KN bằng phương pháp sinh học

KN bằng phương pháp sinh học
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Nội dung
1. Phương pháp thử trên động vật
2. Phương pháp thử trên vi sinh vật.
3. Xác định hoạt lực kháng sinh

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Chất chuẩn





Trong thử nghiệm sinh học chất chuẩn là một yếu tố quan
trọng để đánh giá chất lượng chất thử. Chất chuẩn được
chia làm hai loại:
Chất chuẩn gốc: là những chất đồng nhất có độ tinh khiết
cao. Chất chuẩn gốc thường được làm ở các viện nghiên
cứu quốc gia hoặc quốc tế riêng về chất chuẩn sinh học.
Chất chuẩn thứ cấp: cũng là chất có độ tinh khiết cao, có
hoạt tính sinh học được xác định theo chất chuẩn gốc
quốc tế tương ứng.
Chất chuẩn phải được bảo quản trong các ống thuỷ tinh ở
nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường ở nhiệt độ < 5oC)
trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:

Đánh giá kết quả
Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo
dài và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng
của sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, các điều
kiện thử nghiệm. Các yếu tố này thường không ổn
định. Vì vậy kết quả thử nghiệm sinh học phải được
đánh giá bằng toán thống kê. Độ chính xác của phép
thử được thể hiện bằng giới hạn tin cậy.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Phương pháp thử trên động vật
Nguyên tắc
Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động vật dựa trên sự đáp
ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể

một liều lượng theo quy định của từng thí nghiệm để đánh giá chất
lượng của chế phẩm cần thử.
Động vật thí nghiệm
Động vật dùng trong thí nghiệm phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống,
khoẻ mạnh không nhiễm bệnh, không có thai và được nuôi dưỡng đầy
đủ. Mỗi thí nghiệm có nhu cầu khác nhau về giống, trọng lượng, tuổi của

động vật. Chất lượng của động vật quyết định độ chính xác của phép
thử.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:

Thử in vivo và in vitro

Thử nghiệm được thực hiện trên cơ thể động vật sống gọi là
thử in vivo. Người ta dựa trên các thông số như nhiệt độ cơ
thể, nhịp tim, điện tâm đồ, điện não đồ, sự thay đổi huyết áp,
phản xạ hệ thần kinh hoặc tỷ lệ sống, chết của động vật thí
nghiệm… để đánh giá tác dụng và chất lượng của thuốc.
Phép thử có thể được tiến hành trên các cơ quan cô lập của
động vật, như tim, tử cung, ruột, máu… gọi là thử in vitro.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Liều (Dose)
Liều là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho từng mục đích thí
nghiệm. Ví dụ: Liều LD0, LD50, LD100, MLD, liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt.

Các thử nghiệm trên động vật được áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc
Trong các dược điển thường có các thử nghiệm sau đây được thực hiện bằng các phép
thử trên động vật như:
•

Thử độc tính bất thường

•

Thử chất hạ huyết áp

•

Thử chất gây sốt

•

Định lượng các hormon: gonadorelin, corticotrophin, insulin, oxytocin, menotrophin, ...

•

Kiểm tra tính an toàn của vaccin và sinh phẩm.

•

Xác định hiệu lực của các vaccin và antitoxin.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Phương pháp thử trên vi sinh vật
1. Đại cương vi sinh vật
2. Môi trường nuôi cấy

3. Thử vô trùng
4. Thử giới hạn vi sinh vật

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Vi khuẩn (bacteria)

Việc phân loại theo các nhóm dựa trên hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram
và khả năng hô hấp của chúng.
-Theo hình thể:
+ Cầu khuẩn (Coccus): Vi khuẩn hình cầu có thể đứng riêng rẽ (Micrococcus), thành
từng đám (Staphylococcus), hoặc chuỗi (Streptococcus), hay xếp thành từng đôi
(Diplococcus).
+Trực khuẩn (Bacillus): Vi khuẩn hình que ngắn đứng riêng lẻ hay thành chuỗi
(Bacillus anthracis) hoặc hình que hai đầu tròn (Escherichia coli).
+Xoắn khuẩn (Spirillum): Vi khuẩn hình lò xo như: Treponema Pallidum.
+Phẩy khuẩn (Vibrio): Vi khuẩn hình dấu phẩy như Vibrio cholerae.
-Theo tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram.
+Vi khuẩn có màu tím sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram +
+Vi khuẩn có màu đỏ sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram –
-Theo đặc tính của quá trình hô hấp:
+Sử dụng oxy tự do trong quá trình hô hấp: Vi khuẩn hiếu khí.
+Phát triển được cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, có quá trình hô hấp nitrat: vi
khuẩn kỵ khí không bắt buộc.
+Chỉ sống trong điều kiện kỵ khí, có quá trình hô hấp sulfat: Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi tế bào. Sự phân
chia tế bào xảy ra rất nhanh. Trong điều kiện môi trường thích
hợp và không có các yếu tố kìm hãm thì một tế bào vi
khuẩn sau 6 giờ có thể sinh ra 250.000 tế bào mới. Tuy
nhiên, sự nhân lên của vi khuẩn không phải là vô tận, nó còn

phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong môi trường nuôi cấy, sự
sinh sản của vi khuẩn sau một thời gian nhất định sẽ bị ngừng

lại vì nhiều nguyên nhân như: thức ăn bị hết dần, hoặc vi

khuẩn có thể tiết ra những chất kìm hãm sự phát triển
của chúng.
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Vi nấm (Microfungi)
Nấm men (Yeast):
 Nấm men có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng nẩy chồi. Tế
bào nấm men có kích thước, hình dạng khác nhau tuỳ loài. Chúng có
thể hình cầu, bầu dục, hình quả chanh, hình ống…
 Khuẩn lạc nấm men bao gồm nhiều cá thể thường thuộc một loài phát
triển từ một cá thể mẹ tạo thành một khối. Khuẩn lạc nấm men thường
to hơn khuẩn lạc vi khuẩn, bề mặt có nếp nhăn hoặc trơn nhẵn,

không tạo sợi.
 Nấm men được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm như làm
bánh mỳ, bia, rượu… Nhưng nhiều nấm men gây bệnh hoặc làm hỏng

thực phẩm, thuốc.
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Nấm mốc (Mold):
- Nấm mốc có cấu tạo sợi, sinh sản bằng bào tử, sống hoại sinh, chúng thường
phát triển trên bề mặt cơ chất dưới dạng những lớp hình sợi, mạng nhện hoặc khối sợi
bông. Sợi nấm rất nhỏ, đường kính trung bình 5mm, chiều dài có thể vài chục centimet.

Sợi nấm có vách ngăn hoặc không có vách ngăn. Toàn bộ sợi nấm và các nhánh

phát triển từ một bào tử nấm rồi đan kết nhau thành một khối gọi là hệ sợi nấm.
-

Trên môi trường thạch nuôi cấy, hệ sợi nấm phát triển thành một khối có tiết diện

hình tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc. Khuẩn lạc được đặc trưng bởi màu sắc của

sợi nấm và của bào tử. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt, dạng hạt, dạng sợi hoặc
xốp…
- Nấm sinh sản bằng bào tử: Bào tử vô tính hoặc bào tử hữu tính . Sự sinh sản vô
tính và hữu tính luôn đan kết nhau trong quá trình sinh trưởng của nấm. Vì vậy, nấm
phát triển rất nhanh trên bề mặt các cơ chất. Nấm mốc thường gây ra những biến đổi
về màu sắc, mùi vị, chất lượng của thuốc. Một số sinh các độc tố (Mycotoxin) có hại
cho người và động vật.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối
với quá trình phát triển của vi sinh vật
Nhiệt độ:

•

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất đối với đời sống vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh
vật có một giới hạn nhiệt độ phát triển thích hợp. Nói chung đối với vi sinh
vật, nhiệt độ phát triển thường từ 15 – 45oC.

•

Ở nhiệt độ cao sẽ làm thay đổi quá trình trao đổi chất của vi sinh vật,

vi sinh

vật bị chết. Các tế bào sinh dưỡng thường bị chết ở nhiệt độ 60oC/20- 30
phút.
•

Các bào tử chỉ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 120oC/ 30 – 40 phút. Tính chất này

được ứng dụng trong việc tiệt trùng. Nhiệt độ thấp chỉ có tác dụng kìm hãm sự
phát triển của vi sinh vật (trừ vi sinh vật ưa lạnh).

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Độ ẩm:
Hầu hết các quá trình sống của vi sinh vật có liên

quan đến nước. Khi thiếu nước xảy ra hiện tượng
loại nước khỏi tế bào vi sinh vật, trao đổi chất bị
giảm, tế bào sẽ chết. Vì vậy, để bảo quản dược

phẩm, dược liệu tránh khỏi tác động của vi sinh vật
cần có một giới hạn độ ẩm nhất định.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Ánh sáng:

•

Ánh sáng mặt trời gồm các tia bức xạ như: tia tử ngoại, hồng ngoại, tia
gamma có tác dụng phá huỷ tế bào vi sinh vật, đặc biệt là tia tử ngoại. Bức

xạ UV bước sóng khoảng 260 nm, có tác dụng diệt khuẩn mạnh nhất.
Dưới ảnh hưởng của tia UV, vi sinh vật bị chết hoặc đột biến tuỳ theo liều
lượng.
•

Để ngăn ngừa tác hại của vi sinh vật đối với thuốc các tác nhân vật lý trên
cần được vận dụng trong quá trình sản xuất và bảo quản dược
phẩm, nhằm hạn chế tối đa số lượng vi sinh vật gây nhiễm ban đầu. Đồng
thời các chế phẩm dược phải được quy định giới hạn vi sinh vật cho phép.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường gồm 3 loại:
•

Môi trường tự nhiên: nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật hay

thực vật (như cao thịt, cao men, pepton, tinh bột…). Thành
phần có thể thay đổi tuỳ theo nguồn gốc nguyên liệu.
•

Môi trường tổng hợp: bao gồm các hoá chất thuần khiết
đã được quy định và thường hoà tan trong nước.

•

Môi trường bán tổng hợp: trong thành phần môi trường có cả
các nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Khi pha chế môi trường cần tiến hành qua 6 bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ hoá chất:
Dụng cụ pha chế môi trường tốt nhất là bằng men hoặc thuỷ tinh. Các dụng cụ phải
rửa sạch, hoặc tiệt trùng nóng trước khi sử dụng. Nguyên liệu pha chế môi trường
phải đảm bảo chất lượng, hoá chất phải tinh khiết. Nếu là các dạng bột hoặc tinh thể
phải khô, không đổi màu, không chảy nước.
Bước 2: Cân đong nguyên liệu:
Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là những hoá chất hoặc
nguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối mật, sắt…) phải được cân bằng
cân phân tích.
Bước 3: Hoà tan nguyên liệu:

Thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi trường. Các hoá chất
được hoà tan nóng hoặc lạnh tuỳ theo tính chất của chúng. Môi trường không có
thạch nên hoà tan lạnh hoặc nóng nhẹ. Môi trường có thạch cần đun cho thạch tan
hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Bước 4: Điều chỉnh pH:

Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ 45 - 50oC để pH ít bị thay đổi sau
khi tiệt trùng. Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N thường được sử dụng để điều chỉnh
pH. Sau khi điều chỉnh pH, cần bổ sung nước cho đủ thể tích quy định.
Bước 5: Làm trong môi trường
Các môi trường lỏng (bao gồm các chất hoà tan) phải trong để dễ quan sát sự phát triển của vi
sinh vật. Sau khi hoà tan các chất, nếu môi trường đục cần phải lọc qua vải gạc hoặc giấy.

Bước 6: Đóng ống tiệt trùng:
Môi trường được cho vào ống nghiệm bình nón hoặc bình cầu, tuỳ theo yêu cầu thí
nghiệm. Khi đóng ống, không được để môi trường dính vào miệng ống hoặc bình.
Môi trường cần phải được tiệt trùng ngay sau khi đóng gói. Nếu để lâu, tạp khuẩn sẽ phát triển
làm hỏng môi trường.
Các môi trường thông thường được tiệt trùng 110oC/30 phút hoặc 120oC/ 20 phút.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Các phương pháp tiệt trùng
Tiệt trùng bằng nhiệt khô:
•

Phương pháp này dùng để tiệt trùng các dụng cụ thí
nghiệm bền với nhiệt như bông, băng, vải, gạc, dụng cụ
thuỷ tinh…

•

Điều kiện tiệt trùng là: 180oC/ 30 phút hoặc 170oC/ 1
giờ, hoặc 160oC/2 giờ.

•

Các dụng cụ thuỷ tinh để đóng môi trường phải được
tiệt trùng khô trước khi dùng.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Tiệt trùng bằng hơi nước:
Phương pháp dùng nhiệt ướt thường được dùng để tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các
dụng cụ phẫu thuật.

- Môi trường thường được tiệt trùng bằng nồi hấp ở 121oC/ 15 phút. Các môi trường dễ bị
hỏng bởi nhiệt như môi trường có đường, sữa, bia, máu, albumin… cần tiệt trùng ở nhiệt độ
thấp bằng các phương pháp sau:
- Tiệt trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall): Môi trường được hấp 3 - 4 lần ở nhiệt độ
không quá 100oC trong 30 - 40 phút, cách nhau 24 giờ. Giữa hai lần hấp cho môi trường
vào ủ ở 28 - 32oC/ 24 giờ cho bao tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm sẽ bị tiêu diệt
ở lần hấp tiếp theo.

- Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur): Đun cách thuỷ môi trường 60oC/ 30 phút,
hoặc 73oC/ 15 phút sau đó làm lạnh đột ngột dưới 10oC. Phương pháp này không diệt được
bào tử.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Phương pháp lọc:
Phương pháp lọc được dùng để tiệt trùng các
chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt. Cho chất lỏng chảy

qua màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22mm.

Phần chảy qua phễu được đựng trong các dụng
cụ vô trùng. Thiết bị lọc và màng lọc phải được
tiệt trùng trước khi dùng.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Phương pháp dùng tia bức xạ:
•

Tia tử ngoại (UV) được dùng nhiều nhất để tiệt trùng
các buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật.

•

Đèn tử ngoại phải được chiếu trực tiếp, thẳng góc với
nơi làm thí nghiệm và liều lượng chiếu phải đủ với diện

tích buồng.
•

Tia UV ít có tác dụng diệt nấm, vì vậy khi khử trùng
buồng pha chế cần phối hợp thêm phương pháp dùng
hoá chất để khử nấm.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:

Thử vô trùng

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Mục đích
Thử vô trùng nhằm mục đích phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, vi

nấm trong các chế phẩm như dịch tiêm truyền, một số loại thuốc tiêm,
thuốc tra mắt và các dụng cụ y tế mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô
trùng.

Nguyên tắc
Vi sinh vật có trong chế phẩm thử sẽ phát triển trên các môi trường dinh
dưỡng thích hợp, chúng làm đục môi trường lỏng tạo váng trên bề

mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm. Trên môi trường đặc vi khuẩn,
vi nấm mọc thành các khuẩn lạc đặc trưng.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email:


Môi trường
Trong nhiều dược điển thường dùng môi trường Thioglycolat lỏng để
phát hiện vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí và môi trường Casein đậu tương

lỏng để phát hiện vi khuẩn, vi nấm. Tuy nhiên, có thể dùng các môi
trường khác cho thử nghiệm, với điều kiện các môi trường này thích
hợp cho sự phát triển của loại vi sinh vật cần phát hiện. Ví dụ có thể

dùng môi trường canh thang cao thịt - pepton để phát hiện vi khuẩn
hiếu khí; môi trường Wilson - Blair phát hiện vi khuẩn kị khí; môi trường
Sabouraud lỏng cho sự phát hiện vi nấm.

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email: