Nghiên Cứu Thiết Lập Quy Trình Đẳng Nhiệt Recombinase Polymerase Amplification

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------------

Lê Thị Thúy

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT
RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC
NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

Lê Thị Thúy

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT
RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC
NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ

Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số

: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.BS HỒ HỮU THỌ
TS. MAI THỊ ĐÀM LINH

Hà Nội - 2019


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hồ
Hữu Thọ - Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học Viện Quân Y người thầy đã
tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn, và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong
suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS. Mai Thị Đàm Linh –
Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến
thức và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn đồng nghiệp tại Phòng Công nghệ gen và
Di truyền tế bào đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học và
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp
đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.
Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019
Học viên

Lê Thị Thúy


MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................................4

DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................7
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................9
DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT ..............................................................10
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƯƠNG 1
1.1

: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................3

Bệnh sốt mò ................................................................................................3

1.1.1

Dịch tễ học ...........................................................................................3

1.1.2

Đặc điểm lâm sàng ..............................................................................7

1.1.3

Điều trị .................................................................................................9

1.1.4

Phòng bệnh sốt mò ............................................................................10

1.2.

Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi .............................10

1.2.1.

Đặc điểm sinh học .............................................................................10

1.2.2.

Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò ..........................................................14

1.2.3.

Cơ chế gây bệnh sốt mò ....................................................................18

1.3.

Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò ............................................22

1.3.1. Phương pháp huyết thanh học .................................................................22
1.3.2.

Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR ................................24

1.3.3.

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase

amplification (RPA) ..........................................................................................24
CHƯƠNG 2

: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................34

2.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................34


2.2. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA .....................................................34
2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo ...................................................................35
2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm
nghiên cứu thiết kế ................................................................................................35
2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập ..................................................................37
2.4.1. Tối ưu điều kiện phản ứng ......................................................................37
2.4.2. Tối ưu thành phần phản ứng ...................................................................38
2.5. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại) ......................................................39
2.6. Đánh giá ngưỡng phát hiện ............................................................................40
2.7. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên
thị trường ...............................................................................................................41
2.7.1. Đánh giá độ nhạy ....................................................................................41
2.7.2. Đánh giá độ đặc hiệu ...............................................................................41
CHƯƠNG 3

: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................43

3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa ..........................................43
3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa ...........44
3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA ........................................................................45
3.4. Quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi ...................................................52
3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA ..................................................................55
3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
(PrimerDesign) ......................................................................................................57
3.7. Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
...............................................................................................................................59

KẾT LUẬN ...............................................................................................................64


KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................66
PHỤ LỤC ..................................................................................................................84
Phụ lục 1: Danh sách các mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi.........................84
Phụ lục 2: Kết quả tách chiết các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân
biệt sốt mò .................................................................................................................85
Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện
O. tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo
...................................................................................................................................86
Phụ lục 4: Hình ảnh bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O. tsutsugamushi (Orientia
tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo .......................................87


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141] .........................................4
Hình 1.2. Hình ảnh nốt loét do mò đốt ........................................................................8
Hình 1.3. Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập và ký sinh trong tế
bào nội mô mạch máu ...............................................................................................11
Hình 1.4. Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense ..............................................16
Hình 1.5. Mô hình về quá trình hấp thu và vận chuyển nội bào của O. tsutsugamushi
[62] ............................................................................................................................21
Hình 1.6. Chu trình phản ứng RPA [53] ...................................................................29
Hình 1.7. Sơ đồ mô tả cấu trúc của exo probe [53] ..................................................31
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................34
Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo ............................................35
Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng trong nghiên cứu ............................37
Hình 3.1. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của O.

tsutsugamushi ở Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) và mồi ngược (C) trong
nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao và cs [38]
...................................................................................................................................44
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình
mồi và probe trong nghiên cứu .................................................................................45
Hình 3.3. Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi ........47
Hình 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi
...................................................................................................................................49
Hình 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O.
tsutsugamushi ............................................................................................................50


Hình 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O.
tsutsugamushi ............................................................................................................51
Hình 3.7. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA phát hiện O.
tsutsugamushi ............................................................................................................55
Hình 3.8. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR (PrimerDesign)
phát hiện O. tsutsugamushi .......................................................................................56
Hình 3.9. Đánh giá độ nhạy quy trình RPA và quy trình realtime PCR trên các mẫu
dương tính giả định với O. tsutsugamushi (tp1-tp10) ...............................................59
Hình 3.10. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) trên
các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt
mò ..............................................................................................................................60
Hình 3.11. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia
tsutsugamushi trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn
đoán phân biệt ...........................................................................................................62


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] ........................4

Bảng 1.2: Tóm tắt các thành phần, nồng độ và vai trò các thành phần trong phản ứng
RPA ...........................................................................................................................26
Bảng 1.3: Bảng so sánh một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ...............................32
Bảng 2.1: Nồng độ và thành phần ban đầu sử dụng trong phản ứng RPA ...............36
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR ........................................................39
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt ..........................................................................................40
Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O. tsutsugamushi
...................................................................................................................................43
Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA .......................................52
Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix .................................................................................52
Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát
hiện O. tsutsugamushi ...............................................................................................57
Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu của từng quy trình ....................................................62


DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

TT

Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

1.

bp

: Base pair

2.

DNA

: Deoxyribonucleic acid

3.

kb

: Kilo base

4.

LAMP

: Loop-mediated isothermal amplification

5.

NAT

: Nucleic acid test

6.

PCR

: Polymerase chain reaction

7.

RNA

: Ribonucleic acid

8.

RPA

: Recombinase polymerase amplification


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sốt mò là một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng ở khu vực châu ÁThái Bình Dương, trong đó có Việt Nam. Theo thống kê của của Cục Y tế dự phòng,
bệnh sốt mò có mặt ở hầu hết 24 tỉnh phía Bắc chiếm 38,51% số bệnh nhân sốt nhập
viện, không rõ căn nguyên. Bệnh do tác nhân Orientia tsutsugamushi gây nên; trung
gian truyền bệnh là ấu trùng mò Leptotrombidium. Nếu không được điều trị sớm với
loại kháng sinh phù hợp có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong
cao. Trong khi đó, các triệu chứng của bệnh sốt mò thường không đặc hiệu và có thể
lẫn với nhiều loại mầm bệnh khác với các phác đồ điều trị khác nhau (sốt xuyết huyết,
sốt xoắn khuẩn vàng da …). Để có thể bắt đầu phác đồ điều trị phù hợp kịp thời, việc
chẩn đoán sớm nhiễm O. tsutsugamushi đóng vai trò quyết định.
Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử như PCR/realtime PCR phát hiện
O. tsutsugamushi đã được nghiên cứu và phát triển nhằm cải thiện những hạn chế về
độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể đặc hiệu
hiện có trong chẩn đoán sốt mò. Tuy nhiên, để ứng dụng các phương pháp này vào
chẩn đoán đòi hỏi phải đào tạo vận hành máy luân nhiệt PCR, và trong điều kiện với
nguồn lực hạn chế thì việc trang bị, bảo dưỡng, căn chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo
hoạt động ổn định là rất khó khăn. Để khắc phục những giới hạn của phương pháp
PCR/realtime PCR truyền thống trong kỷ nguyên khuếch đại acid nucleic dùng trong

chẩn đoán phân tử tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các
phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt.
Recombinase polymerase amplification (RPA) là một trong những phương
pháp khuếch đại acid nuclecic đẳng nhiệt với nhiều ưu điểm nổi bật. Khác với PCR
truyền thống, công nghệ sử dụng hỗn hợp các recombinase của sinh vật tiền nhân
(Escherichia coli RecA recombinase hoặc T4 UvsX protein) giúp các mồi gắn đặc
hiệu vào gen đích và enzyme DNA polymerase với hoạt tính thay thế sợi cho phép
tổng hợp liên tục DNA mà không cần biến tính sợi kép DNA ở nhiệt độ cao, do vậy
không cần đến thiết bị luân nhiệt được thiết kế tinh vi với giá thành cao. Phản ứng

1


RPA có thể được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C, so với các kỹ
thuật khuếch đại đẳng nhiệt khác như NASBA, SDA hay LAMP thì điều kiện nhiệt
độ của RPA khá dễ dàng thiết lập và đảm bảo. Bên cạnh đó, thời gian để có thể phát
hiện được tín hiệu từ đơn phân tử đích ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp
đẳng nhiệt khác và PCR. Những ưu điểm này gợi ý rằng RPA có thể là lựa chọn tối
ưu để áp dụng phát hiện acid nucleic chẩn đoán bệnh tại thực địa và khu vực hạn chế
về nguồn lực.
Hiện nay, trên thế giới mới chỉ có rất ít nghiên cứu thiết lập các quy trình RPA
nhằm phát hiện nhanh và chính xác tác nhân gây bệnh sốt mò -O. tsutsugamushi. Các
quy trình được thiết lập vẫn còn nhiều hạn chế về độ nhạy, đặc biệt là khi đánh giá
trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng được thu thấp tại khu vực Đông Nam Á. Qua phân
tích tính đa hình nhận thấy trình tự mồi xuôi và probe thiết kế trong nghiên cứu đã
công bố có đến 03 vị trí chưa bổ sung hoàn toàn với trình tự gen đích 47-kDa của hầu
hết các chủng O. tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á, dẫn đến hiệu suất chẩn đoán
bệnh sốt mò bị hạn chế khi áp dụng tại Việt Nam và các nước trong khu vực.
Với những lý do thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification

(RPA) phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò” với hai mục tiêu chính:
1) Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép phát hiện nhanh
và chính xác O. tsutsugamushi với độ nhạy, độ đặc hiệu cao
2) Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RPA được thiết lập

2


CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Bệnh sốt mò
Bệnh sốt mò hay phát ban, còn được biết đến với tên gọi là bệnh
tsutsugamushi, gây ra bởi trực khuẩn gram âm Orientia tsutsugamushi ký sinh nội
bào bắt buộc [112, 135]. Khoảng 5 đến 14 ngày sau khi bị cắn bởi tác nhân mang
bệnh – mò Leptotrombidium, người bệnh bắt đầu có những biểu hiện của nhiễm trùng
như các triệu chứng giống cúm như sốt, phát ban, sẩn ở vết cắn, đau đầu, đau cơ, ho,
nổi hạch, buồn nôn, nôn và đau bụng [74, 75, 101]. Sốt và đau đầu là những đặc điểm
phổ biến nhất ở bệnh nhân sốt phát ban, chiếm tỷ lệ 95% đến 100% các trường hợp
[74].
1.1.1 Dịch tễ học
 Dịch tễ học bệnh sốt mò trên thế giới
Bệnh sốt mò lưu hành rộng trên thế giới, gặp ở khu vực Châu Á - Thái Bình
Dương, Đông Nam Á [82], phía bắc Liên bang Nga, phía bắc bang Queensland tới
phía đông Australia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn
Độ, Indonesia, Thái Lan, Sri Lanka, Philippines... [98, 124, 141]. Trước đây, bệnh
được xác định vùng dịch tễ là tam giác lưu hành Orientia tsutsugamushi từ bắc Nhật
Bản đến phía đông của Liên bang Nga, phía bắc của nước Úc và phía tây của Pakistan,
Afghanistan [75, 99, 138]. Tuy nhiên, các báo cáo gần đây về bệnh sốt mò cho thấy
bệnh đã vượt quá giới hạn của “Tam giác Tsutsugamushi” khi được phát hiện ở Chile,
Peru, bán đảo Ả rập, một số khu vực Châu Phi [92, 139].

3


Hình 1.1. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141]
Bệnh là vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng và là một trong những bệnh truyền
nhiễm bị lãng quên. Ước tính mỗi năm có khoảng một triệu ca nhiễm bệnh sốt mò và
hơn một tỷ người trên thế giới có nguy cơ mắc bệnh hàng năm. Trong những năm
vừa qua, bệnh sốt mò đã gây dịch ở nhiều nước với số mắc và tử vong cao ở nhiều
khu vực [77, 99, 107].
Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99]
TT

Quốc gia

Khu vực

Thời gian

1

Thái Lan

Chiang Mai

2

Ấn Độ

Bishnipur-Manipur

3

Ấn Độ

Himachal Pradesh
(northern India)

Số ca tử
Số ca mắc

vong

2007

65

0

2007

38

2

2008

5

1

4

Ấn Độ

Pondicherry

2008

50

1

5

Ấn Độ

Meghalaya

2010

24

0

6

Ấn Độ

Sikkim

2011

63

0

4


TT

7
8

Quốc gia

Khu vực

Thời gian

Ấn Độ

Chennai

Úc

Northern
Queensland

Số ca tử

Số ca mắc

vong

2011

52

0

2011

124

0

9

Trung Quốc

Guangdong

2012

29

4

10

Ấn Độ

Meghalaya

2012

90

5

11

Ấn Độ

Rajasthan

2012

42

7

12

Trung Quốc

Jiangsu

2013

271

0

13

Ấn Độ

Puducherry

2013

28

0

14

Ấn Độ

Northern India

2013-2014

228

0

15

Quần đảo
Western Province

2014

9

0

Solomon
16

Bu-tan

Thimphu

2014

12

2

17

Ấn Độ

Uttarakhand

2014

69

1

18

Ấn Độ

Andhra-pradesh

2014

176

8

19

Ấn Độ

Rajasthan

2014

66

14

20

Nepal

Kathmandu

2015

23

0

21

Nepal

Chaitwan

2016

264

8

 Phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh sốt mò đã được phát hiện từ đầu thế kỷ XX. Một nghiên
cứu thực hiện ở cả miền Nam và miền Bắc năm 1964 cho thấy bệnh đã được ghi nhận

5


lưu hành ở ít nhất 11 tỉnh, thành. Tuy nhiên, trong một thời gian dài, bệnh ít được

phát hiện do việc sử dụng rộng rãi chloramphenicol và tetracycline trong thực hành
y khoa và thiếu các xét nghiệm chẩn đoán bệnh đặc hiệu cần thiết [108, 25]. Sau năm
1990, hàng nghìn người mắc và hàng trăm người chết do bệnh sốt mò được ghi nhận
tại các tỉnh Sơn La, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bình Phước,... [11]. Sau thời
gian dài bệnh tạm lắng, gần đây bệnh lẻ tẻ xuất hiện ở nhiều nơi và có xu hướng ngày
càng tăng cao.
Tại Bắc Giang từ năm 1998-2000 ghi nhận 71 trường hợp mắc bệnh sốt mò.
Năm 2011, số bệnh nhân đến bệnh viện điều trị sốt mò là 18 trường hợp từ các huyện:
Lạng Giang, Lục Nam, Yên Dũng, Tân Yên và Lục Ngạn. Trong đó có 6 bệnh nhân
nam (33,3%) và 12 bệnh nhân nữ (66,7%) [20].
Theo kết quả điều tra của Nguyễn Duy Quyền (2002), tại đảo Thanh Lân và
Cô Tô (Quảng Ninh) tỷ lệ người dân bị mắc bệnh sốt mò là 0,14/1.000 dân [24].
Năm 2000-2002, tại Bệnh viện Uông Bí (Quảng Ninh) có 449 bệnh nhân sốt
mò vào điều trị. Bệnh nhân sốt mò được phát hiện rải rác quanh năm, tập trung nhiều
từ tháng 5-10. Các dấu hiệu lâm sàng: Có nốt mò đốt (94,2%); có sốt (100%); có nổi
hạch (98,7%) và phát ban (52,2%). Điều trị bằng chloramphenicol và tetracyclin sau
5-7 ngày hết sốt [18].
Trong thời gian từ 2001-2003, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã
thống kê được 251 ca bệnh sốt mò (trong đó nam chiếm 50,6% và nữ chiếm 49,4%)
từ 225 xã thuộc 125 huyện của 24 tỉnh thuộc Bắc bộ và Bắc Trung bộ nhập viện điều
trị, chiếm 35,3% số các trường hợp sốt không rõ nguyên nhân [5, 25].
Từ năm 1998 đến năm 2005, tại Bệnh viện 110 đã điều trị 168 ca sốt mò. Từ
năm 2010 đến nay, bệnh tiếp tục lưu hành ở nhiều vùng trung du và rừng núi của Việt
Nam, đặc biệt số ca báo cáo nhiều ở các tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Quảng
Nam, Quảng Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình, Yên Bái, Lai Châu, Điện Biên,... với số
ca bệnh lên đến hàng trăm ca mỗi năm [7, 13, 21].

6

Theo tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2008-2010), kết quả điều tra sơ
bộ huyết thanh học và xác định một số yếu tố nguy cơ phơi nhiễm Orientia
tsutsugamushi
trong cộng đồng dân cư tại các khu vực nghiên cứu thuộc khu vực Nam Trung
bộ và Tây Nguyên cho thấy: Tỷ lệ người mang kháng thể kháng Orientia
tsutsugamushi ở khu vực Khánh Hòa 21,04%, Gia Lai 10,58% (huyện Chư Prông
13,99% và huyện Krông Pa 7,14%), và Kon Tum 5,21% [11].
Từ 2008 đến 2010, tại miền Trung và Tây nguyên có 471 bệnh nhân sốt mò,
trong đó ở M’ Drăk (Đăk Lăk) chỉ có 2 bệnh nhân, còn lại 469 bệnh nhân ở địa bàn
tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu tập trung ở Ninh Hòa (55,01%), Thành Phố Nha Trang
(27,93%), Diên Khánh (7,46%), Cam Lâm (3,62%), Vạn Ninh (2,99%) [11].
Tại tỉnh Yên Bái, trong 2 năm từ 2014 - 2015 số bệnh nhân sốt mò tăng đột
biến, đã có 397 bệnh nhân (năm 2014: 136 trường hợp, năm 2015: 261 trường hợp)
đến điều trị sốt mò. Trong số đó có 7 ca tử vong. Các bệnh nhân đến từ các huyện:
Văn Chấn 99 bệnh nhân (24,9%); Trạm Tấu 53 bệnh nhân (13,3%); Mù Cang Chải
157 bệnh nhân (39,5%); thị xã Nghĩa Lộ 57 bệnh nhân (14,3%); Văn Yên 30 bệnh
nhân (7,6%); huyện Trấn Yên 1 bệnh nhân (0,4%). Bệnh nhân gặp ở nữ (61,25%)
nhiều hơn nam (38,75%). Bệnh gặp ở tất cả các lứa tuổi trong đó bệnh nhân trong độ
tuổi lao động nhiều nhất (51%). Bệnh nhân làm nhiều nghề khác nhau trong đó gặp
nhiều nhất là làm ruộng, nương rẫy (51,3%) [13, 22].
Các thông tin trên cho thấy phạm vi phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam có xu
hướng ngày càng mở rộng, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều khu vực với số bệnh nhân
ngày càng tăng lên.
1.1.2 Đặc điểm lâm sàng
Ca bệnh lâm sàng: Ủ bệnh, trung bình 8 - 12 ngày (6 đến 21 ngày) [1]. Lúc
đầu tại nơi ấu trùng mò đốt có một nốt phỏng nước kích thước khoảng 2 - 5mm, không
đau, bệnh nhân thường không chú ý; sau thời gian ủ bệnh, bệnh phát ra với những
triệu chứng sau:

7

Sốt ≥ 38 - 400C, liên tục, kéo dài 15 - 20 ngày, có trường hợp sốt tới 27 ngày
nếu không điều trị; Có khi rét run 1 - 2 ngày đầu, kèm theo sốt thường có nhức đầu
nặng, đau mỏi cơ.
Nốt loét đặc trưng (điển hình của sốt mò): Thường ở vùng da mềm, ẩm, như
bộ phận sinh dục, vùng hậu môn, bẹn, nách, cổ…, đôi khi ở vị trí bất ngờ trong vành
tai, rốn, mi mắt (dễ nhầm với lẹo mắt); đặc điểm của nốt loét: Không đau, không
ngứa; người bệnh thường chỉ có một nốt, hiếm khi có nhiều hơn; nốt hình tròn hoặc
bầu dục đường kính từ 1mm đến 20mm; nốt phỏng ban đầu phát triển dần thành dịch
đục trên một nền sẩn đỏ, sau 4 - 5 ngày vỡ thành một nốt có vẩy nâu nhạt hoặc đen
tùy vào vùng da mềm hay cứng và độ non hay già của nốt loét; sau một thời gian, vẩy
bong để lộ nốt loét lõm đáy nông, hồng nhạt, không mủ, không tiết dịch, bờ viền hồng
đỏ hoặc thâm tùy theo bệnh đang phát triển hay đã lui; từ khi hết sốt nốt loét liền dần;
nốt loét gặp ở 65 - 80% các trường hợp [1, 15, 26].

Hình 1.2. Hình ảnh nốt loét do mò đốt
Hạch và ban dát sẩn: Hạch khu vực nốt loét thường sưng và đau, không đỏ,
vẫn di động, xuất hiện cùng với sốt hoặc sau 2 - 3 ngày, là chỉ điểm tìm nốt loét; Hạch
toàn thân sưng đau nhẹ hơn, trừ những ca nặng. Ban dát sẩn mọc cuối tuần thứ nhất
đầu tuần thứ hai, mọc khắp người, trừ lòng bàn tay bàn chân, tồn tại vài giờ đến 1
tuần, thưa hơn so với sốt Dengue cổ điển, khoảng 35 - 70% số bệnh nhân xuất hiện

8


ban, tùy thời điểm bệnh nhân được khám; đôi khi có đốm xuất huyết (dưới 10%).
Trong những ngày đầu, da và niêm mạc xung huyết ở đa số các trường hợp (khoảng
88%), khác với sốt rét và thương hàn [67, 113, 26].
Ở bệnh nhân nặng hay gặp tiếng tim mờ, huyết áp thấp, mạch chậm so với

nhiệt độ, chảy máu cam, xuất huyết tiêu hóa, viêm phế quản, viêm phổi không điển
hình [2, 143].
Ngoài ra, sốt mò còn có thể ẩn và thể không điển hình (không có nốt loét).
Nếu được điều trị bằng kháng sinh thích hợp, sẽ cắt sốt nhanh. Nếu can thiệp
muộn hoặc không hiệu quả, có thể có biến chứng như viêm cơ tim, sốc nhiễm khuẩn,
viêm phổi, suy hô hấp, viêm não - màng não... dẫn đến tử vong [6, 102].
Tỷ lệ tử vong do Orientia tsutsugamushi khác nhau ở từng nước, từng vùng,
phụ thuộc vào chủng lưu hành ở địa phương. Ở Việt Nam, tỷ lệ tử vong khoảng 1%,
Indonesia và Đài Loan 5-20%, Malaysia 15 - 20%, Nhật Bản 20 - 60% [132, 26].
1.1.3 Điều trị
Kháng sinh đặc hiệu điều trị bệnh sốt mò là chloramphenicol, doxycycline và
tetracycline. Các bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu sẽ hết sốt sau 1 2 ngày. Tuy nhiên, do các kháng sinh này không có tác dụng diệt vi khuẩn mà chỉ có
tác dụng hãm khuẩn nên vi khuẩn Orientia tsutsugamushi vẫn sống và tồn tại trong
hạch bạch huyết, ở hệ võng nội mô trong nhiều ngày, nhiều tháng và dễ tái phát bệnh
[12, 25, 26].
-

Doxycycline là thuốc được lựa chọn hàng đầu. Liều thường dùng là viên

100mg uống hai lần trong một ngày, kéo dài 7 ngày.
-

Tetracycline được sử dụng ở liều 2g/24 giờ chia 4 lần, cách nhau 6 giờ.

-

Chloramphenicol được sử dụng bằng đường uống hoặc đường tiêm, liều

khuyến cáo là 2g một ngày chia 4 lần, đến khi hết sốt 2-3 ngày.
-

Các thuốc macrolide cũng có tác dụng với sốt mò, tốt nhất là azithromycin và

9


thuốc này có thể chỉ định cho trẻ dưới 8 tuổi và phụ nữ mang thai [40].
1.1.4 Phòng bệnh sốt mò
Thực hiện các biện pháp tuyền truyền giáo dục sức khỏe kết hợp vệ sinh phòng
bệnh.
Điều tra cơ bản phát hiện ổ dịch ở địa bàn nghi ngờ và có người ở để xử lý
(bắt thú nhỏ gặm nhấm, bắt mò, phân loại, phân lập O. tsutsugamushi , tìm kháng thể,
phát hiện bệnh nhân).
Tại ổ dịch đã xác định hoặc nghi ngờ:
- Biện pháp ngăn ngừa mò đốt:
+ Tránh ngồi nằm phơi quần áo đặt balô trên bãi cỏ, gần bờ bụi, gốc cây; khi
đi phát nương làm rẫy, hành quân dã ngoại, trinh sát vào rừng cần mang giầy và tất,
chít ống quần.
+ Tối ưu tẩm quần áo bằng thuốc diệt mò (permethrine và benzyl benzoat)
hoặc xoa chân, tay, cổ bằng các thuốc xua mò (diethyltoluamid, DEET,...).
-

Diệt mò ở môi trường: phun tồn lưu vào đất ẩm, bờ bụi cây cỏ cao dưới

20 cm quanh nhà nơi dâm mát thuốc diazinon, fenthion, malathion, lindane, dieldrin,
chlordan.
-

Diệt chuột theo mùa, chú ý rắc thuốc diệt mò trước.

-

Phát quang thảm thực vật quanh nhà chọn lọc các đám thực vật có nhiều

ấu trùng mò (đảo mò).
1.2.

Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi

1.2.1. Đặc điểm sinh học
Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là bệnh sốt mò ở
Việt Nam. Orientia tsutsugamushi (còn có tên Rickettsia orientalis, hoặc Rickettsia
tsutsugamushi) là một loài trong nhóm Rickettsia thuộc Giới Bacteria, Ngành
Proteobacteria, Lớp Alphaproteobacteria, Bộ Rickettsiales, Họ Rickettsiaceae, Giống

10


Orientia (Pinkerton, 1936) [129, 26]. Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008),
chi Rickettsia có 24 loài gây bệnh và chi Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia
tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi).
Vi khuẩn O. tsutsugamushi có hệ hô hấp độc lập, có hệ thống men nhưng
không hoàn chỉnh nên phải sống ký sinh trong tế bào vật chủ, vì vậy chúng lệ thuộc
hoàn toàn vào carbohydrate của tế bào vật chủ để lấy năng lượng chuyển hoá. Nhuộm
giemsa bắt màu tím xanh, có hình cầu, hình que ngắn hoặc hình sợi, kích thước dài
1,2-3 µm, rộng 0,5-0,8 µm [128, 26]. Hiện nay, Orientia tsutsugamushi được xếp vào
lớp vi khuẩn gram âm (pleomorphis) [113, 129].

Hình 1.3. Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập và ký sinh
trong tế bào nội mô mạch máu

Orientia tsutsugamushi có sức đề kháng yếu, dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng
thông thường và nhiệt độ cao, trong môi trường bên ngoài và thuốc sát trùng thông
thường, dung dịch 0,1% formalehyde diệt trong vài giờ, sống lâu ở dạng đông khô
trong bảo quản lạnh -70℃. Sức đề kháng của Orientia tsutsugamushi là quá trình ức
chế tổng hợp peptidoglycan, kháng sinh nhóm betalactam, điều này có thể giải thích
sự thiếu hụt peptidoglycan trên thành tế bào vi khuẩn [29, 30, 112].

11


Nghiên cứu ở bệnh nhân sốt mò hoặc trên động vật thử nghiệm đều chỉ ra rằng
Orientia tsutsugamushi thường gây nhiễm vào các tế bào biểu mô, đại thực bào và
bạch cầu đa nhân trung tính. Sử dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch đối với Orientia
tsutsugamushi đã phát hiện sự suy giảm chất đánh dấu sau mỗi lần cấy chuyển trên
một dòng tế bào cảm nhiễm và sau 10 lần cấy chuyển liên tục thì không còn phát hiện
được chất đánh dấu. Tuy nhiên, khi Orientia tsutsugamushi được tiêm vào mặt sau
noãn của phôi gà, sau đó thu hồi lại cho thấy vẫn còn chất đánh dấu. Điều này cho
thấy Orientia tsutsugamushi phù hợp trong môi trường nuôi cấy invitro nhưng cấy
chuyển nhiều lần dẫn đến giảm bớt những kháng nguyên có khả năng sinh miễn dịch.
Orientia tsutsugamushi xâm nhập tế bào vật chủ nhờ quá trình thực bào của tế bào
bạch cầu [40]. Orientia tsutsugamushi bị bất hoạt bởi tia cực tím giúp chúng bám lên
màng tế bào, lúc này không có vai trò của quá trình thực bào. Sau khi bị thực bào thì
Orientia tsutsugamushi không bị tổn thương và được lưu giữ trong tế bào bạch cầu.
Trong trường hợp bạch cầu đa nhân trung tính, Orientia tsutsugamushi bị thực bào
một cách thụ động, bị hút vào tế bào bạch cầu đa nhân trung tính. Yếu tố độc lực liên
quan tới sự ly giải màng tế bào vi khuẩn của thể thực bào vẫn chưa được xác định,
cấu trúc vi khuẩn trong suốt quá trình thực bào không bị thay đổi, Orientia
tsutsugamushi không bị ảnh hưởng và trốn thoát khỏi thể thực bào và đặc biệt đi vào
trong vùng giàu glycogen trong tế bào chất của tế bào vật chủ. Tuy nhiên không thể
xác định rõ chức năng thực bào diễn ra như thế nào. Thời gian nhân đôi của Orientia

tsutsugamushi là khoảng 8 - 9 giờ. Orientia tsutsugamushi được giải phóng nhờ sự
bảo vệ của màng tế bào vật chủ ký sinh. Nó có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào hoặc
ngoài màng tế bào vật chủ ký sinh, từ đó xâm lấn vào các tế bào khác. Một số nghiên
cứu đã chứng minh sự tồn tại dai dẳng của Orientia tsutsugamushi ở mô trong thời
gian dài sau điều trị [119, 123].
Cấu trúc kháng nguyên có 2 loại:
Kháng nguyên đặc hiệu: Đặc hiệu cho từng typ riêng biệt, có nhiều typ kháng
nguyên khác nhau đại diện cho một địa phương hoặc một khu vực nào đó, giữa các

12


typ không có miễn dịch chéo, điều này đã gây khó khăn trong chẩn đoán và phòng
bệnh bằng văcxin.
Kháng nguyên không đặc hiệu: Orientia tsutsugamushi có một loại kháng
nguyên giống như kháng nguyên OX-K của vi khuẩn đường ruột Proteus mirabilis.
Vì vậy, các nhà khoa học đã sử dụng kháng nguyên OX-K của Proteus mirabilis để
phát hiện kháng thể ở bệnh nhân bị sốt mò (phản ứng Weil-Felix). Phản ứng này tuy
không đặc hiệu, độ hạy không cao nhưng thông dụng, dễ sản xuất, giá thành rẻ phù
hợp cho việc xét nghiệm sàng lọc phát hiện bệnh sốt mò tại tuyến cơ sở [56].
Ba kiểu gene (genotype) Orientia tsutsugamushi cổ điển là Karp, Kato và
Gilliam. Hiện nay có hơn 30 chủng huyết thanh khác đã được xác định. Các chủng
Orientia tsutsugamushi có tính chất kháng nguyên rất đa dạng, do có sự khác biệt
trong cấu trúc của các protein vỏ. Sự khác biệt về mặt kháng nguyên của các chủng
orientia có thể xác định bằng các phương pháp huyết thanh học và kỹ thuật sinh học
phân tử. Độc lực rất khác nhau tùy chủng: các chủng Orientia tsutsugamushi ở Nhật
Bản và Trung Quốc thường có độc lực cao và gây bệnh nặng hơn [84, 138].
Các nghiên cứu cho thấy Orientia tsutsugamushi chỉ có một đơn vị cấu trúc
hệ gene, với các trình tự gene lặp lại tỷ lệ rất cao, đây là sự khác biệt của vi sinh vật
ký sinh nội bào bắt buộc với các loại vi sinh vật khác. Những thông tin về hệ gene

liên quan tới sự hình thành cấu trúc tế bào Rickettsia và phương thức chuyển hóa của
Orientia tsutsugamushi là cơ sở phân tích sự khác biệt của Orientia tsutsugamushi
với các loài Rickettsia khác trong họ. Mặc dù, Orientia tsutsugamushi có kích thước
hệ gene lớn so với các loại rickettsia khác trong họ, nhưng phần lớn đó là các trình tự
lặp lại của các đoạn gene. Phương thức và con đường chuyển hóa của Orientia
tsutsugamushi tương tự như các loài rickettsia khác, nhưng đáng chú ý có sự khác
nhau trong một vài phương thức như: Chu trình chuyển hóa carbohydrate, chu trình
axit tricarboxylic và tổng hợp thành tế bào bằng hệ thống vận chuyển. Điều này liên
quan tới yếu tố độc lực và đặc điểm sinh lý của tác nhân vi sinh vật ký sinh nội bào.
Phân tích các loài rickettsia trên cơ sở kiểu hình (phenotype) và kiểu gene (genotype)

13


khác nhau cho thấy Orientia tsutsugamushi khác với các loài rickettsia khác trong
cấu trúc thành tế bào, kháng nguyên và kích cỡ của hệ gene. Trên cơ sở giải trình tự
hệ gene của Orientia tsutsugamushi cho thấy có trình tự gene lặp lại rất cao (khoảng
40% tổng số nucleotide của hệ gene) [61, 72].
Trên cơ sở dữ liệu giải trình tự gene của Orientia tsutsugamushi cho thấy có
trình tự hệ gene lặp lại cao tới 200 lần. Hơn nữa hệ gene của Orientia tsutsugamushi
có trên 400 gene vận chuyển, 60 phần gene DNA ngoại lai và 70 gene đóng vai trò
phiên mã ngược. Phân tích so sánh gene chuyển đổi trong hệ gene và dọc theo giải
trình tự gene cho thấy tính đồng nhất và gene chuyển đổi có tính đa dạng đó là: sự
tạo chuỗi xoắn, xóa bỏ và hợp thành trong cùng đoạn gene. Sự tương tác qua lại của
các gene với việc lặp của các đoạn gene dẫn đến sự thay đổi kích thước hệ gene của
các chủng Orientia tsutsugamushi khác nhau [45].
1.2.2. Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò
1.2.2.1.

Nguồn lây bệnh

Vi khuẩn Orientia tsutsugamushi có 2 ổ chứa trong tự nhiên là mò và các loài
gặm nhấm (chủ yếu là chuột), thỏ, lợn, gà, các loài chim,... [1, 14, 23, 25]. Ổ chứa
nguồn truyền nhiễm chủ yếu là mò nhiễm Orientia tsutsugamushi, mò có khả năng
truyền mầm bệnh cho các loài gặm nhấm và thú nhỏ, hoặc truyền dọc mầm bệnh qua
trứng sang các đời sau. Mò truyền ngẫu nhiên mầm bệnh sang người qua vết cắn của
ấu trùng mò khi đốt người [25].
Mò Trombiculidae thuộc họ ve bét (Acariformes), lớp nhện (Arachnida),
ngành chân đốt (Arthropoda); kích thước bé dưới 1 mm, mầu sắc từ vàng đến da cam;
phát triển qua 4 giai đoạn: trứng ấu trùng, nhộng và mò trưởng thành; ấu trùng là giai
đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở động vật có xương sống (chuột và thú nhỏ);
thời gian đốt kéo dài trung bình 48-72 giờ; đốt xong ấu trùng trở về mặt đất, trưởng
thành,và sinh sản ra thế hệ sau; chu kỳ sinh trưởng của mò dài 2-3 tháng (vùng ấm)
và trên 8 tháng (vùng lạnh); mò trưởng thành sống trung bình 15 tháng; ấu trùng chưa
đốt động vật có thể sống 30 ngày và có tầm di chuyển rất hạn chế cho nên ổ dịch sốt

14


mò thường có tính chất khư trú [8, 16].
Mò và ấu trùng mò ưa sống ở nơi đất xốp, ẩm mát trong các khe hang, ven bờ
sông suối, nơi dâm mát có bụi rậm và cây thấp có quả hạt để chờ thú nhỏ - gặm nhấm
tới ăn. Người có thể bị đốt khi sinh hoạt, lao động trong ổ dịch; Phát rẫy làm nương;
Bộ đội đi dã ngoại; Ngồi, nằm nghỉ, trên bãi cỏ, để mũ nón buộc võng vào gốc cây…
Hiện nay, đã xác định được trên 45 loài mò có thể mang tác nhân Orientia
tsutsugamushi truyền bệnh trong tự nhiên, nhưng chỉ có loài Leptotrombidium
pallidum, L. akamushi, L. scutellare, L. deliense, L. arenicola, L. imphalum, L.
chiangraiensis, L. fletcheri, L. gaohuensis, và L. pavlovsky đã được chứng minh là
véc tơ truyền bệnh sốt mò [42]. Các loài véc tơ chính phân bố theo các vùng dịch tễ
khác nhau: L. akamushi, L. pallidum, và L. scutellare là véc tơ truyền bệnh sốt mò ở

vùng ôn đới, như Nhật Bản và Hàn Quốc, trong khi L. deliense và L. arenicola là các
véc tơ chính ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới hay Đông Nam Á và Tây Nam
Thái Bình Dương [46].
Ở Việt Nam, đã thống kê được 106 loài mò thuộc 23 giống, 2 phân họ của
họ Trombiculidae. Có 17 loài đặc hữu cho khu hệ mò Việt Nam. Số lượng và giống
loài của khu hệ mò ở Việt Nam phong phú nhưng tập trung chủ yếu ở phân
họ Trombiculidae có 101 loài, chiếm 95,2% và giống Leptotrombilidium có 28 loài
chiếm 26,41%, giống Gahrliepia có 20 loài chiếm 18,81%, 21 giống còn lại chỉ 1-8
loài [9, 10].
Khu hệ mò ở Việt Nam chủ yếu tập trung ở cảnh quan đồi núi có 102 loài, ở
đồng bằng có 21 loài. Có 17 loài phát hiện ở cả cảnh quan đồng bằng và đồi núi.
Trong đó, có 5 loài mò được xác định truyền bệnh sốt mò, đó là Leptotrombidium
denliense,

Leptotrombidium

akamushi,

Leptotrombidium

scutellare, Ascoschoenggastia audyi, Ascoschoenggastia indica. Tuy nhiên, chỉ có
loài Leptotrombidium denliense phân lập được mầm bệnh [8] .

15