Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen matK, ITS của cây lan một lá (Nervilia fordii) (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
VÀ TRÌNH TỰ GEN matK, ITS
CỦA CÂY LAN MỘT LÁ (Nervilia fordii)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
VÀ TRÌNH TỰ GEN matK, ITS
CỦA CÂY LAN MỘT LÁ (Nervilia fordii)
Ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NguyễnThị Tâm

Thái Nguyên - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều
ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả luận văn

Trần Thị Thùy Linh

XÁC NHẬN

XÁC NHẬN

CỦA KHOA CHUYÊN MÔN

CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn
Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô và cán bộ Bộ môn
Di truyền học hiện đại, Khoa Sinh học, Bộ phận Sau đại học thuộc Phòng Đào
tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt
thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả luận văn

Trần Thị Thùy Linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. v
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... v

1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của lan Một lá ...................... 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 4
1.1.3. Phân bố .................................................................................................... 5
1.1.4. Thành phần hóa học của cây lan Một lá ................................................. 6
1.1.5. Công dụng của cây lan Một lá ................................................................ 7
1.2. Mã vạch DNA (DNA barcode) .................................................................. 8
1.3. Sử dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu ............................ 10
1.3.1. Đặc điểm vùng ITS ................................................................................ 10
1.3.2. Đặc điểm gen matK ............................................................................... 11
1.4. Tình hình nghiên cứu về gen matK, ITS của Việt Nam và trên thê giới.. 11
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 14
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu.................................. 15
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15
2.1.2 Hóa chất, thiết bị .................................................................................... 15
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................ 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp thu mẫu ........................................................................... 15
2.2.2. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm hình thái ................................ 16
2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử ....................................................... 16
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 20

3.1. Đặc điểm hình thái của mẫu lan Một lá thu thập tại Thái Nguyên và Cao
Bằng................................................................................................................. 20
3.2. Đặc điểm của gen matK và ITS phân lập từ cây lan Một lá .................... 22
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ lá cây lan Một lá ........................................ 22
3.2.2. Kết quả nhân gen matK và ITS bằng phản ứng PCR ............................ 23
3.2.3. Kết quả xác định trình tự nucleotit đoạn gen matK và ITS phân lập từ
các mẫu lan Một lá .......................................................................................... 24
3.3. Sự đa dạng về trình tự nucleotit của vùng ITS và matK của cây lan Một lá
......................................................................................................................... 32
3.3.1. Sự đa dạng về trình tự nucletotit của vùng ITS của cây lan Một lá ......... 32
3.3.2. Sự đa dạng về trình tự nucletotit của đoạn gen matK của cây lan Một lá . 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 37
1. Kết luận ....................................................................................................... 37
2. Đề nghị ........................................................................................................ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại khoa học Chi lan Một lá (Nervilia fordii)......................... 4
Bảng 2.1.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen ITS và matK ............................ 17
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................ 17
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen ITS và matK ..................... 18
Bảng 3.1. Số lượng và tỉ lệ từng loại nucleotit của vùng ITS từ mẫu LML-01TN (ITS-01-TN) và mẫu LML-02-CB (ITS-02-CB) ..................................... 24
Bảng 3.2. Các vị trí nucleotit sai khác giữa trình tự nucleotit của đoạn gen
matK của mẫu lan Một lá matK-02-CB với JX865503 và JN004498. .......... 32
Bảng 3.3. Mã số, năm công bố, quốc gia và tác giả của 5 trình tự vùng ITS

trên GenBank................................................................................................... 33
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng ITS từ
mẫu LML-01-TN và LML-02-CB với trình tự vùng ITS trên GenBank. ....... 33
Bảng 3.5. Mã số, năm công bố, quốc gia và tác giả của 5 trình tự gen matK
trên GenBank................................................................................................... 35
Bảng 3.6. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự đoạn gen matK
từ mẫu LML-02-CB với các trình tự đoạn gen matK trên GenBank. ............ 35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây lan Một lá (Nervilia fordii) thu thập ở Hòa An - Cao Bằng và
Định Hóa - Thái Nguyên. ................................................................................... 5
Hình 3.1. Hình ảnh thân, rễ, lá của mẫu cây lan Một lá thu tại huyện Hòa An
tỉnh Cao Bằng (LML-02-CB).......................................................................... 21
Hình 3.2. Hình ảnh thân, rễ, lá của mẫu cây lan Một lá thu tại huyện Định
Hóa tỉnh Thái Nguyên (LML-01-TN). ............................................................ 21
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số ........................... 23
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen matK và ITS từ
hai mẫu lan Một lá........................................................................................... 24
Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS mẫu lan
Một lá mẫu LML-02-CB với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng
BLAST trong NCBI ........................................................................................ 26
Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS mẫu lan
Một lá LML-01-TN với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST
trong NCBI ...................................................................................................... 26
Hình 3.7. Trình tự vùng ITS của mẫu LML-01-TN, LML-02-CB và hai trình

tự mang mã số JX011630 và JX011631 trên GenBank .................................. 28
Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự gen matK của mẫu
lan Một lá LML-02-CB với một số trình tự gen matK trên GenBank bằng
BLAST trong NCBI. ....................................................................................... 29
Hình 3.9. Trình tự đoạn gen matK của mẫu LML02-CB và hai trình tự mang
mã số JX865503 và JN004498 trên GenBank ................................................ 31
Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của mẫu lan Một lá dựa trên phân tích trình
tự nucleotit của vùng ITS. ............................................................................... 34
Hình 3.11. Mối quan hệ di truyền của mẫu lan Một lá dựa trên phân tích trình
tự nucleotit của đoạn gen matK. ...................................................................... 36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng nhiệt đới có hệ thực vật vô cùng
đa dạng và phong phú. Theo thống kê, ở nước ta hiện có gần 12.000 loài thực
vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ, 69 loài thực vật hạt trần,
12.000 loài thực vật hạt kín, 2.200 loài nấm, 2.176 loài tảo, 481 loài rêu, 368
loài vi khuẩn lam, 691 loài dương xỉ và 100 loài khác [1], [7]. Trong số các loài
thực vật ở nước ta có nhiều loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Trải qua
nhiều năm điều tra nghiên cứu, thống kê cho thấy ở Việt Nam có khoảng hơn
3.800 loài thực vật được dùng làm thuốc. Đó là nguồn tài nguyên vô cùng quý
giá [2],[8]. Hiện nay nhiều loài có giá trị đang bị người dân khai thác và thu hái
để bán vì lợi ích kinh tế. Trong đó, loài lan Một lá (Nervilia fordii) thuộc họ
Lan (Orchidaceae) có nhiều công dụng như: làm thuốc giải độc nhất là ngộ độc
nấm, làm mát phổi, chữa ho lao, ho lâu năm, viêm phế quản…[2]. Ở nước ta
hiện có 5 loài thuộc chi Nervilia đó là: Nervilia aragoana, Nervilia crispata,

Nervilia fordii, Nervilia plicata và Nervilia prainiana mang một số đặc điểm
hình thái tương tự nhau [2],[6].
Trước đây, việc phân biệt các giống, loài chủ yếu thông qua đặc điểm
hình thái. Tuy nhiên, một số loài có đặc điểm hình thái rất giống nhau, do vậy
khó có thể nhận biết và phân biệt một cách chính xác nếu chỉ dựa trên các đặc
điểm hình thái giải phẫu. Để khắc phục được khó khăn trong phân loại hình
thái thì phương pháp phân loại học phân tử là phương pháp mang lại hiệu quả.
Phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) là phương pháp phân loại
chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích DNA cho những kết quả chính xác,
giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân
loại. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ
thuộc vào các yếu tố môi trường.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Trong các phương pháp phân loại phân tử, mã vạch DNA (DNA barcode)
là phương pháp phổ biến nhất dựa trên những đoạn trình tự DNA ngắn có tốc
độ tiến hóa đủ nhanh để hỗ trợ giải quyết những khó khăn trong phân loại hình
thái. Trên đối tượng thực vật, các vùng mã vạch DNA thường được sử dụng
trong phân loại phân tử thường là các trình tự thuộc hệ gen nhân như ITS
(Internal transcribed spacer) và hệ gen lục lạp như psbAtrnH, matK, rbcL,
rpoC1...
Đối với các loài thuộc chi Nervilia, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra xu
thế phân loại của vùng gen matK so với 3 vùng gen ITS2, rbcL và LSU D1D3. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu về mã vạch DNA đã chỉ ra rằng việc sử
dụng kết hợp hai mã vạch DNA cho kết quả phân loại tốt hơn so với từng
mã vạch đơn lẻ. Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nào
nghiên cứu đặc điểm hình thái chi tiết và mã vạch DNA của loài lan Một lá
Nervilia fordii.

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu:
“Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen matK, ITS của cây Lan
một lá (Nervilia fordii)” nhằm mô tả, xác định các đặc điểm hình thái đặc
trưng và phân tích trình tự hai vùng gen có độ biến thiên cao, thích hợp cho
định loại phân tử là ITS và matK của loài Lan một lá (Nervilia fordii) ở Việt
Nam, góp phần tư liệu hóa nguồn gen của cây Lan một lá và xây dựng mã
vạch DNA.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân tích được đặc điểm hình thái của một số mẫu lan Một lá thu thập ở
địa phương khác nhau.
- Dựa trên phân tích trình tự gen ITS và matK để xác định được mối quan
hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu và phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho
lan Một lá (Nervilia fordii).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của một số mẫu lan Một lá thu được ở
một số địa phương khác nhau.
- Phân lập và giải trình tự vùng ITS và đoạn gen matK từ một số mẫu lan
Một lá.
- Phân tích, so sánh trình tự nucleotit của vùng ITS và đoạn gen matK từ
các mẫu lan Một lá thu được và lập cây phát sinh chủng loại.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của lan Một lá
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Chi lan Một lá (Nervilia) gồm các loài sống sát mặt đất. Chi Nervilia
có khoảng 65 loài đã được ghi nhận. Ở Việt Nam có 5 loài thuộc chi Nervilia
đó là: Nervilia aragoana, Nervilia crispata, Nervilia fordii, Nervilia plicata
và Nervilia prainiana. Cây đầu tiên thuộc chi Nervilia được Roptrostemom
phát hiện vào năm 1828. Sở dĩ cây này có tên là Nervilia do chữ Nerve
nói về những đường gân trên lá. Giáo sư Phạm Hoàng Hộ đặt tên là Trân
Châu và Trần Hợp gọi là Thanh Thiên Quỳ [8].
Bảng 1.1. Phân loại khoa học Chi lan Một lá
(Nervilia fordii (Hance) Schlechter)
Ngành

Magnoliophyta

Lớp

Liliopsida

Bộ

Orchidales

Họ

Orchidaceae

Chi

Nervilia

1.1.2. Đặc điểm sinh học
Theo tài liệu "Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” - của Đỗ Tất
Lợi, lan Một lá còn có tên Thanh thiên quỳ hay Bầu thoọc (bầu nghĩa là lá,
thoọc là một) hay Trân châu diệp. Lan Một lá thường mọc ở kẽ núi đá, nơi thấp
và ẩm ướt, dưới bóng cây to hoặc dưới đám cỏ dày đặc. Hầu như không thấy
mọc ở bờ ruộng hay ở những môi trường khác. Lan Một lá là loại cây địa
sinh, sống lâu, cao từ 10 - 20cm. Thân rất ngắn, củ tròn to, có thể nặng tới 1,5
- 20g. Thẳng từ củ, chỉ mọc lên có một lá riêng lẻ sau khi hoa tàn. Lá hình tim
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




tròn, xếp theo các gân lá hình chân vịt, đường kính 10 - 25cm mép uốn lượn.
Gân lá toả đều từ cuống lá, cuống lá dài 10 - 20cm, màu tím hồng. Cụm hoa có
cán dài 20 - 30cm, hoa thưa 15- 20 cái, mọc thành chùm hay bông màu trắng,
đốm tím hồng hay màu vàng hơi xanh lục. Lá đài và cánh hoa giống nhau. Cánh
môi 3 thuỳ, có rất nhiều gân, có lông ở quãng giữa, thuỳ bên và thuỳ tận cùng
hình ba cạnh, cột dài 6mm, phồng ở đỉnh. Ra hoa tháng 3 - 4 - 5, quả nang vào
các tháng 4 - 5 - 6. Khi hoa nở, đầu cánh hoa phía trên chụm lại làm toàn hoa
giống như chiếc đèn lồng. Quả hình thoi, trên có múi trông giống như quả khế
con, dài 2 - 3cm. Thường sau khi hoa tàn rồi lá mới phát triển do đó hoặc ta chỉ
thấy cây mang hoa, hoặc quả, không có lá, hoặc chỉ thấy cây có lá, thường một
lá [8].

Hình 1.1. Cây lan Một lá (Nervilia fordii) thu thập ở Hòa An - Cao

Bằng và Định Hóa - Thái Nguyên.

1.1.3. Phân bố
Lan Một lá được tìm thấy tại các vùng châu Phi, châu Úc và Châu Á,
Trung và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, lan Một lá phân bố ở các tỉnh Hà Giang,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng
Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hà Tây, Thanh Hóa…
Trước đây, cây lan Một lá ít được chú ý khai thác ở nước ta nhưng trong
những năm gần đây, do loài cây này có giá trị lớn nên bị khai thác nhiều để bán
qua biên giới cho Trung Quốc. Người Trung Quốc tìm mua cây lan Một lá với
giá cao từ 1 - 2 triệu đồng/1 kg. Do lượng cây lan Một lá trong tự nhiên không
nhiều cùng với tốc độ khai thác của người dân để bán và làm thuốc khiến cho
loài cây này trở nên quý hiếm và có nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng. Cây lan
Một lá được ghi vào danh sách các loài cây cần được bảo vệ trong “Sách đỏ
Việt Nam”.
1.1.4. Thành phần hóa học của cây lan Một lá
Hiện nay, ở nước ta chưa có các công trình nghiên cứu về thành phần
hóa học của cây lan Một lá (Nervilia fordii). Tuy nhiên, trên thế giới đã có một
số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học
của các hợp chất chiết xuất từ cây lan Một lá. Kết quả nghiên cứu về thành phần
hóa học cho thấy, lan Một lá (Nervilia fordii) chứa terpenoids, flavonoid, axit
amin và một số loại dầu dễ bay hơi. Các hợp chất này có hoạt tính dược lý
chống viêm, chống vi rút và giảm đau, giảm ho, hen suyễn và viêm phế quản
mãn tính [19].
Năm 2012, Zhang Li và cộng sự tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa

học trên toàn bộ cây lan Một lá (Nervilia fordii). Kết quả, Zhang Li đã phân lập
được 10 chất và xác định được đó là các chất như: rhamnetin, rhamnazin,
rhamnocitrin,

rhamnazin-3O-β-D-glucoside,

rhamnocitrin-4'-

D-glucoside,

rhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-Dglucopyranoside, oblanatuoside,
stigmastero, stigmasterol-3 -D-glucoside và cerevistero [23]. Trong một công trình
nghiên cứu khác Zhang Li và cộng sự còn phát hiện ra ba loại flavonol glycoside
mới được phân lập từ cây lan Một lá (Nervilia fordii) là rhamnazin 3-O-β-dxylopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranoside,rhamnazin3-O-d-glucopyranosylSố hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




(1→4) d-glucopyranoside và rhamnazin 3-O-β-d-xylopyranosyl- (1 → 4) -β-dglucopyranoside-4′-O-d-glucopyranoside [25].
Hiện nay, các nhà nghiên cứu tập trung nghiên cứu về thành phần hóa học
và hoạt tính ức chế khối u của các chất chiết xuất từ cây lan Một lá (Nervilia
fordii). Kết quả sàng lọc hoạt tính chống ung thư trong ống nghiệm chỉ ra rằng
dịch chiết từ cây lan Một lá có tác động ức chế đáng kể đối với sự phát triển của
tế bào ung thư. Các cấu trúc hóa học đã được làm sáng tỏ trên cơ sở các tính chất
hóa lý và dữ liệu quang phổ và được xác định là cycloeucalenol; stigmaterol;
sitosterol; axit ursolic; aurantiamide; (20S, 22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-3β, 5α,
6β-triol; 6 methoxy-cerevisterol; và-daucosterol [13].
1.1.5. Công dụng của cây lan Một lá
Ở Việt Nam, chưa có các công trình nghiên cứu về cây lan Một lá cũng
như thành phần hoá học có trong thân lá và củ của loài này. Tuy nhiên, từ lâu

cây lan Một lá đã được sử dụng như một loài dược liệu quý, có giá trị kinh tế.
Về tính vị và tác dụng: Cây lan Một lá có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính
bình, có tác dụng thanh nhiệt, nhuận phế, giảm ho, làm dịu cơn đau, tán ứ. Ở
nước ta, đồng bào dân tộc ở miền núi thường sử dụng lá của cây làm thuốc giải
độc, nhất là ngộ độc nấm. Người ta dùng 2 - 3 lá phơi khô thái nhỏ, hãm với
nước sôi trong ít phút rồi chiết nước uống 2 lần/ngày. Cây lan Một lá cũng được
dùng làm thuốc bồi dưỡng cơ thể, làm thuốc bổ phổi và mát phổi, chữa lao phổi,
ho lâu ngày. Liều dùng thông thường là dùng 10 - 20 lá dưới dạng thuốc sắc,
thuốc hãm, hấp đường hoặc chế biến thành cao lỏng để uống hàng ngày. Ngoài
ra, loài cây này còn dùng để chữa các bệnh như mụn nhọt, lở, ngứa bằng cách
lấy lá tươi giã nát, đắp lên các chỗ đau nhức hoặc đắp lên mụn, nhọt hoặc các
vết lở [2],[8].
Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn bộ cây để trị các bệnh: ho, lao phổi,
viêm phế quản, viêm miệng, viêm họng cấp tính, tạng lao; trẻ em hấp thụ kém
và nuôi dưỡng kém; rối loạn kinh nguyệt; đòn ngã tổn thương, viêm mủ da. Liều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




dùng 10 - 15 gam dạng thuốc hoặc ngâm rượu. Dùng ngoài bằng cách giã củ tươi
vừa đủ đắp vào chỗ đau [8].
Một số bài thuốc dùng cây lan Một lá như:
- Viêm miệng, viêm họng cấp tính: cây tươi một lá dùng nhai.
- Tạng lao: lan Một lá 15 gam nấu với thịt lợn làm canh ăn.
- Trẻ em hấp thụ kém và nuôi dưỡng kém: Củ lan Một lá 5 - 10 gam nấu
với thịt lợn nạc hoặc trứng gia cầm và ăn như thức ăn.
1.2. Mã vạch DNA (DNA barcode)
Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định
loài sinh vật. Khi tiến hành phân loại hay giám định sinh vật theo phương pháp

truyền thống thì chủ yếu là dựa trên các chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính
sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phân loại
theo phương pháp truyền thống trong nhiều trường hợp còn gặp phải khó khăn
và hạn chế như: có nhiều sinh vật mang những đặc điểm hình thái rất giống
nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác
nhau); ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần
nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Một hạn chế khác của
phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái đó là rất
khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài.
Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về
hình thái, như: những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất hoặc đã qua
chế biến thì không thể xác định được bằng chỉ thị hình thái. Gần đây nhờ vào
sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân
tử nói riêng đã cho phép chúng ta nhanh chóng xác định được sự khác biệt về
vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong
cùng loài. Từ đó có thể định danh được sinh vật và xác định được mối quan hệ
di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ. Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt
giữ sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh
học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền
ở các loài sinh vật. Trong đó, mã vạch DNA được xem như là một công cụ để
giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài.
Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh
loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những
đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay đánh giá

mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen
ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S,
5S và 16S hay được dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật.
So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao
hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào.
Năm 2003, Paul Hebert đưa ra khái niệm mã vạch DNA (DNA barcode),
nhằm giúp nhận diện các mẫu vật. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA
ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân
biệt hai loài sinh vật với nhau [17]. Xác định loài bằng mã vạch DNA sẽ cho
mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi và những quan
sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc phân
biệt loài [9]. Taberlet và cs (2007) cho rằng, hệ thống mã vạch DNA lý tưởng
phải đáp ứng các yêu cầu là: (i) Đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân
biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể
trong cùng loài; (ii) Hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với
cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau;
(iii) Đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng
định danh loài vào các nhóm phân loại; (iv) Có khả năng áp dụng với các mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản
ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA [21].
1.3. Sử dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu
Đối với các loài thực vật dùng làm thuốc luôn cần được xác định ở cấp độ
loài, xác định chính xác loài đóng vai trò quan trọng để đảm bảo về chất lượng
sản phẩm. Hiện nay với sự phát triển của thị trường thảo dược vấn đề giả mạo các

nguyên liệu thảo dược càng trở nên phổ biến. Các nguyên liệu thảo dược bị thay thế
bằng các loại thảo dược khác có quan hệ họ hàng gần gũi mang những đặc điểm
hình thái tương tự do vậy rất khó có thể phân biệt bằng mắt thường. Việc nhận biết
các nguyên liệu thảo dược bằng phương pháp mã vạch DNA sẽ mang lại kết quả
chính xác và giúp bảo vệ người tiêu dùng trước nguy cơ sử dụng phải các dược liệu
giả mạo.
Một số trình tự, vùng gen thường được nghiên cứu và sử dụng phổ biến trong
phân loại thực vật nói chung và nhận biết cây dược liệu nói riêng như trình tự vùng
gen ITS thuộc hệ gen nhân, trình tự gen matK, rbcL, rpoB, rpoC1, trnH – psbA,…
thuộc hệ gen lục lạp,...
1.3.1. Đặc điểm vùng ITS
Vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn DNA nằm giữa
các gen mã hóa RNA cấu trúc của ribosome. Vùng gen ITS bao gồm 2 vùng
riêng biệt là ITS1 và ITS2 và được nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng 5.8S khá
bảo thủ do đó vùng gen này có thể được sử dụng để nghiên cứu phát sinh loài
và nhận diện loài [18].
Các vùng ITS có độ dài 600 đến 700 bp là các vùng tiến hóa nhanh nên
có thể thay đổi về trình tự cũng như độ dài. Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo
thủ nên được sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS. Số bản
sao các đoạn lặp lại của DNA mã hóa ribosome lên tới 30 000 trong một tế bào.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Điều này làm cho ITS trở thành đối tượng lý thú cho nghiên cứu tiến hóa,
phát sinh loài [17] và đa dạng di truyền [12].
1.3.2. Đặc điểm gen matK
Gen matK mã hóa cho maturaseK được phát hiện lần đầu tiên trên cây

thuốc lá (Nicotiana tabacum). Gen matK là một trong những gen tiến hoá nhanh
nhất, có kích thước khoảng 1500 bp, nằm trong hệ gen lục lạp. MaturaseK liên
quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do
matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như
một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực
vật. Hiệp hội mã vạch CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã thử
nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín
dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử
dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [22], [23].
Sử dụng trình tự gen matK đã đạt được một số thành công trong việc
xác định các loại thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum
palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex
Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội
bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng
để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [12],
[15].
Từ các kết quả phân tích trình tự gen matK trên Genbank cho thấy gen
này có tính đa dạng rất cao [11]. Gen matK được dùng để phân biệt loài và nhận
diện loài một cách dễ dàng vì gen matK khác nhau giữa các loài nhưng lại gần
như trùng khớp trong cùng một loài. Gen matK giúp chúng ta có thể dễ dàng
phân biệt những loài có hình thái giống nhau mà bằng phương pháp phân loại
truyền thống khó có thể phân biệt được.
1.4. Tình hình nghiên cứu về gen matK, ITS của Việt Nam và trên thê giới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Ở Việt Nam, đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về mã vạch DNA
như: Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015) đã nhân bản thành công đoạn

gen matK từ nguồn DNA tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật PCR. Đã
xác định được trình tự nucleotit của đoạn gen matK của các mẫu nghiên cứu,
sản phẩm PCR có kích thước 951 bp, kết quả so sánh cho thấy không có sự
khác biệt về trình tự nucleotit của đoạn gen matK ở các lần lặp lại và các mẫu
trong cùng một loài. Trình tự đoạn gen matK phân lập được có thể là một trong
các chỉ thị dùng để phân loại các loài trà hoa vàng của Việt Nam [6].
Để hỗ trợ cho việc định danh loài Bảy lá một hoa Việt Nam - Paris
vietnamensis phục vụ nghiên cứu chọn tạo giống và nhân trồng nhóm các tác giả
nghiên cứu đã tiến hành phân tích mã vạch DNA dựa trên hai vùng gen là ITS và
psbA-trnH. Kết quả phân tích các mã vạch DNA cho thấy vùng gen ITS có thể
sử dụng để phân biệt cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam với các loài thuộc chi Paris
với độ tin cậy cao (giá trị bootstrap là 100) [4].
Nguyễn Như Hoa (2017) đã tiến hành phân tích trình tự vùng ITS của
loài Lan hoàng thảo thủy tiên nhằm phân biệt, nhận diện nhanh, chính xác, chỉ
ra mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong nhóm Thủy tiên và tạo tiền đề cho
việc xác định DNA barcode cho nhóm lan Hoàng Thảo. Trình tự vùng ITS của
15 mẫu thuộc 5 loài Hoàng thảo Thủy Tiên đã được xác định có kích thước từ
674-702bp. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy việc sử dụng trình tự vùng ITS
có thể giúp phân tách rõ ràng các loài trong nhóm Hoàng Thảo Thủy Tiên [5].
Lê Đình Chắc , Nguyễn Thị Hiền (2017) đã tiến hành phân tích trình tự
vùng ITS của 4 mẫu Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu
tại Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và Pù Luông, Thanh Hóa nhằm cung
cấp một quy trình hiệu quả cho việc xác định trình tự gen ITS loài Lan kim
tuyến và có thể áp dụng cho những loài cùng chi. Kết quả, trình tự DNA vùng
ITS đã được xác định thành công, kích thước thu được là 643 nucleotit. So sánh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

với dữ liệu vùng ITS cho thấy Lan kim tuyến có mức độ tương đồng cao, tới
99% với các loài cùng chi như A.albolineatus, A.lylei, A.formossanus và A.
koshunensis. Kết quả nghiên cứu cung cấp các dữ liệu phân tử đầu tiên cho loài
Lan kim tuyến ở Việt Nam. Đây cũng là một dữ liệu cho phân loại và nghiên
cứu nguồn gốc phát sinh loài, cung cấp các thông tin hữu ích cho chiến lược
bảo tồn loài lan quý hiếm này[3].
Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng
dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền,
bảo tồn và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta.
Nhóm nghiên cứu gồm Huang, Qionglin và cộng sự (2013) đã nghiên
cứu 4 mã vạch DNA phổ biến là ITS2, rbcL, matK và LSU D1-D3 để xác định
loài Nervilia fordii và sáu loài trong chi Nervilia. Kết quả nghiên cứu cho thấy
cả 4 mã vạch đều có khả năng phân biệt được ở cấp chi. Trong đó matK có khả
năng phân biệt hoàn toàn cho tất cả các loài được sử dụng trong nghiên cứu
này. ITS2 có khả năng phân biệt loài 66,7% đứng sau matK còn vùng rbcL và
LSU D1-D3 cho thấy khả năng phân biệt loài thấp nhất phân biệt 28,6% và
50%. Từ nghiên cứu cho thấy gen matK là một mã vạch DNA tiềm năng để
phân biệt các loài trong chi Nervilia [18].
De-Yi Wang và cộng sự (2017), đã khẳng định vùng gen ITS và matK
có thể giúp nhận diện loài và dưới loài như một mã vạch phân tử, đồng thời có
thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến hóa học phân tử và nghiên
cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý [10].
Đặc biệt gen matK được nghiên cứu nhiều để phân biệt các loài trong họ
lan. Nhóm nghiên cứu do Vincent Savolainen thuộc khoa Khoa học sự sống
Đại học Hoàng gia London đã tiến hành nghiên cứu trên diện rộng những loài
lan ở rừng nhiệt đới thuộc Costa Rica. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, có thể
sử dụng gen matK để nhận dạng 1600 loài lan. Trong nghiên cứu còn phát hiện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

ra được một loài trước đây được cho là lan nhưng thực ra lại là một loài khác
[16].

Chương 2.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu cây lan Một lá thu thập ở hai khu vực là huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng
và huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên được dùng làm vật liệu nghiên cứu.
2.1.2 Hóa chất, thiết bị
Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử như: Tris HCl, EDTA,
phenol, ethanol (100%), agarose... thuộc các hãng: Merck, Sigma, Biolabscasc
của các nước nước Mỹ, Anh, Đức. Ngoài ra còn một số hóa chất khác. Các thí
nghiệm được tiến hành trên các trang thiết bị như bộ nguồn điện di NanoPAC500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh, máy
PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800, Nhật Bản, một số thiết bị
khác như lò vi sóng (Electrolux của Việt Nam), tủ sấy (Nuaire của Mĩ), tủ lạnh
-20oC (Panasonic của Nhật Bản), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử
trùng và một số thiết bị khác.
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 4 năm 2019
Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm
Công nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường
Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Thu thập mẫu lan Một lá ở khu vực huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng và
huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên, chọn mẫu cây khỏe, không bị sâu bệnh.
Tiến hành trồng các cây này ở một địa điểm thích hợp có cường độ ánh sáng
vừa đủ, tưới nước hàng ngày với lượng nước như nhau. Sau một thời gian, thu
hoạch lá non để tiến hành tách DNA. Mẫu lá được làm sạch bằng cồn sau đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




được cho vào túi nilon buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm bảo quản ở

-

20oC để tách chiết DNA phục vụ nghiên cứu.
2.2.2. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm hình thái
- Sử dụng phương pháp đo các chỉ tiêu về chiều cao cây, kích thước lá, củ.
- Sử dụng phương pháp mô tả hình dạng lá, thân, củ.
2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Lá của lan Một lá được thu từ Cao Bằng và Thái Nguyên đã được giữ ở 20C cho tới khi sử dụng. DNA từ lá cây lan Một lá được tách bằng Kit
GeneJET Plant Genomic DNA Purification (K0791) theo hướng dẫn
của nhà sản xuất. Cụ thể:
- 100mg lá tươi được nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ,
sau đó được bổ sung 350 µl đệm phá tế bào A (Lysis Buffer A) và đảo đều
trong 10 giây.
- Thêm 50 µl đệm phá tế bào B (Lysis Buffer B) và 20 µl RNase A.
- Mẫu sau đó được ủ ở 65°C trong 10 phút trong bể ổn nhiệt, thường xuyên

đảo trộn mẫu bằng máy vortex sau mỗi 2 phút.
- Kết thúc quá trình này 130 μl dung dịch tủa được cho vào ống mẫu, lắc
nhẹ 2-3 lần và ủ trong đá 5 phút.
- Ống mẫu sau đó được ly tâm 14000 vòng trong 5 phút để thu dịch nổi
vào ống 1.5ml và cộng 400 µl dung dịch bám màng (Plantg DNA Binding
Solution) và 400 µL cồn tuyệt đối rồi lắc đều.
- Chuyển dịch mẫu từ ống 1.5ml sang cột để thu DNA. Tiến hành li tâm
8000 vòng trong 1 phút để bỏ dịch.
- Màng trên cột đã được rửa với 500μl dung dịch rửa 1 (Wash Buffer I) rồi
loại dung dịch rửa bằng li tâm 10000 vòng trong 1 phút.
- Sau đó rửa lại bằng 500 μl dung dịch rửa 2 (Wash Buffer II) và li tâm
14000 vòng trong 3 phút để loại dung dịch rửa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




- Cuối cùng DNA được thu lại từ cột bằng cách bổ sung 100 μl nước cất
lên cột, để 5 phút ở nhiệt độ phòng và li tâm 10000 vòng trong 5 phút để thu
dịch chứa DNA tổng số.
DNA tổng số sau đó được kiểm tra bằng điện di và bảo quản ở -20C cho
các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3.2. Phương pháp nhân gen bằng kĩ thuật PCR
Gen matK và ITS được khuếch đại bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu. Trên cơ sở cặp mồi nhân bản gen matK và ITS công bố trên website:
/>Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm 2 cặp mồi là (matK- F,
matK- R) và (ITS-F, ITS-R. Trình tự các cặp mồi được thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen ITS và matK
STT Vùng gen

Trình tự mồi 5’-3’

Kích thước đoạn

nhân bản

DNA dự kiến

1

ITS-F

ATGCGATACTTGGTGAAT

2

ITS-R

GACGCTTCTCCAGACTACAAT

3

matK- F

CGATCTATTCATTCAATATTTC

4

matK- R

TCTAGCACACGAAAGTCGAAG

500bp

800bp

T
Bước 1: Nhân gen bằng kĩ thuật PCR
Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 15µl, được thực hiện trên máy
PCR. Thể tích cụ thể của các thành phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở
bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN