KN bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Sắc ký lỏng hiệu năng cao
High performance liquid
chromatography-HPLC

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh
của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance
Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký
lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát
triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay
phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao
nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích
.Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm
đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc . Và nó
hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần
cho phép định tính và định lượng .

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


1 - Khái niệm

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách

trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã
được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với
các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) .

2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký
và lọai sắc ký .
• Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận
hoặc pha đảo .
• Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion.
• Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết .
• Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột
,chúng ta cần có một pha động .
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp
chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các chất
A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết
định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các
tương tác .
Chất phân tích A+B+C
F1
Pha tĩnh

F2

F3

Pha động

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa
rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (
F1) .và ngược lại .
Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực
F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định .còn F3 là
yếu tố ảnh hưởng không lớn .
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo của
pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột .

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết
quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau
và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột . (như hình dưới đây )

Pha động

Thời gian

A

B

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


3 - Phân loại sắc ký :
Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loại như sau :
Sắc ký hấp phụ :
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh
đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo
chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động
học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ :
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động
không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha
động phân cực .
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các
chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân
cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau ....Hiện
nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha
đảo ( RP )
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị
tương ứng như sau :
L1 : RP 18
L7 : RP 8
L3 : Si 60

Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m
Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m
Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m

Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH2,CN . . vv

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Kết quả của quá trinh tách các chất được Detector phát hiện
ghi thành sắc ký đồ
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


to : Thời gian lưu chết
t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B
tr1 : Thời gian lưu chấtA tr2 : Thời gian lưu chất B
tr2
tr1

t’r1
to

t’r2

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm
mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị
cực đại.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì
thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã
chọn .Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính
các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động
+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào
pH của pha động .
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Trong một phép phân tích nếu Tr nhỏ quá thì sự tách kém
,còn nếu Tr quá lớn thì peak bị giãn và độ lặp lại của Peak
rất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều
vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất, độ chính xác
của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta
dựa vào các yếu tố trên đã trình bày .
4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor

K’ = ( Tr - t0)/ t0
Nếu K’ nhỏ thì Tr cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu K’
lớn thì Peak bị giãn . Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối
ưu .
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:

4.3 - Độ chọn lọc  :
Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi
02 chất A ,B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng
tách,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc  .

 = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A
với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

= 1.02

= 1.16

= 1.20

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


4.2 Số đĩa lý thuyết N:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp
pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một
khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được
thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha
động .
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :
+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt phatĩnh
+ Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động
+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột .

Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng
định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được
xác định.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


4.2 Số đĩa lý thuyết N:

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau :
N = 5,54 ( Tr / W0,5)2
Tr : Thời gian lưu của chất phân tích .
W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak .
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là
vừa đủ .

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên
một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 02 Peak cạnh nhau phải
được tính theo công thức sau:
R= 2( t’RB - t’RA)/ (wA + wB)
Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gauss) thì độ phân giải tối thiểu
để 02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp
Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak
sẽ không chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng R theo 03 cách sau:
*
Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động

(Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đổi cường độ ion nếu là
IE - HPLC ....)
*
Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc
cột có kích thước nhỏ hơn.
*
Làm tăng độ chọn lọc  bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với
quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động .

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


• Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn
nhiều pha động ,độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta
có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương
trình Gradient dung môi .
• Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình
Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải
tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng
các yêu cầu trong quá trình phân tích .

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên
sắc ký đồ thu được .
T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại điểm 1/10 chiều cao
Peak :

T = a/b
a b

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan
tâm đến hệ số không đối xứng T,

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


• Khi T  2.5 thì phép định lượng được chấp nhận
• Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định, vì vậy phép định lượng
cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peak cân đối hơn theo các
cách sau :
+ Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến Detector
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng
lên
+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm
thể tích tiêm mẫu

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Hệ thống HPLC

Column

Degasse

Pump

Tiím
mẫu

Detector

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Hệ thống HPLC
Trong đó :
1: Bình chứa dung môi pha động
2: Bộ phận khử khí
3: Bơm cao áp
4: Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5: Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt )
6: Detector ( nhận tín hiệu )
7: Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều
khiển hệ thống HPLC.
8: In dữ liệu .

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Hệ thống HPLC
1. Bình đựng dung môi
- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường dung môi vào đầu
bơm cao áp .Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng
1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04
đường là 100 % .

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 04
đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 03 và
02 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn,hệ
pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định .
Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải
Gradient dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn .
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Hệ thống HPLC
2. Bộ khử khí Degasse :

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại
trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà
dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau
đây sẽ xảy ra
Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ
làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi .
Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết
được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (Bị Error) khi
đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động .
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích
sai .
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Hệ thống HPLC
3 Pump Cao áp :
-Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia
tách sắc ký .Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 30006000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump

phải tạo dòng liên tục .Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999
ml/phút .(hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên
đến 1200 bar)
-Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất
tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút .
-Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt .
Hiện tại bơm có 2 Piston để thay phiên nhau đẩy dung môi
liên tục .

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email: