KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN HỆ PROTEIN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA THƠM Ở ĐỒNG BẲNG SÔNG CỬU LONG BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.69 MB, 64 trang )
B
GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO
ĐÀO TẠ O
TRƯ Ờ NG ĐẠ I HỌ C CẦ N THƠ
VIỆỆ N NGHIÊ
VI
GHIÊN
N CỨ
CỨ U VÀ PHÁT
PHÁT TRI
TRIỂ N CÔNG
CÔNG NGHỆ
NGHỆ SIN
SINH HỌ C
L U Ậ N V Ă N T Ố T N G H IỆ P Đ Ạ I H Ọ C
N GÀ
G À NH
NH CÔ
C Ô NG
NG N GH
GH Ệ S IN H H Ọ C
K HẢ O SÁT S Ự BIỂ U H IỆ N HỆ PR O T EIN CỦ A M T SỐ
GIỐ NG LÚA T H Ơ M Ở ĐỒ NG BẰ NG SÔ
SÔNG CỬ U LONG
BẰ NG KĨ THUẬ T ĐIỆ N DI
CÁN
CÁ
N BỘ HƯ Ớ NG DẪ N
TS. TRẦ
TRẦ N NHÂN
NHÂN DŨ NG
SI
SINH
NH VI
VIÊN
ÊN THỰ
THỰ C HI
HIỆỆ N
NHÂM
NHÂM THỊ
THỊ THU THỦ
THỦ Y
MSSV: 3064419
LỚ P: CNSH
CNSH TIÊN
TIÊN TIÉN K32
Cần Thơ, tháng 11/2010
PHẦ N KÝ DUYỆ T
. CÁN B
HƯ Ớ NG DẪ N
SINH VIÊN THỰ C HIỆ N
Trần Nhân Dũng
Nhâm Thị Thu Thủy
DUYỆ T CỦ A H I ĐỒ NG BẢ O VỆ LUẬ N VĂN
C n Thơ
Thơ , ngày
tháng 11 năm 2010
CHỦ TỊ CH
CH H I ĐỒ NG
TS. TR
TRƯ Ơ NG TRỌ NG NGÔN
LỜ I CẢ M T
Luận văn tốt nghiệp tuy không phải là một công trình quá lớn lao nhưng đã đánh
dấu kết
kết quả của cả một quá trình học tậ
tậpp trong suốt mư ời sáu nă
năm.
m. Đ ể hoàn thành
thàn h tốt
luận văn này em đã nhận được sự giúp đỡ từ rất nhiều người. Em xin chân thành gửi
lời cám ơn đến:
TS. Trần Nhân Dũng đã tận tình
tình dạy bảo, hướ
hướng
ng dẫ
dẫn,
n, thăm hỏi và động viên.
Th.S. Trần ThịXuân Mai đã giúp đỡ, hỗ trợ và chỉbảo.
CN. Nguyễn ThịXuân Dung đã theo sát, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong
suốt thời gian làm luận văn.
CN. Nguyễn Vũ Linh đã hỗ trợ trong quá trình hoàn thành luận văn.
Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học và các thầy cô
của Viện đã quan tâm, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề
tài tốt nghiệp.
Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học Tiên Tiến K32 đã giúp đỡ, chia sẻ trong học tập
cũng như trong cuộc sống.
Con xin dành lời tri ân sâu sắc đến ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con nên
người. Ông bà, cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con.
TÓM L Ợ C
Nhằ m thiế t lậ p quy trình trích ly protein
prot ein từ hạ t lúa và nghiên
ng hiên cứ u sự biể u hiệ n hệ
protein
prote
in củ a mộ t số giố ng lúa thơ m ở ĐBSCL, các thí nghiệ m đư ợ c tiế n hành trên 5
giố ng lú
lúa
a thơ
thơ m và 2 giố ng lúa
lúa không
không thơ m theo
theo các
các bư ớ c: kh
khảả o sát các quy trìn
trình
h trích
trích
ly, điệ
điệ n di SDS và điệ
điệ n di hai chi
chiềề u. Kế t quả
quả qu
quyy trìn
trình
h trích
trích ly
ly protein
protein từ hạ t sử dụ ng
dung dịch
dịch trích
trích ly bao
bao gồ m 125mmol/l Tris
Tris HCl,
HCl, p H 6,8 có
có chứ a 4mol/l urea;
urea; 4% SDS
và 5% 22-Me
Merc
rcap
apto
toet
etha
hano
noll kế t hợ p vớ i phư ơ ng pháp thẩ
thẩ m tíc
tích
h đố
đố i chứ
chứ ng nư ớ c cch
ho
lư ợ ngprotein
ngprotein cao
cao và tin
tinh
h sạ
sạ ch.
ch. Qua
Qua phổ điệ
điệ n di hai ch
chiề
iề u, chúng
chúng tôi
tôi đã xác đ
định
ịnh đư ợ c
nhữ ng protein
protein tư ơ ng qu
quan
an vớ
vớ i mùi
mùi th
thơơ m củ
củ a thà
thành
nh ph n globul
globulin
in có
có điể
điể m đẳ
đẳ ng đi
điệệ n
nằ m tron
trong
g khoả
khoả ng 6,4 - 7,0, trọ ng lư ợ ng phân tử đư ợ c tìm
tìm thấ
thấ y trê
trên
n gel đi
điệệ n di
di h
hai
ai
chiề u là 11,5kDa,
11,5kDa, 30,7kDa, 33,9kDa, 34,0kDa
34, 0kDa và 66,8kDa.
66,8kDa.
Từ khóa
hóa
: điệ n di hai chi
chiềề u, globul
globulin,
in, hệ protein, lúa thơ m, mùi
mùi thơ m trên
trên lúa
lúa,, SDSPAGE.
1
MỤ C LỤ C
KÍ TÊ
TÊN
N H I ĐỒ NG
LỜ I CẢ M TẠ
TÓM LƯ Ợ C......
C.............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..........
... i
MỤ C LỤ C..........
C.................
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..........i
...iii
DANH SÁCH BẢ NG.......
NG ..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
........v
..v
DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................vi
CÁC TỪ VIÉT TẮ T.........
T................
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............vi
.......viii
CHƯ Ơ NG I: G
GIỚ
IỚ I TH
THIỆ
IỆ U.....
U........
......
.......
.......
......
.......
.......
......
.......
.......
.......
.......
......
.......
.......
......
.......
.......
......
.......
.......
.......
.......
......
...11
CHƯ Ơ NG II:
II: L
LƯƯ Ợ C KH
KHẢẢ O TÀ
TÀII LIỆ U..
U.............
..................
..................
..................
..................
..................
..................... 2
I. SƠ LƯ Ợ C VỀ CÁC GIÓNG LÚA THƠ M HIỆ N NAY
NAY
.............................
2
1. Các giố ng lúa thơ m trên thế giớ i........
i...............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..............
..........
... 2
2. Các
Các giố
giố ng lúa
lúa th
thơơ m tr
tron
ongg nư ớ c
3. Prot
Protei
einn ddựự trữ
trữ tr
tron
ongg hạ t lúa
...................................................................
........................................................................
2
3
3.1. Protein dự trữ trong hạt...............................................................................3
3.2. Các thành phần và vịtrí protein trong hạt lúa............................................4
4. Mùi thơ m trên cây lúa............
lúa..................
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..........
...66
5. Nhữ ng yế u tố ả nh hư ở ng đế n mùi
mùi th
thơơ m ttrê
rênn cây lúa....
lú a...................
..................
..................
...66
6. Nh
Nhữữ ng nghi
nghiên
ên cứ u ccơơ bả n về lúa
lúa th
thơơ m trên
trên thế
thế giớ
giớ i và Vi
Việệ t Nam
.........
9
6.1. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm trên thế giới ................................... 9
6.2.. Nhữ
6.2
Những
ng nghiên cứu cơ bản v
về
ề lúa thơm ở Việt N am ................................... 10
II
II.. KĨ THUẬ T ĐIỆ N HAI CHIỀ U T
TRO
RONG
NG PHÂ
PHÂN
NT
TÍC
ÍCH
H PROT
PROTEIN.
EIN...........1
..111
1. Điệ n di mộ t ch
chiềiề u (SDS-PAGE).........
(SDS-PAGE)................
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............11
......11
2. Điệ n di dự a vào đđiêm
iêm đăng điệ n...........
n.................
.............
..............
..............
.............
.............
..............
..............
..........13
...13
3. Điệ n di hai chiề u...................................
u...........................................................................................
............................................................ 14
CHƯ Ơ NG III: P
PH
HƯ Ơ NG TIỆ N VÀ PHƯ Ơ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U
.............
15
I. ĐỊ
ĐỊA
A ĐIỂ M VÀ THỜ I GIA
GIAN
N NGHI
NGHIÊN
ÊN CỨ U.........
U............
.......
.......
......
.......
.......
......
.......
.......
......
.......
.....15
.15
1. Địa điêm
điêm nghi
nghiên
ên cứ u
.....................................................................................
ii
15
2. Thờ i gia
giann ngh
nghiên
iên cứ u......
u..........
.......
......
.....
15
II
II.. PHƯ Ơ NG P
PHÁP
HÁP N
NGHIÊN
GHIÊN CỨ U.....
U........
......
.......
.......
......
.......
.......
......
.......
.......
.......
.......
......
.......
.......
......
.......
.......
.....1
..155
1. Dụ ng cụ và hó
hóaa chấ t........
t..............
.............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
..............
............1
.....155
1.
1.1
1. D
Dụng
ụng c ụ ..................................................
......................................................................................................
.................................................... 15
1.
1.2
2. Hóa chấ
chất...............................................
t......................................................................................................
......................................................... 15
2. Nguyên liliệệ u ....................................................
......................................................................................................
..................................................16
16
III. PHƯ Ơ NG PH ÁP
ÁP.......
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
....... 17
1. Quy trình thí ng
nghi
hiệệ m........................................................
m. .....................................................................................
..............................17
17
2. Ti
Tiếế n hàn
hànhh thí nghiệ m
....................................................................................
17
2.1. Thí nghiệm 1: Ly trích protein ................................................................... 17
2.2. Thí nghiệm 2: SDS-PAGE..........................................................................18
2.3.. Thí nghiệ
2.3
nghiệm
m 3: Đ iệ
iện
n di hai chiề
chiều
u (2(2-DE
DE)).................................................... 19
CHƯ Ơ NG IV
IV:: KÉ
KÉT
T QU
QUẢẢ VÀ TH
THẢẢ O LUẬ N....
N...........
..................
..................
..................
..................
.....................21
..21
1. Ly trích pr
prote
otein.............
in....................................................................
..................................................................................
........................... 21
2. SDS-P
SD S-PAG
AGE.................
E........................................................................
.....................................................................................
.............................. 23
3. Điệ n di hai chiề u.......
u..............
..............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
.............
......25
25
CHƯ Ơ NG V: K
KÉ
ÉT LUẬ N VÀ ĐỀ NGH
NGHỊỊ
.............................................................
32
I. KÉT LUẬ N........
N...............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
..............
........... 32
II. ĐỀ NGHỊ .............
....................
..............
..............
.............
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
..............
....... 33
TÀI LIỆ U THAM KH Ả O...................
O.........................
.............
..............
..............
.............
.............
..............
.............
.............
..............
.........34
..34
PHẦ N PH L C
Phụụ lụ c 1:
Ph
1: H
Hìn
ìnhh ge
gell củ
củ a đđiệ
iệ n ddii hhai
ai ch
chiề
iề u
Phụụ lụ c 22:: X
Ph
Xác
ác đđịn
ịnhh hhàm
àm lư ợ ng ppro
rote
tein
in bbằằ ng phư
phư ơ ng ph
pháp
áp Brad
Bradfo
ford
rd
1. Ngu
Nguyên
yên tắc
2. Tiến hành thí nghiệm
Phụụ lụ c 33:: Đ
Ph
Điệ
iệ n ddii SSD
DS
1. Ngu
Nguyên
yên tắc
2. Tiến hành
iii
Phụ lụ c 4:
4: Điệ
Điệ n di
di cchi
hiềề u thứ
thứ nhấ
nhấ t ((Iso
Isoele
electr
ctric
ic focus
focusing
ing))
Phụụ lụ c 5:
Ph
5: Điệ
Điệ n di
di chi
chiềề u thứ
thứ hai
hai SDS
SDS - PAGE
PAGE cho
cho 2-D
2-D
1. Chuẩn bịgel
bị gel
2. Cân bằng thanh IPG S
Strip
trip
3. Loa
Loading
ding gel
4. Tiến hành điệ
điện
n di
5. Nhuộ
Nhuộm
m gel bằng Biosafe Coomsi
Coomsiee Blue
6. Rử
Rửaa gel
7. Đ ọc kết
kết quả
Phụụ lụ c 6:
Ph
6: Phư
Phư ơ ng ph
pháp tín
tính
h trọ
trọ ng lư ợ ng phân
phân tử tr
trên
ên gel SDS
Phụ lụ c 7:
7: Ma trậ n nhị
nhị phân
phân thôn
thông
g qua 2-DE
Phụụ lụ c 8:
Ph
8: So
So sán
sánh
h độ
độ khác
khác biệ
biệ t giữ
giữ a các
các gi ng lú
lúa
a thơ
thơ m ở đi
điệệ n di
di hai
hai ch
chiề
iề u
iv
DANH SÁCH B NG
Bả ng
Tênn B
Tê
Bảả ng
Trang
1
Tổ hợp lai tạo và đặc điểm của một số giống lúa được sử dụng
16
2
Kết quả ly trích protein của các phương pháp được khảo sát
21
3
Tóm tắt những protein khác biệt của từng giống lúa thơm
33
v
D A N H S Á C H H ÌN
ÌN H
Tên Hình
[ình
1
Nguyên lí điện di SDS
13
2
Nguyên lí của điện di hai chiề
chiều
u
14
3
Sơ đồ bố trí các bước tiến hành thí nghiệm
17
4
Quy trình trích ly protein từ hạt lúa
17
5
Phổ điện di SDS của các phương pháp ly trích được khảo sát
22
6
Phổ điện di SDS của các giống lúa
23
7
So sánh giữa đối chứng âm và lúa thơm
25
8
So sánh giữa giống lúa MTL513 và đối chứng âm
26
9
So sánh giữa giống lúa MTL495 và đối chứng âm
27
10
So sánh giữa giống lúa MTL578 và đối chứng âm
28
11
So sánh giữa giống lúa MTL579 và đối chứng âm
29
12
So sánh giữa giống lúa MTL549 và đối chứng âm
30
13
Giản đồ tương quan giữa các giống lúa thơm thông qua 2DE
31
vi
CÁC
CÁ
CT
VIÉT
VIÉT TẮ T
KDM
Khao Dawk Mali
kDa
Kilo Dalton
PMSF
Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
fgr
Fragrance
RNA
Ribonucleic Acid
DNA
Deoxyribonucleic Acid
cM
Centi Morgan
ESP
External Sense Primer
INSP
Internal Non-fragrant Sense Primer
IFAP
Internal Fragrant Anti-sense Primer
EAP
External Anti-sense Primer
SSR
Simple Sequence Repeat
Đ BSCL
Đ ồng Bằng Sông Cửu Long
PC R
Polymerase Chain Reaction
2DE
2-Dimensional Electrophoresis
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
IEF
Isoelectric focusing
I PG
Immobilized pH Gradient
DD
Dung dịch
vii
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
CH
Trư ờ ng ĐHC T
Ơ N G I: G I Ớ I T H I Ệ U
Lúa là một trong những loại cây lương thực phổ biến nhất trong cuộc sống con
người. Đ ặc tính mùi thơm ở lúa đượ
đượcc đánh giá rrất
ất ccao.
ao. Nó được tạo thành bởi hàng
trăm loại chất thơm dễ bay hơi như hydrocarbons, alcohols, aldehydes, ketones, acids,
phenols, pyridine, 2-acetyl-1-pyrroline... (Lorieux et al., 199
1996);
6); trong đó, 2-acetyl-1 pyrroline được xem như là nguyên nhâ
nhân
n chính tạo ra mùi thơm của hai giống Basmati
và Jasmine (Bradbury, 2005).
2005). Tạ
Tạii Đ ồng Bằ
Bằng
ng Sông Cửu Long (Đ BSCL), ngoài các
giống lúa thơm đặ
đặcc sản hiệ
hiện
n có tại một vài địa phươ
phương
ng như Dự Hư
Hương,
ơng, Nà
Nàng
ng Thơm
Chợ Đ ào,... hiện nay các nhà khoa học và các cơ quan nghiên cứu đã và đang tiế
tiến
n
hành nhập nội và lai tạo được một số giống lúa thơm có những đặc tính thích nghi tốt
với điều kiệ
kiện
n sinh th
thái
ái vùng Đ BSCL như Jasmine 85, VĐ 20, ST3, ST10,... Hơn nữa,
các giống lúa thơm có ưu điểm là tính trạng mùi thơm thường liên kết với tính trạng
chấtt lượ
chấ
lượng
ng nấu nướng tốt và tỉ lệ xay xát cao (Nagarju et al., 19
1979
79).
). Bê
Bên
n cạnh nh
những
ững
ưu điểm đó thì những giống lúa đặc sản chất lượng cao nêu trên cũng mang một số
nhược
như
ợc điểm như thời gian sinh tr
trưở
ưởng
ng dài, năng suất thấ
thấp,
p, chống chị
chịu
u sâu bệnh yế
yếu,
u, dễ
rụng hạt
hạt và hay bị đổ
đổ.. Thêm vào đó, các giống lúa thơm ở Việt Nam có mùi thơm
không giữ được lâu, sau khi thu hoạch tồn trữ khoảng hai tháng gạo đã hết mùi thơm
( ).
Việc
chọn tạo những giống lúa mới có mùi thơm khắc phục những nhược điểm nêu và cho
năng suất cao, chất lượ
lượng
ng tốt là một chiến lược trong nông nghiệp. Đ ể góp phần giả
giảii
quyết vấn đề này, đề tài nghiên cứu “Khảo sát hệ protein của một số giống lúa thơm ở
Đ ồng Bằng Sông Cửu Long bằng kĩthuậ
kĩthuậtt điện di” được thực hiệ
hiện.
n.
Mụ
M ụ c tiêu củ a đề tài:
tài: (i) Khả
Khảo
o sát hệ protein của một số giống lúa thơm ở Đ BSCL
hiện nay, từ đó tuyển chọn được những giống lúa tốt áp dụng vào sản xuất, (ii) Xây
dựng quy trình chuẩn để khảo sát hệ protein của các giống lúa thơm.
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
1
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
C H Ơ N G II: L Ợ C K H Ả O T À I L IỆ U
I. SƠ L Ợ C VỀ CÁC GIÓNG LÚA THƠ M HIỆ N NAY
1. Các gi
giốố ng lú
lúaa th
thơơ m tr
trên
ên thế giớ i
Trên thế giới có 114 nước trồng lúa, phân bố trên tất cả các châu lục, nhưng tập
trung nhiều nhất vẫn
vẫn là Châu Á. Chủng loại
loại các giống lúa ngày càng đa
đ a dạng.
dạng. Đ ặc tính
thơm là một trong những phẩm chất được đánh giá cao. Lúa thơm được trồng và tiêu
thụ chủ yếu
yếu ở Ả n Đ ộ, Pakist
Pakistan,
an, Thái Lan,
Lan, Bangladesh, Afghanist
Afghanistan,
an, Indonesia
Indonesia,, Iran và
Mỹ. Trong đó, các nước Ả n Đ ộ, Thái Lan và Pakistan
Pakistan phần lớn xuất
xuất khẩu
khẩu gạo
gạo thơm
sang các nước
nướ c Trung Đ ông, Châu Âu và Mỹ với thu nhập mỗi năm hàng triệu đôl
đôla.
a.
Trong các nước nêu trên, Pakistan là quốc gia đứng đầu trong xuất khẩu lúa thơm với
tổng diện tích sản xuất lúa thơm ở Pak
Pakistan
istan hơn
hơ n 2,
2,11 tr
triệu
iệu hha.
a. Đ ối với Mỹ lúa thơm chỉ
được trồng trong một khu vực giới hạn tại Mỹ. Trong đó, giống lúa Della là giống
được trồng nhiều hơn so với các giống lúa khác và một số giống lúa thơm khác cũng
được trồng như Dellamont, A201 và Jasmine 85. Trong các nước Thái Lan,
Bangladesh, Việt Nam và Iran, thì Thái Lan là nước chủ lực trong sản xuất và xuất
khẩu gạo
gạo thơm chất lượ
lượng
ng cao trên thị trườ
trường
ng thế giới (Singh et al
al.,., 2000). Lúa
Basmati là giống
giống lúa thơm nổi ti
tiếếng. Lúa Basmati gốc ở Ả n Đ ộ, Pakistan và Nepal,
đượcc trồng độ 2 triệu ha trên thế giới hàng năm. Gạ
đượ
Gạoo thơm
thơ m này có hạt nnhỏ,
hỏ, dài từ 6,8 7,0mm, tỉlệ
tỉ lệ chiề
chiềuu dài và chiề
chiềuu rộng từ 3,5 - 3,7 và có hàm lượng
lư ợng amylose trung bình
20 - 22%. Gạo Basmati sau khi nấu nở dài ra, nhưng vẫn thon và hạt cơm mềm rời
nhau sau nhiều giờ. Hai đặc tính chính của Basmati là mùi thơm và cơm nở dài; đặc
tính sau này bị chi phối bởi nhiều gen nên gây khó khăn trong tạ
tạoo giống truyền gen
(Khush, 2001).
2. Cá
Cácc gi
giốố ng lúa
lúa th
thơơ m tr
tron
ongg nư ớ c
Nhóm lúa Tám thơm có hạt gạo dài, trong và thơm,
thơ m, cung cấ
cấpp một
m ột số lượng
lượ ng cao để
xuất khẩu, nhất là Trung Quốc. Nổi tiếng nhất ở miền Bắc là Tám thơm, cây thấp,
cứng, gié trung bình, chịu lạnh, nhưng ở vùng đất phì nhiêu có nhiều gié. Sau đó là
Tám xoan, thân cao hơn, gié dài có nhiều hạt lúa. Hai giống lúa này luôn được trồng ở
đất màu mỡ và có năng suất cao độ 2 - 3 t/ha (Dumont, 1995).
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
2
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
Ở miề
miềnn Nam, giống lúa nổi ti
tiếng
ếng là Nàng Thơm Chợ Đ ào, còn gọi là lúa hạt
hạt lựu vì
có đốm bạc bụ
bụng.
ng. Nàng Thơm Chợ Đ ào có thân cao, gié nhỏ, trọng lượng 1000 hạt từ
19 đến 29g/hạt (bình quân 22g). Năng suất trung bình 2 - 3 t/ha. Ngoài ra còn có các
giống lúa nổi tiếng khác như lúa
lú a Móng Chim, Nàng Hươ
Hương,
ng, Nan
Nanhh Chồn (Bà Rịa), Tàu
Hư ơng, Th
Hương,
Thơm
ơm Sớm, Thơ
Thơm
m Lùn, lúa Huyế
Huyếtt Rồn
Rồngg (Long An)
An),...
,... ST3
ST3 là giống lúa biến
dịtừ VD 20 - có nguồn gốc từ giống lúa KDM 105 được Viện Lúa quốc tế (IR
(IRRI)
RI) cho
lai với IR262
IR26 2 tạo nên IR84 là loại lúa đặc sả
sảnn của tỉnh Sóc Tră
Trăng.
ng. Giống lúa
lú a ST3
ST3 đư
được
ợc
công nhận là giống quốc gia nă
năm
m 2002. Từ năm 2002 - 2009, các giống ST5 - ST20
đượcc phóng thích. Trong đó ST15, ST16, ST19, ST20 có phẩ
đượ
phẩm
m chất gạo
gạo cao cấ
cấp.
p. Đ iều
đáng chú ý là lúa thơm ST trên ruộng tôm - lúa luôn trúng giá, đượ
đượcc các thương
thươ ng lái să
sănn
đón vì nông dân hạn chế tối đa phân bón hóa học, nông dược, lúa khô ráo tự nhiên, giữ
hương thơm lâu, phẩm cấp gạo hơn hẳn cùng giống đem trồng ở nơi khác. (Theo báo
SGGP, 2009).
Miền Trung và Tây Nguyên có các giống lúa thơm nổi tiếng như lúa Ngự, Cúc
Thơm, Thái Thơm, Nếp Than, Nếp Trắng, Bake Dẻo, Nếp Cái Hoa Vàng. Hai giống
lúa thơm nổi tiếng
tiếng nhất mi
miền
ền Trung là Đ ế An Cựu và lúa Ngự, nhưng nay không còn
tìm thấy nữa. Lúa thơm ở Tây Nguyên có trọng lượng 1000 hạt trên 25g.
Hiện nay có nhiều giống lúa thơm được du nhập vào Việt Nam như Basmati 370,
Basmati đột biến (Ân
(Ân Đ ộ), Khaodawkma
Khaodawkmali
li (Thái Lan) Jasmine 85 (Thái Lan), VD10,
VD20 (Đ ài Loan), IR
IR841
841 (IRRI, Philippine
Philippines),
s), Bác Thơm, Quế Hươ
Hương
ng Chiêm, Qua Dạ
Hương, Chi Ư u Hương (Trung Quốc)
Quốc),, v.v... Các nhà khoa họ
họcc đã dựa vào các
các giống
lúa thơm này để tiến hành lai tạo và chọn lọc ra các giống lúa mới phù hợp với điều
kiện khí hậu và dinh dưỡng ở Việt Nam.
3. Protei
Protein
n d trữ tr
trong
ong hạ t lúa
lúa
3.1.. Protei
3.1
Protein
n d trữ tr
trong
ong hạ t
Theo Hingins (1984), protein dự trữ là tất cả các proteon tích lũy với hàm lượng
đáng kể trong quá trình phát triển của hạt. Khi hạt nảy mầm chúng sẽ thủy phân nhanh
để cung cấp nguồn đạm cho các giai đoạn đầu phát triển của cây con.
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
3
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
Protein dự trữ không biểu hiện hoạt tính ezyme (Shewry et al., 1999). Chúng được
tích lũy bên trong các mô đặc biệt.
biệt. Đ ối với cây họ đậu thì protein này tích lũy ttrong
rong tử
diệp, còn ở ngũ cốc thì trong phôi nhũ.
Thành phần protein dự trữ ở hạt lúa là nhân tố dinh dưỡng quan trọng và được tổng
hợp chủ yếu trong giai đoạn phát triển sớm (Zhu, 1995).
3.2. Các thành
thành phầ
phầ n và vị trí protein trong h t lúa
•
Albumin
Albumin
Album
in tan trong nư
nước,
ớc, bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4
(NH4)2
)2SO4
SO4 khá cao (70-80%).
Các protein ở nhóm này phổ biến ở tế bào động vật và thực vật. Tinh thể albumin lòng
trắng trứng, albumin huyết than
thanh
h đượ
đượcc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Trọng
lượng phân tử của các protein thuộc nhóm này rất khác nhau, từ 12kDa đến 16kDa
hoặc có thể đến 17kDa trên gel SDS, điểm đẳng điện là 4,8 (Trần Tố, 2008) trên gel
của điện di hai chiều.
Theo Yamagata (1982), trong thành phần albumin có hàm lượng lysine cao nhất,
kế đến là glutelin và prolanin. Hai thành phần albumin và globulin tập trung ở lớp
aleuron, không giữ được ở gạo xay chà trắng, còn hai thành phần glutelin và prolanin
phân bố đều trong nội nhũ.
nhũ.
•
Globulin
Globulin
Glob
ulin không ta
tan
n hoặc rấ
rấtt ít tan trong nướ
nước,
c, tan tr
trong
ong dung dị
dịch
ch loãng ccủa
ủa muối
trung hòa NaCl, KCl, Na2SO4, K2SO4. Các protein nhóm này thường bịkết tủa ở nồng
độ (NH4)2SO4 bán bão hòa. Theo Yamagata et al. (1982), globulin có trọng lượng phân
tử là 26kDa trên gel SDS và chủ yếu tập trung ở tầng aleuron của hạt lúa. Các protein
thuộc nhóm này cũng có trọng lượng phân tử rất khác nhau và thường chứa nhiều
amino acid có chứa lưu huỳnh thiết yếu (Tanaka, 1975). Theo Komatsu et al. (1992)
thì globulin
globul in trong lúa có điểm đẳ
đẳng
ng điện nằ
nằm
m trong khoảng 6,4 - 7,0.
•
Prolamin
Prolami
Prol
amin
n không tan trong nướ
nướcc hoặc dung dịch muối loãng, tan trong et
ethanol
hanol hoặc
isopropanol 70-80%. Prolamin là một trong hai dạng protein dự trữ, chiếm từ 18-20%
protein tổng trong nội nhũ của lúa, được tổng hợp ở m
mạ
ạng lưới nội cchấ
hấtt (T
(Tanaka
anaka et al.,
1980). Prolamin bao gồm ít nhất 4 polypeptide 16kDa, 13AkDa, 13BkDa và 10kDa
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
4
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
(Ogawa et al., 1987). Mỗi tiểu đơn vịpolypeptide của nó gồm một vài thành phần với
điểm điện di khác nhau (Hibino et al., 1989). Trong đó, prolamin 10kDa là protein
giàu amino acid có sulfur (Masumura
(Masum ura et al
al.,
., 198
1989).
9). Nhữ ng protein dạng prolam
prolamin
in này
được phân chia thành hai dạng: prolamin nghèo cystein (CysP) và prolamin giàu
cystein (CysR)
(Cy sR) và có ít nhất hai cơ chế quy định cho qu
quáá trình tổng hợp v
vàà tích lũy
prolamin trong hạt lúa.
lúa.
•
Glutelin
Glutelin
Gluteli
n chỉ tan trong d
dung
ung dịch kiềm và aci
acid
d loãng. Trong hạt lúa, thàn
thành
h phầ
phần
n
glutelin là protein dự trữ chính chiếm khoả
khoảng
ng 80% tổng số protein trong nội nhũ
(Juliano, 1972). Theo Yamagata et al. (1982), glutelin khi được ly trích và điện di bằng
SDS - PAGE có hai tiểu nhóm phân tử với trọng lượ
lượng
ng phân tử khác nhau.
nhau. Nhóm tiể
tiểu
u
đơn vị acid dạ
dạng
ng a có trọng lượng phân tử 37kDa - 39kDa và nhóm ti
tiể
ểu đơn vị
vịbase
base
dạ
dạng
ng p có trọng lượng phân tử 22kDa-23k
22kDa-23kDa.
Da.
Theo Yamagata et al. (1982), các protein globulin, albumin và prolamin có trọng
lượng phân tử lần lượt là 26kDa, 16kDa, 13kDa trên gel SDS.
•
Protein
Protein tổ ng s
Hàm lượng protein là một chỉtiêu tương đối quan trọng với chất lượng dinh dưỡng
của hạt
hạt lúa
lúa.. Prot
Protein
ein trong gạ
gạo
o có giá trị cao hơn các loạ
loạii ngũ cốc khác bởi vì hàm
lượng lysine của nó khá cao 3,5-4% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn ThịLang, 2000). Do đó,
hàm lượng protein của gạo tuy thấp (khoảng 7-8%) nhưng nó được xem là protein có
phẩm
phẩ
m chấ
chấtt cao nhấ
nhất.
t.
Các nhà chọn giống đã cố gắng cải tiến nâng cao hàm lượng protein trong các
giống lúa mới nhưng ít thành công. Nghiên cứu của Chang và Somrith (1979) cho biết
sự di truyền tính trạng protein do đa gen điều khiển có hệ số di truyền khá thấp, có thể
do ảnh hưởng mạnh mẽ giữa kiểu gen và môi trường.
Trong quá trình canh tác nếu không bón hay bón ít đạm thì các giống lúa cải tiến
chỉ chứa một lư
lượng
ợng protein tương đư
đương
ơng với lúa đị
địaa ph
phương.
ương. Ngượ
Ngượcc lại
lại,, nếu bón đủ
đạm và áp dụng đúng các biện pháp kĩthuật canh tác thì hàm lượng protein sẽ tăng 12% mà năng suất vẫn không giảm. Theo Gomez (1979), việc quản lý kĩthuật canh tác
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
5
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
cho thấy có ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng protein hạt gạo. Hàm lượng protein cao
hơn ở những chỗ sạ thưa ở cùng nơi có hàm lượng đạm hữu dụng.
4. Mùi thơ m trên
trên cây
cây lúa
Cho tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về các chất tạo mùi thơm ở lúa cũng như
bản chấ
chấtt di truyề
truyền
n của gen tạ
tạo
o mùi thơm. Ngư
Người
ời ta đã chứng minh rằ
rằng,
ng, chấ
chấtt thơm
trong lúa được hợp thành từ hơn một trăm hợp chất dễ bay hơi như hydrocarbons,
alcohol, aldehydes, ketones, acids, esters, phenols, pyridines, pyrazines và những hợp
chất khác (Yajima
(Yaj ima et al., 1978) . Tính trạng mùi thơm trên lúa chịu ảnh hưở
hưởng
ng bởi ccả
ả
hai nhân tố di truyền
truyền và môi trườ
trường.
ng. Đ ặc tính sinh hóa của mùi thơm được biết đế
đến
n do
sự có mặt của chất 2-acetyl-1-pyrroline (Tanchotikul và Hsieh, 1991). Chất tạo mùi 2acetyl-1-pyrroline được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây, trừ phần rễ (Lorieux et
al., 1996). Những giống lúa không thơm chứa một lượng rất ít chất 2-acetyl-1 pyrroline trong khi những giống lúa thơm chứa lượng lớn chấ
chấtt này (Widjaja et al.,
1996). Theo Bradbury (2005), một gene lặn (fgr) trên nhiễm sắc thể số 8 điều khiển
tính trạng này. Lorieu
Lo rieux
x et al. (1996) đã nhận định rằng có sự liên kết chặ
chặtt chẽ giữa
RG28 và fg r với khoảng cách là 4,5cM.
5. Nhữ
Nhữ ng yế u t ả nh hư ở ng đế n mùi thơ m củ a lúa
lúa
Tuỳ loại gạo thơm mà khác nhau về mức độ thơm (đậm, trung bình và nhẹ). Mùi
thơm
thơ
m và chất lượ
lượng
ng cơm cchị
hịu ảnh hưởng
hư ởng nhiều bởi kiều kiện môi trư
trường.
ờng. Một số giống
có thể trồng ở nhiều nơi và cho năng suất tương đương nhau nhưng về chất lượng thì
lại rất khác nhau đặc biệt là mùi thơm. Theo Singh et al. (1997) các yếu tố ảnh hưởng
đến sự hình thành mùi thơm bao gồm:
•
Nhữ
Nhữ ng yế u t thuậ n lợ i
-
Nhi
Nhiệt
ệt độ thấp trong thời kỳ trỗ và phát triển của hạt
-
Bón phân chuồng/ phân hữu ccơ
ơ
-
Đ ất màu mỡ
-
Sạ
-
Đ ất nhẹ và đấ
đấtt rẫ
rẫy
y
-
Không xay chà bằn
bằng
g máy
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Việ
Việ n NC & PT Công Nghệ Sinh Họ c
6
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
•
•
Trư ờ ng ĐHC T
Nhữ
Nhữ ng yế u t bấ t thuậ n
-
Thời tiế
tiếtt n
nóng
óng tron
trong
g th
thời
ời kỳ trổ và phát tr
triển
iển của hạ
hạtt
-
Bón phân ure
-
Đ ất xấu
xấu
-
Cấy
Đ ất nặng
nặng
-
Thu hoạch trễ
-
Dùng máy xay chà
Anh hư ở ng củ a nhiệ t độ
Các nhà khoa học đồng ý chung là sự hình thành và duy trì mùi thơm được gia tăng
nếu trong giai đoạn hạt vào chắc nhiệt độ xuống thấp. Gieo cấy muộn dẫn đến trổ bông
và chín trong những ngày nhiệt độ thấp hơn đã làm tăng chất lượng gạo nhưng giảm
năng suất của lúa thơm (Chandra et al., 1997; Rao et al., 1996).
• Anh hư ở ng củ a đấ t đai
Nhiều nông dân cho rằng ở những vùng đấ
đấtt thị
thịtt nhẹ và xốp như vùng đồi núi thì
thuận lợi cho việc hình thành mùi thơm trong khi hầu hết các giống lúa đặc sản, lúa
thơm lại được gieo trên những cánh đồng bằng phẳng và được tuới tiêu thuận lợi. Lúa
thơm sinh trưởng tốt trong điều kiện đất phù sa trẻ ít chua, ảnh hưởng mặn tiềm tàng ở
tầng dưới. Nếu không đáp ứng được những yêu cầu đó thì lúa thơm vẫn trồng được
nhưng năng suất thấp, mùi thơm giảm.
•
Yế u t din
dinh dư ỡ ng và phân
phân bón
bón
Suwanarit et al. (1996) cho biết mùi thơm, độ mềm cơm, màu trắng sáng, độ dính
của cơm
cơ m gạo KDM105 bị ảnh hưởng nếu bón phân đạm. Bón nhiều đạm sẽ gia tăng
năng suất nhưng mùi thơm sẽ giảm. Gạo đặc sản trồng trên những đất nghèo đạm có
chất lượng cao hơn. Phân kali ảnh huởng tốt đến chất lượng và hương vịcủa cơm. Nếu
bón nhiề
nhiều
u kali hơ
hơn
n lượng dùng để đạt nă
năng
ng suấ
suấtt tối đa của giống KDM105 thì sẽ làm
tăng mùi thơm và góp phần làm cho hạt gạo sáng hơn nhưng độ mềm cơm giảm
(Suwanarit et al., 1997a). Sở dĩbón phân kali làm tăng năng suất hạt vì kali làm cho
cây cứng, không bị
bịđổ
đổ ng
ngã.
ã. Hơn nữa, kali giúp tăng trọng lượ
lượng
ng hạt v
vìì tăng khả nă
năng
ng
tích lũy chất khô trong hạt và giảm hiện tuợng bất thụ. Bón phân lân làm tăng hàm
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
7
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
lượng protein trong gạo. Tuy nhiên nếu bón nhiều sẽ làm cho chất lượng gạo giảm.
Bón phân chứa kẽm làm tăng lượng amylose trong gạo (Chen và Fan, 1997).
•
Các biệ n pháp
pháp canh tác
Các biện pháp canh tác như chuẩn bịđất, phương pháp gieo sạ, thời gian gieo, thời
gian thu hoạch đều ảnh hưởng lớn đến chất lượng gạo và việc hình thành mùi thơm.
Nếu đất được làm kỹ và để ẩ
ẩm
m khoảng 30 trướ
trướcc khi cấ
cấy
y thì trọng lượng 100
1000
0 hạt
hạt,, tỷ lệ
xay chà, chiều dài hạt, hàm lượng protein và độ bền gel là cao nhất. Tuy nhiên nếu chỉ
làm đất
đất khô
khô rồ
rồii
đưa nước vào cấ
cấy
y thì cá
cácc giá
trị
trên
đều
đều th
thấ
ấp.
hưởng đến trọng lượng 1000 hạt, tỷ lệ xay chà, hàm lượng protein và chiều dài hạt.
Nếu mật độ sạ dày các chỉ
chỉtiêu
tiêu trên đề
đều
u giảm
giảm.. Theo kinh nghiệm của nông dân thì lúa
sạ có mùi thơ
thơm
m hơn lúa cấy (Singh et al., 1998).
1998).
•
Anh
Anh h ở ng củ a mùa
mùa vụ
Về mùa vụ, do các giống lúa thơm đều yêu cầu biên độ nhiệt ngày và đêm khá
chênh lệch nên thời vụ gieo trồng cần được tính toán sao cho giai đoạn trổ, giai đoạn
hạt vào chắc phải phù hợp với nhu cầu sinh lý của cây để đạt được chất lượng gạo cao.
Nếu cấy sớm mùi thơm sẽ g
giả
iảm,
m, cấ
cấy
y trễ thì hàm lượng amylose tă
tăng
ng (Ali et al., 19
1991
91).
).
Thời gian thu hoạch cũng ảnh hưởng lớn đến chất lượng gạo và mùi thơm. Nếu
gặt trễ sẽ giảm mùi thơm và các chỉtiêu chất lượng khác. Thời điểm thu hoạch tốt nhất
để thu được năng suất và tỷ lệ xay chà cao là ở 35 ngày từ khi lúa trổ 50%. Tốt nhất là
sấ
sấy
y hoặc phơi trên sân phơi. Đ ối với lúa
lúa,, đặ
đặcc biệt là lúa mùa hay những giống lúa đặ
đặcc
sản thì câu nói "càng cũ càng tốt" được nhiều người ưa chuộng. Thực tế là lúa được
bảo
bả
o quản vài tháng có chất lượng tốt hơn, vì sau khi bả
bảo
o quản đượ
đượcc vài tháng khả n
năng
ăng
hấp thụ nước của gạo tăng khoảng 15% trong quá trình nấu. Nhưng bảo quản lâu hơn
nữa
nữ a thì sẽ có các vấn đề cầ
cần
n lư
lưu
u ý như dịch hại trên nông sả
sản,
n, chư
chưaa kể đế
đến
n nhữn
những
g biến
đổi hoá tính của hạt lúa trong quá trình bảo quản lâu. Kinh nghiệm cho thấy môt số
giống lúa thơm nếu bảo quản lâu hơn 3 tháng sẽ giảm mùi thơm.
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
8
Mậ
Mậtt
độ cây
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
•
Trư ờ ng ĐHC T
nh hư ở ng củ a độ thuầ n giố ng
Đ ộ thuần của giống ả
ảnh
nh hưởng rất lớn đế
đến
n mùi thơm sử dụng giống không đạt chấ
chấtt
lượng sẽ ảnh hưởng đến chất lượng gạo và mùi thơm, nên mua giống ở những nơi tin
cậy để bảo đảm giống đúng cấp, đúng chất lượng.
6. Nhữ ng nghi
nghiên
ên cứ u cơ
cơ bả n về lú
lúa
a th
thơơ m tr
trên
ên thế
thế gi
giớớ i và Vi
Việệ t Nam
Nam
6.1
.1..
Nhữ
Nhữ ng nghi
nghiên
ên cứ u cơ bả n về lúa
lúa th
thơơ m tr
trên
ên thế
thế gi
giớớ i
Vấn đề lúa thơm cũng được các nhà khoa học trên thế giới hết sức quan tâm. Việc
phân tích và xác định mùi thơm được tiến hành bằ
bằng
ng nhiều phư
phương
ơng pháp khác nh
nhau.
au.
Sood và Siddiq (1978) đã khởi đầu việ
việcc xá
xácc định mùi thơm b
bằng
ằng phư
phương
ơng phá
pháp
p ngửi
mùi thơm khi nấu, phương pháp phân tích KOH 1,7%. Tiếp sau đó, phương pháp phân
tích DNA được Bradbury et al. (2005) sử dụng; dựa vào gen fgr,
fg r, Bradbury
Bra dbury xá
xácc đị
định
nh
marker
mar
ker RM515 và SSRJ07 là mar
marker
ker chuẩn để xác định mùi thơm của lúa với kích
thước là 386591bp. Nghiên cứu này cũng kết luận rằng khi sử dụng bốn cặp mồi ESP
(external sense primer), INSP (internal non-fragrant sense primer), IFAP (internal
fragrant anti-sense primer) và EAP (external anti-sense primer) trong cùng một phản
ứng PCR sẽ cho băng 577/585bp cả giống lúa thơm và không thơm do sự khuếch đại
của cặp mồi ESP và EAP. Cặp mồi INSP và EAP khuếch đại một đoạn với kích thước
là 355bp cho các giống lúa không thơm trong khi cặp mồi ESP và IFAP khuếch đ
đạ
ại
một đoạn có kích thước là 257bp cho các giống lúa thơm. Bốn mồi này cho phép chọn
được những cá thể thơm đồng hợp tử, không thơm đồng hợp tử và không thơm dịhợp
tử. Tuy nhiên, phươ
phương
ng pháp xác định mùi thơm phổ biến và chính xác nhất là phương
pháp sắ
sắcc kí khối phổ
phổ.. Yoshihashi (2002) áp dụng phươ
phương
ng pháp sắ
sắcc kí khối phổ để xác
định xem mùi thơ
thơm
m có đượ
đượcc thành lậ
lập
p trong thời g
gian
ian nấu hay không. Yoshi
Yoshihashi
hashi et al
al..
(2004) đã ứng dụng phương
phư ơng pháp này để xác đị
định
nh hàm lượng 2-acetyl-1-pyrroline trên
giống lúa KDM105. Laksanalamai và Ilangantileke (1993) còn sử dụng phương pháp
sắc kí khí để so sánh mùi thơm trên lá của hai giống Pandanus amaryllifolius và
KDM105. Bergman et al. (2000) cho rằng sử dụng phương pháp sắc kí khối phổ trong
công tác chọn
c họn giống là nha
nhanh
nh và cchính
hính xác cao vì chúng ta có thể xác đ
đị
ịnh đượ
đượcc 2acetyl-1-pyrroline trong hai thế hệ lai so với 4 thế hệ lai như phương pháp truyền
thống và có thể phân tích tới 50 mẫu/ngày.
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Việ
Việ n NC & PT Công Nghệ Sinh Họ c
9
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
6.2
6.
2. Nhữ
Nhữ ng nghi
nghiên
ên cứ u c bả n về lúa th m ở Vi
Việệ t Nam
Nam
Việc phát triển các giống lúa thơm là một trong những nhu cầu cấp thiết trong giai
đoạn hiện nay cũng như trong thời gian tới vì điều này sẽ làm tăng hiệu quả xuất khẩu
gạo (Dung, 2004; Trị
Trịnh
nh Khắc Quang, 2004). Bộ Nôn
Nôngg Nghiệp và Phát Tr
Triển
iển Nông
Thôn đã chọn bảy tỉnh thành Đ BSCL tổ chứ
chứcc mô hình sản xuất lúa chất llượ
ượng
ng cao như
các tỉnh: Đ ồng Tháp, An Giang, Long An, Sóc Tră
Trăng
ng và Thành phố Cần Thơ. Các tỉnh
tỉnh
thành này sẽ sản xuất một triệu tấn lúa chất lượng cao để xuất khẩu. Chính vì thế, việc
chọn tạo ra những giống lúa chất lượng cao, đặc biệt là lúa thơm đã được rất nhiều tác
giả nghiên cứu. Việ
Việnn Nghiên cứu và Phát tri
triểển Đ BSCL - Đ ại học Cầ
Cầnn Thơ đã ti
tiến
ến
hành lai tạo và chọn lọc được một số giống lúa thơm ngắn ngày, năng suất cao, có khả
năng chịu mặn và chịu phèn như MTL495, MTL513, MTL514, MTL250, MTL548,
MTL555...
MTL555
... Các giống OM
OM3536,
3536, OM5649.... cũng được
được Viện lúa Đ BSCL cho ra đời
đáp ứng tiêu chuẩ
chuẩn.
n. Những
Nhữ ng giống lúa ST3, ST5, ST10, ST3 đỏ..
đỏ.... từ tỉnh
tỉnh Sóc Trăng bắt
đầu được nông dân mở rộng sang nhiều tỉnh, nnhất
hất là một số tỉ
tỉnh
nh ven biển vùng
Đ BSC
BSCL.
L. D
Dựa
ựa vào những nghiên cứu đó, nhiều
nhiều tác giả đã tiến
tiến hành phân tích các đặc
đặc
điểm di truyền của các giống lúa thơm nhằm nâng cao công tác tuyển chọn và lai tạo
giống. Nguyễn Thành Tâm (2008) đã kết hợp kĩthuật PCR và phương pháp phân tích
sinh hóa để chọn giống lúa thơm chất lượng cao kết hợp với các đặc tính phẩm chất và
tính chống chị
chịuu rầy nâu và bệnh cháy lá với 4 cặp mồi chuyên bbiệt
iệt ESP, IFAP, INSP
và EAP ; kết quả đã chọn ra các giống lúa thơm MTL495, MTL513, MTL5459 và
MTL578 có mùi thơm tương đương với giống Jasmine 85. Nguyễn ThịLang và Bùi
Chí Bửu (2004) đã ứn
ứngg dụng mark
marker
er phân tử đánh dấu mùi thơm
thơm trê
trênn lúa, xác định
định gen
fg r
điều khiển tính trạng mùi thơm bằng phương pháp Fine Mapping với
microsatellite, phân tích quần thể tổ hợp lai KhaoDawkMali/OM1490 cho thấy rằng
gen fg r diều khiển mùi thơm là gen lặn trên nhiễm sắc thể số 8. băng thể hiện mùi
thơm xuất hiện ở độ lớn 190bp và không thơm ở độ lớn 90bp (cặp mồi RG28F-R),
băng thể hiện mùi thơm xuất hiện ở độ lớn 160bp và không thơm ở độ lớn 120bp (cặp
(cặp
mồi RM223). Việc ứng dụng kĩthuật điện di SDS cũng được nhiều tác giả áp dụng để
xác định mùi thơm. Qua đó, Quan ThịÁi Liên và Võ Công Thành (2007) đã kết luận
rằng băng protein thể hiện mùi thơm trên lúa liên quan đến protein thành phần globulin
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Việ
Việ n NC & PT Công Nghệ Sinh Họ c
10
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
và có trọng lượng phân tử là 24,4kDa. Nguyễn ThịMỹ Phương et al. (2005) đã xác
định protein liên quan đến tính thơm thuộc thành phần protein albumin với 3 băng trên
phổ điện di SDS là 59,7kDa, 27,7kD
27,7kDaa và 24,5kDa. Theo Trần Thị Kim Thúy (2002)
thì có thể mùi thơm của lúa thể hiện qua protein thành phần globulin. Lê Nguyệt Ánh
(2005) qua quá trình phân tích bước đầu trên nhiều phổ điện di albumin giữa lúa thơm
và không thơm đã nghi ngờ trong protein thành phần albumin có protein tương quan
đến mùi
mùi thơm. Nguyễn Bích H
Hàà Vũ (2006) cũng đã sử dụng kĩ
kĩthuật
thuật này để xác định
các giống lúa thơm quốc gia MTL250, MTL233, MTL241 và ST3.
II
II..
KĨ THU
THUẬẬ T ĐI N DI HAI CHI
CHIỀỀ U TRON
TRONG
G PHÂN TÍC
TÍCH
H PROTEIN
PROTEIN
Đ ể đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệ
hiệuu quả hay không, ngoài cách xác
định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách
là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực
hiện nhờ kỹ thuật điện di.
1. Điệ n d
dii mộ t chiề
chiề u (SD
(SDS-P
S-PAGE
AGE))
Một phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường. Hiện tượng này,
được đặt tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân tách protein và
các đại phân tử khác như DNA và RNA. Vận tốc di chuyển (v) của một protein (hay
bất kỳ phân tử nào) tron
trongg điện trư
trường
ờng phụ thuộc vào lực điện trườn
trư ờngg (E), điện tích thực
của protein (z) và hệ số ma sát (f).
Đ iện di luôn được thự
thựcc hiện trên gel (hay trên vật thể rắn
rắn như giấy) bởi vì gel
giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích
thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ
gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển
trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. Đ iện ddii được
đượ c thực hiện trên một bản
bản
polyacrylamide
polyacry
lamide mỏng, thẳng đứng. Hướ
H ướng
ng của dòng điện từ trên xuống.
Gel polyacrylamide được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết
chéo của methylenebisacrylamide, được chọn làm môi trường cho điện di vì nó có tính
trơ về mặt
mặt hóa học và đư
được
ợc tạ
tạoo hình nhanh chó
chóng.
ng. Đ iệ
iệnn di là một cách lọc qua gel mà
theo đó tất cả các phân tử, khôn
khôngg xét về kích thước,
thước , sẽ bị tác động một lực để di
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
11
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
chuyển trong cùng một chất nền. Gel ở đây có thể xem tương đương với một hạt trong
cột lọc gel.
Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên
acrylamide dưới
dướ i điều kiệ
kiện
n đã bị biế
biến
n tính
tính.. Hỗn hợp protein đượ
đượcc hòa tan trong dung
dịch sodium dodecyl sulf
sulfate
ate (SDS), một cchất
hất tẩy mang đi
điện
ện tích âm sẽ phá tất cả các
nối không cộng hóa trị của p
protein
rotein ban đầ
đầu.
u. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay
dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulííde. Phức hợp SDS
với protein đã bị biến tính có một điệ
điện
n tích thực âm tỉ lệ thuậ
thuận
n với khối lư
lượng
ợng của
protein. Đ iệ
iện
n tích âm có đư
được
ợc do gắn với SDS lớn hơ
hơn
n rất nhiề
nhiều
u điện tích của bản thân
protein ban đầ
đầu;
u; vì thế
thế,, điệ
điện
n tích ban đầ
đầu
u của protein không ản
ảnh
h hưởng đáng kể đến
điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi
điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng
cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu
phóng xạ có thể được phát hiệ
hiện
n bằ
bằng
ng cách đặt một tấm phim chụp x-quang lên miế
miếng
ng
gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự gh
ghi.
i.
Những
Nhữ
ng protei
protein
n nhỏ di chuyể
chuyển
n nhanh trong gel, trong khi nhữn
những
g protein lớn ở phía
đầu, gần vịtrí nạp mẫu. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những
điều
điề
u kiệ
kiện
n như thế tỉ lệ với khối lượng của chún
chúng.
g. Tuy nhiên, cũng có vài prote
protein
in giàu
carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE có độ
phân tách cao, cho kế
kếtt quả nhanh và độ nhạ
nhạy
y cao. Chỉ với lượng nhỏ khoả
khoảng
ng 0,1pg
(~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn
(~0,02pg) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Vì vậy, SDS-PAGE giúp
chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch.
detail.php?cateid=4&id=85
__
_
___ D
Chuyên ngành
P rot eỉ
eỉn
n
k
X
2-
0
OD
'ệ Sinh Họ c
SDS gắn vào am ino acid k hiến cho
p ro te in tí ch đi ện âm v à là m ch o
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
(www.molecularstation.com/images/protein-gel-electrophoresis.jpg )
Hình 1. Nguyên lí điệ
điệ n di SDS
2. Điệ n di d a vào điêm đăng điệ n
Phương pháp điện di đẳng điện (IEF: Isoelectricfocusing) là điện di trong phân
tích protein dựa vào điểm đẳng điện pI (pI là giá trịpH mà ở đó các protein trung hòa
về mặt điện tích, tổng điện tích bằng 0). Gel điện di IEF được tẩm hợp chất gồm các
phân tử lưỡng tính (các ampholyte) chủ yế
yếu
u là các polycarboxylic acid, polyamin tổng
hợp. Các ampholyte sẽ tạo một gradient pH từ thấp đến cao trên gel thường được gọi
là các thanh Strip với các khoảng
khoảng pH khác nhau (3-1
(3-10,
0, 4-7). Môi trường ở pH> pI thì
protein tích điệ
điện
n âm và pH < pI thì protein tích điệ
điện
n dương. Trong điệ
điện
n trường IEF
IEF,,
các protein
prote in tùy thuộc điện tích sẽ dịch chuyển về cực âm hay dư
dương
ơng v
vàà ở giá trị
trịpH
pH =
pI trên gel thì chúng sẽ dừng lạ
lại.
i.
3. Điệ n di hai chiề
chiề u
Đ ây là một phương pháp có khả năng phân tách cao do sư kết hợp SDS-PAGE với
điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào
điểm đẳng
đẳng điệ
điện.
n. Sau đó, đặt khoả
khoảng
ng gel có cchứa
hứa prot
protein
ein vừ
vừaa đượ
đượcc điện di lên tấ
tấm
m gel
SDS-polyac
SDS-p
olyacrylam
rylamide
ide theo phư
phương
ơng nằm ngang. Pr
Prote
otein
in sẽ chịu một điệ
điện
n trườn
trường
g theo
chiều dọc. Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang
theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng. Khả năng phân tách của phương pháp
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
13
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
này được chứng minh khi hơn một ngàn protein của vi khuẩn E. coli có thể được phân
tách trong một lần chạy điện di.
Những
Nhữ
ng protein được phân tách từ tế bào ở các điề
điều
u kiện sinh lý khác nhau có thể
phân tách được bằ
bằng
ng phươ
phương
ng pháp này, sau đó cư
cường
ờng độ của tín hiệu sẽ đ
được
ược xác định.
Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào tình
trạng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế là có rất nhiều protein được
phân tách
tá ch nhưng lạ
lạii phân biệt rõ
rõ.. Đ ể khắ
khắcc phục hạ
hạn
n chế này
này,, ngườ
ngườii ta kế
kếtt hợp điệ
điện
n di
hai chiều với kỹ thuật khối phổi.
detail.php?cateid=4&id=85
Hình 2. Nguyên
Nguyên lí củ
củ a điệ
điệ n di hhai
ai cchi
hiềề u
( Proper
ties/protein purification.htm)
C H Ơ N G III: P H Ơ N G T IỆ N V À P H Ơ N G P H Á P N G HI
HIÊ N C Ứ U
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
14
Lu n văn tố t nghiệ p Đạ i họ c khóa 32 - 2010
Trư ờ ng ĐHC T
I. ĐỊA ĐI
ĐIỂỂ M VÀ TH
THỜỜ I GI
GIAN
AN NGHI
NGHIÊN
ÊN CỨ U
1. Địa điêm
điêm nghiên cứ u
Phòng
Phò
ng th
thíí nghiệ
nghiệ m Cô
Công
ng nnghệ
ghệ Enzyme
Enzyme củ a V
Việiệ n Nghiên
Nghiên cứ u và Phát
Phát triể
triể n Công
Công
Nghệ
Ng
hệ Sin
inhh Họ c, Trư ờ ng Đạ i Họ c C
Cầầ n Thơ .
2. Thờ
Thờ i gi
gian
an nghi
nghiên
ên cứ u
Từ tháng 6 nnăm
ăm 2010
20 10 đế n th
tháng
áng 1111 năm 2010
II. PH Ơ NG TIỆ N NGHIÊN CỨ U
1. Dụ ng cụ và hóa
hóa ch
chấấ t
1.1.
1.1. Dụ ng cụ
• Má
Máyy ly tâm
tâm,, tủtủ hú
hút,
t, m
máy
áy vortex, ccân
ân điệ n tử , tủ lạ nh (-200
(-200C)
C),, bbình
ình hút
hút ẩ m, ttủủ
sấ y, máy
máy đđoo quan
quangg phổ
phổ , máy kh
khuấ
uấ y từ , má
máyy lắ c nhuộ
nhuộ m màu,
àu, má
máyy đđoo ppH
H, bộ điệ n di
di
(gồ m khu
khung
ng điệ
điệnn ddi,i, khun
khungg đổ
đổ gel và bộ ngu
nguồồ n), th
thiếiế t bị điện
điệ n di
di hai
hai chiề
chiề u (Bio
(B io-- R
Rad
ad),
),
thiế t bbịị điệ n di đđứứ ng Pro
Protein
tein II (Bio-R
(Bio-Rad).
ad).
• Bộ mi
micro
cropip
pipette
ette,, cá
cácc loạ
loạ i falcon
falcon có nắ p, eppen
eppendof
doft,
t, ch
chày
ày và cố i, ố ng ngh
nghiệiệ m
thủ y tinh
tinh,, ố ng đo
đong,
ng, cuvet
cuvette
te nnhự
hự a, tuýp
tuýp ( xanh
xanh và vvàng),
àng), becher
becher,, giấ y, găng tay,...
tay, ...
• Kít tinh sạ ch protein ( 2D2D-clea
cleann uupp kit (Bio-Rad)
(Bio-Rad),, IPG Str
Strip
ip 7cm, pH 3-1
3-100 (Bio-
Rad), 2D kít (Bio-Rad).
1.2.
1.2. Hóa chấ t
• Dung dịch trích ly protein
- Dung dịch 1: 125mmol/l Tri
Triss HCl, pH 6,8 có chứ a 4mol/
4mol/ll uurea
rea;; 44%
% SDS
(Merck) và 55%
% 2-Mercap
2-Mercaptoet
toethanol
hanol (Merck)
- Dung dịch 2: 0,5M Tris-HC
Tris-HCl,l, pH 6,8 có chứ a 2,5% SDS (Merck), 10
10%
%
glycerol (Merck) , 5% 2-Mercaptoethanol (Merck)
- Dung dịch 33:: 0,5M Tris-H
Tris-HCl,
Cl, pH 6,8 có chứ a PM
PMSF
SF (Merck)
(Merck) 1mM
• PMSF 1m
1mM,
M, EDTA (Merck) 5mM (pha stock)
• Hòa tan mẫ u: Reh
Rehydra
ydration
tion (Bio
(Biorad
rad,, M
Mỹỹ ) hoặ c T
Tris-H
ris-HCl
Cl 0,05M pH 7,5
• Dùng tron
trongg phư ơ ng ph
pháp
áp định lư ợ ng pro
protein
tein Brad
Bradfor
ford:
d: Com
Comassie
assie Blue G250
(Merck),
(Me
rck), cồ n tu
tuyệ
yệ t đố i, Acid pho
phosphori
sphoricc 85% (Merck
(Merck))
• Các hóa ch
chấấ t tro
trong
ng bộ chạ y điệ n di SSDS
DS
Chuyên
Chuy
ên ngà
ngành
nh Công N
Nghệ
ghệ Sinh Họ c
Vi
Việệ n NC & PT Công Nghệ Sin
Sinh
h Họ c
15
