Quy trình sản xuất enzyme amylase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (sản xuất mật tinh bột)

MỤC LỤC
I.

Tổng quan về enzyme amylase: ........................................................................ 1
1.

Lịch sử nghiên cứu: ....................................................................................... 1

2.

Enzyme amylase là gì? .................................................................................. 1

3.

Phân loại: ....................................................................................................... 2

4.

Đặc tính:......................................................................................................... 4

5.

Cơ chế tác dụng: ............................................................................................ 4

II.

Nguồn thu nhận enzyme amylase: ................................................................. 6

1.

Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật: .............................................. 6

1.1.

Malt đại mạch: ........................................................................................ 6

1.2.

Lúa: ......................................................................................................... 6

2.

Thu nhận enzyme amylase từ nguồn VSV: ................................................... 6

III.

Quy trình sản xuất enzyme amylase: ............................................................. 7

1.

Bản chất của quá trình: .................................................................................. 7

2.

Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase: ......................................................... 7
2.1.

Nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy: .................................................... 7

2.2.

Giống vi sinh vật dùng trong sản xuất amylase: ..................................... 8

a.

Quy trình sản xuất lên men bề mặt: ........................................................... 8

b.

Quy trình sản xuất lên men chìm: ............................................................ 16

3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:.......................................... 18

a.

Chủng vi sinh vật: .................................................................................... 18

b.

Môi trường dinh dưỡng: ........................................................................... 19

c.

Độ ẩm môi trường: ................................................................................... 19

d.

Không khí: ................................................................................................ 20

e.

Ảnh hưởng của pH: .................................................................................. 21

f.

Nhiệt độ: ................................................................................................... 21

g.

Thời gian nuôi cấy: .................................................................................. 22

h.

Sục khí và khuấy trộn:.............................................................................. 22

IV.

Ứng dụng enzyme amylase trong công nghiệp thực phẩm ......................... 23

1.

Tình hình ứng dụng enzyme trong công ngiệp trên thế giới ....................... 23

2.

Ứng dụng enzyme amylase trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ........... 24
a.

Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất mì chính ............................... 24

b.

Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bia: ....................................... 27

c.

Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất cồn........................................ 29

d.

Ứng dụng trong sản xuất siro ................................................................... 31

e.

ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bánh mỳ ................................ 33

f.

Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bánh kẹo ............................... 35

g.

Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất glucoza và mật ..................... 35

Tài liệu tham khảo.................................................................................................. 37


I.

Tổng quan về enzyme amylase:
1. Lịch sử nghiên cứu:

Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống
song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Đó
là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm... Ở thời kỳ này
người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men.
Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cố gắng đi
sâu tìm hiểu bản chất của quá trình lên men. Van Helmont đã nhận thấy thực chất của
sự tiêu hóa là sự chuyển hóa hóa học của thức ăn và giải thích cơ chế của nó với sự so
sánh nó với quá trình lên men rượu. Danh từ ferment (từ chữ Latinh fermentatio - sự
lên men) được Van Helmont dùng để chỉ tác nhân gây ra sự chuyển biến các chất
trong quá trình lên men rượu.
Vào nửa cuối thế kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Réaumur cũng đã
nghiên cứu bản chất của sự tiêu hóa. Nhà tự nhiên học này đã cho chim quạ đen nuốt
những miếng thịt đặt sẵn trong ống kim loại có thành đã được đục sẵn và buộc vào
dây thép. Sau vài giờ đã không thấy gì ở trong ống. Hiện tượng này đã thúc đẩy sự
nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả năng tiêu hóa của dịch dạ dày.
Sau thí nghiệm này một thời gian, vào năm 1783, nhà bác học người Ý là Spalanzani
đã lặp lại thí nghiệm bằng cách lấy dịch dạ dày trộn với thịt mới và thấy có hiện tượng
hòa tan xảy ra.
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lên
men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm
đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường. Đây là
công trình đầu tiên thu được chế phẩm amylase ở dạng dung dịch và lịch sử enzyme
học thực sự được xem như bắt đầu từ đây.
Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz
đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở
dạng bột. Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại
mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình thành này có khả năng

chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hóa. Danh từ
diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là do Payen và Persoz dùng để gọi enzyme
amylase lúc bấy giờ.
2. Enzyme amylase là gì?
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này
thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm
polysaccharide với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH

RH + R’OH

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và
Exoamylase (enzyme ngoại bào).
1


Endoamylase gồm có -amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme
khử nhánh này được chia làm 2 loại: Khử trực tiếp là Pullunase (hay còn gọi là dextrin 6-glucosidase) và khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6
glucosidase) và Maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân liên kết bên trong
các chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có -amylase và -amylase. Đây là những enzyme thủy phân
tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
 Tinh bột: là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ (như
khoai lang, khoai tây,..), trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt có công thức tổng quát là
(C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylo và
amylopectin. Các loại tinh bột đều có 20-30% amylo và 70-80% amylopectin. Trong
thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng.
Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside
bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: dịch hóa

và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi
dextrin tiếp tục bị đường hóa thì tạo ra maltose và glucose.
 Glycogen: là 1 loại Carbohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể
động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng
trong sự chyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glycogen được cấu tạo từ các
glucose liên kết với nhau bằng liên kết -1,4-glycoside. Ở các vị trí phân nhánh,
glucose nối với nhau bằng liên kết -1,6-glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn
tinh bột, phân tử lượng ở trong khoảng 2-3 triệu Da.
Glycogen dễ tan trong nước, nếu chúng ta ăn quá nhiều carbohydrate thì cơ thể
chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen
tập trung chủ yếu ở trong gan.
3. Phân loại:
 Endoamylase ( enzyme nội bào):
- -amylasae: có khả năng phân cắt các liên kết 1,4- glucoside của cơ chất một
cách ngẫu nhiên, là enzyme nội bào.

2


-

Enzyme khử nhánh:
+ Khử trực tiếp (Pullulanase):
Pullulanase là một trong các enzyme quan trọng nhất trong chế biến tinh bột.
Enzyme này được sử dụng trên một quy mô lớn trong glucose và các ngành công
nghiệp sirô maltose. Pullulanase là một loại enzyme rất mạnh cho sự thoái hóa tinh
bột thành glucose hoặc maltose. Pullulanase thủy phân liên kết α-1,6- glycosidic của
chuỗi phân nhánh và α-1, 4-glycosidic.

+ Khử gián tiếp:

Transglucosylase (oligo-1,6- glucosidase) và Maylo-1,6-glucosidase: Enzyme
này thủy phân liên kết β-1,6- glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới
hạn
có
thể
chuyển
hóa
đường
có
thể
lên
men
được.
 Exoamylase (enzyme ngoại bào):
- β–amylase
(β-1,4-glucan-maltohydrolase) β–amylase xúc tác từ sự thủy phân các liên kết
1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm
maltose từ đầu không khử của mạch. Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế
amylase này được gọi là β- amylase. Tác dụng của β- amylase lên tinh bột có thể
được biểu diễn theo sơ đồ sau:
Tinh
bột
(Glycogen ) 
54-58%maltose
+ 42-46% β- dextrin

-

γ–amylase (glucoamylase)
3

Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6- glucoside, ngoài ra
còn có khả năng thủy phân liên kết -1,2 và -1,3- glucoside. Glucose amylase có khả
năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin… thành glucose
mà không cần có sự tham gia của các loại enzyme amylase khác.

4. Đặc tính:
Enzyme
amylase thủy phân
tinh bột tạo thành
dextrin
và 1 ít
maltoza. Dextrin có
khả năng hoạt hóa
cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme này. α - amylase của sinh vật có những đặc
tính rất đặc trưng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt.
 Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu:
 Nấm mốc: pH = 4,5 - 4,9.
 Vi khuẩn: pH = 5,9 - 6,1 (pH<3 vô hoạt trừ enzyme của Asp.Niger pH = 2,5 2,8).
 α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lượng lớn
glucoza và maltoza.
 To tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất.
Trong dung dịch đệm pH = 4,7; α - amylase của Asp. Oryzae rất nhạy với tác
động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ
còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 -85%. Ở 50oC trong 2 giờ, α - amylase của
nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn.
 -amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau.
 Amylase dễ tan trong nước,trong dung dịch muối và rượu loãng.

 Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn
định cấu trúc bậc 3 của enzyme.
 Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, H+, Hg2+.
5. Cơ chế tác dụng:
Các giai đoạn của QT thủy phân tinh bột của α-amylase:
* Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột

→

dextrin phân tử lượng thấp
4


* Giai đoạn đường hóa:
Dextrin

 tetra và trimaltose

 disaccharide và monosaccharide.

Amylase

 oligosacharide

 poliglucose.

Maltose

 maltotriose

 maltotetrose.

-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm rất giống nhau,có khả năng phân
cách các liên kết -1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu
nhiên,không theo 1 trật tự nào cả. -amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó
còn thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm.

 Ở
giai
đoạn đầu
(giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành 1 lượng lớn
dextrin phân tử thấp( -dextrin ),độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh,( các amylose và
amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
 Giai đoạn thứ 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị
thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với Iod. Các chất này bị
thủy phân rất chậm bởi -amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác
dụng của -amylase, amylose bị phân hủy khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm
6-7 gốc glucose.
 Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose
colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotritrose, maltose.
Tóm lại, dưới tác dụng của -amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose,
maltose, glucose và dextrin phân tử thấp.Tuy nhiên, thông thường -amylase chỉ thủy
phân tinh bột chủ yếu tạo thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iod và 1 ít
maltose. Vì vậy người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay
amylase dịch hóa.

5

II.

Nguồn thu nhận enzyme amylase:

1. Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật:
Từ lâu nay ta đã biết sử dụng các loại enzyme từ hạt nảy mầm để sử dụng trong
ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia),…hoặc sản xuất các hỗn
hợp bột enzyme gồm amylase, protease để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho
trẻ em, người già những người suy tiêu hóa .
Hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ
thấp để giữ cho nguyên hoạt tính của enzyme được gọi là malt. Malt có thể được sản
xuất từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại mạch, lúa, ngô, đậu,…mà chủ yếu từ đại mạch,
lúa.
1.1. Malt đại mạch:
Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại mạch chủ yếu là amylase mà chủ yếu là
α-amylase và β-amylase, quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển hóa
enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời tổng hợp
thêm hàng loạt các enzyme mới, giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất
khô của hạt, tạo độ thông thoáng bằng cách đảo trộn. Hạt đại mạch trước khi ngâm
không có hoạt lực của enzyme α-amylase, khi hạt trải qua 3-4 ngày trong giai đoạn
nảy mầm thì hoạt lực đạt tới mức cực đại vào ngày thứ 7. Sau đó sẽ giảm xuống.
1.2. Lúa:
Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình nảy
mầm, hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại
enzyme và quá trình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành
enzyme và tốc độ phản ứng.
Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở các dạng liên kết. Khi hạt nẩy mầm,
các enzyme này chuyển sang dạng hoạt động và còn có sự hình thành một số enzyme
mới ở phôi.
2. Thu nhận enzyme amylase từ nguồn VSV:

Enzyme amylase có thể thu được từ các VSV sau:
- Chủng nấm mốc Asp. Oryzae, Asp.nier…
- Các loại vi khuẩn là bacillus subtilis, Bac. Mensentericus…
Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự
nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi
khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus. Nấm men
và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsy, Endomyces
cũng tạo amylase.
Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa,
Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh
trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vi sinh
vật khác.
Enzyme amylase chủng yếu được thu nhận từ các loại VSV. Nguyên nhân cơ bản
là do:
6


-

Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn khác.
Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú.
Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền.
Tốc độ sinh sản rất nhanh.
Dễ kiểm soát quá trình sx và mở rộng ở quy mô công nghiệp.

Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme: Trong công nghệ enzyme
từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
III.

Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính
enzyme).
Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm.
Quy trình sản xuất enzyme amylase:

Muốn thu nhận được enzyme amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân
lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải
tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu
chuẩn hóa các điều kiện nuôi. Như vậy là sự tổng hợp enzyme amylase không chỉ phụ
thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các
điều kiện nuôi đặc hiệu.
1. Bản chất của quá trình:
Amylase rất thông dụng, được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Enzyme
này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử đường gluco gồm
α-amylase, β-amylase và các glucoamylase.
Chế phẩm amylase kỹ thuật và tinh khiết có thể sản xuất từ những hạt ngũ cốc nẩy
mầm ( thóc, ngô, đại mạch, tiểu mạch, lúa mì…) và từ quá trình nuôi cấy vi sinh vật.
Chế phẩm amylase thu được từ phương pháp nuôi cấy vi sinh vật hầu hết được
tổng hợp bởi nấm mốc, vi khuẩn và một số ít từ nấm men.
2. Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase:
2.1. Nguyên liệu tạo môi trƣờng nuôi cấy:
- Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có
nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt
ngũ cốc khác. Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều
hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt
khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm
bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối
nguyên liệu.

- Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề sâu (Sử dụng môi trường hoàn toàn
lỏng ): Nguyên liệu nuôi cấy phổ biến là dịch đường như gluco, fructo, saccaro, nước
chiết bắp, pepton,… nồng độ thích hợp khoảng 10 - 15%.
7


2.2. Giống vi sinh vật dùng trong sản xuất amylase:
- Chủng nấm mốc Asp. Oryzae, Asp.nier…
- Các loại vi khuẩn là bacillus subtilis, Bac. Mensentericus…
a.

Quy trình sản xuất lên men bề mặt:

8


NGUYÊN LIỆU
XỬ LÝ
THANH TRÙNG
LÀM NGUỘI

GIỐNG VSV

PHÓI TRỘN
NUÔI CẤY
THU
ENZYME THÔ
SẤY
NGHIỀN MỊN

TRÍCH LY
LỌC
KẾT TỦA
ENZYME
ENZYME
THÔ
SẮC KÝ
SẤY
BAO GÓI

Sơ đồ quy trình:

THÀNH
PHẨM

9


Thuyết minh quy trình:
Bƣớc 1: Chuẩn bị nguyên liệu nuôi cấy:
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
- Nguồn tinh bột:
 Cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất béo, 10-14% protein, 816% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ 37-59%.
 Cám mì: chứa 16-22 % tinh bột, 10-12% protein, trong đó có các amino acid
quan trọng như methionine (0,19%), cysteine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%),
tryptophan (0,3%), 3-4% chất béo, 10,3% cellulose, các nguyên tố tro (Na- 0,09%,
K- 1%, Ca- 0,16%, P-0,94%) và nguyên tố vi lượng cùng các chất khác.
- Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn đến hoạt lực của các
enzyme amylase. Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có
vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc

không quá 0,05%.
- Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi cấy: mầm
mạch ( 15-20% ), trấu ( 20-25% ), mùn cưa ( 5-10% )…
 Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mùn cưa được xử lý để loại bỏ các tạp
chất. Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo.
 Thanh trùng: Trước khi thanh trùng người ta cho vào môi trường 0,2%
formalin ( 40% ) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường. Nhiệt độ thanh
trùng là 95oC trong 60 phút. Đồng thời phải thanh trùng khay lên men.
- Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm, dùng 3kg môi
trường/khay.
Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được độ ẩm
thích hợp. Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật nuôi cấy trong môi trường cám là
60% W. Độ ẩm vượt quá 60% thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển,
khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ; đồng thời môi trường sẽ bị bết lại, không khí
không thể thâm nhập vào trong lòng môi trường. Nếu độ ẩm bé hơn 60 % W (thường
45-50% W) nấm khó phát triển, thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi,
và như vậy họat tính enzyme sẽ giảm rất mạnh.
Trường hợp cần tạo giống trung gian, ta nên tạo độ ẩm môi trường khoảng 4550% W. Trong suốt quá trình nuôi cấy để thu nhận enzyme, ta cần duy trì độ ẩm thích
hợp khoảng 50 – 60% W và độ ẩm trong không khí là 95 – 100% W.
Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trường để tiêu
diệt những vi sinh vật nhiễm vào môi trường mà có thể ức chế sự phát triển của giống
vi sinh vật mà ta quan tâm. Người ta thường thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 1 – 1,5
at trong thời gian 45 – 60 phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả cũng
như tạo điều kiện thích hợp cho sợi nấm phát triển, trước khi thanh trùng, người ta
thường dùng acid clohydric hay acid sunfuric để điều chỉnh pH của môi trường.
Sau khi thanh trùng môi trường xong người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận
enzyme.
10

Bƣớc 2: Trộn và nuôi cấy:
- Môi trường sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống vào các khay với tỷ lệ
cấy khoảng 0,2-2% lượng giống so với lượng môi trường ở mỗi khay.
- Đưa khay lên các giá đỡ.
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30oC, độ ẩm 60-65%, đồng thời phải
thoáng khí.
- Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương
pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.
Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
 Nhiệt độ tăng rất chậm.
 Bào tử trưởng nở, sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
 Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
 Khối môi trường còn rời rạc.
Thời kỳ này không hình thành enzyme, không đòi hỏi nhiều không khí, cho nên
chỉ cần làm thoáng khoảng 2-3 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi trên giờ.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không
được đưa nhiệt độ cao quá 30oC vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100%.
- Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những
thay đổi cơ bản sau:
 Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất
mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi
trường, trong lòng môi trường.
 Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám
bằng mắt thường.
 Môi trường được kết lại khá chặt.
 Độ ẩm môi trường giảm dần.
 Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC ( do quá trình hô hấp

của nấm mốc ), vì thế ta phải hạ nhiệt môi trường giúp cho nấm mốc mọc đều và đẹp.
 Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
 Enzyme amylase được tổng hợp mạnh.
 Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này
cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30oC là tốt
nhất. Ở một số nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-29oC và độ
ẩm cao vào phòng nuôi. Lượng khí thổi vào ở giai đoạn này thường 60 thể tích khí/thể
tích phòng nuôi/giờ; lượng khí thổi vào nhằm mục đích cung cấp khí oxy, thải CO2,
vừa làm giảm nhiệt độ phòng nuôi.
- Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay
đổi cơ bản như sau:
 Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm
11


lại.
 Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu của giai đoạn sinh trưởng
thứ nhất và thứ hai, nấm mốc Asp. Oryzae chỉ tạo được có 7,5-8% enzyme, trong vòng
12 giờ sau, hoạt lực của -amylase tăng 9-12 lần, hoạt lực đường hoá tăng hai lần và
hoạt lực của oligo-1,6-glucosidase tăng lên 10 lần. Đối với đa số VSV ở giai đoạn này
nên hạ nhiệt độ xuống 3-40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho đa số nấm
mốc trên môi trường rắn là 28-300C, cho Bac.subtilis là 35-370C.
 Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi
trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt độ nuôi
duy trì ở 30oC, trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzyme
amylase tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu
nhận enzyme rất cần thiết.
Cần thu nhận enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh
bào tử là lúc quá trình tổng hợp enzyme đã yếu đi. Do đó, cần một bước nuôi cấy thử
nghiệm để xác định thời điểm thu nhận enzyme thô. Chế phẩm enzyme thô thu được

chứa tế bào nấm, cơ chất, nước và enzyme.
Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn: Thời gian nuôi để có lượng amylase
cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất của chủng
sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào
bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường
làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với đa số nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử.
Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi để có tích lũy amylase cực
đại đối với từng loại nấm sợi và vi khuẩn như sau:
Chủng

Thời gian nuôi (giờ)

Asp. oryzae – 476

24 – 25

Asp. oryzae – KC

30 – 36

Asp. oryzae 8F1

24 – 30

Asp. awamori 22

36

Bac. subtilis

68 – 72 (ở 300C)

Bƣớc 3: Thu nhận enzyme:
Kết thúc qúa trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme amylase, chế
phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng
còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường).
Để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô α-amylase không bị mất hoạt tính nhanh
người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường
dùng ở đây là máy sấy chân không ). Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết
thúc là nhỏ hơn 10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta
thường sấy ở nhiệt độ 38-400C. Enzyme α-amylase ở nấm mốc Asp. oryzae sẽ bị bất
hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-700C.
12


Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải
qúa trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch
enzyme.
Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau:
- Toàn bộ khối lượng enzyme thô amylase được đem đi nghiền nhỏ.
 Nghiền mịn:
 Mục đích: là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế
phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào
sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme amylase ngoại bào khi được tổng hợp
và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ,
enzyme
thoát
ra
khỏi
các

thành
phần
này
dễ
dàng
hơn.
Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp
này được dùng là cát và bột thạch anh. Các chất này là những chất vô cơ không tham
gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát, trước khi sử dụng cát và bột thạch
anh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt
VSV.
 Trích ly:
 Mục đích: Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme
α-amylase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta
thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô,
người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng
làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát và bột thạch anh ra khỏi hỗn hợp bã rồi
mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó
có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là
làm sao tách enzyme ra khỏi vật chất này.
 Kết tủa enzyme α-amylase:
- Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây
tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai
tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả
những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi đổ chất làm kết tủa
enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính.
Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau:
Cứ một phần dung dịch enzyme thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon.
- Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ,

sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-70C) theo thời gian, các
enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận
kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).
- Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước, để dễ bảo quản
người ta sấy kết tủa enzyn α-amylase ở 400C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8%
W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
- Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme α-amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn
toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzyme ngoài enzyme
13


amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzyme α- amylase này còn chứa hoạt tính protase có
tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzyme có độ tinh khiết cao hơn ta
phải tinh chế enzyme α-amylase kết tủa bằng các qúa trình lọc Gel. Gel sử dụng là
Sephadex G200...

14


Giải thích quy trình:
Đầu tiên, ta tiến hành nhân giống để chuẩn bị cho công đoạn lên men. Cám sẽ
được gầu tải cám số (5) đưa lên thùng chứa cám số (6), cám ở thùng chứa số (6) và
dịch môi trường ở thiết bị số (8) sẽ cho đi qua thiết bị thanh trùng số (7) để loại có các
vi sinh vật tạp nhiễm gây ảnh hưởng đến quá trình lên men. Môi trường cần có độ ẩm
50-60%. Môi trường sau khi được thanh trùng sẽ cho vào các khây đã được hấp thanh
trùng tại thiết bị số (9) với chiều dày môi trường trên mỗi khay 2-5 cm, sau đó chuyển
sang bàn trung gian số (10) để tiến hành cấy mốc giống. Các khay môi trường sau khi
đã cấy mốc giống được chuyển vào các tủ chứa khay, rồi được đẩy vào phòng nuôi
mốc. Tại đây, mốc được nuôi để thu enzyme amylase. Mốc sau khi gieo cấy sẽ phát
triển trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dưới theo các kẽ hở giữa các cấu tử thành

phần môi trường. Môi trường nuôi cấy bề mặt là môi trường rắn xốp. Vi sinh vật phát
triển sử dụng oxy trong các quá trình biến đổi sinh hóa, đồng thời thải CO2 ra môi
15


trường xung quanh và tỏa nhiệt ra xung quanh làm nóng và khô môi trường, hệ sợi
làm cho môi trường kết thành tảng. Khi đó cần phải thông gió, phun mù và làm ẩm
trực tiếp, lật khối môi trường nuôi cấy hoặc bẻ nhỏ. Vì vậy, trong buồng nuôi cấy
thường có hệ thống thoát khí vừa làm giảm đi lượng CO2 trong buồng, đồng thời cũng
giúp hạ nhiệt của buồng. Trong quá trình nuôi cấy VSV ta cần cung cấp oxy, oxy
trước khi đưa vào phòng nuôi cấy sẽ được đi qua thiết bị lọc khí số (14) để loại bỏ các
tạp chất, bụi bẩn cũng như VSV có hại cho quá trình lên men. Kết thúc quá trình nuôi
cấy ta thu được enzyme thô, để thu được enzyme tinh khiết thì các khây mốc này được
lấy ra khỏi buồng nuôi cấy và tiến hành quá trình nghiền thông qua thiết bị nghiền số
(15), sau đó đem đi trích ly và lọc. Vì sản phẩm thu được còn hàm lượng ẩm lớn, dễ
làm cho enzyme bị biến tính, nên ta cần sấy sản phẩm này thông qua thiết bị sấy số
(16) cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt được 5-8% W thì kết thúc quá trình sấy.
 Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp này:
 Ƣu điểm
Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo thành từ
nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV,
enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận
hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý. Môi trường đặc là môi
trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực
đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy.
 Nhƣợc điểm:
Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này

VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích.
b.

Quy trình sản xuất lên men chìm:
Bước 1:Chuẩn bị môi trường:

Môi trường sử dụng trong nuôi cấy bề sâu: để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn,
người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzyme đươc tạo ra từ
VSV. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những
khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế ta
thấy rằng nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn
phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường. Hay nói cách khác, chủng nấm mốc
Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha khí của môi trường.Trong
trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn
hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt.
Bước 2: Trộn giống vi sinh vật:
Sau khi đã bổ xung các chất dinh dưỡng cho môi trường thì ta tiến hành hấp khử
trùng môi trường ở nhiệt độ 118 – 125 0C, thời gian 40 – 60 phút, sau đó để nguội đến
16


nhiệt độ bình thường ( 28 – 30 0C ) và tiếp giống vi sinh vật ( Asp. Oryzae ) vào môi
trường, tỷ lệ giống đưa vào là 2 – 2,5 %.
Bước 3: nuôi cấy vi sinh vật:
Sau đó quá trình nuôi cấy được thực hiện theo 2 phương pháp: nuôi cấy theo chu
kỳ hay nuôi cấy liên tục.

- Nuôi
cấy theo chu kỳ,
là

phương
pháp nuôi cấy
trong 1 thiết
bị lên men. Sau
1 chu kỳ nuôi
từ 2 – 4 ngày ở
0
28 – 32 C người ta thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy như là 1 loại chế phẩm enzyme
thô. Sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy, người ta vệ sinh thiết bị, chuẩn bi môi trường
mới để tiếp tục nuôi cấy một mẻ mới, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật cao.
Tuy nhiên quá trình nuôi cấy này cũng có những nhược điểm riêng. Vd: thời gian
ngừng giữa hai lần nuôi cấy để vệ sinh thiết bị thường làm gián đoạn việc sản xuất, do
đó năng suất thấp. Năng suất giữa các mẻ không giống nhau.
- Nuôi cấy liên tục là để khắc phục tình trạng trên. Quá trình nuôi cấy liên tục có
thể nuôi cấy trong 1 thiết bị, cũng có thể thực hiện trong nhiều thiết bị.
- Như vậy dòng môi trường vào bằng với tốc độ dòng sản phẩm ra. Phương pháp
này có lợi là nếu chất lượng sản phẩm ra cuối cùng ra ta thu nhận đuợc chưa đạt yêu
cầu đặt ra ta có thể khắc phục bằng hai cách:
 Cách thứ nhất: ta cho tốc độ môi trường vào và sản phẩm ra chậm lại, có
nghĩa là làm sao cho thời gian lưu của dung dịch và tế bào vi sinh vật trong
thiết bị lâu hơn.
 Cách thứ hai là: ta tiến hành hoàn lưu dịch lên men hòa chung với dòng
môi trường để tái lên men. Như vậy, các thành phần dòng môi trường có cơ
17


hội tham gia triệt để vào quá trình trao đổi chất, các loại enzyme sẽ được
tạo ra nhiều hơn.

Bước 4:Thu nhận và tinh chế enzyme:

Dung dịch sau khi nuôi cấy theo phương pháp bề sâu được tách khỏi sinh khối và
các thành phần không hòa tan bằng phương pháp ly tâm. Dịch thu thường chứa 2 –
3% chất khô hòa tan. Hàm lượng chất này rất nhỏ, do đó ta cần phải cô đặc chúng cho
đến khi khối lượng dịch giảm đi 5 – 10 lần ở điều kiện chân không.
Ngoài phương pháp cô đặc chân không, ta có thể dùng nhựa trao đổi ion để hấp
thụ enzyme. Sau đó ta tiến hành phản hấp thụ và sẽ thu được enzyme.
3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men:
a. Chủng vi sinh vật:
Muốn nhận chế phẩm enzyme amylase có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn,
nghiên cứu xem chủng, giống nào có khả năng tích tụ nhiều amylase.
Khi tuyển chọn được giống tốt tức là có được điều kiện cần thiết để tạo ra chế
phẩm amylase có hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ có tính chất tương đối với thời
gian và điều kiện nhất định nào đó. Loài người luôn tìm cách phân lập và tạo ra các
giống mới có hoạt lực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo,
gây đột biến, tách và cấy gen.

18


b. Môi trƣờng dinh dƣỡng:
Chất lượng cám gạo, cám mì có ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme, nên dùng
cám tốt, mới, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Các chất bổ sung thêm
vào có thể là chất làm xốp môi trường hoặc làm làm giàu thêm các chất sinh trưởng.
Thường là mầm mạch (15-20%), trấu (2-25%), mùn cưa (5-10%),…Ngoài ra còn có
một số chất dinh dưỡng đặc trưng khác như N, P, Ca, Mg,…
Bảng: Thành phần của cám mì và cám gạo
Hàm Lượng %
Thành phần

Cám

mì

Cám
gạo

Tinh bột

16-22

20

Protein

10-12

10-14

Methionine

0.19

Cysteine

0.3

Arginine

1

Lysine

6

Tryptophan

0.3

Chất béo

3-4

10-15

Cellulose

10.3

8-16

Na

0.09

K

1

Ca

0.16

P

0.94

37-59

Cám dùng trong sản xuất không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%,
không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp
chất độc không quá 0,05%.
c. Độ ẩm môi trƣờng:
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích (đối với Asp. Niger, Asp.
Awamort, Asp. Flavus, Asp. Oryzae) của môi trường là 58-60% và phải giữ cho môi
trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55-70% sẽ làm
giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của
VSV cũng như sự tạo enzyme amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường bình
tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực amylase cao nhất thu được ở độ ẩm
65-68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên
các khay), thì độ ẩm môi trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60%, vì cao
19


hơn sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn
chế hong khô của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có
ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành enzyme. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường
đến sinh tổng hợp enzyme amylase được trình bày trong bảng sau:
Bảng: Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của Asp. Oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt:

20 giờ
Phươn

án thí
nghiệm

Độ
ẩm %

34 giờ

Hoạt
độ
Độ
amylase
ẩm %
đv/g canh
trường thô

42 giờ

Hoạt
độ
amylase
đv/g canh
trường thô

Độ
ẩm %

Hoạt độ
amylase đv/g
canh trường

thô

Khay
để hở

27,8

15,0

23,8

18,0

22,0

20,5

Khay
đậy nắp

46,4

20,4

42,4

32,9

42,4

36,7

Qua bảng số liệu trên thấy rõ hoạt lực -amylase của canh trường nuôi nấm sợi,
khi bị hong khô giảm gần hai lần. Điều đó khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho
môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng
của VSV. Trong quá trình sinh trưởng của VSV tiêu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của
môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt
này bằng thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ
thông khí có thể liên tục, gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dày
của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Thường là
ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khảng 4-5 lần thể tích
không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn ở giai đoạn thứ hai là 30-60 thể
tích không khí trên thể tích phòng nuôi/ 1 giờ, còn ở giai đoạn thứ ba giảm đi chỉ còn
10-12 thể tích không khí mà thôi.
d. Không khí:
Asp.oryzae là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ
oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường phải xốp, rải thành lớp dày không
quá 2,5-3cm, phòng nuôi phải thoáng.
Theo thực nghiệm, để thoả mãn cho sự hô hấp của nấm mốc Asp.oryzae trong
toàn bộ chu kỳ phát triển cứ cách 1giờ, môi trường cần khoảng 1,7m3 không khí. Asp.
oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%. Chế độ thông
20


khí có thể liên tục, gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tuỳ thuộc vào chiều dày của
lớp môi trường nuôi, và khoảng cách giữa các tầng khay và đĩa khay.
e. Ảnh hƣởng của pH:
Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt trên canh trường rắn, pH ít ảnh hưởng tới
sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của môi trường
vào khoảng 5,5 - 6,0. pH thấp hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh

hưởng tới tích tụ enzyme. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng: pH ban đầu thường
vào khoảng 6 - 7. Đối với Asp.oryzea sau 3 ngày nuôi cấy pH giảm còn 5,5 - 6,0.
Ngược lại khi nuôi Asp.awamori để nhận glucoamylase, sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 7,8. Thực tế pH có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ enzyme, vì thế trong sản xuất người ta
sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu.
Bảng: Nhiệt độ và pH của một số enzyme amylase do VSV tổng hợp
Vi sinh vật

Enzyme

pHopt

topt

α-Amylase

4,5-6,2

40

β-Amylase

3,5-7,0

50

Glucoamylase

4,5-4,7

55-75

α-Amylase

4,7-6,0

65

Glucoamylase

3,8

50

α-Amylase

3,8

50

Glucoamylase

5,0

55

α-Amylase

5,5-5,9

50-57

β-Amylase

4,8

30

Glucoamylase

4,8

50

Bac.amyloliquefac

α-Amylase

5,7-6,0

55-60

Bac.diastaticus

α-Amylase

5,8

70

Bac.subtilis

α-Amylase

4,6-5,1

37

Glucoamylase

4,8

55

Glucoamylase

5,5

45

Aspa.wamori

Asp.niger
Asp.asami
Asp.ozyzea

iens

Endomyces sp
Phizopase
doleamar

f. Nhiệt độ:

Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm ba thời kỳ:
 Thời kỳ trương và nảy mầm của đỉnh bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu
tiên, đối với vi khuẩn 3-4 giờ). Trong thời kỳ này cần phải đốt nóng không khí
21


phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-300C đối với
nấm mốc và duy trì ở nhiệt độ 32-380C đối với vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của
không khí là 96-100%.
 Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4-18 giờ). Ở giai
đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn.
Kết quả là trong lớp sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên 37-400C, đôi khi cao
hơn tới 470C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm đều và
đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-290C và độ ẩm
cao vào phòng nuôi.
 Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10-20 giờ). Trong thời kỳ
này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh. Các
enzyme amylase tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một
ngày đầu của giai đoạn sinh trưởng thứ nhất và thứ hai, nấm mốc Asp. Oryzae
chỉ tạo được có 7,5-8% enzyme, trong vòng 12 giờ sau, hoạt lực của -amylase
tăng 9-12 lần, hoạt lực đường hoát tăng hai lần và hoạt lực của oligo-1,6glucosidase tăng lên 10 lần. Đối với đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ
xuống 3-40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho đa số nấm mốc trên
môi trường rắn là 28-300C, cho Bac.subtilis là 35-370C.
g. Thời gian nuôi cấy:
Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực
nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất của chủng sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà
có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử
là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với đa

số nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời
gian nuôi để có tích lũy amylase cực đại đối với từng loại nấm sợi và vi khuẩn như
sau:
Chủng

Thời gian nuôi (giờ)

Asp. oryzae – 476

24 – 25

Asp. oryzae – KC

30 – 36

Asp. oryzae 8F1

24 – 30

Asp. awamori 22

36

Bac. subtilis

68 – 72 (ở 300C)

h. Sục khí và khuấy trộn:
Phần lớn vi sinh vật tạo amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng cuả
chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hoà tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình

sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy
hoà tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó, việc sục
khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới quá trình sinh trưởng và tích luỹ sinh
khối cũng như sinh tổng hợp các enzyme của VSV.

22


Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hoà tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng
logarithm. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa
nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm.
IV.
1.

Ứng dụng enzyme amylase trong công nghiệp thực phẩm
Tình hình ứng dụng enzyme trong công ngiệp trên thế giới

Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme, loài người đã
tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong công nghiệp. Số lượng
enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme được ứng dụng vào công
nghiệp cũng ngày càng nhiều.
Bảng: Thị trường enzyme trong công nghiệp thực phẩm trên thế giới
STT

Lĩnh vực công nghiệp và enzyme

1

Chuyển hóa tinh bột

140

Amylo glucosidase

55

• α-amylase

40

• Glucose isomerase

20

• Enzyme nấm sợi

5

• Pullulanase

3

• β-amylase

1

Công nghiệp sữa

110

• Rennet động vật

75

• Rennet vi sinh vật

20

• Lipase-esterase

8

• Lysozyme

6

Rượu, bia, nước giải khát

46

• Pectinase

10

• Papain

8

• β-glucanase

4

• Cellulase – Hemicellulase

3–4

• α-amylase

2–3

• Amyloglucosidase

1–2

• Glucose oxidase

0,5

Cồn

32

2

3

4

Gía trị buôn bán
enzyme (triệu USD)

• α-amylase
23