tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
HISTAMINE

Người thực hiện

:

Lớp

:

Người hướng dẫn :

Nguyễn Minh Huệ
K59CNSTHB
PGS.TS. Nguyễn Hoàng Anh

1Hà Nội, 6/2018


NỘI DUNG TRÌNH BÀY

1. MỞ ĐẦU

2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

2


I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
NƯỚC MẮM

-

Là một loại gia vị truyền thống, có giá trị dinh dưỡng cao.
Là mặt hàng chính trong ngành thủy sản
Bộ tiêu chuẩn codex quy định hàm lượng histamine không vượt 400mg/l.
Nước mắm Việt Nam có hàm lượng từ 1000 – 3000 mg/l.
Cản trở con đường xuất khẩu ra nước ngoài

3


I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
HISTAMINE
SỰ PHÂN GIẢI HISTAMINE

Histamine oxidase
Histamine dehydrogenase

Histamine

-

Imidazol acetaldehyde

Bacillus amyloliquefacians và Staphylococus carnosus phân giải được 59,9% và 29,1% ( Zaman và cs, 2010).
L.sakei phân giải được 40-50% (Aishath Naila và cs, 2012)
Bacillus polymyxa cũng có khả năng phân giải histamine (Lee và cs, 2015,2016).

“ Tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine”

4


I. MỞ ĐẦU
1.2. Mục đích và yêu cầu

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn cao từ bộ sưu tập giống
Phòng TNTT

Tuyển chọn và định

Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn cao

danh các chủng vi
khuẩn có khả năng
phân giải histamine
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.

5


II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng
23 chủng vi khuẩn trong bộ sưu tập giống Phòng thí nghiệm Trung tâm, khoa Công nghệ Thực Phẩm.
2.2. Nội dung

Test khả năng chịu mặn của 23 chủng vi khuẩn trong bộ sưu tập giống tại phòng TNTT.

Định danh sơ bộ các chủng có khả năng chịu mặn (khảo sát các phản ứng hóa sinh, quan sát hình thái dưới
kính hiển vi).

Xác định khả năng phân giải histamine của các chủng vi khuẩn chịu mặn cao .

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử chủng vi khuẩn phân giải histamine.
6


II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP
2.3. Phương pháp nghiên cứu

•

Test khả năng chịu mặn: phương pháp đếm khuẩn lạc (theo TCVN 4884-1:2015):

Ria thuần

Nuôi lỏng

Cấy chang

Đếm khuẩn lạc
MT HA

MT HA
Nuôi ở tủ 37ºC

Nuôi ở tủ lắc 37ºC

trong 7 ngày

Trong 7 ngày

Nuôi ở tủ 37ºC trong 7 ngày

7


II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP

2.3. Phương pháp nghiên cứu

•

Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn

Gram âm

Test catalase: (theo TCVN 4884-

Test KOH: (theo Buck JD, 1982)

2005)

Nhuộm Gram: (theo Buck JD,
1982)

8

Gram dương


II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP
2.3. Phương pháp nghiên cứu

•

Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải histamine:

Xác định hàm lượng histamine bằng hệ thống HPLC
Chuẩn bị mẫu:

250µl dịch nuôi

5ml mt HA đã

5% histamin

7 ngày

hấp khử trùng

5mM

Ly tâm, thu dịch
nổi tại 0h, 4
ngày,7 ngày

Chiết trong
Bơm vào hệ

Tạo dẫn xuất

Methanol: nước

thống HPLC

bằng OPA

(75%:25%)

Tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC chạy sắc ký với detector huỳnh quang, bước sóng: Ex 230nm và Em 450 nm.

9


II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP

2.3. Phương pháp nghiên cứu

•

Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải histamine:

Xác định hàm lượng histamine bằng hệ thống HPLC

FLD1 A, Ex=230, Em=450 (Histamine_25052018\Histamine_25052018b 2018-05-25 16-16-47\his0000010.D)
LU
7.774

8000

f(x) = 65.14x + 74.05
R² = 1

60

6000

50

5000
40

4000
3000

30

2000
20

1000
0

0

20

40

60

80

100

120

10
2.278

Diện tích peak

7000

0

Hàm lượng histamine (ppm)

0

Hình 1. Đồ thị đường chuẩn histamine

2

4

6

8

10

12

14

Hình 2. Hình ảnh sắc ký đồ chuẩn histamine

10

min


II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP
2.3. Phương pháp nghiên cứu

•

Định danh bằng phương pháp PCR: (theo Đào Thị Thu Ngà, 2012)

Tách chiết DNA tổng số

Khuếch đại gen mã hóa

Chạy PCR

16rDNA

Giải trình tự DNA

Mẫu được gửi đi phân tích tại PTN Proteomics, Trung tâm NC và PT CNSH, Viện CN sinh học–CN Thực Phẩm, Trường

Blast trên ngân hàng
Gen

ĐH Bách Khoa HN

11


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chịu mặn
Bảng 1. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chịu mặn
Mật độ khuẩn lạc
TT

Mật độ khuẩn lạc

(CFU/ml)

Tên chủng

TT

15%

20%

25%

(CFU/ml)

Tên chủng
15%

20%

25%

1

DC0001

1208775

650761

0

13

HH0005

1520765

789110

0

2

DC0002

1090503

681510

0

14

HH0006

1372973

814559

0

3

DC0003

1743551

1005110

0

15

HH0007

1607521

889050

21

4

DC0004

1371077

511220

0

16

BL0001

1330632

670210

0

5

DC0005

1935691

983973

97

17

BL0002

1490068

769032

0

6

DC0006

1312157

521001

0

18

BL0003

1445455

793752

0

7

DC0007

1161546

545716

0

19

BL0004

1241921

657865

0

8

DC0008

1103260

612052

0

20

BL0005

1002798

541260

0

9

HH0001

1136776

579962

0

21

BL0006

1108484

594569

0

10

HH0002

1278294

660016

0

22

BL0007

1805914

1021092

205

11

HH0003

1401459

721580

0

23

BL0008

1570969

609904

0

12

HH0004

1890994

1019010

147

 

12


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chịu mặn

Hình 3. Hình ảnh ria thuần chủng HH0004 trên đĩa thạch

Hình 4. Hình ảnh cấy trang chủng HH0004 trên đĩa thạch

13


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn

Bảng 2. Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn

STT

Tên chủng

Đặc điểm khuẩn lạc

Test KOH

Test catalase

Đặc điểm hình thái

1

BL0001

Tròn, trắng đục

-

+

Gram âm, trực khuẩn

2

BL0002

Tròn, bóng, trắng

-

+

Gram âm, cầu khuẩn

3

BL0003

Tròn, bóng, trắng đục

-

+

Gram âm, cầu khuẩn

4

BL0007

Tròn, trắng đục, bóng

+

+

Gram dương, trực khuẩn

5

HH0004

Tròn, bóng, trắng đục

+

+

Gram dương, trực khuẩn

6

HH0005

Tròn to, trắng đục

+

+

Gram dương, trực khuẩn

7

HH0006

Tròn, trắng đục

+

+

Gram dương, cầu khuẩn

8

HH0007

Tròn, trắng đục

+

+

Gram dương, cầu khuẩn

9

DC0003

Tròn, bóng, trắng đục

+

+

Gram dương, cầu khuẩn

10

DC0005

Tròn, bóng, trắng đục

+

+

Gram dương, cầu khuẩn

“ + ”: có phản ứng

“ - ”: không phản ứng
14


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn

Chủng BL0007

Chủng HH0004

Hình 5. Hình ảnh soi dưới kính hiển vi quang học một vài chủng vi khuẩn

15

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine

Bảng 3. Bảng hàm lượng và tỉ lệ phân giải histamine tại các thời điểm 0h, 4 ngày và 7 ngày

4 ngày

7 ngày

Hàm lượng
TT

Tên chủng

histamine tại 0h
(ppm)

Hàm lượng histamine

Tỉ lệ phân giải so với 0h

Hàm lượng histamine

Tỉ lệ phân giải so với

(ppm)

(%)

(ppm)

0h (%)

1

BL0007

20.741

18.0929

12.77

14.5157

30.01

2

HH0005

20.741

15.9589

23.05

15.836

23.65

4

DC0005

20.741

18.4767

10.92

16.9568

18.25

5

HH0004

20.741

13.5485

34.68

10.9539

47.19

16


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine

25

HL histamine (ppm)

20

15

BL0007
HH0005
DC0005
HH0004

10

5

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

Thời gian (ngày)

Hình 6. Biểu đồ thể hiện hàm lượng histamine tại các thời điểm 0h, 4 ngày, 7 ngày

17


III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine

0 giờ

4 ngày

7 ngày
Hình 7. Hình ảnh sắc kí đồ của chủng HH0004 tại thời điểm 0 giờ, 4 ngày và 7 ngày
18

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Định danh bằng PCR

Hình 8. Kết quả tách chiết DNA tổng

Hình 9. Kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu

số

Kết quả giải trình tự của chủng HH0004, được blast trên genbank cho kết quả là chủng Virgibacillus campisalis. Đây là vi
khuẩn gram dương, kị khí, hình que.

19


IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
- Từ 23 chủng vi khuẩn, tuyển chọn đc 10 chủng có khả năng phát triển tốt được ở nồng độ muối 20%.
- Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn ở nồng độ muối 20%, xác định hình thái vi khuẩn, các đặc tính
sinh hóa của chúng.
- 10 chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn ở nồng độ muối 20% được đem đi phân tích khả năng phân giải histamine thì
thấy có 4/10 chủng có khả năng phân giải histamine và chủng HH0004 có khả năng phân giải tốt nhất với tỉ lệ phân giải sau
7 ngày là 47,19% so với thời điểm 0h.
- Chọn chủng HH0004 có khả năng phân giải histamine cao nhất đưa đi định danh được kết quả là: chủng vi khuẩn HH0004
có tên là Virgibacillus campisalis.

20

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.2. Kiến nghị
- Tiếp tục tiến hành thí nghiệm với các chủng BL0007, HH0004, DC0005, HH0005 với thời gian nuôi lâu hơn để kiểm tra khả
năng phân giải histamine tối đa của chúng.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải histamine của các chủng vi khuẩn đã tìm ra để tối ưu hóa các yếu tố

21


22