Đề tài: Nghiên cứu tối ưu quá trình sấy vi khuẩn lactobacillus acidophillus

Mục lục
Phần A : Tổng quan đề tài nghiên cứu tốt nghiệp

5

I/Vai trò của vi khuẩn lactic:

5

II/ Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic

8

II.1/ Đặc điểm chung

8

II.2/ Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

8

II.3/ Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
vi khuẩn lactic

9

II.3.1. ảnh hưởng của các hợp chất vô cơ

9

II.3.2.ảnh hưởng của oxy

10

II.3.3.ảnh hưởng của Ph

10

II.3.4.ảnh hưởng của nhiệt độ

10

II.3.5. ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu

10

III/ Các phương pháp sấy khô vi khuẩn

11

III.1/ Cơ sở của phương pháp

11

III.2/ Một số phương pháp sấy khô vi khuẩn phổ biến

11

III.2.1. Sấy đông khô

11

III.2.2.Sấy chân không

12

III.2.3. Sấy phun

13

III.2.4 Sấy tầng sôI

13

III.3/ Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào vi khuẩn
sau khi sấy

14
III.3.1. Anh hưởng của chế độ sấy

14

III.3.2/ Anh hưởng của chủng giống.

15

III.3.3/ Anh hưởng của thành phần môi trường sinh trưởng16
III.3.3.1.Sự tích luỹ các chất hoà tan tương thích
SVTH: Nguyễn Thị Thường

16

1


III.3.3.2/ Những xử lý dưới mức gây chết.

17

III.3.4 Thành phần môI trường sấy

18

III.3.5. Bảo quản và hydrat

20

IV.Nội dung nghiên cứu trong đề tài

22

V.Phương pháp nghiên cứu:

22

1.Chuẩn bị môI trường nuôI cấy

22

2.Tiến hành nuối cấy

23

3.Ly tâm

23

4.Chuẩn bị môi trường sấy

23

5.Chuẩn bị mẫu sấy đông khô

23

6.Rehydrat

24

7.Đánh giá khả năng sống sót của tế

24

Tài liệu tham khảo

25

Phần B: Báo cáo thực tập tốt nghiệp

28

I Giới thiệu chung về nhà máy bia á Châu

29

I.1.tổ chức nhân sự

29

I.2 sơ đồ mặt bằng nhà máy

30

I.3.Tình hình nguyên liệu và phụ liệu

31

I.3.1.Nguyên liệu sản xuất chính:

31

I.3.2 Nguồn cung cấp năng lượng

31

I.4.Sản phẩm

32

I.4.1. Bao bì:

32

I.4.2. Đóng gói:

32

II/ Thuyết minh dây chuyền

34

Phần I: Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu

34

A. Nguyên liệu

34

SVTH: Nguyễn Thị Thường

2


1. Malt đại mạch.
1.1 Chỉ tiêu cảm quan:
1.2Chỉ số cơ học:
2. Gạo
2.1 Yêu cầu chung về gạo
2.2.Thành phần hoá học của gạo

34
34
34
35
35
35

3. Hoa houblon

35

3.1 Yêu cầu của hoa houblon

35

3.2.Thành phần hoá học của hoa houblon

36

4. Nước

36

B. Xử lý nguyên liệu

37

1. Nghiền malt
2 Nghiền gạo.
Phần II: Phân xưởng nấu

II.1 Hồ hoá
II.2 Đường hoá.
II.3 Lọc dịch đường
II.4/ Nấu hoa ( hoa houbol hoá dịch đường)
II.5/ Lắng trong và làm lạnh sơ bộ dịch đường
II.6/Làm lạnh nhanh
Phần III: Phân xưởng lên men
III.1 Gây men giống:
III.2 Lên men:
III.3 Lọc trong bia
Phần IV. Phân xưởng chiết chai
IV.1 Máy rửa chai
IV.2Máy rửa két
IV.3 Chiết bia
IV.4 Thanh Trùng
IV.5. máy dán nhãn
Phần V . Phân Xưởng phụ trợ
V.1.Hệ thống xử lí nước RO

37
39
41
41
43
44
45
48
49
50
50

51
54
57
57
58
59
60
60
61
61

SVTH: Nguyễn Thị Thường

3


V.2 ChÕ ®é vÖ sinh thiÕt BÞ (hÖ thèng CIP)
V.3 hÖ thèng xö lÝ n­íc th¶I

SVTH: NguyÔn ThÞ Th­êng

61
64

4


Phần A : Tổng quan đề tài nghiên cứu tốt nghiệp
I/Vai trò của vi khuẩn lactic:
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực

phẩm, trong công nghiệp sản xuất axit lactic, nông nghiệp và các sản phẩm
probiotic điều trị các bệnh đường ruột ở người, động vật và bảo quản.
Trong công nghiệp thực phẩm, các quá trình lên men lactic để chế
biến rau quả, thịt, cá vừa nhằm mục đích bảo quản vừa đem lại cho
sản phẩm các tính chất và hương vị hấp dẫn.
Trong công nghiệp người ta thường sử dụng loài vi khuẩn
Lactobacilus delbrueckii và loài L. coagulas để sản xuất axit lactic
và các loại lactat. Axit lactic được sử dụng như một chất gia vị để bổ
sung vào các đồ uống nhẹ, dịch quả, mứt và siro cũng như trong
ngành đồ hộp rau quả và cá. Muối của axit lactic (muối canxi hay
muối sắt) có tác dụng điều trị, bổ sung các chất khoáng thiếu hụt
trong cơ thể
Trong chăn nuôi thức ăn gia súc: Quá trình lên men lactic dùng để ủ
chua thức ăn. Nhờ quá trình ủ chua này mà thức ăn có thể giữ được
lâu ở trạng thái tươi đồng thời không những không làm giảm giá trị
dinh dưỡng mà còn làm tăng hàm lượng vitamin trong thức ăn so với
trước khi ủ.
Trong y dược: các vi khuẩn lactic được sử dụng như các probiotic.
Trong ruột chỉ có khoảng 1% trong số hơn 400 loài vi khuẩn khác
nhau là có hại. Còn lại phần lớn các vi khuẩn đường ruột là có ích,
chúng được chế biến thành chế phẩm tế bào ở dạng khô, gọi là các
probiotic.

SVTH: Nguyễn Thị Thường

5


Chế phẩm probiotic là các tế bào vi sinh vật có ích đã được tách nước
đến độ ẩm nhất định, bảo quản ở dạng khô, các tế bào có thể được tái sinh

bằng cách cho tế bào hoạt hoá nước trở lại (rehydrat) trong môi trường.
Các vi khuẩn probiotic này giúp cải thiện sức khoẻ bằng cách:


hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại (chúng tạo ra những chất
gồm axit lactic, axit axetic, axit benzoic, hydroperoxit và các chất kháng
sinh tự nhiên làm hạn chế sự sinh sản của vi khuẩn gây bệnh nào đó).




thúc đẩy sự tiêu hoá và tăng cường sức đề kháng nhiễm trùng.
Phần lớn các probiotic đã được tiêu thụ như một khẩu phần ăn có vi sinh
vật, như sữa có Lb. acidophilus, sữa chua, sữa đậu



Thực tế, các vi sinh vật không thể sống quá lâu trong đại tràng, chúng
sẽ vị thải ra ngoài cùng với phân, do đó việc bổ sung thường xuyên các
sản phẩm thực phẩm chứa probiotic là một giải pháp hữu hiệu để duy trì
khu hệ vi sinh vật đường ruột khoẻ mạnh [30,31,34,39].



Đối với những người sau khi sử dụng thuốc kháng sinh thì các sản phẩm
thực phẩm có chứa probiotic là một giải pháp khôi phục lại hệ vi khuẩn
đường ruột một cách nhanh nhất, giúp duy trì một hệ tiêu hoá khoẻ
mạnh [27,46].

ứng dụng chế phẩm probiotic vào môi trường nuôi cá.

Trong nông nghiệp, nuôi cá nước ngọt chiếm một quy mô khá lớn.Thế
nhưng số lượng các bệnh do vi sinh vật gây ra ở cá ngày một gia tăng. Đã
có nhiều nghiên cứu để phát hiện các vi sinh vật có hại trong hệ thống tiêu
hoá của cá và các phương pháp điều khiển chúng, nhưng lại có rất ít các
công trình nghiên cứu đề cập đến những vi sinh vật có ích với cá, đặc biệt là
nhóm vi khuẩn lactic và tác dụng của chúng với cá. Các chế phẩm probiotic
chứa vi khuẩn lactic có thể sử dụng như những chất kháng sinh bổ sung vào
môi trường giúp ngăn chặn các nhân tố gây bệnh và thúc đẩy sự sinh
trưởng, phát triển của cá.
SVTH: Nguyễn Thị Thường

6


Một số chủng probiotic được sử dụng phổ biến :

Carnobacterium divergens : loài này được phân lập từ cá hồi
Atlantic, ban đầu có tên là Lactobacillus plantarum. Các thí nghiệm in
vitro cho thấy Carnobacterium divergens kìm hãm Vibrio anguillarum,
Vibrio salmonicida và Proteus vulgaris.
Các thí nghiệm in vitro cho thấy Carnobacterium divergens cấy
cho ấu trùng mới nở, sau 5 ngày chúng chiếm 70% số lượng hệ vi sinh vật
của ấu trùng, trong khi đó hệ vi sinh vật của các ấu trùng không được cấy
Car. divergens có thành phần nổi trội là các nhóm cơ hội
Cytophaga/Flexibacter (45%) và Pseudomonas sp (45%).

Carnobacterium sp. K1 : chủng này được phân lập từ đường ống
tiêu hoá của cá hồi non. Nó có khă năng chống lại Aeromonas hydrophila,
A. salmonicida, Flavobacterium psychrophilum, Photobacterium damselae,
Streptococcus milleri, Vibrio anguillarum và V. rodalii. Một số thí nghiệm

in vitro cho thấy Carnobacterium sp. K1 theo đường miệng thâm nhập vào
cá, bám chặt vào dịch ruột, sống sót và tồn tại một số ngày (> 10 6 CFU/g
phân), kìm hãm Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida(ở cá chép) và
A. salmonicida, Yersinia ruckerii (ở cá trắm đen).

Lactobacillus rhamnosus (ATCC 53103) : được phân lập từ người
và có khả năng kháng lại A. salmonicida.

Lactobacillus sp. DS-12 (Weissella hellenica) : được phân lập từ
ruột cá bơn, có khả năng chống lại Edwardsiella tarda, Pasteurella piscida,
Aeromonas hydrophila và Vibrio anguillarum, chịu được nồng độ muối
mật 10% và chịu axit (pH 3 trong 90 phút).
Trong số các vi sinh vật đường ruột, Lactobacillus acidophilus cũng là
vi sinh vật đường ruột có ích được biết đén nhiều. Đó là vi khuẩn có ích nổi
trội nhất trong dịch ruột trước, chúng có dạng hình que tròn ở hai đầu, kích
SVTH: Nguyễn Thị Thường

7


thước 0,6 -0,9 x 1,5 m. Nó giúp làm giảm mức độ có mặt của các vi
khuẩn, nấm men có hại trong ruột nhỏ, sinh ra enzym lactaza - một enzym
quan trọng đối với sự tiêu hoá sữa và sinh ra các VTM B (niacin, axit folic
và piridoxin) trong quá trình tiêu hoá [29,30,34].

II/ Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic
II.1/ Đặc điểm chung
Chúng là những vi khuẩn Gram(+), không sinh bào tử, catalaza âm
tính, oxydaza âm tính, khử nitrat âm tính và hầu hết đều không di động.
Chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các pocphyrin, chúng

không chứa các xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi có mặt oxy, là
loại cơ thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như kị khí [1 ] .
II.2/ Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn Lactic có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tap., ngoài nguồn
cacbon, nitơ, còn phảI có các yếu tố tăng trưởng như VTM B, các axits
amin, bazơ pyruvic, pyrimic. Đó là lý do giảI thích cho sự phân bố rộng rãI
cùa vi khuẩn này trong môI trường giàu dinh dưỡng như sữa. Vì vậy môI
trường nuôI cấy vi khuẩn Lactic thường dùng là môI truờng MRS. [1 ].

a)Nguồn cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nguồn cacbon từ nhiều loại
hydratcacbon khác nhau như các hexoza (glucoza, fructoza, mannoza,
galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza, trehalose ) và cả các
polysacarit (tinh bột). Ngoài ra LAB còn sử dụng cả cellobiose, Melibiose,
raffinose [2 ]. Tuy nhiên, nguồn cacbon quan trọng nhất đối với vi khuẩn
lactic vẫn là monosaccarit và disaccarit, chúng được dùng để cung cấp
năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit
lactic, malic, pyruvic, fumaric, axetic...

b) Nguồn nitơ
SVTH: Nguyễn Thị Thường

8


Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các
hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ, còn lại phần lớn các vi khuẩn
lactic không thể tham gia phản ứng phosphỏyl hoá nên những loài này thì
chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chính vì vậy,
ngoài nguồn dinh dưỡng là axit amin, trong môi trường nuôi cấy người ta

còn bổ sung các hợp chất chứa nitơ như: pepton, cao thịt, cao men,
casein...[3]

c) Nguồn cung cấp vitamin cho vi khuẩn lactic
Hầu hết các vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các vitamin. Vì
vậy, trong suốt quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic người ta phải bổ sung các
nguồn cơ chất chứa nhiều vitamin vào môI trường.
Tuy nhiên, nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào loài vi
khuẩn, môi trường và điều kiện nuôi cấy ví dụ như L. fermenti cần nhiều
B1, L. casei cần nhiều B2 để tạo FAD, FMN; L. lactIS cần nhiều B12; l.
Arabinosus cần nhiều biotin[2]

d) Các muối vô cơ và các hợp chất hữu cơ cần thiết khác
Lactobacillus đòi hỏi những inon Mg+2, Mn+2 để sinh trưởng và phát
triển [1]. Ion .Mn+2 đóng vai trò trong việc bảo vệ chúng khỏi các tác đọng
bất lợi của oxy. Ngoài ra các muối NaH2PO4, Na2HPO4 Còn đóng vai trò
tạo môI trường đệm cho chúng trong quá trưởng sinh trưởng phát triển. Axit
oleic cũng rất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Vì vậy, người
ta thường bổ sung Tween 80 - một dẫn xuất của axit oleic vào môi trường
nuôi cấy [3].
II.3/ Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi
khuẩn lactic
II.3.1. ảnh hưởng của các hợp chất vô cơ

SVTH: Nguyễn Thị Thường

9


Phốt phát là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu

cầu. .Hợp chất mangan ngăn cản sự tự phân của tế bào, tham gia vào cấu
trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzym, giải độc các tế bào khỏi
sự có mặt của oxy. Mn2+ thay thế dioxit dimustaza để thải các gốc O2-, mặt
khác mangan còn tham gia vào sự ổn định cấu trúc của riboxom .

II.3.2.ảnh hưởng của oxy
Vi khuẩn lactic là loài hô hấp tuỳ tiện, nhưng chủ yếu là kỵ khí và vi
hiếu khí.

II.3.3.ảnh hưởng của pH
Các loài vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra lượng axit rất khác nhau
trong môi trường. Chính vì vậy, sức chịu axit của chúng rất khác nhau.
Lactobacillus acidophillus có pH hoạt động là 4.0 6.8 ; pH tối ưu là 5.8
6.6 [1]. Trong quá trình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác
dụng ức chế các loại vi sinh vật khác, sau đó khi lượng axit tích luỹ đủ lớn
thì ức chế luôn cả chính bản thân vi khuẩn lactic.

II.3.4.ảnh hưởng của nhiệt độ
Khoảng nhiệt độ phát triển của Lactobacillus acidophillus là khá
rộng từ 15 45 0C, dưới 15 oC chúng không phát triển được[ 2]. Chúng
khá nhạy cảm với nhiệt độ, số lượng tế bào giảm mạnh khi nhiệt độ tăng
hoặc giảm ngoài giới hạn.
II.3.5. ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu
Màng tế bào vi khuản là màng bán thấm. Hoạt động trao đổi chất qua
màng tế bào phụ thuộc vào hệ enzym pecmeraza nằm trên màng và áp suất
thẩm thấu mỗi cơ chất có trong môi trường. áp suất thẩm thấu của môi
trường tỷ lệ với nồng độ chất khô hoà tan trong môi trường. Ngườita nhận
thấy hàm lượng NaCl lớn hơn 5% thì phần lớn các vi khuẩn lactic

SVTH: Nguyễn Thị Thường

10


không phát triển, trừ Enterococcus có thể chịu hàm lượng muối lên tới
6,5% ở pH = 9,5[28].
III/ Các phương pháp sấy khô vi khuẩn
Để tạo chế phẩm probiotic, người ta tiến hành tách nước tế bào vi
khuẩn, có thế nói khi đó tế bào ở trạng thái tiềm sinh. Có nhiều phương
pháp để tách nước khỏi tế bào vi sinh vật nhưng tách nước khỏi tế bào bằng
phương pháp sấy khô đang phát triển mạnh mẽ và trở thành một lĩnh vực
đầy triển vọng. Tuy nhiên do vi khuẩn lactic có khả năng sống sót kém dưới
những thay đổi bất lợi của môi trường nên vấn đề đặt ra là tìm điều kiện
thích hợp cho quá trình sấy vi khuẩn Lactobacillus acidophillus để thu được
chế phẩm thô có tỷ lệ tế bào sống cao nhất đồng thời giữ nguyên được các
tính chất ban đầu của chúng.
III.1/ Cơ sở của phương pháp
Nước chiếm 70 - 80% trọng lượng tế bào vi sinh vật trong đó một phần
ở trạng thái liên kết( nghĩa là tạo thành dạng keo của tế bào và tham vào
cấu trúc tế bào) một phần ở trạng thái tự do ( dạng dung dịch các hợp chất
hữu cơ, vô cơ hình thành trong tế bào liên quan đến quá trình trao đổi chất).
Nước trong tế bào là môi trường hoạt động cho rất nhiều các phản ứng
hoá sinh xảy ra trong quá trình trao đổi chất như các phản ứng tổng hợp và
phân huỷ các thành phần cấu trúc tế bào. Nếu lượng nước trong tế bào bị
mất đi ít hay nhiều đều làm cho chúng không xảy ra được hoặc xảy ra một
cách hết sức chậm chạp. Tế bào bị mất nước thì các hoạt động trao đổi chất
cũng như các quá trình oxy hoábị đình trệ, có thể nói "tế bào ở trạng thái
tiềm sinh". Từ cơ sở đó người ta đã đề xuất phương pháp bảo quản khô vi
khuẩn bằng cách loại nước khỏi tế bào .
III.2/ Một số phương pháp sấy khô vi khuẩn phổ biến

III.2.1. Sấy đông khô

SVTH: Nguyễn Thị Thường

11


Trong phương pháp sấy này, nước được tách một cách đặc biệt ra
khỏi tế bào, chúng được chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi
không qua trạng thái lỏng và đi ra khỏi tế bào. Vật liệu sấy được sấy
trong môi trường chân không cao [5] ( với áp suất nhỏ hơn 256 mmHg,
nhiệt độ sấy có thể đạt -80 0C). Do đó, có thể ngăn chặn được nguy cơ phá
huỷ bởi nhiệt độ, các phân tử không kết hợp lại với nhau khi cô đặc tránh
được các quá trình vi sinh vật xảy ra làm giảm chất lượng sản phẩm sấy.
Vật liệu sấy trước khi sấy được làm lạnh đông sâu nhanh nhằm
chuyển toàn bộ nước có trong vật liệu sang trạng thái rắn, các cấu tử hoà
tan được cố định sao cho không kết hợp lại với nhau. Dưới áp suất rất thấp
nước sẽ bay hơi, hơi ẩm sẽ bay sang thiết bị ngưng tụ và ngưng tụ thành
nước đá. Thiết bị ngưng tụ này được làm lạnh bằng nước muối có nhiệt độ
vào là - 10 0C và nhiệt độ ra là 40 0C. Trong quá trình làm lạnh sâu, vi
sinh vật có thể bị chết . Nguyên nhân chính làm chết tế bào vi khuẩn trong
sấy đông khô là do sự tạo thành các tinh thể đá, áp suất thăm thấu trong tế
bào tăng lên nhiều do nồng độ chất hoà tan trong tế bào tăng cao. Chính sự
tăng áp suất thẩm thấu này làm cho màng tế bào bị phá huỷ, gây biến tính
cũng như làm mất tính chất ưa nước của các phần tử có phân tử lượng cao
trong tế bào [6]. Vì vậy để khắc phục ta hiện tượng này người ta sử dụng
các chất độn (chất mang) để nhũ hoá keo bảo vệ tế bào. Các chất độn
thường sử dụng là sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, pepton, muxin hay
các loại đường, betain, glycerol, dimethylssunphoaxit.[7], [19].
Đây là một phương pháp được chứng minh là cho tỷ lệ sống sót của

tế bào một số loài vi khuẩn sau khi sấy là cao nhất. Phần trăm số lượng tế
bào sống sót cao (khoảng 90%) tuỳ theo từng loại chất độn được bổ sung
[5].
III.2.2.Sấy chân không

SVTH: Nguyễn Thị Thường

12


Phương pháp sấy chân không được thực hiện dựa trên nguyên tắc :
áp suất hơi bão hoà giảm thì nhiệt độ sôi giảm và ngược lại. Do đó, người ta
tiến hành sấy ở áp suất thấp nhằm giảm nhiệt độ sấy để thu được tỷ lệ tế
bào vi khuẩn sống sót sau khi sấy cao .
Phương pháp sấy chân không thấy là cho tỷ lệ tế bào sống sót nhỏ
hơn so với phương pháp sấy đông khô. Phương pháp này được áp dụng khi
độ ẩm vật liệu không quá cao, khi đó thời gian sấy sẽ không quá lâu, ảnh
hưởng đến sự sống của tế bào. Phương pháp này ít được sử dụng do tỷ lệ tế
bào sống sótứau khi sấy không cao lắm, khoảng 60 - 70%, do độ ẩm vật
liệu trước khi sấy không cao thì sự phối trộn giữa vật liệu sấy và chất mang
không đều khiến chất mang sẽ không phát huy được khả năng bảo vệ của
mình.
III.2.3. Sấy phun:
Là phương pháp sấy dựa trên nguyên tắc bay hơi ẩm nhờ sự chênh
lệch nhiệt độ giữa vật liệu và tác nhân sấy. Tác nhân sấy thường là không
khí nóng, nhiệt độ đầu vào là 100 - 120 0C, nhiệt độ đầu ra là 60 - 90 0C.
Trong các phương pháp sấy thì sấy phun là phương pháp sấy có số
lượng tế bào sống thấp nhất, hầu như là dưới 60%, thậm chí có thể dưới
30%. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu cho thấy, chế phẩm sấy phun có thời hạn
sử dụng ngắn, số tế bào chết tăng nhanh trong quá trình bảo quản do đã bị

suy yếu trong quá trình sấy và không đủ khả năng chống chịu tiếp trong khi
bảo quản, tỷ lệ tế bào chết có thể lên đến 70 -79% sau 2-3 tháng bảo quản ,
tuy nhiên chúng không cần sử dụng các tác nhân bảo vệ làm môI trường sấy
nên giảm giá thành sản phẩm so với sấy đông khô[21].
III.2.4 Sấy tầng sôi:
Sấy tầng sôi là phương pháp sấy dùng không khí nóng hoặc hơi nước
làm tác nhân sấy có nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ phù hợp chuyển động chảy
trùm lên vật liệu sấy làm cho nước trong vật liệu sấy bay hơi rồi đi theo tác
SVTH: Nguyễn Thị Thường

13


nhân sấy. Sau thời gian sấy nào đó ta thu được sản phẩm sấy có độ ẩm theo
yêu cầu. Dòng khí nóng chảy qua các lớp vật liệu sấy dưới những điều kiện
xác định về tốc độ và hướng để tạo nên một trạng thái sôi, chúng có thể
được cung cấp các ống xen vào giữa lớp vật liệu sấy.
Trong phương pháp sấy tầng sôi, vật liệu sấy có thể trải qua các quá
trình : sấy khô, làm nguội, kết tụ và tạo các hạt. Quá trình kết tụ và tạo hạt
có thể được thực hiện theo nhiều cách khác nhau tuỳ thuộc vào dạng vật
liệu sấy và tính chất của sản phẩm cần đạt được. Thông thường, đối với vật
liệu sấy là tế bào vi sinh vật thì người ta trộn sinh khối tế bào với các loại
chất độn khác nhau trước rồi mới đưa vào sấy.
Phương pháp sấy tầng sôi có ưu điểm là cho phép sấy ở nhiệt độ thấp,
thời gian ngắn và thời gian làm nguội sản phẩm nhanh, chúng thích hợp cho
cả các vật liệu sấy dễ bị hoặc không bị tổn thương bởi nhiệt. Phương pháp
này hiện nay đang được ứng dụng nhiều trong thực tế .
III.3/ Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào vi khuẩn sau
khi sấy
III.3.1. Anh hưởng của chế độ sấy

Các phương pháp sấy khác nhau cho tỷ lệ tế bào sống sau khi sấy khác
nhau. Các yếu tố của chế độ sấy bao gồm: kiểu tách nước ra khỏi tế bào,
nhiệt độ sấy, thời gian sấy, hàm lượng ẩm còn lại sau khi sấy ...ảnh hưởng
trực tiếp đến hoạt độ nước của tế bào, đến sự tổn thương các thành phần tế
bầo.
Hoạt độ của nước là một yếu tốquan trọng tác động đến hoạt đông sinh
lý và trao đổi chất của vi sinh vật [17]. Trong quá trình sấy nếu aw giảm
chậm thì sẽ cho phép cảI thiện một cách có ý nghĩa khă năng sống sót của
tế bào , ngược lại tốc độ tách nước ra khỏi tế bào càng lớn, hoạt độ nước
của tế bào bị giảm đột ngột, tế bào dễ bị sốc và chết. Nghiên cứu về L.
plantarum trong phương pháp sấyphun cho thấy , để đạt được cùng một
SVTH: Nguyễn Thị Thường

14


hoạt độ nước cuối cùng là aw = 0.29 , nếu thực hện sock nhệt thí % tế bào
sóng là 41%; nếu thời gian sấy kéo dài tới 135 phút thì đạt được 85 % tế
bào sóng sót[8]
Vi khuẩn Lactic rất nhạy cảm với nhiệt độ, đặc biệt là khi nhiệt đô lớn hơn
450C. Vì vậy nhiệt dộ sấy càng thấp thì cho khả năng sống sót càng cao.
Nghiên cứu thực hiền sấy chân không L. bungraricus ( t = 150 phút) cho
thấy [24]
Nhiệt độ

300C

350C

400C

450C

Tỷ lệ sống sót( n/no)

o.95

0.9

0.85

0.5

Nhiệt độ sấy cao gây biến tính protein, oxy hoá các chất béo, tác động
xấu đến không bào, ribosome , gây kết tụ phân tử AND, thay đổi khả năng
hoà tan của một số ổtein hoặc gây ra các tổn thương khó hồi phục cho tế
bào, làm chết tế bào. [8].
Trong sấy đông khô, trong qúa trình làm lạnh và làm tan giá liên quan
tới sự phá huỷ màng tế bào sinh vật ( sự tạo lỗ hổngtrên màng tế bào, làm
nứt , vỡ tế bào). Với sấy phun, khả năng sống sót của LAB càng giảm khi
nhiệt độ ra của tác nhân sấy càng cao.
Thời gian sấy cũng là một yếu tố quan trọng, thời gian tiếp xúc với các
điều kiện bất lợi càng lâu, khả năng sống sót của tế bào càng giảm [20]. Do
vậy, việc lựa chọn phương pháp sấy có thời gian sấy ngắn và nhiệt độ sấy
thấp là một điều hết sức có ý nghĩa.
III.3.2/ Anh hưởng của chủng giống.
Trong quá trình sấy đông khô và bảo quản ở trạng thái khô, các chủng
khác nhau của các giống khác nhau có tỷ lệ sóng sót khác nhau và mang
tính đặc hiệu của loài đó. Sự khác biệt này vẫn chưa được giải thích, tuy
nhien có một số giả thiết cho rằng:(i) có thể là do trình tự gen khác nhau

SVTH: Nguyễn Thị Thường

15


dẫn tới những thay đổi về kiểu hình của các chủng L. lactic; (ii) sự khác
nhau về cấu trúc và thành phần của màng và thành tế bào khác nhau dẫn tới
những tổn thương khác nhau.
III.3.3/ Anh hưởng của thành phần môi trường sinh trưởng
Các LAB sử dụng trong công nghiệp thực phẩm luôn phảI tiếp xúc
với các điều kiện áp lực bất lợi như nhiệt độ thấp, pH thấp, áp suất thẩm
thấu lớn Khi ở trạng thái này, màng tế bào chất cho phép vận chuyển nước
và ngăn cản hiệu quả sự vận chuỷên các chất hoà tan từ tế bào ra môI
trường ngoại bào. Khi áp suất của môI trường ngoài tăng đột ngột làm cho
nước thấm từ trong ra ngoài , điều đó làm giảm sự trương nở của tế bào, làm
biến dạng tế bào, thau đổi nồng độ các thành phần trong tế bào chất, làm
giảm thể tích tế bào. Ngược lại, khi có một sự sốc trương, nước từ môI
trường ngoại bào đI vào môI trường nội bào , làm tăng thể tích tế bào, tăng
áp lực trương nở. Cả hai sự thay đổi áp suất thẩm thấu này đều bất lợi đối
với tế bào vi khuẩn. Để sống sót được vi khuẩn phảI phát triển những
phương thức thích hợp để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa bên
trong tế bào và môi trường ngoài tế bào [33], [34],[35].
III.3.3.1.Sự tích luỹ các chất hoà tan tương thích
Các phản ứng thích nghi của vi khuẩn trong môI trường áp lực xảy ra
theo hai khía cạnh: một là chúng tích luỹ các tác nhân bảo vệ thẩm thấu với
nồng độ cao; hai là chúng tăng cường khả năng chịu đựng nhiều chiều với
các áp lực môI trường khác nhau [13], [22].
Các tác nhân bảo vệ thẩm thấu là các chất hữu cơ có thể được tích
luỹ với nồng độ cao trong tế bào chất, chúng không phản ứng với các thành
phầncủa tế bào, ở những điều kiện bất lợi thẩm thấu chúng làm cho tế bào

thiết lập lại được cân bằng thẩm thấu. Các tác nhân bảo vệ thẩm thấu này
còn được gọi là các chất hoà tan tương thích.

SVTH: Nguyễn Thị Thường

16


Các chất hoà tan tương thích này có thể được tích luỹ bằng con
đường sinh tổng hợp( các chất hoà tan tương thích nội sinh như glutamat,
proline) hoặc bằng cách hấp thụ từ môi trường ( chất hoà tan tương thích
ngoại sinh như glycine betaine, các disaccarit như sucro, maltose,
trehalose) [36], [22]. Một số vi khuẩn Lactic không có khả năng tổng hợp
các chất hoà tan tương thích, ví dụ như L. plantarum không tổng hợp được
glycine betaine, chất này được vận chuyển từ môI trường vào nội bào khi
tế bào bị sốc trương[32].
Môi trường MRS chứa nguồn axit amin tự do, cao thịt , cao nấm men,
các thành phần này cung cấp cho LAB một lượng lớn choline, carnitin,
dimethylsulfonoacetat
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng trong môI trường MRS có bổ sung
muối NaCl sẽ là tăng khả năng tạo chất hoà tan tương thích. Các phân tích
môI trường MRS bởi C- NMR quang phổ cho thấy, khi không bổ sung
muối vào thì những dấu hiệu tạo thành proline( chất hoà tan tương thích) rất
mờ nhạt ( các pick proline yếu), Còn khi bổ sung 1 Mol NaCl dấu hiệu tạo
thành glycine betaine rất rõ ràng [14]. Ngoài ra sự có mặt của NaCl trong
môI trường nuôi cấy cũng làm tăng tỷ lệ axit béo no/ axit béo chưa no (do
đó thúc đẩy sự tạo thành axit lactobacilic); đồng thời làm tăng tính thẩm
thấu các ion nhỏ như Ca+2, H+, Na+ nhưng cơ chế của này vẫn chưa đựoc
giảI thích rõ ràng [15].
Do vậy môi trường sinh trưởng cũng có những ảnh hưởng nhất

định lên khả năng sống sót của tế bào vi khuẩn trong quá trìng sây.
III.3.3.2/ Những xử lý dưới mức gây chết.
Dưới những điều liện sinh trưởng khắc nghiệt dưới mức gây chết, tế
bào vi khuẩn phảI phát triển hệ thống tự bảo vệ để sống sót, thích nghi. Hệ
thống tự bảo vệ này cố thể được tạo ra do đột biến gen để tế bào thích ứng

SVTH: Nguyễn Thị Thường

17


với những tác động lý hoá học bất lợi hoặc tế bào ở pha cân bằng có những
biến đổi thao các cachs khác nhau để đối phó với các áp lực môI trường.
Nghiên cứu của Waston etal năm 1998 về việc bỏ đói tế bào Gran (+)
Staphylococcus aureus ( sau 25 ngày nuôi cấy trong môI trường thiếu
glucose) tế bào vi khuẩn đã phát triển khả năng sống sót bằng cách giảm
kích thước tế bào.
Còn tế bào vi khuẩn E. faecalis đối phó với sự thiếu glucose bằng
cách tăng sự thẩm thấu các tác nhân bảo vệ thẩm thấu vào trong nội
bào[30].
Đối với L. lactis, khi có các tác động lý ghoá thì xảy ra sự đột biến các gen
liên quan tới sự tỏng hợp guanine nucleotit làm cho tế bào đột biến bền hơn
với các điều kiện áp lực đa chiều của môI trường trong suốt pha mũ.
III.3.4 Thành phần môI trường sấy
Sấy đông khô thường được sử dụng để bảo quản các mẫu sinh vật.
Tuy nhiên chúng lại dễ làm biến tính protein và do đó làm giảm tỷ lệ sống
của nhiều loại tế bào [40], [41].. Để ngăn chặn và làm giảm những hiện
tượng này các chất bảo vệ như sữa gấy, sucrose, trehalose
glycerol,dimethylsulfoxit được thêm vào các mẫu trước khi làm lạnh và
lạnh đông khô[42].Trong khi thêm những dung dịch trên để làm tăng số tế

bào sống trong những mẫu sấy đông khô, duy trì khả năng sống, thấp hơn
so với môi trườngban đầu [40].
Cơ chế trehalose bảo vệ sự sống sót tế bào vi khuẩn trong quá
trình sấy
Có 2 yêu cầu đối với các chất được sủ dụng trong môI trường sâý: là bào vệ
màng tế bào nguyên vẹn và bảo vệ cấu trúc protein trong suốt quá

SVTH: Nguyễn Thị Thường

18


trình sấy và rehydrat. Disacarit trehalose, sucrose đáp ứng đầy đủ được 2
yêu cầu này.
Trong quá trình sấy đông khô, khi nước được thoát khỏi màng chất béo
thì các nhóm có cực ở đầu được xích lại gần nhau, do đó làm tăng lực Van
der Walls ở các mạch vòng. Chính sự tăng tương tác Van der Walls này
thúc đẩy sự tạo thành trạng thái keo ở nhiệt độ phòng, điều này dẫn tới sự
phân tách riêng các thành phần của màng tế bào. Khi màng lipid khô được
rehydrat thì nó phải trải qua một giai đoan chuyển hoá từ trạng thái keo
sang trạng thái tinh thể lỏng, trong quá trình này có thể tạo ra các lỗ hổng
trên màng lipid. Những lỗ hổng này làm rò rỉ các chất tan trong tế bào ra
môI trường bên ngoài, làm chết tế bào. Khi thêm disacarit vào môI trường
trước khi sấy như trehalose sẽ làm giảm nhiệt độ chuyển hoá trạng thái của
màng tế bào khô bằng cách thay thế nước vào giữa các nhóm đầu của chất
béo, ngăn cản sự tạo thành lỗ hổng khi rehdrat.
Chính nhờ sự làm giảm nhiệt độ chuyển trạng thái của màng tế bào
khô mà trehalose và sucrose đã bảo vệ cả cấu trúc và chức năng của các
protein nhạy cảm trong suốt quá trình sấy. Do khi làm mất nước tế bào các
disaccarit taol liên kết hydro với các protein , do đó ngăn chặn sự biến tính

của protien , duy trì sự ổn định của protein trong quá trình sấy. Vì vậy, với
sự có mặt của trehalose, sucrose khi sấy thì dường như sự tăng khả năng
sống sót của vi khuẩn là do trehalose, sucrose làm giảm nhiệt độ chuyển
trạng thái của màng tế bào, và duy trì được cấu trúc của protein ở trạng thái
mất nước.
Khi sấy tế bào mà không sử dụng đường, cả E.coli, B.thurigiensis đều có
nhiệt độ chuyển hoá màng cao hơn nhiệt độ phòng., và những tế bào này
khi rehydrat bằng nứơc ở nhiệt độ phòng sẽ làm cho chúng chịu một trạng
thái chuyển hoá hướng nhiệt. Tuy nhiên khi sấy kho với sự có mặt của
trehalose, sucrose thì nhiệt độ chuyển hoá màng ở những tế bào mất nước
SVTH: Nguyễn Thị Thường

19


trở nên thấp hơn nhiệt độ phòng vì vậy khi rehydrat ở nhiệt độ phòng
chúng không bị chuyển trạng thái.
Tác dụng bảo vệ của sữa gầy:
Sữ bột gày ngăn cản sự tổn thương tế bào khi sấy bằng cách làm ổn
định các thành phần màng tế bào [19], hơn nữa protein của sữa có thể
tạo lớp vỏ bảo vệ cho các protein của thành tế bào, còn canxi trong sữa
làm tăng khả năng sống sót khi làm lạnh và đông khô tế bào [21].
Khi sấy đông khô L. salivarius[*]
+ nếu chỉ có sucrose : tăng khả năng sống sót 13% nhưng không bảo
vệ khả năng sống trong quá trình bảo quản, và giảm 4% khă năng sông
sau 3 tuần.
+Sữa bột gầy: tăng 22.4% khả năg sống sau khi sấy, duy trì jkhả năng
sống trong quá trình bảo quản.
+ Trehalose: ít nhất là 34% sống sót sau khi sấy.
+ Trehalose + sucre: > 78 % sống sót sau khi sấy.

+ Trehalose+ sữa gầy + sucre: 83 85% dsống sót sau khi sấy.
*Carvalho nhận thấy monosodium glutamat (MSG) khi được
dùng làm thành phần môi trường sấy đông khô cũng làm tăng khả năng
sóng của phần lớn các LAB , bảo quản cấu trúc protein của chúng
thông qua các phản ứng giữa nhóm axyl của chất bảo vệ với nhóm
COOH của các protein ở tế bào vi khuẩn, đồng thời MSG góp phần giữ
lại độ ẩm lớn của tế bào sau khi sấy.
III.3.5. Bảo quản và hydrat
Trong quá trình bảo quản các mẫu tế bào khô, tính ổn định của
chúng sẽ bị giảm, tỷ lệ sống sót sẽ cao hơn nếu nhiệt độ bảo quản thấp
hơn. Thêm vào đó các điều kiện bảo quản như áp suất, tiếp xúc với

SVTH: Nguyễn Thị Thường

20


ánh sáng và độ ẩm tương đối rõ ràng là rất quan trọng để hồi phục các
tế bào sấy khô.
* Đối với mẫu tế bào sau khi sấy đông khô
Chứa trong T0(0C) AW( %)

S.thermophilus(% B.longum(%
sống)

Túi

kim 4

loại

25

3

3 7.0 7.3

68 70

7.0 7.2

58 64

7.0 7.3

54 66

6.9 7.1

44 52

6.9 7.2

45 54

4.17
2.7

sống)

3.5
Chai thuỷ 4

3.23

tinh

3.2

25

3.4
Chai PET

4

3.27

25

3.1

6.8 7.0

33 - 39

3.6
Kết quả trên cho thấynhững mẫu tế bào khô được bảo quản ở nhiệt độ

4 0C, trong bóng tối thì tính ổn định của chúng cao hơn, tỷ lệ sông sót
cũng cao hơn.
ảnh hưởng của các điều kiên rehydrat
Một tế bào vi sinh vật sống sót qua nhiều khâu như làm lạnh, sấy khô
và bảo quản có thể giảm khả năng sống khi rehydrat hoá. Rehydrat là
một bước quan trọng phục hồi lại các vi sinh vật đã bị sấy khô, vì tế
bào đã bị tổn thương gần chết có thể không sửa chữa được những tổn
thương nếu chúng được rehydrat hoá dưới các điều kiện không thích
hợp (về phương diện áp suất thẩm thấu, pH và nguồn dinh dưỡng),
nhiệt độ rehydrat, thể tích rehydra.

SVTH: Nguyễn Thị Thường

21


Tuỳ thuộc vào từng chủng và phương pháp sấy đã sử dụng, thời gian
bảo quản mà các điều kiện rehydrat là khác nhau.
Nghiên cứu sấy phun L.plantarum , khi rehydrat ở 250C thì cho tỷ lệ tế
bào sống là 35 38%; còn khi rehydrat ở 37 0C thì tỷ lệ sống là 59
61% [8];
Tuy nhiên đối với các LAB sau khi sấy đông khô thì nhiệt độ
rehydrat thường vào khoảng 200C, nhiệt độ rehydrat càng cao tỷ lệ tế
bào hồi phục càng giảm.

IV.Nội dung nghiên cứu trong đề tài này là:
+ Khảo sát khả năng sống sót của chủng Lactobacillus acidophillus DH
trong các môi trường có hoạt độ nước khác nhau.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy, thời gian sấy trong phương
pháp sấy đông khô và sấy tầng sôi đến khả năng sống sót của chủng ci

khuẩn Lactobacillus acidophillus DH.
+ Nghiên cứu bổ sung vào môi trường sấy đông khô một số thành phần
có khả năng nâng cao khả năng sống của chủng Lactobacillus
acidophillus DH.
+ Nghiên cứu tính thích nghi của vi khuẩn Lactobacillus acidophillus
DH khi nuôi cấy trong môI trường MRS không bỏ sung NaCl, và trong
môI trường MRS có bổ sung NaCl nhằm tăng khả năng sống sót của
chúng khi sấy.
+ Nghiên cứu điều kiện thích hợp để rehydrat các tế bào sấy khô.

V.Phương pháp nghiên cứu:
1.Chuẩn bị môI trường nuôI cấy
Những tế bào vi khuẩn chủng Lactobacillus acidophillus DH được
nuối cấy trong môI trường MRS có bổ sung NaCl, và không bổ sung
SVTH: Nguyễn Thị Thường

22


NaCl. MôI trường sinh trưởng được giữ ổn định trong suốt quá trình
nuôi cấy.
MôI trường MRS:
pepton

10 g

Cao thịt 10g
Cao nấm men 5g;
Glucose 20 g;
Tween 80 1g; K2HPO4 2g;

Natriacetat 5g;
Amonicitrat 2g;
Mg.SO4.7H2O 0.2g;
MnSO4.H2O o.05 g;
Nước 1000ml;
pH = 6.2 6.5; agar 15 - 20 g; Hấp tiệt trùng môI
trường ở 1100C trong 20 phút( bằng máy hấp tiệt trùng)
2.Tiến hành nuối cấy cho đến cuối giai đoạn logarit ( trong tủ ấm).
3.Ly tâm 30 phút ở 4000 vòng/phút để thu được huyền phù vi khuẩn(
mật độ ít nhất là 108 tế bào/ ml), sau đó bảo quản lạnh ở 40C cho đến
khi thực hiện.( Băng máy ly tâm tách nước và tủ lạnh).
4.Chuẩn bị môi trường sấy với các mẫu ( % g/100ml)
+ 20% Sữa gầy
+ 20% sữa gầy + 10% monosodium glutamatnatri (MSG).
20% Sữa gầy
+ 10% sữa gầy + 10% monosodium glutamatnatri (MSG).
+10% sữa gầy + 60% đường saccarose
+10% sữa gầy + 60% đường saccarose
Sau đó cho môI trường sấy vào các ampoul, hấp tệit trùng ở
1150C trong 20 phút.( Dùng máy hấp tiệt trùng)
SVTH: Nguyễn Thị Thường

23


5.Chuẩn bị mẫu sấy đông khô: 0.1ml huyền phù vi khuần + o.1 ml
môI trường sấy cho vào ampoul( lấy bằng micropipet) , sau đó đem
lạnh đông ở -300C trong vòng từ 1 2h; sau đó làm lạnh đông sâu
tiếp trong 1 -2 giờ , tốc độ giảm nhiệt độ 1-2 0C/ phút , ở điều kiện
300C. Bảo quản ở 80C trong bóng tối.

6.Rehydrat: mẫu đông khô đựơc hồi phục bằng cách hoà trong môi
trường sinh trưởng ở dạng lỏng, ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tăng
trưởng của tế bào.
7.Đánh giá khả năng sống sót của tế bào: lấy mẫu trước khi sấy,
ngay sau khi sấy, sau khi hồi phục, đem pha loãng rồi cấy trên hộp
petri. Sau đó đếm khuẩn lạc. Đánh giá khả năng sống sót dựa vào Số
tế bào sống ngay sau khi sấy/ số tế bào sống trước khi sấy; và dựa
vào số tế bào sau khi bảo quản, hồi phục/ số tế bào sông trước khi
sấy.
Với sấy tầng sôi thì không qua giai đoạn lạnh đông, lạnh
đông sâu. hõn hợp huyền phù vi khuẩn được đem đI sấy
bằng thiết bị sấy tầng sôi.

SVTH: Nguyễn Thị Thường

24


Tµi liÖu tham kh¶o
[1] NguyÔn thÞ HiÒn, Microbiologie industrielle, parti I(2004 – 2005).
[2] NguyÔn thÞ HiÒn, Microbiologie industrielle, parti II+III(2004 – 2005).
[3] To Kim Anh, trav·u pratique (2004 – 2005).
[4] Gaber zayed, Yrjo H. Roos, Influnece of trehalose and moisture content
on survival of L. salivarius subjected to freeze – drying and storage,
process Biochemistry 39( 2004) 1081 – 1086.
[5] Victor Kollman, ph.D, Freeze – drying makes the diffirences, reseach
expriment s and innovations november 1995.
[6] Thammavongs B, corroler D, pranoff JM, Auffray Y, Boutibonnes P,
Physiological response of Enterococcus faecalis JH2 – 2 to cold sock
growth at low temperatures and freezing/ thawing challege, lett AppL,

Microbiol 1996; 23; 398 – 402.
[7] Castro HP, Teixeira PM, Kirby R. Evident of membrane damage in L.
Bungaricus foolowing freeze – drying , J.Appl Microbiol 1997; 82; 87 –
94.
[8] Pierre Andre Marechal, Patric Gervais , Survie des bacteries lactiques
sousmis µ la dÐhydratation importance de la cinÐtique de dÐhydratation.
[9] Vianney Pichereau, A xel Hartke, Yanick Auffray, Starvation and
osmotic stress induced multiresstances influence of extracellular
compounds, International Journal of food Microbiology 55 (2000) 19-25

SVTH: NguyÔn ThÞ Th­êng

25