thể
phát hiện được nhưng chưa định lượng được.
LOD co thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn
của tín hiệu đo (diện tích peak mẫu chuẩn).
LOD =

(SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu; a: độ dốc của đường chuẩn).

Giới hạn định lượng: là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà
phương pháp kiểm nghiệm có thể xác định được với độ chính xác và độ đúng
cho phép.
LOQ =

(SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu; a: độ dốc của đường chuẩn).

LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu
đường nền.
Ngoài ra, có thể tính giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện bằng cách lấy
mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất, đi pha loãng nhiều lần. Rồi tiến hành chạy
máy như điều kiện ban đầu và kiểm tra xem ở nồng độ nào thì tín hiệu
peakchuẩn này có tỉ lệ với đường nền bằng 1/3 đối với định tính và bằng 1/10
đối với định lượng, sau đó ghi nhận lại thông số nồng độ.
9

3.4.

Khảo sát độ lặp lại

Tiêm 6 mẫu thử khác nhau được chuẩn bị theo quy trình vào hệ thống HPLC.
Ghi nhận kết quả theo bảng 1.8.
Bảng 1.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định lượng cafein
Khối lượng cân tR (phút)
mẫu thử (mg)

Mẫu

Diện tích peak
(µV*sec)

1
2
3
4
5
6
Trung bình
RSD
Nhận xét giá trị RSD, nếu RSD < 2 % quy trình nghiên cứu đạt độ lặp lại.
3.5.

Khảo sát độ đúng

Chuẩn bị 9 mẫu thử, tính toán lượng chuẩn cần thêm vào mẫu thử với các tỷ lệ
lần lượt là 80%, 100%, 120%, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần trong cùng

điều kiện khảo sát.
Tính toán lượng chuẩn cần thêm:
Hàm lượng cafein trong mẫu thử = 121,503 (µg/ml)
Trong 100 mg bột trà đem chiết với quy trình này thu được 3,0376 mg cafein
Giả sử quy trình này đạt độ lặp lại, ta có được hàm lượng cafein trung bình
trong mẫu thử là 3,0376 %.
-

Lượng chất chuẩn cần thêm (80 %) = 3,0376 * 80 % = 2,43 mg.

-

Lượng chất chuẩn cần thêm (100 %) = 3,0376 * 100 % = 3,0376 mg

-

Lượng chất chuẩn cần thêm (120 %) = 3,0376 * 120 % = 3,645 mg

Để có lượng chất chuẩn thêm vào mẫu thử, ta tiến hành pha dung dịch mẫu
chuẩn có nồng độ 3,0376 (mg/ml). Thêm lần lượt 0,8 ml (tương ứng 80 %), 1
ml (tương ứng 100 %), 1,2 ml (tương ứng 120 %) vào 100 mg mẫu bột trà rồi
tiến hành chiết xuất theo quy trình ở trên.
10


Tiến hành tiêm và chạy 9 mẫu này với điều kiện sắc ký đã chọn ban đầu.
Xác định tỷ lệ hồi phục (%) (hàm lượng chuẩn thực tế / hàm lượng chuẩn lý
thuyết) khi tính toán lượng chuẩn cần thêm vào mẫu thử với các tỷ lệ lần lượt
là 80 %, 100 %, 120 %, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần trong cùng điều
kiện khảo sát. Ghi nhận kết quả theo bảng 1.9.

Bảng 1.8. Kết quả khảo sát độ đúng
Phép
thử

% thêm Diện
vào
tích
peak
80 %

mchuẩn lý mchuẩn tìm Tỷ lệ hồi Trung
RSD
thuyết
thấy thực phục
bình (%) (%)
(mg)
tế (mg)
(%)
2,43

1
2
3
4
100 %
3,0376
5
6
7
120 %

3,645
8
9
Trung bình tỷ lệ hồi phục (%)
Kết quả phân tích cần đạt các yêu cầu sau: trong tất cả các lần thử RSD < 5 %
và tỷ lệ hồi phục trung bình của phương pháp nằm trong giới hạn cho phép 95
% – 105 %. Từ đó kết luận phương pháp đạt độ đúng.

11