Tổng hợp nano bạc ứng dụng diệt vi khuẩn bằng phương pháp khử quang hoá

t¹P CHÝ Y - D−îc häc qu©n sù sè 4-2020

TỔNG HỢP NANO BẠC ỨNG DỤNG DIỆT VI KHUẨN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỬ QUANG HOÁ
Lê Văn Dung1, Nguyễn Minh Ngọc2, Nguyễn Tiến Thắng3
TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu tổng hợp nano bạc trong dung dịch bằng phương pháp khử quang
hoá. Đối tượng và phương pháp: Dùng ethylhydroxyl celolose (HEC) làm tác nhân khử, đồng
thời là chất ổn định dung dịch nano bạc. Quá trình tổng hợp được thực hiện trong dung dịch,
chiếu sáng với bước sóng 430 nm. Xác định kích thước hạt nano bằng các phương pháp:
Quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS), tán xạ ánh sáng động học (DSL). Nghiên cứu khả
năng diệt vi khuẩn (VK) trên 3 chủng E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATTC 27853 và S.
aureus ATC29213. Kết quả và kết luận: Đã nghiên cứu thành công phương pháp tổng hợp
dung dịch nano bạc để diệt VK trong nhiều đối tượng.
* Từ khoá: Nano bạc; Khử quang hoá; Diệt vi khuẩn.

MỞ ĐẦU
Bạc là kim loại chuyển tiếp màu trắng,
mềm, có tính dẫn điện cao nhất trong tất
cả nguyên tố, độ dẫn nhiệt cao nhất trong
tất cả kim loại, được sử dụng làm đồng
tiền xu, đồ trang sức, chén đũa và đồ
dùng sinh hoạt. Các hợp chất của bạc
được dùng trong phim ảnh, bạc nitrat pha
loãng được dùng làm chất diệt VK. Trong
y học, bạc là thành phần sản xuất băng
vết thương và được sử dụng như một lớp
phủ kháng sinh trong các thiết bị y
tế. Băng chứa bạc sulfadiazine hoặc bạc
nano được sử dụng để điều trị nhiễm
trùng bên ngoài vết thương [1, 2]. Nano

bạc là những hạt nano của bạc có kích
thước từ 1 - 100 nm, hình dạng đa dạng
phụ thuộc vào phương pháp điều chế
(hình cầu, tứ diện, bát diện…). Có rất nhiều
phương pháp tổng hợp nano bạc, theo
1

thống kê, từ năm 1992 - 2014, số lượng
công trình công bố về phương pháp tổng
hợp nano bạc tăng rất nhanh (năm 1992
chỉ có 1 công trình, năm 2014 là 800 công
trình). Các phương pháp tổng hợp nano
bạc phổ biến: Phương pháp khử hoá học
[3, 4, 5, 6, 7], chiếu tia laser [8], điện hoá
[9]. Các phương pháp tổng hợp trước đây
có nhiều ưu điểm nhưng vẫn tồn tại
những nhược điểm: Nhiều giai đoạn phức
tạp, hoá chất đắt tiền, sản phẩm thu được
kém bền theo thời gian bảo quản nên ảnh
hưởng đến khả năng ứng dụng. Vì vậy,
chúng tôi nghiên cứu tổng hợp nano bạc
qua một giai đoạn với chất khử là
hydroxylcellulose (HEC), đồng thời là chất
ổn định của dung dịch nano bạc trong quá
trình bảo quản, chất oxi hoá là bạc nitrat,
trong quá trình tổng hợp, chiếu sáng tử
ngoại để tăng tốc độ tổng hợp.

Bộ môn Hóa, Học viện Quân y
Khoa Hóa - ĐHNN – ĐHQG

3
Công ty Cổ phần Liên doanh Sơn Quốc tế
Người phản hồi: Lê Văn Dung ()
Ngày nhận bài: 25/3/2020
Ngày bài báo được đăng: 12/5/2020
2

24


T¹P CHÝ Y - D−îc häc qu©n sù sè 4-2020
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu
Hydroxyethyl cellulose (HEC) và bạc
nitrat được cung cấp bởi Công ty SigmaAldrich (Mỹ). Ba chủng VK E. coli ATCC
25922, P. aeruginosa ATTC 27853 và S.
aureus ATC29213 được cung cấp bởi Bộ
môn Vi sinh vật, Học viện Quân y.
2. Tổng hợp nano bạc
Thêm từ từ dung dịch muối bạc nitrat
nồng độ 0,1M (tương ứng với các nồng

độ nano bạc thu được) vào bình cầu hồi
lưu chứa 50 ml dung dịch HEC 0,35%,
khuấy đều, đồng thời chiếu sáng tử ngoại
bằng đèn chiếu tử ngoại (15 watt,
254/365 nm) ở bước sóng 254 nm (đèn
được đặt cách bình phản ứng 5 cm) đến
khi thu được dung dịch nano bạc có màu
vàng nhạt đến nâu, đun sôi hồi lưu dung

dịch đến khi không còn ion bạc (không có
phản ứng tạo kết tủa đen với dung dịch
natri sunfua). Bảo quản dung dịch nano
bạc ở điều kiện thường, trong lọ tối màu.

Phản ứng của quá trình tổng hợp như sau:

Cellulose-CH2-CH2-OH + 4Ag+ + H2O
3. Khảo sát dung dịch nano bạc
Khảo sát phổ UV-VIS của dung dịch
nano bạc bằng cách pha loãng các dung
dịch nano bạc đến 20,0 ppm. Thực hiện
đo phổ UV-VIS trên máy đo Spectro UVVIS UVD-2960 (Công ty Labomed, Inc, Mỹ)
với bước sóng 370 - 600 nm. Đo kích
thước hạt nano bạc bằng phương pháp
tán xạ ánh sáng. Pha loãng dung dịch
nano bạc đến nồng độ 20 ppm bằng dung
dịch Tween 80 nồng độ 2%, thực hiện
phép đo trên máy SZ-100 - HORIBA với
góc nhiễu xạ 90o, vùng đo 0,1 - 10.000 nm,
cuvet 1 cm.
4. Thử hoạt tính diệt VK của dung
dịch nano bạc
* Xác định nồng độ ức chế VK tối thiểu
(MIC):
Pha loãng dãy nồng độ dung dịch nano
bạc ở các nồng độ khác nhau (1/2; 1/4; 1/8;
1/16; 1/32; 1/64), trộn mỗi dung dịch với
lượng VK ở nồng độ nhất định (108 VK/ml).

hν

Cellulose-CH2-COOH + 4Ag + 4H+

Sau mỗi thời điểm (0 giờ, 2 giờ, 6 giờ,
24 giờ), lấy hỗn hợp cấy lên đĩa thạch
thành các đường song song. Ủ ấm ở
nhiệt độ thích hợp (37oC) trong thời gian
quy định (24 giờ). Định lượng VK mọc trên
đĩa thạch so với mẫu chuẩn (mẫu chuẩn
có các đường ứng với dãy nồng độ VK:
102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 CFU/ml).
* Khả năng diệt khuẩn bề mặt tiếp xúc:
Các chủng VK dùng trong nghiên cứu:
VK 24 giờ tuổi, chủng E. coli ATCC 25922,
P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus
ATCC 29213. Dung dịch nano bạc được
chia ra 2 lọ: 1 lọ giữ nguyên nồng độ ban
đầu, 1 lọ được pha loãng có nồng độ
bằng 1/2 dung dịch ban đầu. Tạo huyền
dịch nồng độ 108 của từng chủng VK E.
coli, P. aeruginosa, S. aureus trên máy so
độ đục nồng độ 0,5 Mc Farland. Tạo mô
hình nhiễm: Với mỗi chủng VK tạo 2 mô
hình nhiễm bằng cách dùng tăm bông đã
được thấm ướt bằng huyền dịch VK đã
25


t¹P CHÝ Y - D−îc häc qu©n sù sè 4-2020

chuẩn bị ở bước 2 ria lên bề mặt 2 đĩa
petri có đường kính 12 cm. Khi bề mặt
các mô hình nhiễm se lại dùng tăm bông
đã được làm ẩm bằng nước muối sinh lý
phết lên một góc đĩa, ria các tăm bông đó
lên các đĩa thạch Muller Hinton tương
ứng (thời điểm 0). Phun sương dung dịch
nano bạc nồng độ 1 và 1/2 lên các mô
hình nhiễm. Dùng tăm bông đã được làm
ẩm bằng nước muối sinh lý phết ngẫu
nhiên lên một góc đĩa petri (1 tăm bông
cho 1 đĩa petri) ở các thời điểm 1 phút, 5
phút, 15 phút sau khi VK tiếp xúc với

dung dịch phun sương nano bạc. Mỗi tăm
bông được ria lên 1 đĩa thạch Muller
Hinton tương ứng để kiểm tra khả năng
diệt khuẩn. Ủ các đĩa thạch ở 37oC trong
24 giờ. Sau 24 giờ, lấy các đĩa thạch
Muller Hinton ra đọc kết quả. So sánh mỗi
nồng độ dung dịch nano bạc tiếp xúc với
3 chủng VK tương ứng ở các thời điểm
1 phút, 5 phút và 15 phút với thời điểm 0.
Nếu không mọc VK, kết luận dung dịch
nano bạc diệt hoàn toàn VK; nếu có mọc
VK, kết luận dung dịch nano bạc không
diệt hoàn toàn VK.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Tổng hợp dung dịch nano bạc

Bảng 1: Thời gian phản ứng ở các nồng độ AgNO3 khác nhau.
-1

[AgNO3] (mmol.L )

0,5

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

7,0

8,0

Thời gian phản ứng (phút)

15

15

25

40

60

90

150

320

Hình 1: Hình ảnh dung dịch nano bạc (Nồng độ tăng dần từ phải qua trái).
Khi tăng nồng độ của AgNO3, thời gian phản ứng tăng dần, dung dịch có màu đậm dần
từ vàng chanh sang đỏ, nồng độ cao nhất có màu nâu đen.
26


T¹P CHÝ Y - D−îc häc qu©n sù sè 4-2020
2. Khảo sát phổ hấp thụ UV-VIS của dung dịch nano bạc

Bước sóng (nm)

Hình 2: Phổ UV-VIS của các dung dịch nano bạc.
Khi nồng độ dung dịch càng cao, bước sóng hấp thụ cực đại càng lớn. Các nghiên
cứu đã chỉ ra bước sóng hấp thụ cực đại càng lớn, kích thước hạt nano càng lớn [10].
Như vậy, khi tăng nồng độ AgNO3 trong quá trình tổng hợp nano bạc thì kích thước hạt
nano bạc tăng dần.
3. Phân tích kích thước hạt
Bảng 2: Kích thước hạt nano bạc.
Tên
mẫu

Nồng độ AgNO3
(mmol/l)

M1

0,5

M2

1,0

M3

2,0

M4

3,0

Các vùng kích thước
hạt trung bình (nm)

Tỷ lệ (%)

4,1

24,0

45,5

76,0

4,7

23,0

47,1

77,0

4,6

17,0

57,3

83,0

6,5

16,0

62,7

84,0

Kích thước hạt
trung bình chung (nm)
35,6

37,3

48,3

53,7

27


t¹P CHÝ Y - D−îc häc qu©n sù sè 4-2020

M5

4,0

M6

5,0

M7

6,0

M8

7,0

7,1

18,0

66,2

82,0

7,9

21,0

73,1

79,0

6,8

12,0

74,3

88,0

73,2

100,0

55,6

59,4

66,2

73,2

Khi tăng dần nồng độ AgNO3, kích thước hạt tăng dần từ 35,6 nm (AgNO3 0,5 mmol/l)
đến 73,2 nm (AgNO3 7,0 mmol/l). Tuy nhiên, từ mẫu M1 đến mẫu M7 có 2 vùng kích
thước hạt nano, vùng 1 kích thước rất nhỏ (< 10 nm) với khoảng 20%, vùng 2 có kích
thước lớn hơn (40 - 90 nm). Mẫu M8 không có vùng có kích thước nhỏ, chỉ có 1 vùng
có kích thước lớn.
4. Nghiên cứu khả năng diệt VK
* Xác định nồng độ ức chế VK tối thiểu (MIC):
Bảng 3: Khả năng diệt VK E. coli ATCC 25922 của nano bạc ở các nồng độ khác nhau.
Nồng độ nano bạc (ppm)

Khả năng diệt VK E. coli ATCC 25922 (CFU/ml)
0 giờ

2 giờ

6 giờ

24 giờ

162,0

10

8

0

0

0

81,0

10

8

0

0

0

40,5

10

8

0

20,2

10

8

10,1

10

5,0

10

Mẫu chuẩn

0 giờ

0

0

10

5

0

10

4

8

10

6

10

5

10

7

8

10

6

10

6

10

7

2 giờ

6 giờ

24 giờ

Hình 3: Hình ảnh khả năng diệt VK E. coli ATCC 25922 của dung dịch nano bạc.

28


T¹P CHÝ Y - D−îc häc qu©n sù sè 4-2020
Nồng độ dung dịch nano bạc tối ưu dùng để diệt VK E. coli ATCC 25922 là 40,5 ppm.
Các dung dịch có nồng độ thấp < 10 ppm không có khả năng diệt VK. Dung dịch nồng độ
20 ppm ức chế tạm thời VK (sau 6 giờ VK vẫn phát triển).
* Khả năng diệt khuẩn bề mặt tiếp xúc:
Bảng 4: Khả năng diệt VK trên bề mặt tiếp xúc của dung dịch nano bạc.
TT

1
2
3
4
5
6

Loại VK

E. coli
ATCC 25922
P. aeruginosa
ATTC 27853
S. aureus
ATC 29213

Nồng độ nano
bạc (ppm)

Nồng độ VK
ban đầu (VK/ml)

Nồng độ VK sau khi phun dung dịch
nano bạc (VK/ml)
1 phút

5 phút

15 phút

100,0

10

8

0

0

0

50,0

10

8

0

0

0

100,0

10

8

0

0

0

50.0

10

8

0

0

0

10

8

10

8

100,0
50,0

10

3

10

4

0
10

0
2

0

Dung dịch nano bạc dạng phun sương bề mặt với nồng độ thử nghiệm có hiệu lực
diệt khuẩn với các chủng VK Gram âm E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC
27853 ở nồng độ nano bạc 50 ppm; hiệu lực diệt khuẩn tốt với chủng S. aureus ATCC
29213 ở nồng độ 100 ppm sau thời gian phun 5 phút.

KẾT LUẬN
Đã nghiên cứu thành công phương
pháp tổng hợp dung dịch nano bạc bằng
phương pháp quang hoá sử dụng ánh
sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, dùng
chất hydroxyetylcellulose làm chất khử và
ổn định dung dịch. Dung dịch nano bạc
thu được có kích thước trung bình nhỏ,
bền theo thời gian. Sử dụng các phương
pháp hiện đại như quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), tán xạ ánh sáng động
học (DSL) xác định kích thước hạt nano
trong dung dịch. Nghiên cứu khả năng ức
chế VK E. coli ATCC 25922, kết quả khả
năng ức chế VK tốt nhất ở nồng độ nano
bạc 40 ppm. Dung dịch nano bạc dạng phun
sương bề mặt với nồng độ thử nghiệm có

hiệu lực diệt khuẩn với các chủng VK
Gram âm E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa
ATCC 27853 ở nồng độ nano bạc 50 ppm;
hiệu lực diệt khuẩn tốt với chủng S. aureus
ATCC 29213 ở nồng độ 100 ppm sau
thời gian phun 5 phút. Kết quả nghiên
cứu cho thấy có thể sử dụng dung dịch
nano bạc tổng hợp được để diệt VK trong
nhiều đối tượng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Atiyeh, Bishara S, Costagliola, et al.
Effect of silver on burn wound infection control
and healing: Review of the literature. Burns

2007; 33(2): 139-148.
2. Hermans, Michel H. Silver-containing
dressings and the need for evidence. American
Journal of Nursing 2006; 106(12):60-68.

29


t¹P CHÝ Y - D−îc häc qu©n sù sè 4-2020
3. Turkevich J, Stevenson PL, Hillier J.
A study of the nucleation and growth process
in the synthesis of colloidal gold. Discuss.
Faraday Soc 2006; 11:55-75.
4. Polte J, et al. Formation mechanism of
colloidal silver nanoparticles: Analogies and
differ-ences to the growth of gold nanoparticles.
ACS Nano 2012; 6(7):5791-5802.
5. Patakfalvi R, Dekany I. Nucleation and
growth of silver nanoparticles monitored by
titration microcalorimetry. J Therm Anal Calorim
2005; 79:587-594.
6. Yoosaf K, et al. In situ synthesis of metal
nanoparticles and selective naked-eye detection
of lead ions from aqueous media. J Phys
Chem C 2007; 111:12839-12847.

30

7. Hada H, et al. Photoreduction of silver
ion in aqueous and alcoholic solutions. J Phys

Chem 1976; 80(25):2728-2731.
8. Hu MZ, Easterly CE. A novel thermal
electrochemical synthesis method for production
of stable colloids of “naked” metal (Ag) nanocrystals.
Mater Sci Eng C 2009; 29(3):726-736.
9. Surudzic R, et al. Electrochemical
synthesis of silver nanoparticles in poly(vinyl
alcohol) solution. J Serb Chem Soc 2013;
78(12):2087-2098.
10. MA Noginov, et al. The effect of gain
and absorption on surface plasmons in metal
nanoparticles. Applied Physics B 2007; 86:455-460.