Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài cấp nhà nước nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bệnh sốt dengue sốt xuất huyết dengue và bệnh viêm đ

Bộ Khoa học và Công nghệ
Chơng trình KC- 04

Báo cáo
tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nớc

Đề tài: KC 04 - 32
Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để
chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt
xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đờng hô
hấp cấp (SARS) ở Việt Nam.
GS.TS. Trơng uyên Ninh
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng

6701
24/12/2007
Hà Néi, 9- 2007
B¶n qun thc VVSDTTW- Bé Y TÕ


Những chữ viết tắt trong báo cáo


ARN

Axit ribonucleic

ADN

Axit deoxyribonucleic

CID

Center of Infection Diseases
Trung tâm các bệnh nhiễm trùng

CDC

Center of Diseases Control
Trung tâm kiểm soát bệnh tật

ELISA

Enzym linked Immunosorbent Assay
Thử nghiệm miễn dịch men

GAC- ELISA

IgG Capture ELISA
Kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiÖn IgG

HI

Hemagglutination Inhibition test

HT

HuyÕt thanh

FBS
IFAT

Fetal Bovin Serum
(Immunofluorescent indirect Antibody Technique)
Kü thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

IFDT

(Immunofluorescent direct Antibody Technique)
Kỹ tht miƠn dÞch hnh quang trùc tiÕp

IFA

(Immunofluorescent Indirect Antibody Technique)
Kü thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

MAC -

IgM Capture ELISA

ELISA

Kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiện IgM

ML

Maximum Likelihood
Phơng pháp chắc chắn tối đa

MP

Maximum Pasimony


Phơng pháp chi li tối đa
NJ

Neighbor Joining
Phơng pháp kế cận liền kề

NNKHC
Primer
PRNT

Ngăn ngng kết hồng cầu (HI)
Đọan mồi ADN
Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization
tests.
Kü thuËt trung hoµ vµ Kü thuËt Trung hoà giảm đám
hoại tử

PCR

Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi Polymeraza

RT- PCR

Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction
Phản ứng dao chép ngợc khuếch đại chuỗi

SARS

Severe Acute Respiratory Syndrome
Hội chứng viêm đờng hô hấp cÊp tÝnh

SARS-CoV

Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona
virus
Virus Corona g©y bƯnh SARS

SD
SXHD
TCYTTG
VVSDTTW
VCNSH
WHO

Sèt Dengue
Sèt xt hut Dengue
Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi
ViƯn Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương
Viện Công nghệ Sinh học
World Health Organization
(Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi)

WB

Western Blot

Mục lục
Số TT

Nội dung

Trang

Đặt vấn đề

1

Chơng I.
Tổng quan tài liệu

A. Nghiên cứu virus Dengue gây nên bệnh Sốt
Dengue/ Sốt xuất hut Dengue ë ViƯt Nam
1.1

BƯnh sèt Dengue vµ sèt xt huyết Dengue

1.1.1

Biểu hiện lâm sàng

1.1.2

Tác nhân truyền bệnh

6

1.1.3

Tình hình dịch bệnh trên thế giới

8

1.1.4

Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam

11

1.2

Virus Dengue

11

1.2.1

Đặc điểm hình thái và cấu trúc

13

1.2.2

Genome của virus

13

1.2.3

Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus Dengue

15

1.2.4

Đặc điểm kháng nguyên

17

1.2.4.1

Phát hiện kháng thể

18

1.2.4.2

Phân lập virus

20

5

B. nghiên cứu virus corona gây bệnh viêm đờng
hô hấp cấp SARS ở Việt Nam
1.1

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

26

1.2

Các nghiên cứu tại Việt nam

42

Chơng II
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
A. Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh Sốt Dengue/


Sốt xuất huyết Dengue
2.1

Đối tợng và vật liệu

2.1.1

Đối tợng

2.1.2

Vật liệu

2.1.3

Hoá chất

49

2.2

Trang thiết bị

54

2.3

Phơng pháp

55

44

Các phơng pháp sản xuất kháng nguyên và Kháng huyết thanh
2.3.1

Sản xuất kháng nguyên

55

2.3.2

Phơng pháp sản xuất kháng huyết thanh

58

2.3.3

Phơng pháp ELISA phát hiện IgM

59

2.3.4

Kỹ thuật trung hoà (Neutralization Test - NT)

59

2.3.5

Phơng pháp miễn dịch hấp phụ liên kết men

60

phát hiện KT IgG

(GAC- ELISA)

2.4

Các phơng pháp phân lập và xác định type virus

60

2.4.1

Cấy truyền trên nÃo chuột ổ (1-3 ngày tuổi)

60

2.4.2

Phơng pháp phân lập virus trên tế bào muỗi

61

Aedes. albopictus dòng C6/36.
2.4.3

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trùc tiÕp

64

(Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA).
2.4.4

Kü tht miƠn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp

65

(Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay – IFA).
2.4.5

Kü thuËt Trung hoà giảm đám hoại tử

66

( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT )
2.4.6

Phơng pháp tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase

68

(RT-PCR - Polymerase Chain Reaction)
C. Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh
bƯnh Viêm đờng hô hấp cấp SARS

2.1

Đối tợng nghiên cứu

73

2.2

Vật liệu

74

2.2.1

Mẫu bệnh phẩm

74

2.2.2

Tế bào

74

2.2.3

Sinh phẩm khác

74


2.2.4

Môi trờng và hoá chất

75

2.2.5

Trang thiết bị và dụng cụ

76

2.3

Phơng pháp

78

2.3.1

Phân lập virus SARS-CoV

78

2.3.2

Tạo plasmid tái tổ hợp.

78

2.3.3

Biểu lộ và tinh sạch kháng nguyên .

79

2.3.4

Phơng pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme tóm bắt

80

kháng thể IgM (MAC- ELISA)
2.3.5

Phơng pháp Western Blot.

81

Chơng III
Kết quả và Bàn luận

A. Kết quả sản xt bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh
bƯnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue.
3.1

Nu«i cÊy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus

82

Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) trên tế bào muỗi
Aedes albopictus dòng C6/36.
3.1.1

Nh©n virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus

82

Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) vào tế bào muỗi
Aedes albopictus dòng C6/36 để tách chiết ARN.
3.1.2

Quan sát sự nhân lên của virus Dengue trong tế bào muỗi Aedes

100

albopictus dòng C6/ 36 dới kính hiển vi điện tử
3.2

Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng

106

nguyên Dengue tái tổ hợp các type.
3.2.1

Kháng nguyên Dengue thô

106

3.2.2

Kháng nguyên tái tổ hợp.

108

3.2.3

Quy trình tách chiết và tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp của virus
dengue tõ chđng E. coli cho c¶ bèn typ virus dengue
Tách dòng và xác định trình tự đọan gen PreM và E của 4 type virus

109

3.3

117

Dengue.
3.3.1

Tách RNA tổng số của tế bào muỗi C6/36

117

3.3.2

Khuếch đại đoạn gene PreM và E bằng phơng pháp RT-PCR

118


3.3.3

Biểu hiện kháng nguyên màng và vỏ của virus Dengue type 1, 2, 3, 4

148

trong hƯ nÊm men Pichia pastoris
3.3.4

BiĨu hiện gen mà hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) trong
Pichia pastoris

163

3.3.5

Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên DxME tái tổ hợp với kháng thể
kháng virus Dengue tự nhiên bằng Western Blot
Thiết kế cặp mồi và xây dựng kế họach tách dòng gen mà hóa kháng

167

3.4

168

nguyên vỏ của virus Dengue các type I, II, III, IV.
3.5

Chế tạo cộng hợp (Gold monoclonal antibodies) gắn kháng nguyên vào

173

giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane)
3.6

Nghiên cứu dung dịch đệm buffer tối u

179

dùng trong phản ứng
3.7

Hoàn thiƯn Bé sinh phÈm

183

3.8
3.8.1

Thư nghiƯm Bé sinh phÈm trong phßng thÝ nghiƯm
Th−êng qui sư dơng Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bệnh sốt Dengue/

198
200

sốt xuất huyết Dengue
3.8.2

So sánh kết quả thư nghiƯm trong phßng thÝ nghiƯm

204

3.9

øng dơng Bé sinh phÈm trong thực địa

210

3.9.1

Kết quả kiêm tra tại phòng thí nghiệm Sốt xuất huyêt Arbovirus, Viện

210

Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng
3.9.2

Giá thành và chất lợng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt

211

Dengue/ sốt xuất huyết Dengue
3.9.3

Một số hình ảnh khi tiến hành thí nghiệm tại các điểm nghiên cứu

213

B. Kết quả sản xuất Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh
bệnh viêm đờng hô hấp cấp (SARS)
3.1

Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS-CoV

217

3.2

Xác định các thông số cơ bản cho bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn

218

đoán nhiễm virus SARS-CoV
3.2.1

Xác định thời gian sử dụng tối u của bộ sinh phẩm.

219

3.2.2

Xác định độ đặc hiệu của Bộ sinh phẩm

220

3.2.3

Xác định độ nhạy của sinh phẩm.

220

3.3

Thành phần bộ sinh phẩm.

221

3.4

Phát hiện kháng thể IgM trong huyết thanh bệnh nhân SARS và nhân

221

viªn y tÕ cã tiÕp xóc trùc tiÕp víi bƯnh nhân SARS.
Bàn luận
1

Một phơng pháp chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả

226

2

Trong giai đoạn đầu của dịch SARS, một số phơng pháp ELISA đợc

234

giới thiệu
3

Bộ sinh phẩm MAC- ELISA phát hiện sớm nhiễm virus SARS

236

4

Toàn bộ bệnh nhân đợc xác định nhiễm virus SARS-CoV trên lâm

239

sàng đà đợc khẳng định lại khi phát hiện đợc kháng thể IgM kháng

đặc hiệu virus SARS CoV thông qua phơng pháp MAC-ELISA.
5

Sự xuất hiện của KT kháng đặc hiệu virus SARS-CoV trên một số

239

ngời không có biểu hiện lâm sàng

Kết luận

241

Tài liƯu tham kh¶o

244


Đặt vấn đề

Trong vòng 15 năm gần đây, nhiều dịch bệnh nguy hiểm ở qui mô khu vực cũng
nh toàn cầu đà xảy ra và lần đầu tiên gây ảnh hởng lớn đến nền kinh tế thế
giới. Tất cả các bệnh dịch nguy hiểm này (nh dịch hạnh ấn Độ vào năm 1994,
dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông 1997, dịch viêm nÃo Nipah tại Malaysia, dịch
SARS hay hội chứng hô hấp cấp tính ở Trung Quốc từ năm 2002 đến 2003, và
cúm gia cầm ở vùng Đông Nam á từ năm 2003 đến2007) đều có mầm bệnh
từ động vật và phát sinh tại á Châu và dần dà lây lan làm ảnh hởng đến nền
kinh tế thế giới. Với tiến trình toàn cầu hoá hiện nay, chúng tôi thiết nghĩ trong
tơng lai sẽ xảy ra nhiều dịch bệnh ở tầm mức tơng tự. Hơn nữa, do các yếu tố
xà hội, văn hoá và nhân khẩu ở Châu á có lẽ vẫn là nơi tiếp tục xuất hiện các

dịch bệnh bắt nguồn từ động vật Việc phát hiện ổ dịch trong chơng trình
chiến lợc dự phòng sớm tại á châu sẽ giúp chúng ta chủ động phát hiện và
ngăn chặn kịp thời các bệnh dịch đà biết đến cũng nh các bệnh dịch mới phát
sinh. Trong các bệnh dịch mới gần đây, nổi lên có dịch SD/ SXHD và Viêm
đờng h« hÊp cÊp SARS....
Sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue (SD/ SXHD) lµ mét bƯnh nhiƠm trïng cÊp
tÝnh do virus Dengue gây ra. Bệnh không có vacxin và thuốc điều trị. Biểu hiện
lâm sàng của SD/ SXHD rất đa dạng từ sốt cao đột ngột kéo dài 2-7 ngày kèm
theo triệu chứng đau đầu, đau cơ, đau xơng, đau khớp, đau bụng cho tới buồn
nôn, phát ban... Sau đó có thể cã biĨu hiƯn xt hut d−íi da, xt hut néi
t¹ng (chảy máu cam, chảy máu lợi, nôn ra máu, đi ngoài ra máu...). Ngoài ra
còn có thể có thêm các dấu hiệu khác nh gan to, sốc, huyết áp hạ vµ cã thĨ dÉn
tíi tư vong (Barnes W. J. S. và Rosen L., 1974). Bệnh SD/ SXHD là bệnh do
muỗi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] trun v× vËy bƯnh th−êng dễ dàng
phát triển thành dịch. Virus Dengue đợc Sabin phân lập đầu tiên ở Calcuta, ấn

1


®é, New-Guinea vµ Hawaii (Sabin A. vµ cs, 1952)... Sau này đợc xác định là
virus Dengue type 1-Hawaii và virus Dengue type 2-New-Guinea. Các type virus
Dengue 3 và virus Dengue 4 đợc Hammon W.M. và cs phân lập ở Philippines
vào năm 1956 (Hammon W.M. và cs 1960). Tiếp đó nhiều chủng virus Dengue
đà đợc phân lập từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới nhng đều đợc xác định
là thuộc 4 type huyết thanh nêu trên (Anonymous, 1986).
Tới năm 1997 bệnh SD/ SXHD đà lan rộng trên phạm vi toàn thÕ giíi. Theo
Gubler, D.J. (1997) th× hiƯn nay cã tíi hơn 2,5 tỷ ngời đang sống trong khu vực
có lu hành SD/ SXHD và hàng năm có khoảng 100 triệu ngời mắc bệnh này.
Để có thể phòng chống bệnh một cách hiệu quả thì việc chủ động giám sát
huyết thanh học, dịch tễ học, côn trùng học virus Dengue gây nên bệnh sốt

Dengue/sốt xuất huyết Dengue là hết sức cần thiết.
Các phơng pháp chủ yếu chẩn đoán huyết thanh học của virus Dengue bao
gồm: Phản ứng Ngăn ngng kết hồng cầu (HI), phản ứng kết hợp bổ thể (CF),
phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn
enzym phát hiện kháng thể IgM (MAC-ELISA) và phản ứng miễn dịch hấp phụ
gắn enzym phát hiện kháng thể IgG (GAC-ELISA), kỹ thuật RT- PCR
Ngoài bệnh SD/ SXHD, Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tính nặng (SARS) là
một bệnh dịch mới xuất hiện trên phạm vi toàn cầu. SARS đà xuất hiện tại 23
Quốc gia: Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore, Canada, Hoa Kỳ, Việt Nam,
Malaysia, Thái Land Tính đến tháng 04 năm 2004 trên toàn thế giới đà có
tổng số mắc/ tổng số chết là: 3169/ 144 ng−êi (Theo Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíiWHO) [39].
T¸c nhân gây bệnh SARS là một biến thể họ Corona (Coronaviridae); Một
nhóm virus có thể gây bệnh cho cả ngời và động vật [41]. Trên ngời, Corona
thờng gây ra viêm đờng hô hấp trên, chủ yếu ngời trởng thành. Ngoài ra

2


cũng cần chú ý tới một số loại vi khuẩn, virus cơ hội thờng xuyên có mặt ở
đờng hô hấp của ngời; Có thể góp phần gây ra các bội nhiễm đờng hô hấp
dới và viêm phổi không điển hình trên bệnh nhân SARS.
Virus này có sức đề kháng yếu, tồn tại với động lực lớn trong không khí mát
lạnh khoảng 2- 5 giờ. Virus SARS nhạy cảm với nhiệt ®é cao, tia cùc tÝm, c¸c
ho¸ chÊt khư trïng…
Ngn bƯnh vµ ỉ chøa virus SARS: Ch−a biÕt râ rµng. Ng−êi có thể là nguồn
bệnh chính trong chuỗi mắt xích lây truyền Ngời- Ngời. Ngời bệnh SARS,
nhất là bệnh nhân nặng đang trong giai đoạn khởi phát và toàn phát là ngn
trun nhiƠm nguy hiĨm. Theo qui lt chung cđa c¸c bệnh do virus thì SARS
có thể thải mầm bệnh từ 5 đến 15 ngày sau khởi phát. Thời gian ủ bệnh trung
bình 7 ngày; Một số trờng hợp có thể kéo dài tới 14- 15 ngày [32].

Triệu chứng: Hắt hơi, chảy nớc mũi, ngạt mũi, ho, đau họng hoặc khó thởCó
thể dẫn đến biến chứng nh: Nhiễm khuẩn huyết, viêm màng nÃo do bội nhiễm
vi khuẩn
Để chẩn đoán bệnh này, ngời ta thờng:
Phát hiện trực tiếp virus hoặc kháng nguyên virus. Có thể có kết quả trong vài
giờ nếu bệnh phẩm lấy tốt; Rồi tiến hành các kỹ thuật:
- Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp là phơng pháp nhạy cảm để phát hiện virus
trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng và nuôi cấy tế bào. Tỷ lệ dơng tính là 30%.
- Các phơng pháp khác: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dùng trong nghiên
cứu. Kỹ thuật này khá chính xác nhng đòi hỏi các trang bị kỹ thuật đắt tiền
cũng nh tay nghỊ cđa c¸n bé kü tht
ViƯc ph¸t hiƯn nhanh virus Dengue gây bệnh SD/ SXHD hay bệnh Viêm đờng
hô hấp cấp SARS sẽ giúp cho các bác sỹ lâm sàng có hớng điều trị thích hợp và

3


các nhà Dịch tễ học đa ra các giải pháp hữu hiệu, làm giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ
chết vì bệnh này.
Có nhiều phơng pháp chẩn đoán hai bệnh trên trong phòng thí nghiệm, tuy
nhiên đều tuân thủ nguyên tắc:
- Phát hiện kháng thể (IgG, IgM) kháng virus Dengue hay virus Corona trong
huyết thanh bệnh nhân.
- Xác định virus trong huyết thanh hoặc trong các tổ chức có khả năng nhiễm
virus.
Dựa vào các điều kiện trên mà chúng tôi đa ra mục tiêu của Chơng trình
nghiên cứu này là:
1. Xây dựng đợc qui trình kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính xác sốt
Dengue/ sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đờng hô hấp cấp (SARS).
2. Sản xuất Bộ sinh phÈm chÊt l−ỵng cao, dƠ sư dơng cho viƯc chÈn đoán

bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm ®−êng h« hÊp cÊp
(SARS).

4


Chơng I.
Tổng quan tài liệu

A. Nghiên cứu virus dengue gây bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt
huyÕt Dengue ë ViÖt Nam

1.1 BÖnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue
1.1.1. Biểu hiện lâm sàng
Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue đợc chia thành nhiều cấp độ khác nhau tuỳ
theo mức độ nặng của bệnh mà bệnh nhân có những biểu hiện nh: sốt cao từ
38 0C đến 40 0C, thời gian kéo dài 2-7 ngày kèm theo các triệu chứng đau đầu,
đau cơ, buồn nôn, phát ban, có thể kèm theo rét tuy không thành cơn, choáng
váng, chóng mặt, xuất huyết dới da, xuất huyết niêm mạc, xuất huyết phủ tạng.
ở thể nặng bệnh nhân có thể bị sốc hay còn gọi là hội chứng sốc Dengue
(HCSD). HCSD xảy ra với trẻ em nhiều hơn ở ngời lớn, phổ biến nhất vào ngày
sốt thứ 4 đến thứ 6, ở bệnh nhân nặng có dấu hiệu suy tuần hoàn, đau bụng, bồn
chồn, vật vÃ, nếu không đợc can thiệp sớm bệnh nhân có thể bị tử vong sau từ
12 đến 24 giờ [8].
Các triệu chứng của bệnh thờng rất đa dạng nhng lại không có tính chất đặc
trng. Do đó, không thể phân biệt đợc sự khác biệt về lâm sàng giữa các bệnh
nhân nhiễm các type virus Dengue khác nhau. Mặt khác, các triệu chứng này
cũng tơng tự nh các triệu chứng gặp phải khi bị nhiễm các loại virus gây bệnh
khác nh cúm, sởi, viêm nÃo.
Căn cứ theo biểu hiện lâm sàng của bệnh SD/ SXHD có thể chia thành 3 cấp độ

sau đây :
+ Sốt Dengue (SD): còn gọi là sốt Dengue cổ điển, thờng có các triệu

5


chứng nh các bệnh nhiễm virus khác là: sốt từ 38 0 C- 40 0 C, đau mỏi cơ và các
khớp xơng, đau đầu vùng trán và thái dơng, rất ít gặp mảng xuất huyết dới
da, tỉ lệ tử vong thÊp (kho¶ng 0.018%) [21].
+ Sèt xuÊt huyÕt Dengue: Sèt cÊp tính cao, kéo dài 2-7 ngày kèm theo nhức
đầu, đau khớp, đau cơ, xuất hiện mảng hoặc chấm xuất huyết dới da, niêm
mạc, xuất huyết nội tạng, hạ sốt do xuất huyết nhiều, xuất hiện các biểu hiện
nh chảy máu mũi, chảy máu chân răng ... nhiều và kéo dài [21]
+ Hội chứng sốc Dengue: có các biểu hiện tợng tự nh SXHD nhng còn
kèm theo hiện tợng mạch đập nhanh, huyết áp tụt, da lạnh và ớt. Khi sốc sâu,
kéo dài có thể dẫn tới suy thận cấp, rối loạn tiêu hoá, ngừng tim, xuất huyết nội
tạng và tử vong sau 12-24 giê [30].

ë ng−êi m¾c sèt Dengue th−êng thấy các đặc điểm nh: Hạch lympho sng đau
toàn thân, lợng tiểu cầu ít giảm, giÃn mạch ngoại vi, bạch cầu giảm, hematocrit
tăng nhẹ. Đối với trờng hợp mắc SXHD thì có thêm các đặc điểm khác nữa
nh: gan to, tiểu cầu giảm, hematocrit tăng hơn 20% so với bình thờng, có biểu
hiện vàng da, xuất huyết phủ tạng hệ tiêu hoá và ngoài tiêu hoá nh nÃo, màng
nÃo ... nặng có thể chuyển sang các giai đoạn khác nghiêm träng h¬n nh− SXHD
thĨ n·o (héi chøng n·o cÊp), SXHD thể suy gan cấp ....

1.1.2 Tác nhân truyền bệnh
Bệnh SD và SXHD lây qua đờng máu. Các nghiên cứu về trung gian truyền
bệnh đà xác định muỗi vằn Aedes aegypti (A.aegypti) là vector chủ yếu, ngoài ra
các loại muỗi khác nh− Aedes albopictus, Aedes polynesiens cịng cã thĨ trun

bƯnh SXHD. Muỗi A.aegypti là loại muỗi sống ở trong nhà hoặc xung quanh
nhà. Chỉ có muỗi cái đốt ngời vào ban ngày, chủ yếu vào sáng sớm và chiều tối
[35]. Muỗi c¸i cã thĨ trun bƯnh sau thêi kú đ bƯnh 3 đến 10 ngày hoặc có thể
truyền bệnh ngay nếu đang hút máu bệnh nhân dở dang rồi đốt sang ngời khác.
Nơi đậu của muỗi là những chỗ tối tăm trong nhà nh: hốc tủ, gầm giờng, gầm

6


bàn, chỗ treo quần áo, chăn màn (80.5%) và những vật dụng khác. Một điểm
đáng lu ý là muỗi A.aegypti có khả năng truyền virus Dengue qua lăng quăng,
nghĩa là virus Dengue có chu kỳ xuyên qua trứng. Đây cũng là một yếu tố quan
trọng trong công tác phòng chống bệnh, diệt muỗi trởng thành phải đi đôi với
diệt lăng quăng trong các vật chứa nớc. Điều này chính là cơ sở của phơng
pháp quản lý muỗi dựa và cộng đồng. Vòng đời của muỗi A.aegypti đợc thể
hiện ở Hình 1.1.

Hình 1.1. Vòng đời của Muỗi
Sau khi bị nhiễm virus, muỗi sẽ bị nhiễm suốt đời. Muỗi cái có thể truyền virus
Dengue cho trứng và trứng lại có khả năng tồn tại rất lâu trong điều kiện khô
hạn (có thể trên 1 năm) [24], đây là một yếu tố khó khăn cho việc diệt muỗi.
Muỗi sinh sản vào mùa ma, ở những nơi chứa nớc nhân tạo (vũng nớc đọng,
chum, vại ...v.v).
Thời gian virus nhân lên trong hạch nớc bọt muỗi là từ 3 10 ngày tuỳ theo
nhiệt độ môi trờng. Muỗi cái có thể truyền dọc virus Dengue sang thế hệ sau
tuy nhiên đờng truyền dọc này không có vai trò lớn trong cơ chế lây truyền
Dengue sang ngời, ngời vẫn là vật chủ chính nhân virus Dengue.
1.1.3 Tình hình dịch bệnh trên thế giới
Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue là bệnh nhiễm virus cấp tính đang lan tràn
rộng trên thế giới... Bệnh thông thờng là nhẹ (sốt Dengue - SD) nh−ng cã thÓ

7


nỈng nÕu cã xt hut (Sèt xt hut Dengue- SXHD). Bệnh hay bùng nổ
thành dịch lớn ở những vùng cha từng bị nhiễm virus Dengue và có điều kiện
thuận lợi cho sự phát triển lan tràn của vectơ truyền bệnh.
Dịch Sốt Dengue lần đầu tiên đợc Y văn ghi nhận là vào mùa hè năm 1780 tại
Philadenphia, Hoa Kỳ. Sau đó bệnh đợc thấy ở nhiều nớc nhiệt đới và cận
nhiệt đới... Tại châu A, năm 1953, SXHD xuất hiện lần đầu tiên ở Manila
(philipin). Rồi Thái Lan, Indonexia, Singapore, India, Banglades... ở vùng Tây
Thái Bình Dơng, có từ 28 đến 35 nớc đà trải qua các vụ dịch SD/ SXHD. Sốt
Dengue và sốt xuất huyết Dengue đà đợc các nớc trên thế giới công nhận là
một vấn đề Y tế công cộng quan trọng [34].
Tại Việt Nam, SXHD đợc phát hiện lần đầu tiên ở miền Bắc vào năm 1958;
Còn miền Nam là năm 1960. Sau đó dịch lan rộng tới hầu hết các tỉnh trong cả
nớc...Những năm có dịch lớn là: 1969,1977,1978,1979,1980,1983,1987,1991,
1994, 1998. Hiện nay bệnh SD/ SXHD không chỉ lu hành ở thành thị, khu vực
đông dân c mà còn lan tràn cả các vùng nông thôn đồng bằng, trung du và
miền núi [26].
Theo thống kê cuả TCYTTG thì ở Việt Nam từ năm 1963 đến năm 1988 có số
bệnh nhân mắc trên số bệnh nhân chết về SD/ SXHD là 1.111.734/ 10.415; đây
là số lợng bệnh nhân mắc và chết lớn nhất so với các nớc trong khu vực Đông
Nam A và Tây Thái Bình Dơng, tính trung bình hàng năm có 50.000 - 100.000
ngời mắc SD/ SXHD.
Bệnh cảnh lâm sàng của sốt Dengue kèm theo xuất huyết đợc Hamon và CS
mô tả năm 1953 ở Manila (Philippine). Đến năm 1956, cũng tại Manila, virus
Dengue đà đợc Sabin phân lập từ máu bệnh nhân và muỗi.
Từ năm 1979 đến năm 1980 dịch lan sang vùng nam Thái Bình Dơng, Bắc
Qeensland (Australia)...

8


ở châu Mỹ, sau vụ dịch đầu tiên tại Philadenphia năm 1780 thì mÃi đến năm
1826-1828, ngời ta lại ghi nhận có những trận dịch tơng tự xảy ra tại vïng
biĨn Caribe (Nam Mü). Trong thËp kû tõ 1950 ®Õn 1960, tại vùng này có những
chiến dịch lớn nhằm loại trừ muỗi truyền bệnh đà đợc tiến hành ở Mexico,
Panama... Nhng sau đó muỗi lại xuất hiện ở hầu hết các nớc trong vùng. Từ
đó tần số các vụ dịch SXHD lại tăng lên với đầy đủ cả 4 type virus Dengue.
Trong 15 năm gần đây do sự giao lu thuận tiện nên chỉ từ tháng 1 đến tháng
10/1995 đà có 200.000 bệnh nhân sốt Dengue và 5.500 bệnh nhân sốt xuất huyết
Dengue đợc báo cáo từ các nớc: Brazin, Hondurat, Nicaragoa, Venezuela.

Nhìn vào Hình 1.2. Bản đồ dịch tễ về tình hình mắc SD/ SXHD trên thế giới có
thể nhËn thÊy r»ng dÞch SD/SXHD cã xu h−íng lan réng không những trong mỗi
nớc mà còn ra nhiều nớc khác; Năm 1970- 1980 SD/ SXHD lan ra các nớc
trong khu vựv Đông Nam A; Tiếp theo 1980- 1997, dịch SD/ SXHD lan sang Ân
Độ.Từ đó hàng năm có sự gia tăng số nớc báo có dịch và số trờng hợp mắc
bệnh. Rồi tiếp đến các nớc vùng Tây Thái Bình Dơng và Trung Mỹ đang là
vùng hoạt động mạnh của virus Dengue gây nên bệnh SD/ SXHD. Theo thống
kê của WHO từ năm 1995 đến nay, mỗi năm có khoảng 50 triệu ngời bị nhiễm
virus Dengue với khoảng 500.000 trờng hợp phải nhập viện do mắc SXHD,
trong đó có khoảng 12.000 trờng hợp tử vong hoặc cao hơn nữa nếu nh bệnh
nhân không đợc chẩn đoán và điều trị kịp thời. Đặc biệt vào những tháng đầu
năm 2004, tại Inđônêxia dịch SD/SXHD đà bùng phát mạnh với tổng số trờng
hợp bị nhiễm hơn 80.000, số tử vong là hơn 1000 tr−êng hỵp [17].

9

Hình 1.2. Bản đồ dịch tễ về tình hình mắc SD/ SXHD trên thế giới
Nhìn vào Hình 1.3, ta thấy bệnh SD/ SXHD hiện đang lu hành tại vùng
Trung, Nam Mỹ và vùng Đông Nam A.

Hình 1.3. Vùng lu hành bÖnh SD/ SXHD hiÖn nay

10


Bệnh SD/ SXHD hiện đang đe dọa tính mạng và søc kháe têi hµng tû ng−êi n»m
trong khu vùc nhiƯt đới, A nhiệt đới [14].
1.1.4 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
ở Việt Nam, từ năm 1913, Gaide đà thông báo về bệnh Dengue cổ điển ở miền
Bắc và miền Trung. Năm 1929, Boye có viết về một vụ dịch Dengue cổ điển xảy
ra ở miền Nam Việt nam vào năm 1927.
Miền Bắc Việt Nam, vụ dịch SXHD đâu tiên đợc Mirosky. J, F. Vymola,
Hoang Thuc Thuy ghi nhận vào mùa hè năm 1958 [19]. Nhiều tác giả đà mô tả
các đặc điểm lâm sàng của 68 bệnh nhân nằm viện giống hệt nh các nét lâm
sàng của những trờng hợp mắc SXHD ở các nớc khác trong vùng đà đợc xác
minh về mặt virus học. Tiếp đó, năm 1969, đà có dịch lớn xảy ra ở 19 tỉnh,
thành phố miền Bắc [23]. Theo Trơng Uyên Ninh và CS [27]: Năm 1976 có 11
tỉnh thì đến 1987 lên đến 17 tỉnh thành miền Bắc có SD/ SXHD.
Miền Nam Việt Nam, dịch SXHD đợc mô tả đầu tiên vào năm 1960 với 60
bệnh nhân tử vong. Tiếp theo, từ tháng 6 đến tháng 10 năm 1963, có 331 bệnh
nhân nhập Viện và tử vong 116 trờng hợp do virus Dengue type 2 đà đợc
Halstead ghi nhận. Sau đó, liên tục năm nào cũng có bệnh nhân thờng xảy ra
hàng năm ở các tỉnh, thành phố đông ngời, miền đồng bằng châu thổ và các
vùng ven biển. Bệnh đà lan rộng đến các thị xÃ, thị trấn, huyện lỵ miền núi, trên
các trục đờng giao thông chính liên tỉnh. Số mắc trung bình hàng năm từ

50.000 - 100.000 ngời. Trong giai đoạn 1980-1989, SD/ SXHD có tỷ lệ chết
đứng đầu: 0,84/100.000 dân. Từ 1985-1989 tỷ lệ mắc cao thứ ba trong các bệnh
truyền nhiễm: 201,5/ 100.000 dân, sau hội chứng cúm và ỉa chảy [9]. Theo Lê
Hồng Hinh và CS [10] thì SD/ SXHD lµ mét trong 10 bƯnh trun nhiƠm cã tỷ
lệ mắc và chết cao nhất ở Việt Nam (1994).

11


1.2. ViruS Dengue

M
E
Lipids từ vật chủ

Capsid
Hệ gen ssRNA
~ 11 kb

Sợi ARN đơn chứa khoảng 11,000 bazơ
CAP

5’
N.C.R

~ 100 nt

C prM

Vùng cấu

trúc

E

Vùng khơng
cấu trúc

NS

NS

2a 2b

Enzymes liên quan
đến q trình dịch
mã

4a 4b

N.R.
650

3

NS

: NS2B/NS3 serine protease complexe
: Furin-like Golgi protease
: ER signalases

H×nh 1.4. H×nh th¸i cÊu tróc cđa virus Dengue
Vïng NS1..NS5: Khu vùc cã cÊu tróc gièng c¸c virus thc hä Flaviviridae
(ChiÕm >50% sè lợng nucleotid trong chuỗi ARN)
Vùng C-prM-E: Khu vực có cấu trúc riêng biệt (Khu vực mở)
1.2.1 Đặc điểm hình thái vµ cÊu tróc
Virus Dengue thc hä Flaviridae, gièng Flavivirus bao gåm 4 type huyÕt
thanh lµ Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4. Virus Dengue hình khối cầu có
đờng kính khoảng 40-50 nm, chứa một sợi ARN đơn-dơng (khoảng 10200
nucleotide). Cũng nh các Flavivirus kh¸c virus Dengue cã mét líp vá

12


(envelope) bản chất là glycoprotein-lipit bao quanh màng protein, lớp vỏ này bắt
nguồn từ màng tế bào vật chủ (Hình 1.4). Ngoài ra nucleocapsid có cấu trúc đối
xứng 20 mặt. Hạt virus có hệ số lắng khoảng 175S đến 215S. Tỷ trọng xác định
bằng ly tâm gradien sacarosa khoảng 1.19 g/cm3. Tỷ lệ này có thể thay đổi đôi
chút do c¸c kü tht tinh chÕ [25]

1.2.2 Genome cđa virus
Virus Dengue có hệ gen của Flavivirus điển hình. Genome là một sợi ARN đơn,
dơng có chiều dài xấp xỉ 10200 ribonucleotit. Hệ gen chứa một khung đọc mở
mà hoá thành một chuỗi polyprotein duy nhất. Chuỗi này, sau đó sẽ đợc phân
cắt bởi các enzyme của tế bào vật chủ và các enzyme của virus thành 10 phân tử
protein chức năng, bao gåm 3 protein cÊu tróc vµ 7 protein phi cÊu tróc. Genome
cđa virus Dengue cã cÊu tróc ph©n bè của các gen theo thứ tự nh sau: 5-CpreM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3 (Hình 1.5).

Hình 1.5. Cấu trúc bộ gen của virus Dengue

- Đầu 5 không mà hoá dài khoảng 100 nucleotit.

- Đầu 5 không mà hoá dài khoảng 100 nucleotit, đợc metyl hoá đảm
bảo sự bền vững cho vật liệu di truyền. Đầu 3 (không đợc polyadenin hoá)
không mà hoá dài khoảng 400 nucleotit.

13


- Khoảng một phần t chiều dài của genome tính từ đầu 5 mà cho các
protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M), protein vỏ (E). Đoạn gen này
đà đợc hiểu rõ và đà đợc giải trình tự. Đoạn này chứa nhiều vùng đặc hiệu loài
và đặc hiệu type. Ngời ta dựa vào các vùng đặc biệt này để phân biệt cấu trúc
gen của các virus trong nhóm và các type virus trong loài.
-Phần còn lại của genome mà ho¸ cho 7 protein phi cÊu tróc thùc hiƯn c¸c
chøc năng sinh học xác định vòng đời của virus. Chức năng của các protein này
đến nay vẫn cha đợc biết đầy đủ.
Khoảng 1/ 4 chiều dài của genome tính từ đầu 5 (khoảng hơn 2000
nucleotid) mà hoá cho các protein cấu trúc. Đoạn gen này chứa nhiều vùng
quyết định kháng nguyên quan trọng góp phần đánh giá đặc hiệu type. Tính chất
đặc trng của vùng này cho phép phân biệt cấu trúc gen của các virus trong
nhóm và trong cùng type huyết thanh. Hiện nay đà phân biệt đợc 4 type huyết
thanh của virus Dengue gây bệnh là: virus Dengue type I (D1), virus Dengue
type II (D2), virus Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4). Về
phơng diện kháng nguyên , cả 4 type huyết thanh này đều có liên quan chặt chẽ
với nhau và có phản ứng chÐo nhau [6]. Khi c¬ thĨ nhiƠm mét trong bèn type
virus Dengue, cơ thể sẽ sinh miễn dịch đối với type virus đó trong một thời gian
dài nhng không có tác dụng miễn dịch đối với các type còn lại. Điều này giải
thích tại sao một ngời có thể nhiễm cả bốn type virus trong suốt cuộc đời [12,
25].
ã Protein cÊu tróc
Bao gåm protein lâi (C), protein vá (E), protein mµng (M).

+ Protein lâi (C) lµ protein cã kÝch th−íc nhỏ và là thành phần cơ
bản tạo nên lõi nucleocapsit cđa virus.
+ Protein vá (E) cã ngn gèc tõ mµng tế bào chủ, đợc glycosyl
hoá ở pH thấp, mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngng kết
hồng cầu và tơng tác với các thụ thể gây ra các triƯu chøng cđa SD/SXHD.

14


+ Protein màng (M) Có hai dạng phụ thuộc vào ®é sinh tr−ëng cđa
virus bao gåm M cã khèi l−ỵng phân tử 8 kDa và pre_M có khối lợng phân tử
19 23 kDa.
ã Protein phi cấu trúc
Chức năng của nhóm protein này cha đợc biết một cách đầy đủ. Các
chức năng sinh học này xác định vòng đời của virus . Cấu trúc đoạn gen này khá
giống nhau ở các type virus Dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhân gây
lên các phản ứng chéo nhau trong chẩn đoán huyết thanh học.
+ NS1 là glycoprotein ở dạng chất tiết hoặc không tiết, có thể giữ vai
trò sao chép ban đầu
+ NS2 có thành phần là các enzyme quan trọng trong việc sao chép
ARN, helicase và ARN triphotphatase tạo thành cấu trúc đầu 5, protease để
phân cắt polyprotein và liên kết với màng.
+ NS5 thành phần là các enzyme polymerase phụ thuộc ARN có chức
năng phiên mà DNA và enzyme methyltransferase metyl hoá đầu 5.
+ Ngoài ra còn có các vị trí của NS2A, NS2B, NS4A, NS4B. Các
protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vòng đời của
virus [12].

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chÕ g©y bƯnh cđa virus Dengue

15


Flaviviri
Hạt
virut
on
Plasma membrane

E
n
d
os
o
m
e

Các nhân tố gắn và thụ thể

H
H

+

H

+

H+

+

H

RCs

H+

+

H

H+

H

+

> 20 h p.i.

+

Bộ máy
Golgi

3-10 h p.i.

+-

dạng sao chép

-

RCs
dsRNA

RF

nhân

NS1

prME

+

IR
+

+
>15 h p.i.
NC

Endoplasmic reticulum

H×nh 1.6. Cơ chế gây bệnh của virus Dengue
Sau khi bám vào tế bào chủ, nhờ liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế
bào chủ thích hợp là Fc và C3, virus Dengue xâm nhập ngay vào tế bào theo cơ
chế thực bào. Tại vùng có pH thấp, hình dạng của virus bị biến đổi, xảy ra quá
trình dung giải vỏ protein E, ARN virus đợc giải phóng vào trong bào tơng.
ARN virus hoạt động nh một mARN nhờ enzyme polymerase của tế bào chủ

trực tiếp dịch mà thành polyprotein. Hoạt động này diễn ra trong tế bào chất
vùng gần nhân và đợc sự hỗ trợ của mạng lới nội chất. Để sao chép genome
của mình, virus phải tạo một sợi ARN âm bổ sung với sợi đơn dơng của mình.
Quá trình này đợc xúc tác bởi một protein lµ replicase vµ enzyme ARN
polymerase cđa tÕ bµo chđ, sau đó ARN sợi đơn âm này sẽ đợc sử dụng nh
một sợi khuôn để tổng hợp ra một bản sao mới của sợi dơng. Khi các protein
capsit đợc tổng hợp đủ, chúng tập hợp lại thành một cấu trúc rỗng gọi là
procapsit, sợi ARN dơng đi vào cấu trúc này và kết hợp thành nucleocapsit.

16


Các nucleocapsit này di chuyển đến màng tế bào chất nhờ bộ máy Golgi, sau đó
chúng di chuyển đến mặt trong của màng và đợc bao bọc bởi màng. Các hạt
virus trong một tế bào đợc hình thành và giải phóng ra ngoài do tế bào chủ bị
huỷ hoại. Các nucleocapsit cã mµng bao chÝnh lµ mµng sinh chÊt cđa tế bào chủ
cũ và các virion mới có thể sử dụng các bao màng này để hoà nhập với màng
của tế bào chủ mới (Hình 1.6).

ở trong cơ thể, virus Dengue tăng sinh trong các đại thực bào. Khi cơ thể bị
nhiễm virus Dengue type khác thì những kháng thể có sẵn trong cơ thể không có
khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nên không trung hoà đợc kháng
nguyên của virus. Virus xâm nhập vào bạch cầu đơn nhân, số lợng bạch cầu
đơn nhân to tăng lên. Hoạt hoá các CD4, CD8, lympho độc tế bào. Các lympho
T hoạt hoá giải phóng ra nhiều cytokinin, các bạch cầu đơn nhân to nhiễm virus
bị ly giải do đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Xuất hiện thoát huyết
tơng và xuất huyết [15]. Theo thống kê có đợc từ Tổ Chức Y Tế Thế Giới thì
cả bốn type virus đều có thể gây SD, SXHD và shock Dengue.

1.2.4. Đặc điểm kháng nguyên

Virus Dengue mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngng kết
hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [15]. Virus
Dengue có nhiều kháng nguyên, trong đó có kháng nguyên đặc hiệu type, kháng
nguyên chung của phân nhóm và của nhóm, dựa vào sự khác biệt giữa các đặc
điểm quyết định kháng nguyên ngời ta phân chia virus Dengue thành 4 type
khác nhau tõ virus Dengue type I (D1) ®Õn virus Dengue type IV (D4). C¶ 4
type hut thanh cđa virus Dengue rất gần nhau về phơng diện kháng nguyên
nhng khác nhau ở chỗ có một phần miễn dịch chéo. Virus Dengue còn có
chung một số đặc điểm kháng nguyên với một số Flavivirus khác. Kháng
nguyên của virus Dengue khu trú ở đại thực bào phổi, lách, gan, tuyến ức, các tổ
chức da và bạch cầu đơn nhân. Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của
virus là kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên ngng kết hồng cầu và kháng
17