Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus fermentum bằng phương pháp sấy phun hỗ trợ quá trình lên men ca cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN
Lactobacillus fermentum BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẤY
PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO

Họ và tên : Đào Thị Minh Nguyệt
Ngành

: Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm và dinh dƣỡng ngƣời

Niên khóa : 2013 – 2017

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 05 năm 2017


NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN
Lactobacillus fermentum BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẤY
PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO

Tác giả
ĐÀO THỊ MINH NGUYỆT

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm và dinh dưỡng người

Giáo viên hướng dẫn:

TS. DƢƠNG THỊ NGỌC DIỆP
TS. VŨ THỊ LÂM AN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 05 năm 2017



LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi
đã nhận được sự giúp đỡ tận tình từ quý thầy cô, các anh chị và bạn bè.
Đầu tiên, tôi xin cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa cùng quý thầy cô trong khoa Công nghệ thực phẩm đã
trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản trong suốt 4 năm học. Những kiến thức này là
nền móng vững chắc để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu và phục vụ cho
công việc trong thời gian tới.
Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến TS. Dương Thị Ngọc Diệp và TS. Vũ Thị Lâm
An đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành đề tài. Cảm ơn các thầy cô, anh chị và tập thể mọi người trong phòng Thực
Hành Vi Sinh, phòng Kỹ Thuật Thực Phẩm khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại
học Nông Lâm đã giúp đỡ về cơ sở vật chất, trang thiết bị và chỉ bảo tôi khi thực hiện
đề tài nghiên cứu tại đây.
Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ tôi để
tôi có thể hoàn thành đề tài này.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người.
Thành phố Hồ Chí Minh tháng 05 năm 2017

Đào Thị Minh Nguyệt

i

TÓM TẮT
Lactobacillus fermentum đã được phân lập từ hạt ca cao lên men. Vi khuẩn này
được đánh giá là có tác động tốt đối với chất lượng hạt ca cao sau lên men. Việc bổ
sung giống khởi động có ý nghĩa đối với quá trình lên men ca cao, nhằm hạn chế và
khắc phục tác động của một số điều kiện ảnh hưởng không tốt đối chất lượng hạt ca
cao sau lên men. Nhằm thuận tiện cho việc bổ sung giống khởi động trong lên men
thực phẩm, các loại chế phẩm vi sinh thường được sử dụng để thay thế cho sinh khối
tươi. Sấy phun là một trong những phương pháp vi bao tạo các chế phẩm vi sinh đã và
đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất các loại chế phẩm vi
bao hiện nay.
Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích tạo ra chế phẩm vi bao vi khuẩn
Lactobacillus fermentum bằng phương pháp sấy phun tạo điều kiện thuận lợi cho việc
bổ sung giống khởi động hỗ trợ quá trình lên men ca cao đạt hiệu quả. Quá trình thực
hiện bao gồm 5 thí nghiệm nhằm xác định loại chất vi bao (tinh bột acetate và
maltodextrin), tỉ lệ chất vi bao (10%, 15%, 20% và 25%), và nhiệt độ sấy phun đầu
vào (100 oC, 110 oC, 120 oC và 130 oC) thích hợp với L. fementum, đảm bảo khả năng
sống sót sau khi sấy phun. Đồng thời, xác định tỉ lệ sống sốt của vi khuẩn sau 30 ngày
bảo quản. Cuối cùng so sánh khả năng sinh acid lactic của chế phẩm sau 30 ngày bảo
quản với sinh khối tươi khi được bổ sung vào quá trình lên men ca cao và ca cao lên
men tự nhiên trong quy mô phòng thí nghiệm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tiến hành vi bao L. fermentum với dịch tạo
màng chứa 20% maltodextrin, nhiệt độ sấy phun đầu vào là 100 oC thì tỉ lệ sống sót
của vi khuẩn đạt 25,76%. Sau 30 ngày được bảo quản tại 4±1 oC, tỉ lệ sống sót của
L. fermentum trong chế phẩm là 76,71%. Khi bổ sung chế phẩm sau 30 ngày bảo quản
và sinh khối tươi vào quá trình lên men ca cao, sau 3 ngày hàm lượng acid lactic trung
bình trong hạt ca cao lên men tương đương nhau lần lượt là 0,645% và 0,654% (không
có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê, p < 0,05). Như vậy, chế phẩm tạo thành có
thể thay thế cho sinh khối tươi trong việc bổ sung giống khởi động trong quá trình lên

men ca cao.

ii


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................vi
DANH SÁCH HÌNH ẢNH ......................................................................................... vii
DANH SÁCH BẢNG BIỂU ...................................................................................... viii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu đề tài ........................................................................................................2
1.3 Nội dung đề tài .......................................................................................................2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
2.1 Tổng quan về ca cao ............................................................................................... 3
2.1.1 Giới thiệu .........................................................................................................3
2.1.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tươi ..........................................................4
2.1.3 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men .............................................................5
2.1.4 Những biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao .........................................7
2.2 Vi khuẩn lactic .......................................................................................................8
2.2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic ...........................................................................8
2.2.2 Lactobacillus fermentum ...............................................................................10
2.3 Vi bao và phương pháp sấy phun .........................................................................11
2.3.1 Giới thiệu .......................................................................................................11
2.3.2 Phương pháp sấy phun ...................................................................................12
2.3.2.1 Nguyên lý của quá trình sấy phun ...........................................................12

2.3.2.2 Cấu tạo hệ thống sấy phun ......................................................................12
2.3.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp sấy phun .............................. 14
2.3.3 Một số vật liệu vi bao ....................................................................................15
2.3.3.1 Gelatin .....................................................................................................15
iii


2.3.3.2 Alginate ...................................................................................................15
2.3.3.3 Xanthan gum ...........................................................................................16
2.3.3.4 Tinh bột acetate .......................................................................................16
2.3.3.5 Maltodextrin ............................................................................................ 17
2.3.3.6 Whey protein ...........................................................................................18
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 19
3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu ............................................................................19
3.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 19
3.2.1 Nguyên liệu ....................................................................................................19
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị .........................................................................................19
3.2.3 Hóa chất sử dụng ...........................................................................................20
3.3 Nội dung thí nghiệm............................................................................................. 21
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp .........................................22
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất vi bao trong dung dịch
sấy phun đến khả năng sống sót của L. fermentum sau khi sấy phun .....................23
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến sự sống sót của
L. fermentum sau khi sấy phun ...............................................................................24
3.4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót của L. fermentum trong thời gian bảo quản chế
phẩm........................................................................................................................25
3.4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic của chế phẩm ............25
3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu............................................................ 26
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................27
4.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp cho vi khuẩn L. fermentum ..27

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất vi bao trong dung dịch sấy
phun đến khả năng sống sót của L. fermentum sau khi sấy phun .............................. 28
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến sự sống sót của L.
fermentum sau khi sấy phun .......................................................................................30
4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót của L. fermentum trong thời gian bảo quản chế phẩm
....................................................................................................................................32
4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic của chế phẩm ...................33
4.6 Kích cỡ và cấu trúc bề mặt hạt chế phẩm ............................................................ 34
iv


Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................37
5.1 Kết luận ................................................................................................................37
5.2 Kiến nghị ..............................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................38
PHỤ LỤC .....................................................................................................................43

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ctv

Cộng tác viên

PTNT

Phát triển nông thôn

LM

Lên men

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TN

Thí nghiệm

TNHH

Trách nhiệm hữu hạn

TP. HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

MD

Maltodextrin

TB

Tinh bột

rpm

Tốc độ ly tâm (vòng/phút)

μm

micromet

mg

miligam

ml

mililit

g

gam

ha

hecta

vi


DANH SÁCH HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Cây cao cao .................................................................................................... 3
Hình 2.2 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men ........................................................... 6
Hình 2.3 Biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao ................................................... 7
Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lạc và kết quả nhuộm gram của L. fermentum .................. 10

Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo máy sấy phun ........................................................ 13
Hình 2.6 Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic ........................................................... 14
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm sấy phun dịch vi khuẩn Lactobacillus fermentum
...................................................................................................................................... 21
Hình 4.1 Tỉ lệ sống sót của L. fermentum, ẩm độ của, hiệu suất thu hồi chế phẩm khi
sử dụng TB acetate và MD làm chất vi bao. ............................................................... 27
Hình 4.2 Tỉ lệ sống sót của L. fermentum, ẩm độ, hiệu suất thu hồi của chế phẩm khi
thay đổi tỉ lệ MD bổ sung vào dịch sấy phun. .............................................................. 29
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đối với khả năng sống sót của L. fermentum
sau khi sấy phun, ẩm độ và hiệu suất thu hồi chế phẩm............................................... 31
Hình 4.4 Mật độ vi khuẩn L. fermentum trong chế phẩm sau 30 ngày bảo quản lạnh ...
...................................................................................................................................... 32
Hình 4.5 Vi ảnh SEM của Maltodextrin, chế phẩm sấy tại 100 oC ở ngày thứ 1 và
ngày thứ 30 được bảo quản lạnh................................................................................... 35
Hình 4.6 Vi ảnh SEM của mẫu chế phẩm khi sấy ở 100 oC và 130 oC. ...................... 36
Hình PL 2 Mật độ vi khuẩn L. fermentum khi nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng
trong 32 giờ................................................................................................................... 44

vii


DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi ............... 4
Bảng 4.1 Kết quả hàm lượng acid lactic sau 3 ngày lên men ca cao. .......................... 33
Bảng PL 6.1.1 Mật độ vi khuẩn L. fermentum trước và sau khi sấy phun khi thay đổi
vật liệu vi bao. .............................................................................................................. 47
Bảng PL 6.1.2 Ẩm độ và hiệu suất thu hồi của chế phẩm vi bao khi thay đổi vật liệu vi
bao. ............................................................................................................................... 47
Bảng PL 6.2.1 Mật độ vi khuẩn L. fermentum trước và sau khi sấy phun khi thay đổi tỉ

lệ maltodextrin bổ sung. ............................................................................................... 48
Bảng PL 6.2.2 Ẩm độ và hiệu suất thu hồi của chế phẩm vi bao khi thay đổi tỉ lệ
maltodextrin bổ sung. ................................................................................................... 49
Bảng PL 6.3.1 Mật độ vi khuẩn L. fermentum trước và sau khi sấy phun khi thay đổi
nhiệt độ sấy đầu vào. .................................................................................................... 50
Bảng PL 6.3.2 Ẩm độ và hiệu suất thu hồi của chế phẩm vi bao khi thay đổi nhiệt độ
sấy đầu vào. .................................................................................................................. 51
Bảng PL 6.4.1 Kết quả chuẩn độ acid hạt ca cao lên men (% acid lactic) .................. 52

viii


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, cây ca cao đã trở thành cây trồng chuyên canh ở nhiều vùng của nước
ta. Tuy nhiên, các nông hộ chỉ tập trung nghiên cứu kỹ thuật nâng cao năng suất cây
trồng, các vấn đề về kỹ thuật lên men nhằm nâng cao và ổn định chất lượng hạt ca cao
còn nhiều hạn chế. Hiện nay, quá trình lên men cao cao diễn ra một cách tự nhiên,
nhưng do điều kiện thời tiết, khí hậu cũng như hệ vi sinh vật trong quá trình lên men
mà thành phần, chất lượng hạt ca cao có thể bị thay đổi, quá trình lên men không ổn
định: hạt ca cao lên men thường có hàm lượng acid cao, chất lượng liquor (nguyên liệu
làm chocolate) bị đánh giá là chua. Trong nghiên cứu của Schwan và Wheals (2004);
Vương Thanh Tùng (2006) đã có kết luận về ảnh hưởng lớn của điều kiện thời tiết
trong quá trình lên men đến chất lượng hạt ca cao sau lên men và chất lượng của các
sản phẩm chế biến từ ca cao. Hạt ca cao lên men trong điều kiện tự nhiên có chất
lượng chấp nhận được nhưng không đồng đều giữa các lớp trong khối ủ và giữa các
mẻ lên men.
Quá trình lên men ca cao là sự phân hủy lớp cơm nhầy ca cao bởi phức hợp vi
sinh vật. Quá trình này ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng của hạt ca cao và các sản

phẩm sau này. 3 giống nấm men: Hanseniaspora, Saccharomyces và Brettanomyces; 2
giống nấm mốc: Rhizopus và Aspergillus; 4 giống vi khuẩn acid lactic: Leuconostoc,
Streptococcus, Lactococcus và Lactobacillus; 1 giống vi khuẩn acid acetic:
Acetobacter hiện diện trong quá trình lên men ca cao đã được định danh bởi Ngô Thị
Phương Dung và ctv (2012). Trong đó vi khuẩn lactic được xác định là hầu như có mặt
trong suốt thời gian lên men ca cao. Đã có nhiều nghiên cứu ngoài nước về các điều
kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men ca cao tự nhiên cũng như việc bổ sung giống
khởi động trong lên men ca cao. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về việc bổ sung

1


giống khởi động trong quá trình lên men ca cao vẫn còn hạn chế, đặc biệt là bổ sung vi
khuẩn lactic.
Việc bổ sung giống khởi động trong các sản phẩm lên men đã và đang được ứng
dụng một cách rộng rãi. Các giống khởi động này có thể là chủng vi sinh vật tươi hoặc
các chế phẩm có chứa vi sinh vật. Tuy nhiên, để thuận tiện cho việc lưu trữ, bảo quản
các chủng vi sinh vật cũng như thuận tiện cho việc ứng dụng trong quy mô sản xuất
lớn, người ta thường sử dụng các loại chế phẩm đã được sản xuất từ trước. Vi bao là
một công nghệ thuận lợi cho việc lưu trữ và cung cấp các chủng vi khuẩn. Trong số
các kỹ thuật vi bao, sấy phun dường như là một lựa chọn tốt cho sản xuất quy mô lớn
các chế phẩm dạng bột có chứa các chủng vi khuẩn với độ ẩm thấp. Tính ổn định của
các chủng vi khuẩn trong chế phẩm cao hơn các chủng đông lạnh hoặc tươi (Zhao và
ctv, 2008; Peighambardoust và ctv, 2011) và có khả năng lưu trữ ở nhiệt độ phòng
(Chávez và Ledeboer, 2007; Oliveira và ctv, 2007).
Nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng giống khởi động, hỗ trợ, nâng cao
hiệu quả của quá trình lên men ca cao, đề tài “Nghiên cứu chế phẩm vi bao vi khuẩn
Lactobacillus fermentum bằng phương sấy phun nhằm hỗ trợ quá trình lên men ca
cao” được tiến hành.
1.2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu tạo chế phẩm vi bao chứa vi khẩn Lactobacillus fermentum bằng
phương pháp sấy phun. Từ đó, bước đầu khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm đến hạt ca
cao lên men nhằm định hướng lâu dài trong việc ứng dụng chế phẩm hỗ trợ việc bổ
sung giống khởi động giúp quá trình lên men ca cao đạt hiệu quả.
1.3 Nội dung đề tài
Để hoàn thành mục tiêu đề ra, quá trình thực hiện đề tài bao gồm các nội dung:
- Xác định vật liệu chất mang thích hợp đối với vi khuẩn L. fermentum và tỉ lệ
chất mang thích hợp.
- Khảo sát nhiệt độ đầu vào thích hợp đối với vi khuẩn L. fermentum trong quá
trình sấy phun.
- Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic của chế phẩm đối với hạt ca cao khi lên
men ở quy mô phòng thí nghiệm.
2


Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về ca cao
2.1.1 Giới thiệu
Cây ca cao có tên khoa học là Theobroma cacao thuộc chi Thebroma cacao L họ
Sterculiaceae, có nguồn gốc từ những cánh rừng mưa Amazon. Tuy nhiên cây ca cao
hoang dại được phát hiện cách đây khoảng 3000 năm tại Trung Mỹ và Mexico.

Hình 2.1 Cây cao cao
Theo báo điện tử Bộ Nông nghiệp và PTNT (2015), từ năm 2004, nước ta đã có
chương trình phát triển diện tích trồng cây ca cao 50.000 ha đến năm 2020, trong đó
diện tích cây cho trái là 42.000 ha với năng xuất trung bình 1,2 tấn/ha. Từ khi có chủ
chương của Nhà nước, diện tích trồng ca cao tăng từ 1.218 ha (năm 2004) lên trên
20.000 ha (năm 2011), thu hút tổng số nông dân tham gia khoảng 35.000 người.
Theo ông Nguyễn Vinh Thành, chuyên gia phân tích về ca cao của tập đoàn

Cargill tại Hà Lan, sản lượng ca cao toàn cầu những năm qua không tăng nhiều do bất
ổn ở những nước sản xuất ca cao hàng đầu như Bờ Biển Ngà bị giảm sản lượng
khoảng 38%, Ghana giảm khoảng 19%... Trong khi đó, nhu cầu sử dụng hạt ca cao
trên thế giới vẫn tăng, dẫn đến tình trạng cung không đủ cầu, đặc biệt là các nước như
3


Brazil, Nga, Ukraina… Có thể nói, đây là cơ hội cho Việt Nam phát triển diện tích và
sản lượng ca cao.
Ông Nguyễn Văn Hoà, phó cục trưởng cục trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và PTNT)
cho biết, cây ca cao ở Việt Nam đã khôi phục và phát triển từ khi có sự hỗ trợ của dự
án quốc tế Success alliance từ vài chục ha năm 2000 tăng lên 7.320 ha năm 2006, tăng
lên 11.400 ha vào cuối năm 2007 và dự kiến đến 2015 đạt 60.000 ha. Trong đó, có gần
1.000 ha đang cho thu hoạch, năng suất ban đầu đạt bình quân 0,8 tấn/ha, ước tính sản
lượng đạt 773 tấn. Nhiều mô hình trồng ca cao đạt năng suất từ 1,5 tấn đến hơn 2 tấn
hạt khô/ha như: hộ ông Trần Hùng Sơn, xã Phú Đức, huyện Châu Thành (Bến Tre), hộ
ông Đào Văn Tuấn, xã Dăk Rla, huyện Đăkmil (Đăk Nông).
2.1.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tƣơi
Thành phần cấu tạo của quả ca cao gồm có: vỏ quả và cùi trụ chiếm 60% và hạt
tươi chiếm 40% khối lượng quả, trong đó khoảng 0,2% là lớp cơm nhầy bao quanh hạt
ca cao. Bảng 2.1 thể hiện thành phần của hạt ca cao tươi.
Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi
Thành phần
Nước
Chất béo (bơ ca cao)
Carbohydrate
+ Cellulose
+ Tinh bột
+ Pentosan
+ Sucrose

+ Glucose
+ Fructose
Nitrogen
+ Protein
+ Theobromine
+ Enzyme
Polyphenol
Acid citric, acetic,
oxalic
Muối khoáng
Tổng số

Chất nhầy
(Mucilage/Sweating)
84,5
-

Vỏ hạt
(Shell/Testa)
9,4
3,8

Phôi nhũ
(Cotyledon/Kernel)
35
31,3

2,7
0,7
10,0

13,8
46,0
-

3,2
4,5
4,9
1,1

0,6
0,7

18,0
0,8
-

8,4
2,4
0,8
5,2
0,6

0,8
100

8,2
100

4

2,6
100
(Hardy, 1960)


Nhìn chung, nước và glucose chiếm chủ yếu trong lớp cơm nhầy ca cao. Thành
phần chủ yếu của vỏ hạt là tinh bột. Trong phôi nhũ, chứa khá nhiều thành phần. Bao
gồm cả theobromine, polyphenol và enzyme mà ở phần cơm nhầy và vỏ hạt hầu như
không có.
2.1.3 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men
Trong quy trình sản xuất hạt ca cao lên men, lên men là một trong những giai
đoạn quan trọng nhất, nhằm thủy phân phần cơm bao bọc xung quanh hạt và làm chết
mầm hạt ca cao. Tại giai đoạn này các phản ứng sinh hóa diễn ra mãnh liệt để giảm vị
đắng, chát, tạo ra tiền chất cho hương vị chocolate (amino acid, đường khử,
polyphenol…), bên cạnh đó còn tạo ra các nguyên liệu cho quá trình biến đổi sinh hóa
về chất lượng trong các giai đoạn phơi sấy, bảo quản, rang và chế biến chocolate. Hình
2.2 mô tả khái quát về quy trình sản xuất hạt ca cao lên men tự nhiên.

5


Quả ca cao

Bỏ vỏ

Tách hạt

Ủ hạt ca cao

Lên men

Làm khô

Phân loại

Hạt ca cao
đã LM

Hình 2.2 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men
Theo Schwan và ctv (2004), lớp cơm nhầy hạt ca cao là môi trường thích hợp cho
sự phát triển của vi sinh vật bởi nó chứa 82-87% nước, 10-15% đường, 2-3%
pentosan, 1-3% acid citric, 1-1,5% pectin. Chính vì vậy, ngay từ khi bóc vỏ quả, lớp
cơm nhầy đã nhiễm nhiều loại vi sinh vật. Nhìn chung, quá trình lên men hạt ca cao là
một chuỗi các quá trình lên men nối tiếp nhau thể hiện qua sự biến động về mật độ của
một số nhóm vi sinh vật mà chủ yếu là nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic.

6


2.1.4 Những biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao
Lên men ca cao xảy ra qua hai giai đoạn chính:
 Giai đoạn 1: lên men lớp nhầy bao quanh hạt làm cho đường chuyển thành
rượu và acid. Trong giai đoạn này lớp nhầy được lên men nhờ vào các vi
sinh vật làm cho lớp nhầy bị phân hủy, từ đó không khí xâm nhập vào khối
ca cao.
 Giai đoạn 2: lượng acid tạo thành thấm vào bên trong hạt ca cao gây ra các
phản ứng sinh hóa, làm giảm vị đắng chát, tạo thành các tiền chất, hương vị
cho ca cao.

Hình 2.3 Biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao
Bắt đầu quá trình lên men là quá trình phân giải yếm khí lớp cơm nhầy chứa
10-15% đường, 1,5% peptin và pH thấp, tạo điều kiện cho nấm men phát triển mạnh.
Trong 48 giờ đầu của quá trình lên men yếm khí không bắt buộc, các phản ứng sinh
hóa chủ yếu là chuyển hóa đường trong cơm nhầy thành C2H5OH, CO2, năng lượng và
một số sản phẩm khác nhờ nấm men.
Sự chuyển hóa trên tạo điều kiện yếm khí cho phép sự phát triển của các vi khuẩn
Lactobacillus, chủ yếu là L. plantarum, L. collinoides và L. fermentum, các vi khuẩn
7


này cũng tham gia vào quá trình phân hủy đường trong cơm nhầy. Sản phẩm tạo thành
là acid lactic (theo con đường lên men đồng hình), tạo acid lactic, acid acetic và một số
acid hữu cơ khác (theo con đường lên men dị hình). Vi khuẩn acetic oxy hóa C2H5OH
tạo acid acetic.
Các acid sinh ra nhiều, nồng độ C2H5OH cao và nhiệt độ cao sẽ ức chế sự phát
triển của nấm men, phá vỡ thành tế bào, diệt chết phôi mầm. Sau khi phôi mầm chết
một số enzyme như lipase, protease…, có trong phôi mầm sẽ di chuyển vào bên trong
nội nhũ, trong nội nhũ có 2 loại tế bào quan trọng là tế bào dự trữ chất béo, protein và
tế bào chứa các hợp chất polyphenolic và methylxanthine (là sự kết hợp của
theobromine và caffeine). Khi thành tế bào bị phá vỡ, thì các hợp chất bên trong có
điều kiện tiếp xúc với nhau, dưới tác dụng của enzyme thì các phản ứng sinh hóa đã
xảy ra, sản phẩm của quá trình sinh hóa này là amino acid, đường khử, polyphenol, sau
đó các hợp chất này kết hợp với nhau thông qua phản ứng Maillard, phản ứng Caramel
hóa hình thành hương vị đặc trưng chocolate (Stephen, 2009 - Trích dẫn bởi Nguyễn
Tiến Thành, 2014).
Trong quá trình lên men, polyphenol bị oxy hóa tạo ra sắc tố nâu trong ca cao.
Các anthocyanin nhanh chóng thủy phân tạo cyanidin và đường dưới tác dụng của
enzyme glucosidase để tạo nên màu nâu của quinnon. Theo Schwan và ctv (1995), sau
lên men các hợp chất trên còn lại 20%, có lợi đối với sức khỏe con người.

2.2 Vi khuẩn lactic
2.2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Năm 1857, Louis Pasteur đã chứng
minh rằng việc lên men sữa là kết quả hoạt động của nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là
vi khuẩn lactic. Năm 1887, Joseph Lister phân lập thành công loài vi khuẩn lactic
thuần khiết đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Streptococcus
lactis).
Vi khuẩn lactic ít gặp trong đất và nước, thường phát triển trong môi trường có
chất hữu cơ phức tạp như sữa và các sản phẩm từ sữa, thịt và các sản phẩm từ thịt,
trong bia, rượu vang và trong rau quả muối chua... Ngoài ra vi khuẩn lactic còn được
tìm thấy trên da, nước bọt, niêm mạc và hệ tiêu hóa của người và một số động vật.
8


Theo Kiều Hữu Ảnh (2010), hiện nay các loài vi khuẩn thuộc 12 chi được xếp
vào nhóm vi khuẩn lactic do khả năng tạo thành một lượng lớn acid lactic từ hydrate
carbon. Trong đó, các loài thuộc 5 chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, Lactococcus được sử dụng làm giống khởi động trong quá trình lên
men thực phẩm. Một số đặc điểm của các chi này được mô tả bởi Vos và ctv (2009):
 Lactobacillus: gồm một nhóm không đồng nhất của các vi khuẩn hình
que Gram dương, tế bào thay đổi từ trực khuẩn rất ngắn đến rất dài, thường
không di động, không sinh bào tử, kỵ khí bắt buộc. Nhiệt độ sinh trưởng dao
động từ 2-50 oC, nhiệt độ tối ưu thường là 30-40 oC. pH tối ưu thường từ
5,5-6,2.
 Leuconostoc: tế bào có hình cầu thường kéo dài, xếp thành cặp hoặc
chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt
buộc. Mặc dù có thể sinh trưởng ở pH 4,5 nhưng các loài thuộc chi này không
ưa acid, thích pH trung bình ban đầu là 6,5. Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là
20-30 oC, nhưng có thể phát triển ở 5 oC.
 Pediococcus: là vi khuẩn Gram dương. Các tế bào của các đại diện điển

hình không di động, thỉnh thoảng có hình trứng và chia thành các cặp hoặc
chia theo hai hướng vuông góc tạo thành bốn tế bào một nhưng không bao giờ
xếp thành chuỗi. Tăng trưởng ở pH 5 và không tăng trưởng ở pH 9, ngoại trừ
Pediococcus stilesii. Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 25-35 oC, nhưng phụ
thuộc vào loài.
 Streptococcus: tế bào thường có hình cầu hoặc hình bầu dục, có đường
kính dưới 2 μm, xếp theo chuỗi hoặc theo cặp khi nuôi trong môi trường lỏng.
Các tế bào vi khuẩn Gram dương, kỵ khí không bắt buộc. Nhiệt độ tối ưu
thường khoảng 37 oC, nhưng nhiệt độ tối đa và tối thiểu khác nhau giữa các
loài.
 Lactococcus: các tế bào có hình cầu hoặc hình trứng tròn, đứng riêng lẻ,
thành cặp hoặc chuỗi và thường kéo dài chuỗi. Đây là vi khuẩn Gram dương,
không di động, từ kỵ khí không bắt buộc đến kỵ khí bắt buộc. Tăng trưởng ở
10 oC nhưng không tăng trưởng ở 45 oC.
9


Lên men lactic là quá trình chuyển hóa carbohydrate thành acid lactic nhờ hoạt
động sống của vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Có 2 kiểu lên men lactic chính
là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.
- Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men bởi các vi khuẩn lactic đồng
hình, có khả năng phân hủy đường theo con đường đơn giản và cho sản
phẩm chủ yếu là acid lactic (80-90%).
- Lên men lactic dị hình là quá trình lên men do vi khuẩn lactic dị hình.
Chúng phân hủy đường thành acid lactic và hàng loạt các sản phẩm khác
nhau chiếm tỉ lệ khá cao: acid lactic (40%), ethanol (20%), acid acetic
(10%), các chất khí còn lại (20%) (Yuan, 1999 - Trích dẫn bởi Trần Thị Ái
Liên, 2011).
2.2.2 Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus. Là vi

khuẩn Gram dương, có hình que, kích thước thường thay đổi, thường là ngắn,
0,5-1,0 x 3,0-15,0 μm, đôi khi xếp thành cặp hoặc chuỗi.

a

b

Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lạc (a) và kết quả nhuộm gram (b) của L. fermentum
Nhiệt độ phát triển: nhiệt độ tối ưu từ 37-42 oC, nhiệt độ thấp nhất từ 15-18 oC,
nhiệt độ cao nhất từ 48-50 oC.
Theo Wood và Holzapfel (1995), L. fermentum được xếp vào loại lên men dị hình
bắt buộc. Thường lên men tạo acid từ D-Ribose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose,
10


D-Maltose, D-Lactose, D-Melibiose, D-Sucrose, D-Trehalose, D-Raffinose (Abramov,
2014 – Trích dẫn bởi Lehri và ctv, 2017).
Nghiên cứu của Võ Thị Mỹ Lộc và ctv (2013) đã cho thấy, trong điều kiện lên
men tự nhiên, mẫu có chất lượng hạt ca cao tốt nhất sau khi lên men là mẫu có số
lượng vi khuẩn lactic cao nhất. Trong đó nhóm vi khuẩn lactic chiếm chủ yếu là
L. fermentum đã được phân lập và định danh.
2.3 Vi bao và phƣơng pháp sấy phun
2.3.1 Giới thiệu
Vi bao là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi
hiện nay. Đây là phương pháp sử dụng các chất tạo màng là các polymer có nguồn gốc
tự nhiên như gelatin, alginate, chitosan… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamide,
polyester, polyethylene glycon (PEG)… để bao gói các tế bào. Vi sinh vật sống trong
các nang nhỏ. Điều này giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự
tổn thất số lượng tế bào. (Lê Quan Nghiệm và ctv, 2007 - Trích dẫn bởi Đỗ Quốc
Cường, 2009). Một số phương pháp vi bao bao gồm: sấy phun, sấy lạnh đông, ép đùn,

giọt tụ,…. Tất cả các phương pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng.
Sấy phun là một trong những kỹ thuật đóng gói lâu đời và được sử dụng rộng rãi
trong ngành công nghiệp thực phẩm. Sự phát triển của các thiết bị và kỹ thuật sấy
phun phát triển qua một thời gian vài thập kỷ, từ năm 1870 đến năm 1900. Trong
ngành công nghiệp thực phẩm, sấy phun là phương pháp vi bao phổ biến nhất, vì nó là
được coi là có hiệu quả cao và chi phí hợp lý (Gharsallaoui và ctv, 2007). Đây là một
quá trình liên tục. Quá trình này có thể sản xuất các loại bột tinh khiết và tốt nhất với
độ vô trùng cao (Menshutina và ctv., 2010). Kỹ thuật sấy phun đã được áp dụng rộng
rãi trong đóng gói vi khuẩn probiotic, nơi các vi sinh vật vượt qua thành công điều
kiện nhiệt độ đột ngột (Riveros và ctv 2009; Boza và ctv, 2004 - Trích dẫn bởi Duong
Thi Ngoc Diep, 2013).
Theo Anadharamakrishnan và ctv (2015), thông thường, khi tiến hành vi bao các
chủng vi sinh vật, phải chọn các tế bào ở giai đoạn tăng trưởng hoặc giai đoạn cân
bằng. Điều này góp phần tăng khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình vi bao.

11


2.3.2 Phƣơng pháp sấy phun
2.3.2.1 Nguyên lý của quá trình sấy phun
Sấy phun là phương pháp sấy giúp chuyển trạng thái của nguyên liệu từ dạng
lỏng sang dạng bột khô. Trong quá trình sấy phun, dịch nguyên liệu được hệ thống vòi
phun phân tán thành các hạt ẩm cho tiếp xúc với luồng không khí nóng trong buồng
sấy với thời gian ngắn (Patel và ctv, 2009).
Theo Lê Văn Việt Mẫn (2011), quá trình sấy phun gồm ba giai đoạn:
-

Giai đoạn 1: chuyển nguyên liệu cần sấy thành dạng sương mù (các hạt

lỏng phân tán trong môi trường không khí) nhờ cơ cấu phun sương trong thiết bị

sấy phun. Kích thước của các giọt lỏng sau giai đoạn phun sương dao động
khoảng 10-200 μm.
-

Giai đoạn 2: hòa trộn sương mù với tác nhân sấy trong buống sấy. Đây

chính là giai đoạn tách ẩm ra khỏi nguyên liệu. Do nguyên liệu được phun sương
nên diện tích tiếp xúc giữa bề mặt các giọt lỏng và tác nhân sấy là rất lớn. Nhờ
đó, ẩm trong nguyên liệu được bay hơi nhanh chóng. Sản phẩm tạo thành ở dạng
bột mịn. Thời gian tách ẩm diễn ra trong khoảng từ vài giây đến vài chục giây.
-

Giai đoạn 3: tách sản phẩm ra khỏi dòng tác nhân sấy. Người ta có thể sử

dụng hệ thống “Cyclon”, túi lọc hoặc phương pháp kết tủa trong môi trường tĩnh
điện, phổ biến nhất là sử dụng “Cyclon”.
2.3.2.2 Cấu tạo hệ thống sấy phun
Các hệ thống sấy phun hiện nay bao gồm: tác nhân sấy (không khí sấy), caloriphe
để gia nhiệt cho tác nhân sấy, vòi phun, buồng sấy, hệ thống cyclon thu hồi sản phẩm,
quạt hút.

12


Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của hệ thống sấy phun
(Masters, 1991)
 Tác nhân sấy
Thường sử dụng không khí nóng có nhiệt độ thay đổi tùy thuộc vào vật liệu sấy.
 Vòi phun
Theo Trần Văn Phú (2008), vòi phun vừa giúp đưa vật liệu sấy vào buồng sấy,

vừa tạo sương mù.

uá trình phun sương sẽ quyết định kích thước của các hạt ẩm và

sự phân bố của chúng trong buồng sấy, do vậy sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất trao đổi
nhiệt và tốc độ sấy. Hiện nay có các dạng vòi phun như vòi phun áp lực, vòi phun bằng
khí động và vòi phun ly tâm (Westergaard, 2004).
 Buồng sấy
Buồng sấy là nơi vật liệu sấy (các hạt ẩm) tiếp xúc với tác nhân sấy (không khí
nóng). Buồng sấy có thể có nhiều dạng khác nhau nhưng phổ biến nhất là buồng sấy
hình trụ đứng, buồng sấy hình côn với góc côn (2α) 50-60o. Kích thước buồng sấy
được thiết kế phụ thuộc vào kích thước và quỹ đạo chuyển động của các hạt từ cơ cấu
phun sương tạo ra. (Westergaard, 2004).
 Hệ thống thu hồi sản phẩm
Các hạt bột sau khi được sấy khô trong buồng sấy sẽ bị hút theo dòng không khí
đến hệ thống “Cyclon” bởi tác dụng của quạt hút. Hệ thống “Cyclon” được thiết kế để
hướng dòng không khí di chuyển theo kiểu xoáy ly tâm. Các hạt bột va chạm với thành
thiết bị sẽ rơi xuống và được thu hồi. Dòng không khí sẽ được quạt hướng dòng đến bộ
phận gia nhiệt, tách ẩm và tuần hoàn lại vào buồng sấy.
13


 Quạt
Hệ thống sấy phun được trang bị hai quạt.

uạt chính được đặt sau hệ thống

“Cyclon” thu hồi sản phẩm, có tác dụng tạo lực hút dòng không khí có chứa sản phẩm
bột sấy đi qua hệ thống “Cyclon” để phân tách khí thải và thu hồi sản phẩm. uạt phụ
đặt trước thiết bị gia nhiệt không khí trước khi vào buồng sấy, có tác dụng tạo lực đẩy

không khí đến thiết bị gia nhiệt và vào buồng sấy.
Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic (Hình 2.3) có cơ cấu phun sương dạng vòi
phun cơ khí, hoạt động nhờ áp lực khí nén, được sử dụng trong nghiên cứu này.

Hình 2.6 Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic
2.3.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp sấy phun
Theo Keshani và ctv (2015); Roustapur và ctv (2006), phương pháp sấy phun có
các ưu và nhược điểm.
 Ưu điểm
- Thời gian sấy nhanh hơn so với các phương pháp sấy tạo sản phẩm bột khác.
- Ẩm độ và hoạt độ nước của sản phẩm thấp, có khả năng bảo quản tốt.
- Thòi gian tiếp xúc giữa các hạt lỏng và tác nhân sấy trong thiết bị rất ngắn,
làm giảm sự tác động của nhiệt đối với các thành phẩn có trong mẫu sấy.
14