LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII TRONG SỮA BỘT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM










KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTEROBACTER
SAKAZAKII TRONG SỮA BỘT





Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : VƯƠNG MINH ĐẠT
MSSV: 0811110013 Lớp: 08CSH1





TP. Hồ Chí Minh, 2011
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, với sự hỗ trợ
từ Giáo viên hướng dẫn. Những số liệu trong các bảng biểu và hình ảnh phục vụ
cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác
nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, còn sử dụng một số nhận xét,
đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác, và đề tài cũng được
thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi
xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả khóa luận của
mình.
TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011
Sinh viên



Vương Minh Đạt

LỜI CẢM ƠN

Trải qua ba năm học dưới mái trường đại học kỹ thuật công nghệ, được sự
giúp đỡ tận tình của các thầy cô, nay đã hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp. Nhờ
trong quá trình làm bài khóa luận, mà em đã học được nhiều kiến thức mà trước đó
em chưa hề biết.
Em xin chân thành cám ơn các thầy cô khoa Môi trường và công nghệ sinh
học, đã giúp đỡ em tận tình trong ba năm học vừa qua để hoàn thành khóa học. Em
xin cám ơn giáo viên hướng dẩn đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình làm
bài khóa luận tốt nghiệp.
Một điều không thể thiếu, đó chính là gia đình, cha mẹ đã động viên em,
giúp em có thêm tinh thần, vượt qua được khó khăn về tinh thần, cũng như về vật
chất. Nhờ vậy, mà em có thể hoàn thành khóa học và hoàn thành bài khóa luận tốt
nghiệp này.
Ngoài thầy cô và gia đình ra, một điều quan trọng không thể thiếu, đó chính
là tập thể các bạn lớp 08CSH trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ. Chính nhờ các
bạn, giúp đỡ động viên rất nhiều trong quá trình học tập, cũng như trong đời sống.

Em xin chân thành cám ơn!!!
TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011
Sinh viên



Vương Minh Đạt

i

MỤC LỤC
Danh mục các từ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích 1
1.3. Nội dung nghiên cứu 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giá trị dinh dưỡng của sữa bột 2
2.1.1. Đường lactose 2
2.1.2. Protein 2
2.1.3. Chất béo 3
2.1.4. Chất khoáng 5
2.1.5. Vitamin 5
2.1.6. Các hợp chất khác 6
2.2. Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột 6
2.2.1. Listeria monocytogenes 6
2.2.1.1. Giới thiệu 6
2.2.1.2. Phân loại 6
2.2.1.3. Đặc điểm 7

2.2.1.4. Yếu tố độc lực 7
2.2.1.5. Khả năng gây bệnh 8
2.2.1.6. Các thực phẩm liên quan 9
2.2.2. Escherichia Coli 9
2.2.2.1. Giới thiệu 9
2.2.2.2. Phân loại 9
2.2.2.3. Hình thái, cấu trúc 10
2.2.2.4. Đặc điểm 10



ii

2.2.2.5. Khả năng gây bệnh 11
2.2.2.6. Các thực phẩm liên quan 12
2.3. Tổng quan về Enterobacter sakazakii 13
2.3.1. Lịch sử phát hiện 13
2.3.2. Phân loại 13
2.3.3 Đặc điểm 14
2.2.3.1. Đặc điểm chung 14
2.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa 16
2.3.4. Cấu trúc 16
2.3.4.1. Thành tế bào 17
2.3.4.2. Màng sinh học 18
2.3.4.3. Tiên mao 19
2.3.5. Yếu tố độc lực 20
2.3.6. Cơ chế gây bệnh 21
2.2.6.1. Các nguồn nhiễm bệnh 21
2.2.6.2. Triệu chứng 21
2.2.7. Các biện pháp phòng và xử lí bệnh 22

2.2.7.1. Các biện pháp phòng bệnh 22
2.2.7.2. Xử lí bệnh 22
2.2.8 Tình hình nhiễm E. sakazakii trong sữa bột 22
2.2.8.1. Việt Nam 22
2.2.8.2. Thế giới 23
CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII
3.1. Phương pháp truyền thống 25
3.1.1. Nguyên tắc 25
3.1.2. Môi trường nuôi cấy 25
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ 25
3.1.4. Lấy mẫu 25
3.1.5. Chuẩn bị mẫu thử 27



iii

3.1.6. Quy trình phân tích 28
3.1.7. Cách tiến hành 29
3.1.7.1. Phần mẫu thử 29
3.1.7.2. Tiền tăng sinh 29
3.1.7.3. Tăng sinh chọn lọc 29
3.1.7.4. Phân lập Enterobacter sakazakii giả định 29
3.1.7.5. Khẳng định 30
3.1.8. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance
Enterobacter sakazakii Agar 31
3.1.9. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey 32
3.1.10. Khẳng định sinh hóa 33
3.1.10.1. Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa 33
3.1.10.2. Phép thử Oxydase 34

3.1.10.3. Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase 34
3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase 34
3.1.10.5. Phép thử lên men các loại đường khác nhau 34
3.1.10.6. Phép thử chỉ sử dụng Citrate 34
3.1.10.7. Thử nghiệm Nitrate 35
3.1.10.8. Thử nghiệm ONPG 36
3.1.10.9. Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm 37
3.1.9.10. Thử nghiệm VP (voges-proskauer) 38
3.2. Các phương pháp hiện đại 39
3.2.1. Phương pháp PCR 39
3.2.1.1. lịch sử phát triển 40
3.2.1.2. Nguyên tắc 40
3.2.1.3. Các thành phần tham gia vào quá trình PCR 41
3.2.1.4. Phương pháp xác định Enterobacter sakazakii bằng phản ứng PCR 43
3.2.2. Phương pháp real time PCR 46
3.2.2.1. Lịch sử phát triển 46



iv

3.2.2.2. Khái niệm và nguyên lí hoạt động 47
3.2.2.3. Phương pháp tiến hành 49
CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận 52
4.2. Kiến nghị 53
Tài liệu tham khảo 55
PHỤ LỤC 56

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATVSTP: An toàn Vệ sinh thực phẩm
FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
TCVN: Tiêu chuẩn việt nam
PCR: Polymerase Chain Reaction
BPW: Buffered Pepton Water
mLST: Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến
ESIA

TM
: Môi trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định
TSA: Tryptone Soya Agar
EE: Enrichment Enterobacteriaceae
ONPG: O-Nitrophenyl-p-D-galactopyranoside
MR-VP: Methyl red – Voges Proskauer
KIA: Kligler Iron Agar
TSI: Triple Sugar Iron Agar
PCR: Polymerase Chain Reaction















vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột
Bảng 2.2. Thành phần chất béo có trong sữa bò

Bảng 2.3. Thành phần chất khoáng có trong sữa bột
Bảng 2.4. Các thành phần vitamin trong sữa























vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Hình 2.2: Vi khuẩn Escherichia Coli
Hình 2.3: Trẻ em bị viêm màng não do sử dụng sữa bột nhiễm E. sakazakii
Hình 2.4: E.sakazakii dưới kính hiển vi
Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn E. sakazakii
Hình 2.6: Cấu trúc tế bào Gram –
Hình 2.7: 5 bước phát triển của màng sinh học
Hình 2.8: Cấu trúc tiên mao
Hình 2.9: Hai loại sữa điển hình nhiễm E. sakazakii
Hình 3.1: E. sakazakii trong môi trường ESIA
Hình 3.2: E. sakazakii trên môi trương thạch TSA
Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance
Enterobacter sakazakii Agar
Hình 3.4: E. sakazakii trên môi trường Macconkey
Hình 3.5: Kết quả thử nghiệm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ
Hình 3.6: Kết quả thử nghiệm ONPG (+) ống nghiệm màu vàng
Hình 3.7: Kết quả thử nghiệm VP ( Voges-Proskauer)
Hình 3.8: Cơ chế của phản ứng PCR
Hình 3.9: Kết quả sau khi điện di
Hình 3.10: Sơ đồ phát quang của Taqman-probe
Hình 3.11: Kết quả được đọc bằng máy real time 7500.
Hình 3.12: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên
gene OmpA của E. sakazakii






1

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt
Nam là rất cao. Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng.
Qua kiểm tra cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây
ra. Đây là điều đã được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra
các vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong.
Trong đó Vi khuẩn Enterobacter sakazakii là nguyên nhân gây ra các bệnh
như viêm màng não, viêm ruột hoại tử để lại nhiều di chứng nghiêm trọng về thần
kinh và có thể gây chết người. Tỷ lệ Enterobacter sakazakii gây tử vong ở bệnh
viêm màng não là 40-80% và viêm ruột hoại tử là 10-55%. Nguyên nhân lây nhiễm
chủ yếu của loại vi khuẩn này là do sử dụng sữa bột bị nhiễm Enterobacter
Sakazakii
Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiến hành thực hiện bài khóa luận: “Qui
trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột”. Để có cái nhìn tổng quan về
vi sinh vật này
1.2 Mục đích
Tìm hiểu về vi khuẩn Enterobacter sakazakii và qui trình phân lập và phát
hiện E. sakazakii trong sữa bột.
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Tìm hiểu về giá trị dinh dưỡng của sữa bột và các mối nguy trong sữa
bột
- Tìm hiểu tổng quan về E. sakazakii
- Các qui trình phân lập E. sakazakii

2

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN
2.1 Giá trị dinh dưỡng của sữa bột
2.1.1 Đường lactose
Glucid của sữa là lactose hay còn gọi là đường sữa, trung bình mỗi 1 lít sữa
bột có 50g. Lactose là một disaccharide do một phân tử glucose liên kết với một
phân tử galactose tạo thành, enzyme lactase phân hủy đường lactose thành
monosacarit
Trong sữa đường lactose tồn tại dưới 2 dạng
 Dạng α-lactose mono hydrat C
12
H
22
O
11
H
2
O
 Dạng β-lactose anhydrous C
12
H
22
O
11

Ngoài ra trong sữa bò còn chứa các loại đường khác nhưng hàm lượng rất
thấp

Bảng 2.1 khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột
[1]

Loại sữa bột Khối lượng lactose/100g bột
Sữa bột 78.0 g
Sữa bột tách kem 52,9 g
Sữa bột cho trẻ sơ sinh 50,9 g

2.1.2 Protein
- Casein
Casein là tên của một nhóm protein chủ yếu trong sữa. Trong sữa bò casein
chiếm gần 80% tổng số protein hay khoảng 26 g cho 1 lít sữa. Có cấu tạo là các hạt
hình cầu có kích thước 40-200 µm. Chúng tồn tại dưới dạng micelle chứa 65% là
nước phần còn lại là các casein và khoáng (canxi, magie, phosphate, citrate). Là
protein có tính acid vì phân tử của chúng chứa nhiều gốc acid glutamic và acid
aspartic



3

- Các protein khác
Protein hòa tan gồm : albumin 0,4% và globulin 0,2% bị đông tụ khi đun
nóng sữa lên đến 80
o
c
Immunoglobulin trong sữa bò có 3 loại là IgG, IgM, IgA trong đó IgG
chiếm hàm lượng cao nhất, IgA có chức năng chống nhiễm trùng đường ruột
Serum-albumin là protein có phân tử lượng lớn có nguồn gốc từ máu rất
mẫn cảm với nhiệt độ

Ngoài ra trong sữa còn có các loại protein màng, hàm lượng của chúng rất
thấp
- Enzyme
Enzyme do tuyến vú tiết ra hoặc do vi sinh vật trong sữa tổng hợp nên. Sự
có mặt của enzyme là nguyên nhân gây ra biến đổi thành phần hóa học của sữa
trong quá trình bảo quản, dẫn đến chất lượng sữa hư hỏng. Nhưng một số loại
enzyme trong sữa có khả năng kháng khuẩn như lactoperoxydase, lysozyme. Hàm
lượng vi sinh vật càng nhiều thì thành phần enzyme càng đa dạng, có 60 loại
enzyme trong sữa
Lactoperoxidase: Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa oxy từ H
2
O
2
,
đến các chất oxy hóa khác
Catalase: Enzyme này luôn có trong sữa do tuyến vú tiết ra, xúc tác phân
hủy H
2
O
2
, thành nước và oxy tự do
Lipase: enzyme quan trọng nhất trong sữa,là một glycoprotein, xúc tác thủy
phân liên kết ester trong cơ chất triglyceride
Protease: enzyme này xúc tác phân hủy protein. Có 2 loại protease là :
protease kiềm và protease axit
Ngoài ra còn có các loại enzyme khác như : phosphatase, phosphatase acid.
2.1.3 Chất béo
Chất béo là một trong những thành phần quan trọng nhất của sữa. Hàm
lượng chất béo của sữa thay đổi trong một phạm vi khá rộng. Có loại sữa ít

4

béo, khoảng 3g trong 100 ml sữa, có loại sữa nhiều chất béo khoảng 5-6g trong 100
ml sữa. Đối với sữa bò hàm lượng béo khoảng 3.9%.
Thông thường, chất béo chiếm khoảng 2,5 đến 6,0% thành phần sữa, tùy
thuộc vào giống bò và chế độ dinh dưỡng. Mỡ sữa tồn tại dưới dạng hạt nhỏ lơ lửng
trong nước sữa.
Trong thành phần chất béo của sữa có tới 20 loại acid béo khác nhau,
trong đó 2/3 là acid béo no và còn lại là acid béo chưa no. Trong số những acid
béo trong sữa có khá nhiều acid béo dễ hòa tan trong nước (ví dụ acid caproic).
Chất béo của sữa cũng dễ xảy ra những quá trình phân hủy làm thay đổi thành phần
và tính chất như quá trình thủy phân, quá trình oxy hóa,… làm giảm dần chất lượng
của sữa và nhiều khi làm hỏng sữa.
Ngoài chất béo thuộc nhóm lipid của sữa còn có phospholipide và một số
chất khác nhưng hàm lượng không nhiều, phospholipide có khoảng 0.5-0.7g trong
một lít sữa, trong đó chủ yếu là lexitin.
Bảng 2.2. Thành phần chất béo có trong sữa bò
Thành phần
Hàm lượng
(% so với tổng
khối lượng chất
béo)

Ghi chú
Lypid đơn giản
triglyceride
Diglyceride
Monoglycerride

Cholesteride
Ceride
98,5
95-96
2-3
0,1
0,03
0,02
Ester của acid béo và
cholesterol
Ester của acid béo và
rượu cao phân tử






5

2.1.4. Chất khoáng
Hàm lượng chất khoáng trong sữa dao động từ 8-10g/l, các chất khoáng
trong sữa dạng hòa tan hoặc dung dịch dạng keo dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ và pH
các muối trong sữa đều ở dạng dễ đồng hóa.
Các nguyên tố chiếm hàm lượng cao nhất là Ca, P, Mg, K,
Các nguyên tố khác như K, Na, Cl đóng vai trò là chất điện ly. Và Zn, Al,
I, Cu, Mn, Ag… chúng cần thiết cho quá trình dinh dưỡng của con người
Bảng 2.3. Thành phần chất khoáng có trong sữa bột
[1]

2.1.5 .Vitamin
Tùy theo khả năng hòa tan trong nước hay trong chất béo ta tách vitamin
trong sữa làm hai nhóm
 Vitamin hòa tan trong nước: B
1
, B
2
B
3
B
5
B
6
, C và H…
 Vitamin hòa tan trong chất béo A, D, E

Thành phần Khối lương/100g
Natri
Muối
Kali
Magiê
Canxi
Photpho
Kẽm
Iôt
Selen
560,0 mg
1426,9 mg
1710,0 mg
126,0 mg
1360,0 mg
980 mg
0,4 mg
130 µg
20 µg



6


Bảng 2.4. các thành phần vitamin trong sữa
[1]

2.1.6. Các hợp chất khác
Trong sữa bò còn chứa các chất khí chủ yếu là CO
2
, O
2
và N
2
. Tổng hàm
lượng của chúng chiếm 5-6% thể tích sữa.
Hormone do các tuyến nội tiết ra và giữ vai trò quan trọng trong quá trình
sinh trưởng của động vật. Trong sữa có nhiều loại hormone được chia làm 3 nhóm:
proteohormone, hormone peptide, hormone steoride.
2.2.Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột
2.2.1.Listeria monocytogenes
2.2.1.1 Giới thiệu
Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, bệnh Listeriosis do vi khuẩn Listeria
monocytogenes gây ra. Nó là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm
nguy hiểm nhất. với 20-30% gây các bệnh nhiễm trùng dẫn đến tử vong
Ca đầu tiên bệnh Listeriosis phát hiện cách đây 70 năm, nhưng mãi đến
năm 1980 mới chính thức xác nhận bệnh do vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra
các bệnh ngộ độc thực phẩm
2.2.1.2 Phân loại

Vitamin

Mg/100g

Vitamin

Mg/100g

A
D
E
B1
B2
B12
0,3
0,001
1,4
0,4
1,7
0,5

B6
B3
B5
C
H
M
0,005
1
3

20
0,04
0,05




7


Hình 2.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes
Các vi khuẩn chi Listeria bao gồm sáu loài khác nhau (L. monocytogenes,
L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, và L. grayi). Cả hai L. ivanovii
và L. monocytogenes đều gây bệnh ở chuột, nhưng chỉ có L. monocytogenes luôn
gắn liền với bệnh tật của con người
2.2.1.3 Đặc điểm
L. monocytogenes là vi khuẩn gram dương (+), không sinh bào tử, yếm khí,
và có thể phát triển trong tế bào, có thể di chuyển thông qua các tiên mao ở nhiệt độ
dưới 30
o
C nhưng trên 37
o
C thì không di chuyển được.
- Nhiệt độ phát triển
Vi khuẩn L. monocytogenes có thể sống và phát triển ở nhiệt độ từ 3-45
o
C
- Phản ứng sinh hóa
Phản ứng catalase dương tính
Phản ứng oxydase âm tính

Tạo ra hemolysin beta gây phá hủy tế bào máu
2.2.1.4 Yếu tố độc lực
Vi khuẩn L. monocytogenes có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào
chủ (của bệnh nhân) và làm thay đổi một vài chức năng của tế bào trong chiều
hướng có lợi cho vi khuẩn để chúng thoát khỏi hệ thống phòng vệ của cơ thể. Nhờ
vào chiến thuật này, vi khuẩn có thể dễ dàng vượt qua hàng rào của vùng ruột cũng
như của một số bộ phận khác trong cơ thể.



8

Nhóm khảo cứu Pháp cho biết vi khuẩn L. monocytogenes sản xuất ra một
loại độc tố chuyên biệt có khả năng phá vỡ hệ thống SUMOYLATION tức là nguồn
máy phòng vệ tối quan trọng của tế bào chủ.
Ngày 15/2 trong tạp chí Thực nghiệm Y Khoa, tiến sĩ Laurel Lenz và đồng
sự đã công bố, đại thực bào bị Listeria xâm nhiễm phóng ra interferon αβ (IFN- αβ),
làm chúng và những tế bào miễn dịch lân cận không thể đáp ứng với các tín hiệu
hoạt hóa. Điều này làm giảm khả năng miễn dịch với vi khuẩn, gây ra hàng nghìn ca
ngộ độc thực phẩm và hơn 500 người chết mỗi năm ở Mỹ
2.2.1.5 Khả năng gây bệnh
Bệnh do nhiễm khuẩn Listeria hay còn gọi là bệnh Listeriosis. Đây là tình
trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn phải các loại thực phẩm bị nhiễm một loại vi
khuẩn có tên khoa học là Listeria monocytogenes. Loại vi khuẩn listeria này được
Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh
vực an toàn vệ sinh thực phẩm.
Hiện nay, chúng ta đã biết đến hai thể bệnh Listeriosis:
Listeriosis khu trú ở ruột: Bệnh chỉ khu trú ở hệ thống tiêu hóa. Người
bệnh sẽ trải qua các triệu chứng nhẹ giống như bị cúm thường như sốt và đau mỏi
cơ cũng như có hiện tượng tiêu chảy.

Listeriosis thể xâm nhập và lan tỏa: Sự nhiễm bệnh không tập trung tại
đường tiêu hóa mà còn xâm nhập vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu hoặc lan
sang cả hệ thần kinh trung ương và não bộ gây viêm màng não. Listeriosis lan tỏa là
một bệnh lý khá nguy hiểm, đòi hỏi phải nhập viện ngay lập tức để được điều trị
tích cực bằng các loại thuốc kháng sinh
Các trường hợp dễ nhiễm bệnh là trẻ sơ sinh dưới 1 tháng tuổi, người già
trên 60 tuổi, Người đang trong giai đoạn dùng các phương pháp điều trị làm suy
giảm chức năng miễn dịch như hóa-xạ trị, phụ nữ mang thai



9

2.2.1.6 Các thực phẩm liên quan
Hầu hết số ca mắc Listeriosis đều do dùng các loại thực phẩm đã bị nhiễm
khuẩn Listeria.
Trong môi trường chế biến thực phẩm, sự xuất hiện của Listeria có thể gây
ô nhiễm cho các sản phẩm thực phẩm. Ví dụ, sự nhiễm khuẩn có thể xảy ra sau khi
thực phẩm đã được nấu chín nhưng trước khi nó được đóng gói hoặc vận chuyển
đến nơi tiêu thụ, nó đã bị cầm nắm bởi tay người hoặc vật dùng nhiễm vi khuẩn
Listeria.
Các loại rau quả cũng có thể bị ô nhiễm nếu chúng được trồng ở những nơi
có nguồn đất và nước hoặc phân bón có Listeria, hoặc khi rửa các loại thực phẩm
này với nguồn nước bị ô nhiễm. Các loại thịt và sản phẩm sữa hoặc từ sữa có thể bị
ô nhiễm nếu chúng được lấy từ các động vật đã bị nhiễm với Listeria
2.2.2 Escherichia Coli
2.2.2.1 Giới thiệu
Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli) hay còn được gọi là vi
khuẩn đại tràng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột
của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết

trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Sự có mặt của
E. coli trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. E. coli thuộc
họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho
các nghiên cứu về vi khuẩn.
E. Coli đóng vai trò quan trọng trong y tế, nó được sử dụng như là một
công cụ để sản xuất các loại thuốc thông qua việc chuyển gen vào các plasmid
2.2.2.2 Phân loại







10








Hình 2.2 : Vi khuẩn Escherichia Coli
Escherichia Coli là một trong những vi khuẩn đa dạng nhất, 20% của bộ
gen là chung cho tất cả các chủng, và phân thành nhiều loài khác nhau
2.2.2.3 Hình thái, cấu trúc
Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế
bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có
capsul. Kích thước trung bình (0,5µm x 1-3µm) hai đầu tròn. Một số dòng có lông

bám (pili).
Đặc tính sinh hóa: Nhiệt độ thích hợp là 37-38
o
C, pH: 7,2 - 7,4. Khuẩn lạc
thay đổi theo môi trường nuôi cấy: trong môi trường NA : khuẩn lạc tròn, ẩm ướt,
mặt láng, có nếp nhăn. Trong môi trường EMB : khuẩn lạc có màu thâm tím hoặc
đen. Môi trường MacConkey: khuẩn lạc màu đỏ mận chín.
2.2.2.4 Đặc điểm:
 E.coli thuộc họ Enterobacteraceae, gram âm, hình que, đường kính
khoảng 1mm. Phần lớn di động và không sinh bào tử, chỉ có serotyp O.8 và O.9 tạo
bào tử và bất động, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ tiện
 Có khả năng lên men lactose cao.
 Kích thước tế bào và khuẩn lạc phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy.
 E.coli có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7-50
o
C. Nhiệt độ phát triển
tối ưu của E.coli là 37
o
C. Riêng loài E.coli (ETEC) có thể phát triển ở 4
o
C
 Giá trị D của E.coli là 60
o
C trong 0,1 phút.



11

 E.coli sống trong ruột già của động vật. Theo phân người và động vật

ra ngoài thiên nhiên.
 Bị ức chế bởi một số loại hóa chất như chlorine, mối mật, brillian
green
 Có khả năng lên men được nhiều loại đường, sinh hơi. Chúng có khả
năng khử nitrate thành nitrit.
 E.coli có enzyme trytophanase. Nếu trong môi trường có trytophan,
chúng sẽ phân giải trytophan thành Indol.
2.2.2.5 Khả năng gây bệnh
Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm
theo độc tố của chúng.
 Ngoại độc tố: phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết
gây hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh.
 Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc
thần kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác.
E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và
F41.Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của
từng serotyp. Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của
E.coli.
E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có. Bình thường, vi khuẩn
không gây tác hại trên ký chủ (10
3
cfu/g phân). Khi mật số tăng lên cao (10
6
– 10
9

cfu/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh.
Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường
miệng. Ở dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn.
Khi đến ruột, E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc

ruột và tác động lên nhung mao ruột.
Nhiễm trùng huyết: bằng tính xuyên mạch, E. coli xâm nhập vào máu, đi
đến các cơ quan nội tạng khác, tiết độc tố gây độc cho cơ thể, quan trọng nhất là
làm viêm não.



12

- Triệu chứng
Có nhiều loại E.coli, nhưng phần lớn chúng có thể nói là vô hại. Tuy
nhiên, một số E.coli có thể gây tiêu chảy, và loại phổ biến nhất trong nhóm E.coli
có hại này là E.coli O157:H7. Ở vài bệnh nhân, vi khuẩn này có thể gây rối loạn
máu và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong
Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli. Người bị nhiễm
cũng có thể cảm thấy đau thắt bao tử và nôn ói. Triệu chứng thường bắt đầu 3 hay 4
ngày sau khi bị phơi nhiễm vi khuẩn E.coli. Phần lớn bệnh nhân hồi phục sau vài
ngày hay một tuần sau khi mắc bệnh. Phần lớn bệnh nhân cũng chẳng cần đến bác
sĩ vì họ không biết mình bị nhiễm E.coli. Ngoài ra, nhiều người bị nhiễm mà không
có triệu chứng và cũng không mắc bệnh.

Khi bệnh nhân bị nhiễm E.coli nghiêm trọng (tức có thể làm rối loạn máu
và suy thận), một số triệu chứng sau đây thường được ghi nhận:
 Da trở nên xanh xao
 Cảm lạnh
 Cảm thấy yếu cơ
 Có những vết thâm tím trên người
 Đi tiểu rất ít nước tiểu
2.2.2.7 Các thực phẩm liên quan
Các thực phẩm bị nhiễm E. coli là các loại thực phẩm từ động vật như các

loài gia súc. Nguồn E.coli trong ruột gia súc có thể được truyền qua quá trình chế
biến
Sữa chưa được tiệt trùng. Vi khuẩn E.coli được truyền sang sữa qua các
thiết bị vắt hoặc từ vú của động vật
Nước bị ô nhiễm : phân người và động vật có thể gây ô nhiễm mặt đất và
nguồn nước và nước tưới cây, trồng, uống hoặc sử dụng các nguồn nước này có thể
gây nhiễm E.coli





13

2.3. Tổng quan về Enterobacter sakazakii
2.3.1 Lịch sử phát hiện
1958 Enterobacter sakazakii được biết đến với sự mô tả như một sắc tố
màu vàng được Urmenyi và Franklin điều tra thông qua hai trường hợp nhiễm trùng
huyết và viêm màng não gây tử vong ở bệnh viện Osterhills tại Anh .
1980 E. sakazaki được định danh là một loài mới của họ
Enterrobacteriaceae. Đặt theo tên của Riichi Sakazakii nhà vi trùng học Nhật Bản
cho đóng góp quan trọng của ông về sự hiểu biết sinh học Vibrionaceae và
Enterobacteriaceae
1982 có 8 trường hợp bệnh viêm màng não ở trẻ sơ sinh gây ra bởi
E.sakazaki được phát hiện ở Hà Lan
1994 một đợt bùng phát nhiễm trùng E. sakazakii ở Pháp đã xảy ra trong
một khu vực chăm sóc trẻ sơ sinh trong đó có 17 trẻ sơ sinh bị nhiễm. 7 trường hợp
viêm ruột hoại tử, một trường hợp nhiễm trùng máu và một trường hợp gây viêm
màng não

Hình 2.3.Trẻ em bị viêm màng não do sử dụng sữa bột nhiễm E.Sakazakii
2.3.2 Phân loại
Giới : Vi khuẩn
Ngành : Proteobacteria
Lớp : Gammaproteobacteria
Họ : Enterobacteriaceae
Chi: Enterobacter



14

Chi Enterobacter bao gồm mười bốn loài, cụ thể là: E. aerogenes, E.
amnigenus, E. asburiae, E. cancerogenus (E. tylorae), E. cloacae, E. cowanii, E.
dissolvens (Erwinia), E. gergoviae,E. hormaechei, E. vật ở giưa, E. kobei, E.
Nimipressuralis (Erwinia), E. pyrinus (Erwinia) và E. sakazakii. Là tác nhân của
các bệnh nhiễm trùng
Enterobacter sakazakii ban đầu được xác định là một loài mới vào năm
1980. Sử dụng DNA- DNA lai tạo và các kiểm tra sinh hóa cho kết quả 53-54% liên
quan đến các loài trong hai chi, Enterobacter và Citrobacter. Khi so sánh các chủng
loại của các hai chi, E. sakazakii có 41% liên quan đến C. freundii và 51% liên quan
đến E. cloacae. Do đó nó được đặt trong chi Enterobacter
Gần đây đã Dựa trên các phương pháp phân tích. f-AFLP, trình tự gen 16S
ARN và phương pháp lai tạo DNA-DNA được áp dụng cho 210 chủng E.sakazakii

và dữ liệu của tất cả 16 biogroup (Iversen et al., 2007). Đã đưa ra đề xuất phân loại
các chủng thành 1 chi mới Cronobacter.
Cronobacter spp được xem như là một chi mới của E. sakazakii. bằng các
phương pháp nêu trên nhiều loài đã được tìm ra như Cronobacter sakazakii; C.
turicensis; C. malonaticus; C. muytjensii; and C. dublinensis.
2.3.3 Đặc điểm







Hình 2.4: E. sakazakii dưới kính hiển vi
2.2.3.1 Đặc điểm chung
- Đặc điểm



15

E. sakazakii là một vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaciae và đủ
tiêu chuẩn là một vi khuẩn Coliform, chiều dài khoảng 3 µm và chiều rộng
hình que, kị khí tùy nghi, các tế bào di chuyển bằng tiên mao Peritrichous
và không hình thành bào tử, có khả năng tạo màng sinh học.
- Môi trường sống
E. sakazakii không phải là dạng sinh vật cư trú trong đường ruột của con
người. Ta có thể phân lập hàng loạt từ các mẫu môi trường (đất, nước), các loài gây
hại như (ruồi, chuột), từ thực phẩm và từ môi trường bệnh viện. E. sakazakii cũng
có thể được tìm thấy trong sữa bột, ngũ cốc, chocolate, bột mì và các khu vực sản

xuất.
- Nhiệt độ tăng trưởng
Enterobacter sakazakii có khoảng nhiệt độ rộng cho sự phát triển: nhiệt độ
tối thiểu là 5,5 - 8°C, tối đa là 45 - 46°C và nhiệt độ tối ưu để phát triển là 37-43°C .
Ở nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu như thế sẽ giúp E. sakazakii phát triển
trong tủ lạnh nhà từ 7 đến 10°C nếu có trong sữa bột dành cho trẻ em. Còn khi E.
sakazakii phát triển ở nhiệt độ lên tới 45-46°C có thể còn sống sót trong các thiết bị
sấy và máy trộn được sử dụng sản xuất sữa bột cho trẻ em
Thời gian cho một lần chu kì nhân đôi ở 10
o
C là khoảng từ 4-6 giờ. Giảm
còn 40 phút nếu ở nhiệt độ phòng
- pH
Tối thiểu 3,89
Tối ưu 5 - 9.
- Khả năng chịu khô.
E. sakazakii được cho là có khả năng chống thẩm thấu, chịu được khô hạn
hơn so với các vi khuẩn khác như : Escherichia coli, Salmonella và các chủng khác
của Enterobacteriaceae, Phân tích chỉ ra rằng khả năng chịu khô hạn rất có thể là
liên quan đến tích tụ trehalose trong các tế bào. Một chất có khả năng giữ nước cao,
và được sử dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm
- Môi trường nuôi cấy