Nghiên cứu chiết tách và so sánh hoạt tính sinh học của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) giống nhật và giống hàn quốc và bước đầu ứng dụng sản xuất kẹo linh chi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HỒ TRƯƠNG QUỲNH CHÂU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ SO SÁNH
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT
NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)
GIỐNG NHẬT VÀ GIỐNG HÀN QUỐC VÀ
BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT KẸO LINH CHI

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng - Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HỒ TRƯƠNG QUỲNH CHÂU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ SO SÁNH
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT
NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)
GIỐNG NHẬT VÀ GIỐNG HÀN QUỐC VÀ
BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT KẸO LINH CHI

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Đà Nẵng - Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kì công trình nào khác
Người cam đoan

Hồ Trương Quỳnh Châu


NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ SO SÁNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT NẤM LINH
CHI (GANODERMA LUCIDUM) GIỐNG NHẬT VÀ GIỐNG HÀN QUỐC VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG
SẢN XUẤT KẸO LINH CHI
Lê Lý Thùy Trâm, Hồ Trương Quỳnh Châu
TÓM TẮT
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một dược thảo quý; đã được sử dụng như vị thuốc trong điều trị rất
nhiều bệnh. Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) trên thị trường hiện nay có nhiều nguồn gốc khác nhau như
Linh chi giống Nhật, Linh chi giống Hàn, Linh chi giống DT…tạo sự đa dạng về lựa chọn cho người sử dụng
nhưng cũng đặt ra vấn đề về so sánh chất lượng giữa các giống nấm. Xuất phát từ thực tế đó, nhóm nghiên cứu
đã lựa chọn Linh chi giống Hàn và Linh chi giống Nhật để nghiên cứu chiết tách hàm lượng polysaccharide tổng
từ quả thể nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) sử dụng dung môi rượu 400 theo phương pháp ngâm chiết kết hợp
rung siêu âm, đồng thời đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa của cao chiết thu được từ hai mẫu nấm
Linh chi này. Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện chiết tách polysaccharide tổng từ quả thể nấm Linh chi đạt
hiệu suất tối ưu khi chiết với tỉ lệ rắn/lỏng 1/15, thời gian chiết là 90 phút. Bên cạnh đó, khả năng kháng khuẩn

của cao chiết nấm Linh chi giống Hàn và giống Nhật được xác định với 4 chủng vi khuẩn (Escherichia coli,
Salmonella, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus). Kết quả cho thấy, cả hai cao chiết Linh chi giống Hàn và
giống Nhật đều có khả năng kháng khuẩn với tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Ngoài ra, tác động của cả hai
cao chiết lên vi khuẩn gram dương đều mạnh hơn lên vi khuẩn gram âm.

EXTRACTION AND COMPARISON OF BIOLOGICAL ACTIVITY IN JAPANESE GANODERMA
LUCIDUM AND KOREAN GANODERMA LUCIDUM SPECIES AND THE FIRST APPLICATION FOR
CONTAINER PRODUCTION
ABSTRACT
Ganoderma lucidum (Lingzhi mushroom) is a valued medicinal fungus, used as a medication for prevention
and treatment of various diseases. Currently, because of biodiversity for the choice in consumer, the
commercially available lingzhi mushrooms have been derived from many different sources; for example,
Japanese species, Korean species, DT species, etc. However, it is possible for these differences to lead to the
varies in quality of Ganoderma. According to this, our research group carried out the total polysaccharides
isolation from fruiting bodies in Korean Ganoderma lucidum and Japanese Ganoderma lucidum species by using
40o alcoholic solvent based on ultrasonic- associated leaching method, and this evaluated anti-microbial ability
of the resulted extracts from both sources. More particularly, in order to achieve the extractively optimized
efficiency, the process was ongoing within about 90 minutes, the extraction ratio of solid:liquid = 1:15. Besides,
anti-microbial ability was identified by four main bacterial strains (Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus,
and Staphylococcus aureus). The results of study showed that both Ganoderma lucidum species from Korea and
Japan have had anti-microbial properties against all given bacterium. Furthermore, there have been more
effective of both extracts on Gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria.
Keywords: Ganoderma lucidum, polysaccharide, kháng khuẩn, kháng oxi hóa, Linh chi giống Nhật, Linh chi
giống Hàn


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................. 2

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ...........................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 2
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................2
6. Cấu trúc luận văn .....................................................................................................3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................4
1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P.Karst) ..................4
1.1.1. Vị trí phân loại............................................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ........................................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng ....................................................................................5
1.1.4. Phân bố ..........................................................................................................5
1.1.5. Thành phần hóa học và tác dụng trị liệu của nấm Linh chi.......................... 6
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NẤM LINH CHI .............................................6
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới .........................................................................6
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước .........................................................................10
1.3. CÁC SẢN PHẨM ỨNG DỤNG TỪ NẤM LINH CHI .....................................11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 14
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................15
2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................15
2.1.2. Thiết bị .........................................................................................................15
2.1.3. Hóa chất ......................................................................................................15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................15
2.2.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu .................................................................15
2.2.2. Xác định thành phần một số kim loại nặng .................................................16
2.2.3. Phương pháp Kjeldahl.................................................................................17
2.2.4. Xác định hàm lượng cacbon tổng số ........................................................... 17
2.2.5. Xác định hàm lượng polysaccharide toàn phần ..........................................19
2.2.6. Lựa chọn phương pháp xử lý nguyên liệu ................................................... 21
2.2.7. Phương pháp chiết....................................................................................... 21
2.2.8. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ...................................................................22
2.2.9. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn .................................................... 23

2.2.10. Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa ...............................................24
2.2.11. Phương pháp cảm quan .............................................................................24
2.2.12. Phương pháp xử lý số liệu .........................................................................24
2.2.13. Quy trình sản xuất kẹo Linh chi ................................................................ 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 27
3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ ....................................................... 27
3.2. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU ....................................................... 28
3.3. LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT .............................................................. 30
3.4. LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT ......................................................................31
3.5. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CHIẾT ...................................34
3.6. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ NGUYÊN LIỆU VÀ DUNG MÔI ...36
3.7. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CƯỜNG ĐỘ SIÊU ÂM. ............................. 38
3.8. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TỔNG SỐ CỦA HAI
GIỐNG NẤM LINH CHI .......................................................................................... 39
3.9. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN. .......................................................................40
3.10. HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA ....................................................................42
3.11. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN SẢN PHẢM KẸO LINH CHI ............44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 46
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao)


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

Association of Official Analytical Chemists

COXH

Chống oxy hóa

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

DMSO

Dimethyl sulfoxide

OD

Optical Density

SA

Scavenging Activities

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

VSV

Vi sinh vật

UAE

Ultrasonic-aid extraction


DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

Tên bảng

Trang

1.1

Thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi

6

2.1

Kết quả xây dựng đường chuẩn D-Glucose

20

3.1

Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu

27

3.2

Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi chọn

29

phương pháp xử lý nguyên liệu
3.3

Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi chọn

30

phương pháp chiết
3.4

Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi chọn dung

33

môi chiết
3.5

Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi khảo sát

35

thời gian chiết
3.6

Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi khảo sát tỉ

37

lệ nguyên liệu/dung môi
3.7

Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi khảo sát

39

cường độ siêu âm
3.8

Hàm lượng polysaccharide toàn phần của 2 giống nấm Linh

41

chi
3.9

Đường kính vòng ức chế vi sinh vật

42

3.10

Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hoa của hai cao chiết

44

3.11

Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C

45

3.12

Kết quả đánh giá cảm quan

46


DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu

Tên hình

Trang

1.1

Nấm Linh chi

4

1.2

Quả thể nấm Linh chi

12

1.3

Bột nấm Linh chi

12

1.4

Nước uống Linh chi mật ong

12

1.5

Chiết xuất nấm Linh chi kết hợp đông trùng hạ thảo

12

1.6

Trà Linh chi gừng

13

1.7

Trà Linh chi gạo lứt

13

1.8

Viên uống Linh chi

13

1.9

Serum trị mụn Linh chi

13

1.10

Café Linh chi

13

1.11

Hạt nêm Linh chi

13

2.1

Sơ đồ nghiên cứu

14

2.2

Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

17

2.3

Đường chuẩn dung dịch D-Glucose

21

2.4

Quy trình sản xuất kẹo

25

3.1

Hàm lượng polysaccharide trong 2 giống nấm Linh chi

29

thu được theo 2 phương pháp xử lý nguyên liệu
3.2

Hàm lượng polysaccharide trong 2 giống nấm Linh chi

31

thu được theo 2 phương pháp chiết
3.3

Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

33

thu được theo 2 dung môi chiết
3.4

Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

35

thu được khi khảo sát thời gian chiết
3.5

Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

38

thu được khi khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
3.6

Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

40

thu được khi khảo sát cường độ siêu âm
3.7

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

42


Số hiệu

Tên hình

Trang

Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của cao chiết Linh

44

chi nấm giống Nhật
3.8

chi nấm giống Hàn
3.9

Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của cao chiết Linh

44

chi nấm giống Nhật
3.10

Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của vitamin C

45

3.11

Khuôn làm kẹo Linh chi

47

3.12

Kẹo Linh chi

47


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nấm Linh chi (hay còn gọi là nấm trường thọ, nấm gỗ, nấm Lim…[4]) tên khoa
học Ganoderma lucidum P.Karst, được phân bố ở khắp nơi trên thế giới – đặc biệt tìm
thấy nhiều ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam.

Trong những năm gần đây, nhu cầu người tiêu dùng đang có xu hướng sử dụng
các sản phẩm dược phẩm cũng như mỹ phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên. Nấm Linh
chi có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng làm thuốc hỗ trợ và
điều trị bệnh. Ở Trung Quốc, nấm Linh chi được coi là “thần dược” giúp kéo dài tuổi
thọ, ngăn ngừa lão hóa, tăng sức dẻo dai cho cơ thể [20]. Các nghiên cứu khoa học
cũng đã chứng minh các chế phẩm từ Linh chi có tác dụng làm tăng hệ thống miễn
dịch, chống các tế bào lão hóa, khử các gốc oxy tự do, sửa chữa cấu trúc ADN bị hỏng
[20]; ngoài ra còn có khả năng đào thải chất phóng xạ, hạn chế và loại trừ những tổn
thương phóng xạ ở mô và tế bào [19]. Chính vì những tính năng và công dụng phong
phú của Linh chi đối với sức khỏe mà nó ngày càng được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên,
nguồn nấm thu hái trong tự nhiên còn rất hạn chế, không thể đáp ứng được nhu cầu sử
dụng ngày càng tăng cao.
Hiện nay, nhờ sự phát triển của khoa học kĩ thuật kết hợp với các biện pháp nông
nghiệp kĩ thuật cao, Việt Nam đã nghiên cứu trồng thành công nhiều giống nấm Linh
chi khác nhau, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của người dân. Sự đa dạng về chủng loại
nấm như Linh chi giống Nhật, Linh chi giống Hàn, Linh chi giống DT tạo sự phong
phú về lựa chọn nhưng cũng đặt ra câu hỏi về so sánh chất lượng giữa các giống nấm.
Đặc biệt hơn, những thông tin khoa học liên quan đến so sánh hoạt tính sinh học của
các giống nấm Linh chi trên thị trường Việt Nam cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình chiết tách các chất trong nấm Linh chi còn rất hạn chế. Xuất phát từ thực tế
đó, chúng tôi quyết định chọn hai giống nấm Linh chi phổ biến và được ưa chuộng
nhất trên thị trường hiện nay là Linh chi giống Nhật và Linh chi giống Hàn để tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và so sánh hoạt tính sinh học của
cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) giống Nhật và giống Hàn Quốc và
bước đầu ứng dụng sản xuất kẹo Linh chi”.


2
2. Mục tiêu nghiên cứu.
Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu chính sau:

- So sánh hoạt tính sinh học của Linh chi giống Nhật và Linh chi giống Hàn.
- Ứng dụng sản xuất kẹo Linh chi.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.
- Quả thể nấm Linh chi giống Hàn được thu hái tại xã Vĩnh Ngọc, thành phố Nha
Trang, tỉnh Khánh Hòa. Quả thể nấm Linh chi giống Nhật được thu hái tại Lấp Vò,
Đồng Tháp.
- Nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm.
4. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp hóa lý:
+ Xác định độ ẩm của nguyên liệu: Phương pháp sấy đến khối lượng không
đổi.
+ Xác định thành phần một số kim loại nặng: Phương pháp phổ hấp phụ
nguyên tử.
+ Phương pháp chiết soxhlet.
+ Phương pháp ngâm chiết kết hợp rung siêu âm.
- Phương pháp hóa sinh
+ Xác định hàm lượng nitơ tổng số: phương pháp Kjeldahl.
+ Xác định hàm lượng cacbon tổng số.
- Phương pháp thử hoạt tính sinh học của dịch chiết.
+ Hoạt tính kháng khuẩn: phương pháp khoanh giấy lọc
+ Hoạt tính chống oxy hóa: phương pháp DPPH
- Phương pháp thống kê và xử lý số liệu.
- Phương pháp đánh giá cảm quan.
Các thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 3 lần, các số liệu được xử lý bằng
phần mềm Excel 2007.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học của đề tài
+ Cung cấp thông tin khoa học về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 2
giống nấm Linh chi (Linh chi giống Nhật và giống Hàn).

3
+ Cung cấp các thông số công nghệ của quá trình chiết để thu nhận cao chiết nấm
Linh chi có hoạt tính sinh học.
- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
+ Là cơ sở để tạo nên sản phẩm mới có giá trị dược liệu cao, góp phần đa dạng
hóa sản phẩm, tăng tác dụng phòng và điều trị bệnh của nấm Linh chi.
6. Cấu trúc luận văn
Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị, danh mục tài liệu tham khảo và phụ
lục, trong luận văn gồm có các chương với nội dung như sau:
- Chương 1: Tổng quan tài liệu
- Chương 2: Vật liệu và phương pháp
- Chương 3: Kết quả và thảo luận


4
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P.Karst)
Chi Ganoderma trên thế giới có trên 250 loài. Trong đó, loài được sử dụng nhiều
nhất cho đến thời điểm hiện tại để chăm sóc sức khỏe là nấm Linh chi Ganoderma
lucidum P.Karst [1]
Nấm Linh chi gọi theo tiếng Trung Quốc là Lingzhi, theo tiếng Nhật Bản là
Reishi, ở Việt Nam gọi là nấm Lim, nấm Tiên Thảo hay nấm Trường Thọ…[1], [2]
Trong số rất nhiều tên gọi đó thì theo sách “Thần nông bản thảo” tên Linh chi đã được
chính thức sử dụng [1]
1.1.1. Vị trí phân loại
Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum P.Karst.
Theo hệ thống phân loại của P. Karsten (1881) nấm Linh chi thuộc:

Giới nấm (Fungi).
Ngành nấm đảm (Basidiomycota)
Lớp nấm đảm (Agaricomycetes).
Bộ nấm đa tầng (Polyporales).
Họ nấm Linh chi (Ganodermataceae).
Chi Ganoderma

1.1.2. Đặc điểm cấu tạo

Hình 1.1. Nấm Linh chi

Nấm Linh chi là dạng thể quả, có đặc điểm chung là tai nấm hóa gỗ gồm 2
phần: cuống nấm và mũ nấm [4].
Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường đính lệch, đôi khi đính tâm. Cuống nấm
thường hình trụ, dáng thanh mảnh hoặc mập khỏe, ít khi phân nhánh. Lớp vỏ cuống
màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen bóng, không có lông, phủ suốt trên mặt tán nấm. Mũ nấm khi
non có hình trứng lớn dần có hình quạt. Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè
hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ nấm có vân gợn hình đồng tâm và có tia
rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng chanh, vàng nghệ, vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu, nâu
tím, nâu đen, nhẵn bóng. Thường sẫm màu dần khi già, lớp vỏ nhẵn bóng phủ tràn


5
kín mặt trên mũ, đôi khi có lớp phấn ánh xanh tím. Kích thước tán biến động lớn
từ (2-36) cm, dày (0,8-3,3) cm. Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li
ti, là nơi hình thành và phóng thích bào tử nấm. Bào tử nấm dạng trứng cụt với hai
lớp vỏ, giữa hai lớp vỏ có nhiều gai nhọn nối từ trong ra ngoài. Phần đính cuống hoặc
gồ lên hoặc lõm. Phần thịt nấm dày từ (0,4-2,2 cm), màu vàng kem, nâu nhợt hoặc
trắng kem, phân chia theo kiểu lớp trên và lớp dưới, khi nấm đến tuổi trưởng thành thì
phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm [4].

1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng
Linh chi thuộc lớp nấm đảm, do đó có các đặc điểm như: sợi nấm có dạng ống,
có vách ngăn; các vách ngăn chưa hoàn chỉnh, cho phép nguyên sinh chất di chuyển từ
tế bào này sang tế bào khác; sợi nấm phát triển chia thành nhiều nhánh cái và con [5].
Có 2 dạng hệ sợi nấm: Sợi sơ cấp sinh ra từ bào tử, tế bào có 1 nhân; và sợi thứ cấp là
phối hợp giữa 2 sợi sơ cấp, tế bào có 2 nhân.
Chu trình sống của nấm Linh chi giống như hầu hết các loài nấm khác, nghĩa là
cũng bắt đầu từ các bào tử. Bào tử nảy mầm tạo thành ống mầm. Ống mầm phát triển
thành hệ sợi sơ cấp. Hai sợi sơ cấp phối hợp với nhau tạo thành sợi thứ cấp. Sợi sơ cấp
và sợi thứ cấp mọc xen lẫn nhau tạo thành hệ sợi, hệ sợi phát triển thành mạng sợi
nấm. Khi gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ hạ, độ ẩm tăng) mạng sợi sẽ kết thành hạch
nấm. Ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp hạch nấm sẽ kết thành nụ nấm, sau đó nụ phát
triển chồi, tán và thành quả thể nấm trưởng thành. Mặt dưới mũ sinh ra các bào tử, bào
tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục [6].
1.1.4. Phân bố
Nấm Linh chi là một loài phân bố khắp nơi trên thế giới. Nấm mọc trên gốc, rễ
cây sống và cây đã chết, trên rất nhiều cây gỗ mọc trong rừng, đặc biệt là trên các cây
thuộc bộ Đậu như Lim xanh, Lim vàng…Ở nước ta, có thể tìm thấy nấm Linh chi ở
hầu khắp các tỉnh vùng núi từ Lào Cai đến Lâm Đồng [5]
Nấm Linh chi sinh sản chủ yếu bằng bào tử nằm ở mặt dưới thể quả. Phần có
chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất. Ở Trung
Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam và một số quốc gia khác người ta đã chủ động
nghiên cứu trồng thành công nấm Linh chi trên giá thể nhân tạo nhằm phục vụ mục
đích nghiên cứu khoa học cũng như ứng dụng trong cuộc sống.


6
1.1.5. Thành phần hóa học và tác dụng trị liệu của nấm Linh chi
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của nấm Linh chi đầu tiên được tiến hành
vào đầu thế kỷ 20, khi các nhà khoa học quan tâm đến lớp vỏ láng của nấm và đã phát

hiện các chất như esgosterol, các enzyme là phenoloxidase và peroxidase. Cho đến gần
đây, bằng phương pháp kích hoạt phóng xạ, đã xác định được trên 90 nguyên tố hóa
học trong nấm Linh chi, trong đó hai nhóm được quan tâm nhất là polysaccharide và
triterpenoide. Trong các hợp chất trên thì polysaccharide chứa hàm lượng cao nhất, là
hợp chất quyết định chất lượng của nấm Linh chi. Các hoạt chất chính và tác dụng trị
liệu của nó được thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi
Hoạt tính dược lý

Tên hoạt chất/nhóm chất
Ganodosteron

Giải độc gan

Lanosporeric axit A

Ức chế sinh tổng hợp cholesteron

Lonosterol

Ức chế sinh tổng hợp cholesteron

Compounds I, II, III, IV, V

Ức chế sinh tổng hợp cholesteron

Ganoderans A, B, C

Hạ đường huyết

β– D –glucan

Chống ung thư, tăng cường miễn dịch.

Ganoderic axit R, S

Ức chế giải phóng histamine

Ganoderic axit B, D, F, H

Giảm huyết áp

Lingzhi – 8

Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa miễn dịch

Adenosine và dẫn xuất

Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn cơ, giảm đau

Ganodermadiol

Giảm huyết áp

Ganosporelacton A, B

Chống khối u

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NẤM LINH CHI
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 1994, Sang Yeon Yoon cùng các cộng sự đã công bố kết quả thử nghiệm
của cao chiết nước nấm Linh chi có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram dương và
Gram âm, hoạt tính kháng khuẩn được biểu hiện bằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Trong số mười lăm loài vi khuẩn được thử nghiệm, hoạt tính kháng khuẩn của
Ganoderma lucidum thể hiện mạnh nhất khi thử nghiệm với vi khuẩn Salmonella


7
typhimurium ATCC 14028 (MIC = 0,75 mg/ml). Sau đó, nhóm tác giả còn tiến hành
nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Ganoderma lucidum khi kết hợp với bốn loại
kháng sinh (ampicillin, cefazolin, oxytetracycline, chloramphenicol) và đánh giá sự tác
động qua chỉ số nồng độ ức chế phân đoạn (FICI). Sự kết hợp kháng sinh với cao chiết
Ganoderma lucidum trong cả bốn trường hợp đều dẫn đến tác dụng phụ. Sự tương tác,
hỗ trợ lẫn nhau đã được quan sát thấy khi cao chiết Ganoderma lucidum kết hợp với
cefazolin trong thử nghiệm chống lại vi khuẩn Bacillus subtilis và Klebsiella oxytoca.
[18]
Năm 2004, Qing-Yi Lu và cộng sự đã tiến hành điều tra các tác dụng ức chế hóa
học của Ganoderma lucidum bằng cách sử dụng mô hình tế bào nội mô nhân tạo trong
ống nghiệm (HUC) bao gồm các tế bào HUC-PC và các tế bào MTC-11. Cao chiết
ethanol và cao chiết nước từ quả thể và bào tử của G. lucidum được sử dụng để kiểm
tra sự ức chế tăng trưởng, tình trạng trùng hợp sợi actin trong hai loại tế bào khảo sát.
Kết quả cho thấy rằng cao chiết ethanol có tác dụng ức chế tăng trưởng mạnh hơn so
với cao chiết từ nước. Ở nồng độ 40-80 μg/ml, các cao chiết này tạo ra sự trùng hợp
sợi actin, do đó ức chế sự di chuyển của chất gây ung thư 4-aminobiphenyl ở cả hai
dòng tế bào nghiên cứu [21]
Năm 2009, Liyan Zhao và các cộng sự đã tiến hành chiết xuất, tinh chế và khảo
sát hoạt tính chống ung thư của polysaccharide chiết xuất từ nấm Linh chi. Nhóm
nghiên cứu đã sấy khô quả thể Linh chi ở 500C, cắt thành từng miếng nhỏ và chiết với
95% ethanol trong 24 giờ để loại bỏ tạp chất và các phân tử lipophilic. Tiếp đó, dịch
chiết được cô quay thành cao và chiết 10 gam cao này với 280 ml nước cất bằng sóng

siêu âm của thiết bị JY98 (Công ty Công nghệ sinh học Scientz, Ningbo, Trung Quốc)
trong 17 phút. Dịch chiết nước được ly tâm tại 4500 vòng / phút trong 20 phút để loại
kết tủa. Thu dịch ly tâm và bổ sung ethanol khan, sau đó ủ ở 40C trong 24 h. Sau đó ly
tâm, thu kết tủa và rửa lần lượt bằng các dung dịch etanol, acetone, ether và sấy khô để
thu được polysaccharides thô. Các polysaccharide thô này tiếp tục được cho qua cột
sắc kí Sephadex G-100 thu được hai polysaccharide chính là GL1 và GL2. Các tác giả
tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của GL-1 và GL-2 khi kích hoạt tế bào macrophage
(RAW 264.7) và các hoạt động chống ung thư cho tế bào ung thư vú ở người (MDAMB-231) in vitro được đánh giá bằng xét nghiệm MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -


8
2,5-diphenyl tetrazolium bromide). Các kết quả chỉ ra rằng GP-1 và GP-2 có thể làm
tăng sự gia tăng và hoạt động tế bào của đại thực bào một cách đáng kể và có khả năng
ức chế tế bào ung thư [19]
Năm 2010, Sheng-Quan Huang và các cộng sự khi nghiên cứu xác định điều kiện
tối ưu hóa quá trình chiết polysaccharide của nấm Linh chi với dung môi kiềm bằng
phương pháp phản ứng bề mặt đã chỉ ra rằng các điều kiện tối ưu của quá trình chiết là
nhiệt độ chiết 60,1ºC, thời gian chiết 77,3 phút, nồng độ natri hydroxit (NaOH) 5,1%
và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1: 21.4. Hàm lượng polysaccharide thu được khi chiết
với các điều kiện tối ưu đã nêu trên đạt 8,21% và hàm lượng này cao hơn gấp 5 lần so
với khi chiết bằng nước nóng. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét
và kết quả phân tích thành phần hóa học để chứng minh rằng sử dụng dung môi kiềm
có khả năng phá vỡ cấu trúc các sợi nấm, đẩy nhanh quá trình trích ly polysaccharide.
Tiếp đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm các cao chiết lần lượt ở nồng độ
50mg/kg, 100mg/kg, 200mg/kg trên cơ thể chuột để đánh giá tác dụng của cao chiết
với chức năng miễn dịch của chuột. Kết quả xét nghiệm miễn dịch cho thấy
polysaccharides hòa tan trong kiềm không có tác dụng đáng chú ý đối với thực bào
đơn bào và cơ quan miễn dịch (lá lách, tuyến ức) của chuột suy giảm miễn dịch ở liều
lượng thử nghiệm. Tuy nhiên, với liều thử nghiệm 200mg/kg lại có tác dụng cải thiện
hoạt động tế bào killer tự nhiên. [14]

Cũng trong năm 2010, nhóm tác giả đến từ Khoa Sinh học, trường đại học R.D,
Jabalpur đã tiến hành chiết bột nấm Linh chi trong thiết bị soxhlet lần lượt với các
dung môi ethanol, methanol, axeton và nước cất theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
là 1/10. Dịch chiết được thu hồi bằng phương pháp lọc và đảm bảo duy trì ở nhiệt
độ 400C để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Sau đó, dịch chiết được cô đuổi dung
môi trong thiết bị cô quay chân không Buchi R - 300 Rotavapor, Buchi Co. Germany.
Tiếp theo, các cao chiết Ganoderma lucidum của 4 loại dung môi (40Pg / ml) được thử
hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch đối với sáu loài vi
khuẩn: Escherichia coli (MTCC-443), Staphylococcus aureus (MTCC-737),
Klebsiella pneumoniae (MTCC2405), Bacillus subtilis (MTCC-1789), Salmonella
typhi (MTCC-531) và Pseudomonas aeruginosa (MTCC-779). Kết quả cho thấy cao
chiết axeton thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất với đường kính vòng kháng


9
khuẩn là 31,60 ± 0,10 mm, trong khi vi khuẩn nhạy cảm nhất quan sát được là
Klebsiella pneumoniae (một loại vi khuẩn gây bệnh viêm phổi) [15].
Sau đó một năm, năm 2011, nhóm tác giả người Serbia, gồm Maja Kozarski và
cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng oxi hóa của cao chiết nước polysaccharide từ 4
loại nấm dược liệu Agaricus bisporus, Agaricus brasiliensis, Ganoderma lucidum và
Phellinus linteus. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp FT-IR và bằng các bộ kit
Megazyme β-glucan để xác định hàm lượng α và β-glucans. Từ đó nhận thấy rằng có
sự tương quan giữa hàm lượng glucan với hoạt tính kháng oxi hóa. Đối với cao chiết
polysaccharide của A. bisporus giá trị EC50 > 20 mg/ml, với A. brasiliensis
EC50 = 13,25 mg/ml và thấp nhất đối với G. lucidum EC50 = 7,07 mg/ml. Kết quả của
nghiên cứu này cho thấy rằng chiết xuất polysaccharide nấm dược liệu hoạt động như
chất chống oxy hóa tự nhiên và có đặc tính điều hòa miễn dịch. Chất chiết xuất từ
polysaccharide có thể là nguồn tốt cho sự phát triển của phụ gia thực phẩm chống oxy
hóa. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn thử nghiệm in vitro về khả năng điều hòa miễn
dịch của các cao chiết polysaccharide từ các giống nấm này và nhận thấy các

polysaccharide chiết xuất từ A. bisporus, A. brasiliensis và G. lucidum thể hiện tác
dụng kích thích miễn dịch trên PBMCs hoạt hóa của con người và gây tổng hợp IFN-γ.
[19]
Năm 2014, Min Shi đã chiết xuất polysaccharide từ nấm Linh chi trồng trên bã
đậu nành bằng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm. Các điều kiện chiết tối ưu được
công bố là thời gian chiết 30 phút ở 800C với cường độ siêu âm là 80W và tỷ lệ
nguyên liệu/dung môi là 1/10 cho năng suất thu polysaccharide là 115,47 ± 2,95 mg.
Các kết quả được công bố còn cho thấy polysaccharide chiết xuất từ nấm Linh chi có
khả năng điều hòa miễn dịch bao gồm hiệu ứng kích thích sự gia tăng của đại thực
bào, sản xuất NO, thực bào và bảo vệ chống lại sự can thiệp DNA của DOX [16]
Mới đây nhất, vào năm 2017, nhóm nghiên cứu người Malaysia, đứng đầu là
Ibrahim Alzorqi đã tối ưu hóa hiệu suất chiết polysaccharides từ Ganoderma lucidum
bằng dung môi nước sử dụng phương pháp phản ứng bề mặt (RSM). Nhóm nghiên cứu
đã sử dụng mô hình Box – Behnken (BBD) để đánh giá ảnh hưởng của các biến khảo
sát lên hiệu quả chiết polysaccharides. Các thông số được xem xét để tối ưu hóa điều
kiện chiết là cường độ siêu âm (500–700 W), thời gian siêu âm (45–65 phút) và nhiệt


10
độ (70–90°C). Nhóm nghiên cứu đã đưa ra điều kiện tối ưu để chiết tách
polysaccharide về cường độ siêu âm 590 W, thời gian siêu âm là 58 phút và nhiệt độ
81 ° C. Dựa theo các điều kiện tối ưu này, lượng polysaccharide thu được từ nấm Linh
chi là 52,28mg. Nhóm tác giả còn kết luận rằng các kết quả thu được cho thấy sự phù
hợp của mô hình bậc hai trong việc tối ưu hóa các điều kiện chiết polysaccharides từ
Ganoderma lucidum [13].
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước
Trong nước, hướng nghiên cứu chiết tách cũng như xác định hoạt tính sinh học
của nấm Linh chi cũng có những công trình nổi bật.
Năm 2009, Nguyễn Thị Minh Tú và cộng sự đã tối ưu hóa quá trình chiết các
hoạt chất có hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi bằng mô hình quy hoạch trực giao cấp

một thu được phương trình hồi quy: y = 6,59 + 0,65x1 + 0,07x2 – 0,16x3. Hàm mục tiêu
đạt giá trị cực đại tại nhiệt độ chiết 800C, thời gian chiết 7h, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
là 1/20 và hàm lượng cao chiết thu hồi là 6,91  0,03%. Tiếp đó, nhóm nghiên cứu còn
đưa ra kết quả xác định một số thành phần hóa học của nấm Linh chi như hàm lượng
protein (13,5 %), hàm lượng carbohydrate (22,6%) [9]
Năm 2012, Trần Thị Văn Thi và cộng sự đã chiết xuất cao polysaccharide toàn
phần từ mẫu dược liệu nấm Linh chi Ganoderma lucidum trồng tại Phú Lương, tỉnh
Thừa Thiên Huế. Định lượng polysaccharide toàn phần bằng phương pháp Dubois –
đo mật độ quang dựa trên phản ứng tạo màu với phenol – acid sulfuric dùng DGlucose làm chất chuẩn. Nhóm nghiên cứu đã xác định được hàm lượng cao
polysaccharid toàn phần là 4,57 ± 0,18 % (P = 0,95; n =3) so với dược liệu khô tuyệt
đối. Ở liều thử nghiệm tương đương 94,45 gam cao/kg thể trọng chuột, cao
polysaccharide không thể hiện độc tính cấp. Cao chiết này có tác dụng bảo vệ gan tốt
với khả năng ức chế lần lượt 55,78%, 51,72% và 7,07% sự tăng hoạt độ men ALT,
AST và bilirubin toàn phần trong huyết thanh [11]
Nghiên cứu của Đỗ Thị Hà cùng các cộng sự, năm 2013, cho thấy cao chiết
methanol và các phân đoạn n – hexan, dicloromethan, cũng các hợp chất phân lập từ
nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol peroxide và ganodermanontriol) có tác dụng bảo
vệ gan in vivo và in vitro liên quan đến sự kích hoạt enzyme HO – 1 và hợp chất
ganodermanontriol thể hiện tác dụng kích hoạt protein HO – 1 thông qua sự kích hoạt


11
yếu tố chuyển vị trong nhân tế bào NRF – 2, trong các con đường tín hiệu PI3K/Akt và
p38, làm tăng cường mức độ bảo vệ các tế bào gan chống lại t – BHP.s
Từ việc tổng quan tài liệu cho thấy, nấm Linh chi có nhiều tác dụng dược lí tuyệt
vời. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay, tình hình nghiên cứu về nấm Linh chi chủ yếu
chỉ tập trung vào hướng khảo sát các điều kiện nuôi trồng tạo quả thể nấm, các nghiên
cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi còn ít được công bố. Đặc
biệt hơn cả là chưa có nghiên cứu nào so sánh về hoạt tính sinh học của hai loại nấm
Linh chi giống Nhật và giống Hàn, là hai chủng nấm đang được ưa chuộng trên thị

trường Việt Nam hiện nay. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục
đích khảo sát các điều kiện chiết tách và so sánh hoạt tính sinh học của hai loại nấm
Linh chi giống Nhật và giống Hàn. Từ đó, cung cấp thêm thông tin cho người sử dụng
các thông tin khoa học hữu ích để lựa chọn sản phẩm phù hợp.
1.3. CÁC SẢN PHẨM ỨNG DỤNG TỪ NẤM LINH CHI
Vì những tác dụng dược lý tuyệt vời mà hiện nay, trên thị trường, các sản phẩm
Linh chi ngày càng đa dạng.
Đầu tiên, phải kể đến các sản phẩm nấm Linh chi thô. Quả thể nấm Linh chi sau
khi được thu hoạch, xử lý sơ bộ, sấy khô, đóng gói hút chân không và bán ra thị
trường. Ngoài ra, để tiện cho người sử dụng, một số cơ sở chế biến đã sản xuất sản
phẩm bột nấm Linh chi.

Hình 1.2. Quả thể nấm Linh chi

Hình 1.3. Bột nấm Linh chi

Bên cạnh đó, một số sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mĩ phẩm… từ
nấm Linh chi đang rất được ưa chuộng và chiếm ưu thế trên thị trường do có nhiều
tính ưu việt về hoạt tính sinh học, dễ bảo quản, tính an toàn thực phẩm cao, tiện lợi cho
người sử dụng. Một số sản phẩm tiêu biểu phải kể đến như chiết xuất nấm Linh chi kết


12
hợp với Đông trùng hạ thảo, trà Linh chi gạo lứt với tác dụng làm đẹp da, giảm cân;
nước uống Linh chi mật ong, viên uống có thành phần chính là các hoạt chất chiết xuất
từ nấm Linh chi hay các mĩ phẩm làm đẹp da, sáng da, trị mụn có bổ sung thành phần
hoạt chất từ nấm Linh chi…

Hình 1.5. Chiết xuất nấm Linh chi
Hình 1.4. Nước uống Linh chi

kết hợp Đông trùng hạ thảo

mật ong

Hình 1.6. Trà Linh chi gừng

Hình 1.8. Viên uống Linh chi []

Hình 1.7. Trà Linh chi gạo lứt

Hình 1.9. Serum trị mụn Linh chi []


13
Ngoài ra, trên thị trường hiện nay còn có một số sản phẩm mới lạ như café Linh
chi, được quảng cáo với công dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý mạch vành và ung thư; làm
giảm nguy cơ đông máu và tắc nghẽn mạch máu. Hay một số sản phẩm gia vị có bổ
sung hoạt chất từ Linh chi như sản phẩm hạt nêm Linh chi của công ty Cổ phần sản
xuất thương mại Dona.

Hình 1.10. Cafe Linh chi

Hình 1.11. Hạt nêm Linh chi


14
CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Với các mục tiêu của đề tài đề ra, chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu
theo sơ đồ như sau:
Quả thể nấm Linh chi

Xác định:
- Độ ẩm.
- Hàm lượng protein
- Hàm lượng C tổng số
- KL: As, Pb, Hg

Khảo sát
đặc điểm nguyên liệu

Khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình chiết

- Phương pháp xử lý nguyên
liệu
- Chọn phương pháp chiết
- Chọn dung môi chiết
- Thời gian
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
- Cường độ siêu âm

Cao chiết

Ứng dụng

Khảo sát

làm kẹo Linh chi

hoạt tính sinh học
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Để thực hiện đề tài theo các bước của sơ đồ ở hình 2.1, cần sử dụng các vật liệu
và phương pháp nghiên cứu sau:


15
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
a. Quả thể nấm Linh chi
Nguyên liệu sử dụng là quả thể nấm Linh chi giống Hàn và giống Nhật. Quả thể
nấm Linh chi giống Hàn được thu hái tại xã Vĩnh Ngọc, thành phố Nha Trang, tỉnh
Khánh Hòa. Quả thể nấm Linh chi giống Nhật được thu hái tại Lấp Vò, Đồng Tháp.
Cả hai loại quả thể nấm đều được thu hái vào đầu tháng 4 trong điều kiện khô ráo,
không bị sâu bệnh.
Sau thu hái, quả thể nấm Linh chi được sấy khô ở 500C, nghiền thành bột mịn và
cho vào lọ có túi hút ẩm, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Nguyên liệu được sử dụng cho
toàn bộ các thí nghiệm trong đề tài này.
b. Chủng vi sinh vật
Chủng vi sinh vật sử dụng gồm 4 chủng vi khuẩn đã được định danh, cung cấp
bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Hóa trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng,
Khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng và Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo
lường Chất lượng 2 gồm: Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus.
2.1.2. Thiết bị
Sử dụng các thiết bị trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Sinh học,
khoa Hóa trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, Khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm

Đà Nẵng.
Chi tiết xem ở phụ lục 1.
2.1.3. Hóa chất
Rượu 400 được lấy tại lò nấu rượu đường Lê Trọng Tấn, Đà Nẵng.
Sử dụng các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm được mua từ công ty Merck – Đức
và một số từ Trung Quốc.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo Phụ lục 9.6, Dược điển Việt
Nam V [3]