Kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
__________

BÁO CÁO THỰC TẬP
KIỂM NGHIỆM VI SINH


Mục lục

2


ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS
I.

Giới thiệu chung:
Coliforms là một loại vi khuẩn gram âm, hình que, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý,
không sinh bào tử, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ở 37 oC trong
24–48 giờ. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động
vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị bởi vì số lượng của chúng hiện
diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

trong thực phẩm.
II. Quy trình:
Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7)
Quy trình chuẩn:

10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng nhất mẫu dung dịch 10-1

Pha loãng mẫu thành 10-3 và 10-4

Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-3 và 10-4 vào đĩa petri, cấy 2 đĩa/ nồng độ

Đỗ vào 10-15 ml VRB đã đun tan và làm nguội đến 45oC chờ đông đặc đổ thêm khoảng 5 ml lên bề mặt chờ đông đặc

Lật ngược và ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ
Chọn và đếm khuẩn lạc có màu đen đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật

Chọn 5 khuẩn lạc đã đếm vcấy sang môi trường BGBL
Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ

3


Quy trình làm của nhóm: Không có bước cấy 5 khuẩn lạc sang môi trường BGBL trở
về sau (vì không xuất hiện khuẩn lạc ở cả 4 đĩa)
III. Kết quả:
Độ pha loãng F
10-3
10-4

Số khuẩn lạc N (CFU)
0
0
0
0

Vì không có khuẩn lạc nên không thực hiện bước xác nhận sinh hơi ở môi trường
BGBL và tính theo công thức:

C≤

xR

N: là số khuẩn lạc (quy ước N=1)
R: là hệ số tỉ lệ xác nhận sinh hơi trong ống BGBL (quy ước R=1)
n: là số đĩa
V: là thể tích mẫu cấy vào đĩa
f: độ pha loãng
 C≤

IV.

1
2*1*10-3 + 2*1*10-4

*1 = 455 (CFU/g)

Kết luận:
- Coliforms tổng số / g trong mẫu thịt tươi là nhỏ hơn hoặc bằng 455 CFU/g
- Kết luận: Coliforms tổng số trong 1(g) mẫu nằm trong khoảng cho phép theo

TCVN 10-2 CFU
V. Biện luận:
- Môi trường VRB là môi trường tăng sinh chọn lọc Coliforms. Trong quá trình pha môi
trường thì không được hấp vô trùng mà cần phải cân vô trùng.
- Khuẩn lạc ở môi trường VRB có màu đỏ đậm và quầng tủa muối mật xung quanh. Màu
đỏ đậm của khẩn lạc là do Coliforms lên men lactose tạo acid nên làm cho chất chỉ thị
màu Nutral Red chuyển sang màu đỏ. Còn quầng tủa là sự kết tủa của muối mật do bị
acid hóa.
- Môi trường BGBL: Muối mật để ức chế vi khuẩn Gram (+), brilliant green dùng để chọn

lọc vi khuẩn Gram (-), hình que (Coliforms).
- Dùng môi trường BGBL để xác nhận lại khả năng sử dung lactose và sinh hơi của
Coliforms, từ đó khẳng định về sự xuất hiện của Coliforms trong mẫu.

4


ĐỊNH TÍNH E. coli GIẢ ĐỊNH
I.

Giới thiệu chung:
Faecal Coliforms (hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh
Indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5 oC trong canh Trypton. E. coli giả định là một
thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và
được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận
chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm trong mẫu môi

trường.
II. Quy trình:
Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7)
Quy trình chuẩn:

10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng nhất mẫu dung dịch 10-1

Cấy 1g (~10ml của 10-1) mẫu vào ống 10ml môi trường Luarylsulphate broth nồng độ đôi (LSB đôi)

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ
Quan sát thấy có sinh hơi dùng que cấy vòng cấy sang ống chứa 10ml môi trường EC broth

Ủ ở 44 ± 0.5oC trong 24 giờ

Quan sát thấy có sinh hơi dùng que cấy vòng cấy sang ống chứa 5ml canh trypton

Ủ ở 44 ± 0.5oC trong 24 giờ

Thử phản ứng indol bằng thuốc thử Kovac và quan sát kết quả
5


Quy trình làm của nhóm: Thực hiện các bước như trên
III. Kết quả:
- Môi trường LSB và EC broth đều sinh hơi.
- Phản ứng thử Indol dương tính (xuất hiện vòng màu đỏ trên mặt dung dịch).
IV. Kết luận:
Phát hiện E. coli giả định trong 1g mẫu
V. Biện luận:
- Vì đặc điểm của E. coli giả định là Colilform, có khả năng chịu nhiệt và sinh Indol
nên ta thực hiện theo quy trình trên với các môi trường:
• Môi trường LSB dùng để xác định Coliforms (vi khuẩn Gram (-) và sử dụng
lactose). Trong môi trường LSB có Lauryl Sulfate dùng để ức chế vi sinh vật
không phải là Coliforms với điều kiện là pH ổn định, ngoài ra trong môi trường
•

còn có lactose để xác nhận khả năng sinh hơi của Coliforms.
Môi trường EC broth dùng để chọn lọc ra E. coli giả định có khả năng chịu

nhiệt ở 44oC
• Canh trypton dùng để xác nhận E. coli có tryptophanase (tryptophanase phân
hủy tryptophan có trong canh trypton) => dùng thuốc thử Kovac’s để nhận biết.
Cơ chất chính tham gia phát hiện Indol trong môi trường nuôi cấy là pdimethyaminobanaldehyde. Chất này phản ứng với Indol tạo thành phức hợp
-

màu đỏ.
Trong quá trình thực tập nhận thấy ở định lượng Coliforms không có khuẩn lạc mọc
nhưng định tính E. coli giả định thì thấy có xuất hiện bởi vì những lí do sau:
• Nồng độ cấy để định lượng Coliform ít hơn rất nhiều so với E. coli giả định
Coliforms
E. coli giả định
1 ml mẫu ở nồng độ 10-3 và 10-4
10 ml mẫu ở nồng độ 10-1
• Do mẫu là thịt ở Satra foods nên sẽ được bảo quản ở nhiệt độ lạnh  vi sinh
vật sinh trưởng yếu và sau đó cấy thẳng vào môi trường tăng sinh chọn lọc
VRB mà không tăng sinh phục hồi  vi sinh vật chết
• Do trong quá trình thao tác sai  ảnh hưởng tới kết quả

6


ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus
I.

Giới thiệu chung:
Staphylococcus aureus (S. aureus) hay còn gọi là tụ cầu vàng, vi khuẩn gây ngộ
độc từ nhà bếp. S. aureus và vi khuẩn thuộc họ Micrococaceae, Gram (+), hình cầu,
cạnh tranh yếu với các vi sinh vật khác.
Trong tự nhiên S. aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các
loài động vật máu nóng. S. aureus là vi sinh vật có khả năng sản sinh một số loại độc
tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy ở 100oC trong 30 phút và tồn
tại lâu trong thực phẩm. Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4–6 giờ ủ
bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mữa và các triệu chứng
này kéo dài từ 6 – 8 giờ. Những thực phẩm dễ bị nhiễm tụ cầu vàng nhất bao

gồm trứng, thịt gia súc, gia cầm, salad (gồm trứng, cá ngừ, thịt gà, khoai tây, mỳ

ống), các loại bánh nướng có kem và các sản phẩm từ sữa.
II. Quy trình:
Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7)
Quy trình chuẩn:

7


10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng nhất mẫu dung dịch 10-1 pha loãng thành 10-2, 10-3

Trải 0.1 ml dung dịch mẫu pha loãng ở 10-3 lên đĩa Baird Parker Agar (2 đĩa)

Ủ ngược đĩa ở 37 ± 0.5oC trong 48 giờ
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi , màu đen và có 2 quầng (quầng trong đục, quầng ngoài trong) (N)

Dùng que cấy nhọn chuyển 5 khuẩn lạc đã đếm sang đĩa TSA được chia làm 6

Ủ ở 37 ± 0.5oC qua đêm
Dùng que cấy vòng cấy chuyển vào ống chứa 0.3 ml huyết tương

Ủ ở 37 ± 0.5oC và theo dõi sau 2,4,6,8 giờ. Nếu không có biểu hiện ngưng kết thì ủ tiếp đến 24 giờ

Quy trình làm của nhóm: Thực hiện các bước như trên
III. Kết quả:
Độ pha loãng f
10-3

Số khuẩn lạc N (CFU)

6 và >300

Sau 4 giờ thấy cả 5 ống đều đông tụ huyết tương.
 Tỷ lệ xác nhận: R = Số khuẩn lạc đông tụ huyết tương/ Số khuẩn lạc cấy = 5/5 =1

C=

xR
8


N: là số khuẩn lạc (vì N >300 nên ta lấy N=300)
R: là hệ số tỉ lệ xác nhận sinh hơi trong ống BGBL (R=1)
n: là số đĩa (n=2)
V: là thể tích mẫu cấy vào đĩa (V=0.1)
f: độ pha loãng (f=10-3)
300
 C=
*1 = 15*105 (CFU/g)
2*0.1*10-3
Kết luận:
Có 15*105 CFU S.aureus trong 1 gam mẫu
V. Biện luận:
Trong môi trường BPA có lithium chloride là thành phần chọn lọc ra S. aureus, trong
IV.

khi đó glycine và pyruvate là thành phần cần thiết cho sự phát triển của S. aureus.
Khuẩn lạc S. aureus có đặc điểm là tròn, lồi, đen, có 2 quầng nằm trên vùng môi
trường xung quanh (quầng trong đục, quầng ngoài trong):
• Màu đen S. aureus tiết enzyme coagulase khử tellurite trong dịch trứng thành

•

tellurium (có màu đen).
Quầng đục là do S. aureus tiết ra enzyme lipase phân giải lipid  tụ xung

-

quanh khuẩn lạc.
• Quầng trong là do S. aureus tiết enzyme lecithinate khử lecithin.
Môi trường TSA dùng để phục hồi S. aureus sau khi nuôi trong môi trường chọn lọc

-

BPA.
Phản ứng đông tụ huyết tương là do tính chất của enzyme coagulase có ở S. aureus.
Khi có sự hiện diện của enzyme này thì các cấu tử trong huyết tương kết hợp thành
từng khối hay từng cục.

ĐỊNH TÍNH Salmonella
I.

Giới thiệu chung:
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi
khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, di động
bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột. Hầu hết các loài Salmonella có thể
sinh H2S. Salmonella

không

lên

men lactose (trừ Salmonella

arizona)

và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và glucose.
9


Salmonella là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đứng hàng đầu trong số các vụ
ngộ độc do vi sinh vật. Số lượng Samonella đủ để gây ngộ độc là khi chúng hiện diện
cả triệu tế bào trong một gam thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra
thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh cho đến khi các triệu chứng
biểu hiện thường sau 12–36 giờ kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Triệu chứng
kéo dài ít nhất 2-7 ngày. Các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm Salmonella như thịt
gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các loại sản phẩm của trứng, thủy sản.
II. Quy trình:
Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7)
Quy trình chuẩn:

10


Lysine Decarbo-xylase Broth (LDC)
(+)
Manitol Phenol Red brothDùng que cấy thẳng cấy mẫu vào KIA
Urea Broth

Canh trypton

Ủ ở 37 ± 0.5oC trong 24 giờ và quan sát

C

11


Quy trình làm của nhóm: làm tới bước phân lập trên XLD (vì không có khuẩn lạc
nên không thể thử nghiệm sinh hóa)
III. Kết quả:
 Cấy trên môi trường tăng sinh chọn lọc RV:
- Đối chứng: Ống nghiệm đục
- Mẫu: Ống nghiệm đục
 Phân lập trên môi trường XLD:
- Đối chứng: Có khuẩn lạc đặc trưng
- Mẫu: Không có khuẩn lạc đặc trưng
 Thử nghiệm sinh hóa: Vì không có khuẩn lạc đặc trưng trên XLD nên ta không
thể tiến hành thử nghiệm sinh hóa
IV. Kết luận:
Không có Salmonella trong 25g mẫu thịt lợn
V. Biện luận:
Môi trường tăng sinh chọn lọc RV có malachite green oxalat là chất chọn lọc dùng
để ức chế các vi sinh vật khác ngoài Salmonella với điều kiện áp suất thẩm thấu cao,
-

đúng pH và đúng nhiệt độ (42oC)
Môi trường XLD dùng để phân lập Salmonella với đặc điểm nhận diện khuẩn lạc

-

trong suốt, có hoặc không có tâm đen.
Sở dĩ môi trường RV màu đục nhưng khi cấy trên môi trường XLD lại không có
khuẩn lạc là vì trong quá trình thao tác sai  kết quả bị sai hoặc số lượng Salmonella

-

trong RV quá ít  không xuất hiện khuẩn lạc.
Thử nghiệm sinh hóa nhằm khẳng định chính xác có Salmonella, trong đó:
• Ở thạch nghiêng KIA, đặc điểm là trên mặt thạch là màu đỏ, dưới màu vàng.
Sở dĩ có hiện tượng trên là do trong môi trường KIA chỉ có 0.1% glucose, 1%
lactose và pepton. Đầu tiên Salmonella lên men glucose trước tạo acid  làm
màu chất chỉ thị Phenol red chuyển thành màu vàng (Salmonella không sử
dụng được lactose), khi hết glucose thì Salmonella chuyển sang dùng pepton
trong điều kiện hiếu khí  tạo môi trường base trên mặt thạch  chất chỉ thị
chuyển thành màu đỏ, đỏ đậm
• Thử nghiệm manitol (dương tính): Vi khuẩn Salmonella có khả năng lên men
đường manitol sinh acid  làm cho chất chỉ thị Phenol red chuyển từ màu đỏ
sang vàng
• Thử nghiệm urea (âm tính): Khi có cơ chất urea trong môi trường, enzyme
urease được vi sinh vật tiết ra để phân giải urea tạo NH 3  làm cho môi trường
12


hóa kiềm chuyển sang màu đỏ. Vì Salmonella không có enzyme này nên không
thể phân giải urea do đó môi trường vẫn giữ nguyên màu.
• Thử nghiệm lysin (dương tính): Trong môi trường LDC có glucose và lysin
nên khi có Salmonella thì vi sinh vật này ưu tiên sử dụng glucose trước tạo môi
trường acid chuyển từ màu tím sang màu vàng, sau đó khi hết glucose,
Salmonella chuyển sang sử dụng lysin bằng cách tiết ra enzyme decarboxylase
 loại bỏ nhóm carboxyl  môi trường trở nên kìm chuyển từ vàng sang tím

(dương tính). Còn khi không có Salmonella thì những vi sinh vật khác chỉ sử
dụng glucose nên làm môi trường chuyển sang màu vàng (âm tính).
• Thử nghiệm Indol (âm tính): Canh trypton dùng để xác nhận có tryptophanase
(tryptophanase phân hủy tryptophan có trong canh trypton) => dùng thuốc thử
Kovac’s để nhận biết. Cơ chất chính tham gia phát hiện Indol trong môi trường
nuôi cấy là p-dimethyaminobanaldehyde. Chất này phản ứng với Indol tạo
thành phức hợp màu đỏ. Vì Salmonella không có enzyme tryptophanase nên sẽ
âm tính với thuốc thử Kovac’s.

13