Nghiên Cứu Đặc Điểm Hình Thái Và Trình Tự Gen Rpoc1 Của Cây Dừa Cạn [Catharanthus Roseus (L.) G.Don]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN
rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G. Don]

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN
rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G. Don]

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, năm 2016
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới
sự hướng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Mọi trích dẫn trong luận văn đều
ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016
Tác giả luận văn

Đinh Anh Tuấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã

tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công
nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường Đại
học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi tiế n hành các
thí nghiệm của đề tài.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt
thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiện đề tài luận văn.

Tác giả

Đinh Anh Tuấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iii

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đă ̣t vấ n đề ........................................................................................................ 1
2. Mu ̣c tiêu nghiên cứu........................................................................................ 3
3. Nô ̣i dung nghiên cứu ....................................................................................... 3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
1.1. CÂY DỪA CẠN .......................................................................................... 4
1.1.1. Hệ thống phân loại cây Dừa cạn ............................................................... 4
1.1.2. Giá trị sử dụng của cây dừa cạn ............................................................... 6

1.2. MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODING)..................................................... 10
1.2.1. Đă ̣c điể m của mã vạch DNA (DNA barcoding)........................................ 10
1.2.2. Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dươ ̣c liêụ .......................... 12
1.3. GEN LỤC LẠP ............................................................................................ 15
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 17
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BI ....................................................
17
̣
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và máy móc ................................................................... 17
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 17
2.2.1. Phương pháp thu mẫu ............................................................................... 17
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ........................................................... 18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iv

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổ ng số .................................................... 18
2.2.2.2. Phương pháp nhân gen rpoC1 bằng kĩ thuật PCR ................................ 19
2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ( phương pháp thôi gel) .......... 20
2.2.2.4. Phương pháp xác đi ̣nh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 .......... 21
2.2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 21
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................. 22
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 23
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÁC GIỐNG DỪA CẠN THU
TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN .............................................................. 23
3.1.1. Đă ̣c điể m hình thái rễ, thân, hoa, quả và ha ̣t của cây dừa ca ̣n .................. 23

3.1.2. Đặc điểm khác biêṭ về hình thái giữa ba giố ng dừa ca ̣n ........................... 26
3.2. PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN ................................ 28
3.2.1. Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn .................................................... 28
3.2.2. Khuếch đại đoạn gen rpoC1 bằng PCR .................................................... 28
3.2.3. Kết quả xác định trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa ca ̣n 29
3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC MẪU DỪA CẠN DỰA TRÊN
TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA
ĐOẠN GEN rpoC1 ............................................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 37
1. Kế t luâ ̣n ........................................................................................................... 37
2. Đề nghi ............................................................................................................
37
̣
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ........................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1 ................................. 19
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa các trình tự nucleotide của đoạn gen
rpoC1 ............................................................................................................... 32
Bảng 3. 2. Các vị trí sai khác giữa các trình tự amino acid suy diễn của gen
rpoC1 ............................................................................................................... 33

Bảng 3.3. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của
gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn ......................................................... 34
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn
của gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn .................................................. 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vi

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus ......................................................... 5
Hình 3.1. Cây dừa cạn hoa trắ ng nhu ̣y đỏ Hà Giang ......................................... 23
Hình 3.2. Các bô ̣ phâ ̣n của cây dừa cạn ............................................................. 24
Hình 3.3. Đặc điểm khác nhau về hình thái giữa ba giống dừa ca ̣n................... 27
Hình 3.4. Kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m DNA tổng số .............................. 28
Hình 3.5. Kết quả điện di kiể m tra sản phẩm nhân gen rpoC1 .......................... 29
Hình 3.6. Trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa
cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số
KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen ....................................................... 30
Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các
mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang
mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen ............................................. 33
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của 6
mẫu dừa cạn......................................................................................................... 35
Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng dựa trên trình tự amino
acid suy diễn của 6 mẫu dừa cạn. ........................................................................ 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribonucleic acid

PCR

Polymerase chain reaction

rpoC1

RNA polymerase beta' chain

CTAB

Cetyl trimethylammonium Bromide

TIM_HG

Giống dừa cạn hoa hồng tím thu tại Hà Giang

TV_HG

Giống dừa cạn hoa trắng vàng thu tại Hà Giang

TIM_TN

Giống dừa cạn hoa hồng tím thu tại Thái Nguyên

TRANG_TN

Giống dừa cạn hoa trằng đỏ thu tại Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1

MỞ ĐẦU

1. Đă ̣t vấ n đề
Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có nhiều điều kiện cho thực
vật phát triển và tạo ra sự phong phú, đa dạng của nhiều loài thực vật và nhiều
hệ sinh thái khác nhau. Theo thống kê tại Việt Nam hiện có gần 12000 loài
thực vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2256 chi, 305 họ; 69 loài thực vật hạt trần;
12000 loài thực vật hạt kín; 2200 loài nấm; 2176 loài tảo; 481 loài rêu; 368 loài
vi khuẩn lam; 691 loài dương xỉ và 100 loài khác [8].
Lịch sử phát triển môn phân loại học và các công trình nghiên cứu về
phân loại thực vật từ trước còn chưa được đầy đủ. Trong lịch sử nghiên cứu

thực vật ở nước ta đã có nhiều công trình thống kê, phân loại nhiều loài cây,
có thể kể đến một số tác giả như: Tuệ Tĩnh đã mô tả tới 579 loài cây làm
thuốc trong cuốn Nam dược thần hiệu, Lê Quí Ðôn với bộ Vân đài loại ngữ đã
phân chia thực vật thành nhiều loại: cây cho hoa, cho quả, ngũ cốc, rau, cây
loại mộc, loại thảo. Lý Thời Chân cho xuất bản cuốn Bản thảo cương mục
trong đó có đề cập tới trên 1000 vị thuốc thảo mộc...[1].
Trong thời kỳ Pháp thuộc, do tài nguyên thực vật ở nước ta rất phong phú
đã gây được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu phương Tây. Công trình lớn
nhất là bộ Thực vật chí tổng quát Ðông Dương do Lecomte và một số nhà thực
vật học người Pháp đã biên soạn, phân loại, mô tả và thống kê các cây từ Dương
xỉ tới thực vật Hạt kín của toàn Ðông Dương. Công trình nghiên cứu các cây
thuốc ở Campuchia, Lào và Việt Nam của Pételot... Phần lớn các nghiên cứu đều
tập trung vào thực vật bậc cao, đặc biệt đối với cây thuốc [1], [17].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2

Dừa cạn (Catharanthus roseus. G. Don) là loại cây cảnh phổ biến vì
dáng cây đẹp, mềm mại, lá xanh mướt, hoa rực sáng, là những nét đặc trưng
tạo được sự hấp dẫn của loài cây này. Dừa cạn cũng là một loại thảo dược dân
gian vì có chứa nhiều loại alkaloid. Từ dừa cạn có thể chiết được một số chất
điều trị ung thư như vinblastine, vincristine. Trên thế giới dừa cạn gồm 8 loài,
có ba giố ng dừa ca ̣n trồ ng phổ biế n ở Viê ̣t Nam phân biê ̣t nhau về màu sắ c
hoa: hoa màu hồ ng tím, hoa màu trắng vàng và hoa màu trắng đỏ.
Đến nay, các mẫu thực vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc
điểm hình thái, giải phẫu hoặc các đặc tính sinh lý, hóa sinh, di truyề n nhờ
vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp,

như mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư
hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết... đã khiến quá trình nhận diện trở
nên khó khăn thậm chí là không thể. Trong những trường hợp này mã vạch
DNA đã giúp giải quyết khó khăn trên. Mã vạch DNA (DNA barcoding) sử
dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như là một chuỗi
ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy
quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài
chúng rất giống nhau, nhưng thực sự là khác nhau. Hơn nữa, mã vạch DNA
còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật,
nó còn giúp quá trình phân tích sự tiến hóa sinh học của loài trong tự nhiên.
Xuấ t phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu
đă ̣c điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa ca ̣n [Catharanthus
roseus (L.) G. Don]" góp phần tư liệu hóa nguồn gen cây dừa cạn phục vụ
nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3

2. Mu ̣c tiêu nghiên cứu
Phân tić h đươ ̣c đă ̣c điể m hình thái và trình tự gen lu ̣c la ̣p rpoC1 của các
giố ng dừa ca ̣n khác nhau về màu sắ c hoa phu ̣c vu ̣ xây dựng mã vạch DNA
cho cây dừa ca ̣n (Catharanthus roseus (L.) G. Don).
3. Nô ̣i dung nghiên cứu
1) Nghiên cứu đặc điểm thực vật học của cây dừa cạn và so sánh sự khác
nhau về đặc điểm hình thái giữa các giống dừa cạn hoa hồng tím, hoa trắng
vàng và hoa trắng đỏ thu từ mô ̣t số điạ phương phía Bắ c Viêṭ Nam.

2) Nghiên cứu thông tin về trình tự gen rpoC1 và khuế ch đa ̣i đoa ̣n gen rpoC1
từ DNA hệ gen lục la ̣p của cây dừa cạn. Giải trình tự nucleotide của đoa ̣n gen
rpoC1 phân lâ ̣p từ bố n mẫu dừa ca ̣n thu từ hai tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên.
3) Phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn
của gen rpoC1 của các mẫu nghiên cứu và của gen rpoC1 trên Ngân hàng gen
quốc tế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY DỪA CẠN

1.1.1. Hệ thống phân loại cây Dừa cạn
Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài,
hầu hết là cây thân thảo lâu năm. Trong đó, chỉ có loài Catharanthus pusillus
có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ
Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là
2n=16 [1], [22]. Tám loài thuộc giống này đó là:
 Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar;
 Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon. Madagascar;
 Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon. Madagascar;
 Catharanthus ovalis Markgr. Madagasca;
 Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;
 Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar;

 Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon. Madagascar;
 Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon. Madagascar. [1], [22].
Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường dùng để
làm cảnh và được biết đến nhiều nhất là loài Madagascar Periwinkle hay còn
gọi là vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ngoài việc có
công dụng như một loài cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus
roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loài thuốc chống đái
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




5

tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành…
và ngày nay người ta còn tìm được một công dụng hết sức quan trọng của loài
Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả [1], [22].
Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G. Don; Vinca rosea L;
Lochnera rosea Reich, tên gọi khác là bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân
hoa… Về phân loại khoa học, dừa ca ̣n có tên khoa học là Catharanthus roseus
(L.) G. Don, thuô ̣c Giới (regnum) Plantae, bộ (ordo) Gentianales, họ (familia)
Apocynaceae, chi (genus) Catharanthus, loài (species) C. Roseus [1], [22].
Catharanthus roseus giàu alkaloid thuộc loại alkaloid terpenloid indole,
trong nhóm này có ba giống dừa ca ̣n khác nhau về màu sắ c hoa, ‘roseus’ với
hoa màu tím hoặc hồng, ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ, ‘albus’ với
hoa màu trắng [22].

A

B

C

Hình 2.1. Hoa của ba giống Catharanthus
A: Catharanthus roseus var. roseus
B: Catharanthus roseus var. ocellatus
C: Catharanthus roseus var. albus
1.1.2. Giá trị sử dụng của cây dừa cạn
Trong dừa cạn có trên 10 alkaloid, rất phức tạp, người ta đã phát hiện
có hơn 60 chất khác nhau như: ajmalicin, tetrahydroalstonin, serpentin,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




6

lochnerin, akuammin, reserpin... Trong tất cả các alkaloid, có loại vinblastin
và vincritin là hai chất có tác dụng tốt trong chữa các ung thư về máu,
ajmalicin là thuốc điều trị tim mạch rất tốt cho rối loạn thần kinh tim. Nhưng
chỉ mới phát hiện ra những dược tính của dừa cạn trong việc áp dụng chữa
bệnh vì trong tài liệu cổ của y học cổ truyền không thấy đề cập đến cây này.
Tuy vậy, y học cổ truyền một số nước cũng có ghi lại một vài kinh nghiệm sử
dụng dừa cạn để chữa bệnh. Ví dụ, ở Ấn Độ, châu Úc, nam châu Phi, quần
đảo Antilles, người ta dùng dừa cạn sắc uống để chữa bệnh tiểu đường cho
thấy kết quả rất khả quan. Ngoài ra, rễ dừa cạn còn được dùng để tẩy giun,
chữa sốt, làm thuốc thông tiểu, điều kinh, trị tăng huyết áp, chữa sốt rét, kiết
lị, tiêu hóa kém...[1], [23]. Bộ phận dùng để làm thuốc của dừa cạn là rễ, lá
hoặc cả cây. Thông thường, người ta thường nhổ nguyên cả bụi cây dừa cạn
về rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô để cất dùng dần. Trước khi sử dụng có thể sao

qua cho thơm rồi sắc nước uống. Tùy theo mục đích trị liệu, dừa cạn có thể
được phối hợp với các vị thuốc khác hoặc dùng độc vị [1].
Năm 1958, xuất phát từ kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa khối u của
người dân Ấn Độ, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện chất
kháng ung thư trong lá cây dừa cạn là vincaleucoblastine (còn gọi là
vinblastin), 4 năm sau, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là
vincaleucocristin (còn gọi là vincristin). Những thực nghiệm lâm sàng cho
thấy, chiết xuất vinplastin, vincristin có tác dụng làm giảm bạch cầu, ức chế
mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein
ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng
phân chia tế bào ở pha giữa. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng
độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [23]. Hàm lượng các alkaloid này trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




7

dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với vinblastin còn
đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa). Vì thế, quá trình điều chế hai alkaliod
từ cây dừa cạn là một quá trình phức tạp và chi phí giá thành cao [3].
Còn với khoa học hiện đại, từ năm 1952, y học đã phát hiện ra dược
tính của dừa cạn. Xuất phát từ việc bác sĩ Clark Noble ở Canada đã nhận được
một gói chuyển phát nhanh loại cây này do một người dân gửi tới với lời giới
thiệu “dân địa phương đã dùng chúng trị bệnh tiểu đường” nên ông đã đưa
vào phân tích. Kết quả khá bất ngờ, thay vì tác dụng hạ đường huyết trong
máu, ông lại phát hiện ra hoạt tính trị bệnh ung thư bạch cầu của loại cây này.
Dừa cạn đã được đưa vào bệnh viện thử nghiệm và trở thành cây dược liệu
chính thức theo y khoa hiện đại. Khi dùng dừa cạn làm thuốc nên chọn loại

hoa trắng vì hoạt chất của chúng cao hơn cây hoa đỏ, hồng. Thành phần
vincristin có tác dụng với bệnh nhân ung thư nhưng chúng lại là thành phần
gây hại cho thai nhi, ức chế hệ thần kinh. Vì vậy dừa cạn là cây dược liệu có
độc, tránh dùng cho phụ nữ có thai, người huyết áp thấp. Dừa cạn được xem
là đặc hữu của vùng đất Madagascar với giá trị dược tính cao nhất thế giới.
Hiện nay hàng năm người dân Madagascar xuất khẩu đến ngàn tấn dừa cạn
phơi khô ra nước ngoài để làm dược liệu. Công ty Dược liệu Trung ương Việt
Nam II cũng đã xuất khẩu cây này từ thập niên 1990. Thị trường dược phẩm
Mỹ, Pháp, Nhật, Việt Nam… có nhiều loại thuốc được bào chế từ dừa cạn
như thuốc trị cao huyết áp, ung thư (máu, tinh hoàn, dạ con)…Kết quả phân
tích của bác sĩ Clark, chiết xuất dừa cạn giàu alkaloid (gồm các loại:
vinblastin, vincristin, tetrahydroalstonin, pirinin, vindolin, catharanthin,
vindolinin, ajmalicin….) [9]. Trong đó thành phần vincristin, vinblastin khi
tách chiết thành dạng thuốc tiêm sẽ có tác dụng lớn trong ức chế tế bào hoặc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




8

sự phân bào. Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa ở
bệnh nhân ung thư máu. Đặc biệt đến nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp
gì điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với
bệnh nhân ung thư máu. Tuy nhiên không phải cứ dùng trà dừa cạn thì chữa
được ung thư, bởi một liều tiêm vincristin, vinblastin có hàm lượng rất cao,
việc dùng các thành phần này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của
bác sỹ điều trị. Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái.
Giống trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở
Madagascar, chứa khoảng 0,1- 0,2% alkaloid toàn phần. Tỷ lệ alkaloid trong rễ

(0,7-2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37-1,15%). Các nước Hàn Quốc,
Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức bào chế thuốc từ loại cây này [22].
Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có độc,
có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc,
hoạt huyết, tiêu thũng. Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm sự phát
triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ
bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphô cấp, một số ung thư. Trong dân gian vẫn
dùng trị cao huyết áp, trị bệnh đái đường, điều kinh, chữa tiêu hóa kém và chữa
lỵ, thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít. Có người dùng trị ung thư máu,
ung thư phổi [1], [23]. Ở Trung Quốc, toàn cây dừa cạn dùng trị cao huyết áp,
bệnh bạch huyết lymphô cấp tính và ung thư, mụn nhọt độc. Còn ở NouvelleCalédonie (châu Đại Dương), dừa cạn cũng là vị thuốc chống ung thư. Ở
Australia, nước hãm rễ cây dừa cạn là loại thuốc dân gian chống tiểu đường [36].
Theo Tiến sĩ Võ Văn Chi, từ năm 1926 người ta đã tìm thấy một phức hợp có
tính chất của digitalin, tới năm 1944 đã tìm thấy một hoạt chất có chức năng của
insulin, điều đó cắt nghĩa được tác dụng hạ đường huyết của dừa cạn [1], [19].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




9

Theo kinh nghiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước, rễ dừa
cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt, lị trực trùng, chứng tiêu khát, u xơ tuyến
tiền liệt... Thân và lá có tính chất săn da (astringent), lọc máu (despuratif),
dùng chữa một số bệnh ngoài da, sốt rét, bệnh máu trắng, thông tiểu. Kinh
nghiệm dùng dừa cạn chữa bệnh tiểu đường cũng được ghi nhận ở Ấn Ðộ,
châu Úc, nam châu Phi, quần đảo Antilles, nhưng chứng minh bằng thực tế
khoa học thì chưa có [1], [22].
Chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học Canada đã phát

hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và dẫn
đến sự phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng có tác dụng
chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin. Ngoài ra người ta còn phát hiện
tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và
vindolidin. Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những
năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác [1], [22].
Ở nước ta, nhân dân dùng dừa cạn dưới dạng thuốc sắc để làm thuốc lợi
tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường, ngày dùng 10-16g. Các bệnh về nội tiết như
đái tháo đường, thông tiểu, viêm đường tiết niệu, tiểu tiện có máu, ít nước tiểu
và trong bế kinh. Rễ và lá dùng rất tốt trong hạ huyết áp, nếu cần ta cho thêm
cây hoa đại (bông sứ), cỏ mần trầu và lá lạc tiên mỗi thứ khoản 20g sắc nước
uống liên tục trong nhiều tháng liền đối với huyết áp cao ở giai đoạn đầu dù
có nguyên nhân hay không có nguyên nhân vẫn rất tốt. Có nơi dùng cây dừa
cạn khô 20g dạng sắc nước uống để chữa những khối u nhỏ trong cơ thể, thời
gian qua ở nhiều cơ sở điều trị đã chiết xuất vinblastin và vincristin là thuốc
lựa chọn thứ nhất trong điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, là thuốc chọn thứ
hai trong điều trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô tế bào, có vảy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




10

ở đầu và cổ, ung thư biểu mô tế bào thận và còn là một trong những thuốc lựa
chọn thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư vòm họng
và ung thư dạng nấm da [23], [36].
Dừa cạn còn dùng để điều trị bệnh sarcoma lympho, sarcoma bạch huyết
bào, bệnh sarcoma chảy máu Kaposi, sarcoma tế bào lưỡi. Đặc biệt dừa cạn
không có sự kháng chéo giữa vinblastin với các loại thuốc chống ung thư

khác. Liều dùng thân và lá phơi khô 8 - 20g (dạng thuốc sắc, cao lỏng hay
viên nén từ cao khô). Nước ta đã chiết được vinblastin từ lá dừa cạn và dùng
dưới dạng thuốc tiêm để chữa bệnh bạch cầu lymphô cấp. Tương tự các loại
thuốc kháng ung thư khác, các chế phẩm alkaloid của dừa cạn cũng gây một
số phản ứng bất lợi như: buồn nôn, nôn, nhức đầu, tiêu chảy, táo bón, tắc ruột,
liệt, chán ăn, viêm miệng, rụng tóc, giảm bạch cầu, viêm thần kinh. Sử dụng
liều cao và kéo dài có thể gây mù, tử vong. Thuốc có thể gây độc cho thai,
nên tránh dùng cho thai phụ và người đang nuôi con bằng sữa mẹ, người bị
thấp huyết áp [1], [36].
1.2. MÃ VẠCH DNA

1.2.1. Đă ̣c điể m của mã vạch DNA (DNA barcoding)
Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây
dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng
tương đối đầy đủ và toàn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào
sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ
quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, cách thức phân loa ̣i này cũng gặp rất nhiều
khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển
(chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều
kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




11

loại thấp như loài và dưới loài [16]. Từ giữa những năm 1990, với sự phát
triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong
lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại

học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA)
trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích
hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA)
khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [5]. Phân loại học phân tử
(Molecular taxonomy) đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc
phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá
đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của
nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị
DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường. Đối
với thực vật, hệ gen lục lạp (cpDNA) là những gen rất bảo thủ trong tiến hóa.
Trong đó rpoC1 là một gen lu ̣c la ̣p, cấ u trúc vòng kép, bề n vững, chiều dài
dao động từ 409- 545 bp [17]. Chức năng của rpoC1 mã hóa cho tiểu đơn vị β
- RNA polymerase. Căn cứ mức đô ̣ đô ̣t biế n trong triǹ h tự nucleotide của gen
mà có thể phân biệt hai loài hay xác đinh
̣ đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đố i
tươ ̣ng nghiên cứu. Kế t quả nghiên cứu sẽ góp phầ n cho viêc̣ thiế t lâ ̣p mã va ̣ch
DNA (DNA barcoding) cho cây dừa ca ̣n.
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất thuâ ̣t ngữ "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách
để xác định loài [6]. Mã vạch được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một
phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân
biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng
của từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




12

giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch,
máy quét có thể phân biệt được. Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng
được các yêu cầu sau: (i) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều
loài thực vật; (ii) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;
(iii) Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [5], [6].
1.2.2. Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dươ ̣c liêụ
Những ứng dụng của mã vạch DNA không chỉ nhận diện nhanh các
mẫu mà còn rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù
chúng hầu như không giống nhau về hình thái.
Trong lĩnh vực pháp y, chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ, thậm chí chỉ vài
dấu vết để lại trên hiện trường cũng có thể giúp cảnh sát truy tìm nguồn gốc
tội phạm.
Trong nông nghiệp, một trong những điều đáng lo ngại nhất là kiểm
soát những tác nhân gây bệnh cho cây trồng, chi phí cho việc đó lên đến hàng
tỷ USD mỗi năm. Sử dụng mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chóng các
loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chương trình
kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng. Cho đến nay, về cơ bản đã hoàn thành
mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển
giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ
có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh. Kinh
doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ được đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời
gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh. Mã vạch DNA cũng được
sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian gây bệnh. Các nhà khoa học
những người mà không phải là nhà phân loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh
trùng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13

người và động vật. Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như
phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng. Mã vạch DNA cho những
vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và bước đầu đưa vào sử dụng, điều này
cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ và phương
pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng.
Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác
định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu, để ngăn cản sự vận
chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới. Một
thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút,
trong đó nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng. Không thể kiểm soát được săn
bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trưởng giảm 90% .
Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang giã quý hiếm
hay không. Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền
chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp
pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học. Một dự án chiến lược trên toàn thế
giới của mã vạch DNA đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện
mã vạch của các loài đang bị đe dọa. Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn
ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó
còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp. Một số quốc
gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc
khai thác quá mức nguồn tài nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra
sự suy giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng của nhiều loài. Để kiểm soát khai thác,
nhà chức trách cần phải thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm
soát kinh doanh các sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp. Có ít nhất hai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

14

dự án về mã vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy
công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên [17], [22].
Cuộc sống của chúng ta phụ thuộc vào nước. Hiện tại nước ngọt trở
thành nguồn tài nguyên quý giá cần được bảo vệ ở mỗi quốc gia. Nguồn nước
bị ô nhiễm cần được xác định để phòng ngừa và có biện pháp xử lý. Một vài
sinh vật đơn giản trong nước được xem là ô nhiễm (ví dụ như ấu trùng của
muỗi). Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc xác
định các chỉ số ô nhiễm. Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học đang cố
gắng xây dựng thư viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập mờ”. Điều này
giúp cho cán bộ quản lý môi trường tiêu chuẩn hóa lại các chỉ số trong việc
đánh giá mức độ ô nhiễm của nước và thiết lập quy trình đánh giá tiêu chuẩn
nước tốt hơn ở mỗi quốc gia.
Thực vật dùng làm thuốc luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy
xác định chính xác loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất
lượng sản phẩm. Cùng với sự phát triển của thị trường thảo dược, sự giả mạo
các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu. Các nguyên
liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan
hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo. Việc giả mạo các
nguyên liệu thảo dược thường là do: Vật liệu không phân biệt được bằng đă ̣c
điểm hình thái; Những vật liệu có tên tương tự nhau; Việc thay thế những
nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu khác rẻ tiền hơn.
Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm
thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương
pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có
nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15

phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến
hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch
DNA có thể bảo vệ người dùng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc
giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng [5].
Trước đây người ta phân chia dừa cạn thành 2 giống là
Catharanthusroseus var. roseus và Catharanthusroseus var. angustus, đến
2004, dừa cạn có khoảng 100 giống khác nhau. Đã có nhiều nghiên cứu về
dừa cạn như chọn giống dựa vào hình thái hoặc dựa trên hàm lượng alkaloid,
nghiên cứu con đường sinh tổ ng hơ ̣p alkaloid, so sánh hàm lươ ̣ng alkaloid
giữa lá, rễ, sử du ̣ng dừa ca ̣n điề u chế thuố c chữa bênh,
̣ sử dụng các kỹ thuật
AFLP, RAPD và sử dụng hóa phân loại để nhận dạng dừa ca ̣n [5], [11], [22].
1.3. GEN LỤC LẠP

Tế bào thực vật bậc cao chứa 3 cơ quan di truyền đó là: nhân, ty thể và lạp
thể. Mỗi cơ quan tử chứa bộ gen riêng của nó. Di truyền gen ty thể và lục lạp
không tuân theo quy luật Menden và thường di truyền theo kiểu đơn bố mẹ
cho thế hệ sau. Hiện tại các nhà khoa học tập trung nghiên cứu lạp thể nhất là
lục lạp. Ris và Plaut (1962) là những người đầu tiên khám phá ra sự có mặt
của DNA trong lục lạp bằng cách quan sát tảo xanh Chlamydomonas
moewusii dưới kính hiển vi. DNA lục lạp có dạng vòng kép, thường có
khoảng 120-170 nghìn bp, chiều dài khoảng 30-60µm, khối lượng khoảng 80130000000 dalton [7].
Hầu hết gen lục lạp của thực vật thường tồn tại ở dạng vòng, kép lớn. Nhưng
ở một số loài như tảo dinophyte, hệ gen lục lạp lại được chia thành nhiều

plasmid nhỏ, mỗi plasmid này có từ 2000-10000 bp, nhưng không có DNA mã
hóa [6]. Bộ gen của lục lạp gồm khoảng 100 gen, ở các loài thực vật trên cạn,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




16

trình tự gen gần như là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosome, 3031 tRNA, 21 proteins ribosome và 4 RNA polymerase tiểu đơn vị.
Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ được gọi là phần bảo thủ. Phần này chứa
một trình tự các nucleotide bền vững, khó bị các tác nhân lý, hóa học tác động
gây đột biến, do đó đoạn nucleotide này hầu như không bị biến đổi trong quá
trình tiến hóa. Do vậy các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu, sử dụng các
đoạn gen này ở các loài thực vật khác nhau cho công nghệ mã vạch DNA, qua
đó phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen đó để xét mối quan hệ họ hàng
giữa các loài trong sinh giới hiện nay.
Rất nhiều vùng gen trong hệ gen lục lạp đã được sử dụng trong công nghệ
mã vạch DNA như: matK, rpoC1, ... [5].
Maturase K trình tự gen này đã thành công trong việc xác định các loại
thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc

từ Rheum palmatum L

(Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf, R.
officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội bộ loài và
giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định
các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [5], [6].
rpoC1 là gen lu ̣c la ̣p, cấ u trúc vòng kép, bề n vững. Chiều dài trung bình
520 bp. Chức năng mã hóa cho enzyme RNA polymerase β – tiểu đơn vị [4],

[8], [11].
Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã thấy rằng trong số
các gen mã vạch, rpoC1 là một ứng cử viên hứa hẹn cho mã vạch DNA thực
vật. Căn cứ mức đô ̣ đô ̣t biế n trong triǹ h tự nucleotide của gen mà có thể xác
định đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đố i tươ ̣ng nghiên cứu [4], [8], [11].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN