Nghiên cứu đa dạng ditruyền tập đoàn giống lúa chất lượng của Việt Nam bằng chỉ thị SSR

ĐẶT VẤN ĐỂ
Lúa gạo là một trong những loại cây lương thực chủ yếu trên thế giới, có vai trò rất
quan trọng trong cả lĩnh vực kinh tế và vấn đề an ninh lương thực, là nguồn cung cấp lương
thực chủ yếu ở châu Á và cho khoảng 2/3 dân số trên thế giới. Do đó, các chương trình chọn
tạo giống lúa luôn được chú trọng và phát triển nhằm tăng năng suất và chất lượng lúa, đáp
ứng nhu cầu tiêu thụ trên toàn cầu.
Đặc biệt, nhu cầu về các giống lúa có chất lượng cao ngày càng gia tăng trong những
thập kỷ gần đây, do yêu cầu của thị trường và nhu cầu của người tiêu dùng. Gạo có chất
lượng cao được xác định bởi rất nhiều yếu tố như hình dạng hạt, giá trị dinh dưỡng, hương
thơm, chất lượng sau khi chế biến…Trong đó, hương thơm được xem là một trong những
đặc tính quan trọng. Trong khi giá gạo của các giống lúa truyền thống suy giảm, các loại lúa
gạo đặc sản, nhất là những loại gạo thơm vẫn giữ được giá cao và ổn định.
Khi bắt đầu thực hiện cuộc cách mạng xanh, hầu hết các chương trình chọn giống lúa
đều tập trung phát triển các giống lúa có tính trạng chống chịu sâu bệnh và cho năng suất
cao. Phần lớn các giống có mùi thơm thường có năng suất thấp nên người dân đã ngừng
trồng các giống lúa thơm đặc sản của địa phương và thay thế chúng bằng các giống ngắn
ngày, kháng sâu bệnh, năng suất cao và không thơm [8]. Điều này dẫn đến sự tổn hại về mặt
đa dạng di truyền của các giống lúa thơm, có nhiều giống lúa thơm địa phương đã bị cạnh
tranh và thất lạc. (Berner DK& Hoff BJ, 1986 ) [7], (Ghareyazie B, 1997 )[15], (Singh RK
et al, 200 ) [25], (BhattacharjeeP et al, 2002 ) [8], (Garg AK et al, 2006 ) [14].
Hiện nay, các chương trình phát triển và bảo tồn giống lúa chất lượng đang là vấn đề
được rất nhiều nước trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, việc chọn tạo các giống lúa chất
lượng bằng các phương pháp truyền thống là rất khó khăn, bởi sự di truyền đa gen và tương
tác của môi trường là những yếu tố gây khó khăn trong việc cải tiến các tính trạng chất
lượng. Chọn tạo giống lúa chất lượng đòi hỏi vật liệu ban đầu (dòng bố mẹ) có sự đa dạng di
truyền rất rộng. Những hiểu biết về mặt đa dạng di truyền nguồn gen là một điều kiện tiên
quyết để kế tục và sử dụng một cách có hiệu quả trong các phương pháp chọn tạo giống lúa
chất lượng.
1

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện chuyên đề “Nghiên cứu đa dạng di
truyền tập đoàn giống lúa chất lượng của Việt Nam bằng chỉ thị SSR”. Kết quả thu được
sẽ là cơ sở để tham khảo và tiến hành các nghiên cứu tiếp theo nhằm phục vụ cho công tác
thu thập, phân loại, bảo tồn, khai thác và sử dụng giống lúa chất lượng một cách có hiệu
quả.
I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG LÚA CHẤT
LƯỢNG
1.1. Các giống lúa chất lượng
Lúa chất lượng là giống lúa không những có kích thước, hình dạng thon dài mà còn có
phôi nhũ, hàm lượng amyloza cao và đặc biệt các giống lúa chất lượng có mùi thơm đặc
trưng.
Các giống lúa thơm thường được trồng phổ biến ở châu Á, riêng giống lúa Basmati
được gieo trồng khoảng 2 triệu ha chủ yếu ở các nước Ấn Độ, Pakistan và Nepan. Gạo thơm
có hạt nhỏ, thon và dài từ 6,8 đến 7,0 mm, tỉ lệ chiều dài và chiều rộng từ 3,5 đến 3,7 và có
hàm lượng amyloza trung bình 20 - 22%
Ở Ấn Độ có hàng trăm giống lúa thơm địa phương, tuy nhiên chỉ có giống lúa thơm
Basmati được ưa chuộng nhất. Gạo thơm Basmati có hai đặc tính quan trọng hơn hết là mùi
thơm và cơm nở dài, hàm lượng amyloza từ 22 - 25%, sau khi gạo được nấu chín vẫn giữ
được đặc tính này. Ở Thái Lan có hai giống lúa thơm nổi tiếng là Khao Dak Mali và Jasmine
85. Gạo thơm Khaw Dawk Mali có ít hơn 20% amyloza nên hạt cơm sau khi nấu hạt còn hơi
dính vào nhau (Khush, 2001)
Các giống lúa thơm ở Myanmar được gieo trồng nhiều ở các tỉnh miền Trung và chủ
yếu được tiêu thụ ở trong nước. Một số giống lúa chất lượng đang được gieo trồng phổ biến
ở đây như Namathalay, Basmati, Paw San Bay Gyar (Chaudhary RC and Tran DV, (2001)
[9].
Ở Philippin có giống Milsagrosa và ở Trung Quốc có các giống Bắc thơm, Quế hương
chiêm, Qua dạ hương và Chi ưu hương là các giống lúa chất lượng nổi tiếng trên thế giới.
2

Giống lúa Koshihikari là giống lúa cổ truyền của Nhật, thuộc loài phụ Japonica, có
chất lượng cao, hương vị rất được ưa thích trong những bữa ăn chính của người Nhật. Giống
lúa Koshihikari được xem như là lúa Basmati của Nhật với diện tích gieo trồng chiếm
khoảng 30% tổng diện tích trồng lúa ở nước này.
Ở miền Nam Việt Nam, giống lúa nổi tiếng là Nàng thơm chợ Đào (còn gọi là lúa hạt
lựu vì có đốm bạc bụng). Nàng thơm chợ Đào có thân cao, gié nhỏ, năng suất trung bình là
2 - 3 tấn/ha. Ngoài ra, còn có các giống lúa thơm nổi tiếng khác như lúa Móng chim, Nàng
hương, Nanh chồn (Bà Rịa); Tàu hương, Thơm sớm, Thơm lùn, Thơm Bình Chánh, Nàng
Thơm Nhà Bè, lúa Huyết rồng (Long An)… Ở miền Trung và Tây Nguyên, có các giống lúa
thơm nổi tiếng như lúa Ngự, Cúc thơm, Thái thơm, Nếp than, Nếp trắng, Nếp cái hoa vàng.
Ngoài ra, còn có các giống lúa thơm khác như Cúc thơm, Thái thơm, Tám thơm Thanh
Hóa…(Nguyễn Hữu Nghĩa và cs, 2000 b).
1.2. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
1.2.1. Chỉ thị sinh hoá
Được phát hiện nhờ phương pháp isozyme (Goodman &Stuber, 1983; Price et al,
1986), dựa trên cơ sở gen quy định sinh tổng hợp protein. Isozyme là những dạng enzyme
có cùng một phản ứng hoá học như nhau. Về mặt di truyền có thể chia Isozyme thành 2
dạng:
-

Isozyme đơn gen: các isozyme chịu sự kiểm soát của một gen

-

Isozyme đa gen: các isozyme chịu sự kiểm soát của nhiều gen hay nói cách khác là được
mã hoá bởi đa gen.

1.2.2. Chỉ thị di truyền
Các chỉ thị di truyền được phát hiện thông qua phương pháp đánh dấu các đoạn
oligonucleotit và đều có một số đặc điểm chung là không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi

trường, thường liên kết với các tính trạng trội hoặc siêu trội, mang tính ổn định và di truyền

3


qua các thế hệ. Chỉ thị di truyền rất đa dạng và phong phú và được chia thành các nhóm như
sau:
-

Chỉ thị di truyền dựa trên cơ sở phương pháp lai DNA và RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) (Burr et al, 1983; Godshalk et al, 1990; Becker et al, 1995). Dựa
vào các băng DNA trên gel điện di có thể phát hiện được các thể đồng (dị) hợp tử trội và
lặn.

-

Nhóm chỉ thị di truyền dựa trên cơ sở nguyên lý nhân bản gen bằng kỹ thuật PCR:
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Welh & Mc ClellDNA, 1990; William,
1990…); SSR (Simple Sequence Repeats) (Jeffreys et al, 1985), AFLP (Amplification
Fragment Length Polymorphism) (Vos et al, 1995; Becker et al, 1995);…..
Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong những chỉ thị

được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính xác cao.
SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và
chỉ gồm 1 - 6bp. (Litt and Luty, 1989; Jacob et al, 1991). Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số
lượng các nucleotit trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số
lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông
thường có các kiểu lặp lại:
-

Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau.

-

Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotit khác.

-

Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau.
Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể

như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà
phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn
định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những
thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.
Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số
của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp
4


lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn DNA nhờ phản
ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di
trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp).
Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng,
chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập
bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL).
Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR
Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn
sự đa hình. Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm
tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gen, xác định

cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền (Hokanson và cs., 1998).
SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền lúa trồng
O. sativa, nghiên cứu quá trình tiến hóa, làm rõ độ thuần của vật liệu lai tạo giống..., do đây
là chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn định. Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được
thiết lập (www.gramene.org, 2006), phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa (Giarrocco
và ctv, 2007) [19]. Trong những năm gần đây, nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên
cứu đa dạng di truyền và DNA fingerprinting để nhận dạng giống ở lúa đã được công bố
(Kalyan và ctv, 2006) [16] ; Jalaluddin và ctv, 2007; Muhammad và ctv, 2009; Navraj và
ctv, 2009 [27]
Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ
157kp của phân tử DNA có một chỉ thị SSR (Akagi và ctv, 1996 [6]; Chen và ctv, 1997 [10];
Chen và ctv, 2002 [11]; Cho và ctv, 2000 [12]; Coburn và ctv, 2002 [19]; McCouch, 2002
[24]; Paunaud và ctv,(1996) [30] ; Temnykh, 2000 [23]; Temnykh, 2001 [28]).
SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá
trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của
những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker
khác như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những
phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn (Schlotterer và
5


Pemberton, 1994). SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu
di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, tác giả Parasnis phát hiện
đoạn lặp lại GATA kích thước 5kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng
marker SSR.
Hạn chế của kỹ thuật SSR là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ
đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm
nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau.
1.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền về lúa chất lượng
1.3.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúachất lượng trên thế giới

Tác giả Sujatha (2004) nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các giống lúa Basmati
bằng chỉ thị SSR. Nghiên cứu được tiến hành trên 30 giống lúa thơm (bao gồm 22 giống lúa
Basmati hạt ngắn và 8 giống Basmati hạt dài) dựa trên 6 chỉ thị SSR. Kết quả cho thấy 20
trong số 22 giống lúa thơm hạt ngắn nằm cùng một nhóm lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn
còn lại nằm cùng nhau và tách riêng so với các nhóm khác, tám giống lúa Basmati hạt ngắn
nằm trong cùng một nhóm khác. Tác giả đã khẳng định chỉ thị phân tử cung cấp ước lượng
đa dạng di truyền chính xác so với các chỉ thị hình thái. Kết quả nghiên cứu này cũng giúp
cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thích hợp trong công tác lai tạo giống lúa chất
lượng (Sujatha, 2004) [26].
Tác giả Shu Xia Sun và cộng sự (2008) tiến hành kiểm tra gen thơm và không thơm
trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi. Kết quả cho thấy rằng cặp
mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi
Aro7 được xác định 302 bp. Ngoài ra, cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus
hương thơm với khoảng cách là 0,71 cM. Các gen thơm (fgr) được thể hiện giữa marker
Aro7 (0,57 cM) và RM515 (0,71 cM). Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (bacterial
artificial chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 1) [27].

6


Hình 1: Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8
Tác giả K. Kibria và cộng sự (2009), phân tích đa dạng di truyền gen thơm của lúa
bằng chỉ thị SSR và RAPD. Công trình nghiên cứu được thực hiện từ tháng 7 năm 2006 đến
tháng 4 năm 2008 tại Viện hạt nhân Nông nghiệp (Bina), Mymensingh, Bangladesh. Kết quả
chạy SSR của ba mồi (RM223, RM342A và RM515) thu được kết quả 46 băng, mức trung
bình của allele dao động từ 1,78 đến 2,49 [13].
Tác giả Malik Ashiq Rabbani và cộng sự (2010), đã tiến hành đánh giá đa dạng di
truyền giữa các giống lúa truyền thống và giống lúa đã được cải tiến ở Pakistan. Nghiên cứu
được thực hiện trên hai giống lúa Basmati thơm và không thơm thuộc nhóm lúa Indica.
Tổng số 41 dòng được đưa vào đánh giá bởi 30 marker SSR được phân bố trên khắp bộ gen

của lúa. Kết quả phân tích thu được tổng số 104 allele và tất cả đều đa hình, hệ số allele dao
động 2 - 6 allele, trung bình là 3,5 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,259 - 0,782 (trung
bình là 0,571). Sau khi số liệu được phân tích bằng phần mềm UPGMA, 41 giống lúa đã
được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm I gồm có 22 giống (15 giống lúa thơm Basmati và 5
giống không thơm, hai giống lúa Japonica). Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm.
Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để phân
tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa
Basmati không thơm. Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào
7


marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì
lợi ích của cả người nông dân và người tiêu dùng [18]
Tác giả Olufowote và cộng sự (1997) đã nghiên cứu biến động di truyền trong giống
của 71 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP. Kết quả cho thấy các giống lúa địa
phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến. Cả hai
phương pháp đều cho thấy số lượng các allele ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các
giống lúa cải tiến. Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần
gũi, đồng thời số lượng các allele cao hơn chỉ thị AFLP. Các tác giả cũng chỉ ra rằng chỉ cần chọn
chính xác 4 chỉ thị SSR là có thể nghiên cứu các allele dị hợp tử ở lúa [22].
Tác giả Natalya (2000) đã sử dụng chỉ thị RFLP đánh giá đa dạng di truyền của 342
giống lúa Việt Nam và nhận thấy rằng các giống lúa được thu thập từ miền Nam Việt Nam
thuộc nhóm Indica và các giống lúa thu từ miền Bắc thì phần lớn thuộc nhóm Japonica. Sau
nghiên cứu tác giả đã đưa ra kết luận Việt Nam là một nước có đa dạng di truyền lúa thuộc
loại cao nhất thế giới [20].
Tác giả Mahmoud (2005) tiến hành nghiên cứu biến động và quan hệ di truyền của 7
giống lúa bằng việc kết hợp của 8 mồi RAPD, 6 mồi SSR và 8 mồi AFLP. Kết quả thu được
cho thấy mức độ đa hình tương ứng với chỉ thị RAPD, SSR và AFLP là 72,2%, 90% và
67,9% . Cũng qua kết quả này, tác giả khẳng định rằng các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp
dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa (Mahmoud M. Saker và ctv., 2005) [19].

Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 38 giống lúa thơm bản địa Basmati bằng
chỉ thị SSR của tác giả Raj (Raj và ctv., 2006). Tác giả đã sử dụng 32 cặp mồi, kết quả
nghiên cứu cho thấy, có 26 cặp mồi đa hình (81,25%), hệ số PIC dao động từ 0,00 (RM259
và RM230) đến 0,83 (RM420) [23].
Theo Singh Balwant và cộng sự (2011), nghiên cứu đa dạng di truyền của 50 giống
lúa thơm bằng chỉ thị SSR, hình thái, đánh dấu hóa lý. Kết quả SSR marker phân tích cho
thấy đa hình khác biệt giữa các giống với 28 mồi và hệ số PIC có giá trị dao động từ 0,139 0,99 với trung bình 0,589 cho mỗi mồi. [24].
8


1.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa chất lượng ở Việt Nam
Việt Nam được xem là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài
nguyên di truyền lúa của nước ta được đánh giá là phong phú cả về số lượng và chất lượng.
Những công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng
ở Việt Nam còn hạn chế. Tuy nhiên, trong những năm gần đây các nhà khoa học đã quan
tâm đến vấn đề đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nhiều hơn, đặc biệt là các dòng lúa chất
lượng và bước đầu đã có những thành công nhất định [1].
Kết quả Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa Tám đặc sản ở 10 xã của 4
huyện thuộc tỉnh Nam Định là Hải Hậu, Giao Thuỷ, Xuân Trường và Mỹ Lộc trong các năm
1999 và 2000 cho thấy trong số 7 giống lúa Tám đang được gieo trồng phổ biến (bao gồm
Tám xoan, Tám ấp bẹ, Tám nghển, Tám Xuân Đài, Tám tiêu, Tám thơm, Tám cổ ngỗng) thì
giống Tám xoan có đa dạng di truyền giống cao nhất. Các giống có đa dạng thấp là Tám ấp
bẹ và Tám Nghển, đây là những giống đang có nguy cơ bị sản xuất loại trừ (Trần Danh Sửu,
2001).
Tác giả Lê Xuân Đắc và các cộng tác viên (2003) đã sử dụng 10 đoạn mồi RAPD để
đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa Tám đang lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng
Quốc gia. Kết quả thu được tổng số 889 phân đoạn DNA với kích thước từ 0,46 - 2,5 kb, hệ
số tương đồng di truyền giữa các lúa Tám lớn hơn 50% và cao nhất là 93%. Kết quả phân
tích chùm trên sơ đồ hình cây thu được 2 nhóm chính và đặc biệt 2 giống có hệ số tương
đồng di truyền sai khác nhiều nhất so với các giống khác là Tám Nhỡ Bắc Ninh (GB0318)

với sự sai khác là 0,35 (1 - 0,65), giống Tám nghệ hạt đỏ (GB0316) với sự sai khác là 0,34
(1 - 0,66). Trong 20 giống lúa Tám nghiên cứu thì 2 giống Tám thơm Hà Đông (GB0310) và
Tám xoan Hải Dương (GB0311) tương đồng với nhau ở mức cao nhất là 0,93 [3].
Dương Xuân Tú và cộng tác viên (2008), đã nghiên cứu và sử dụng chỉ thị phân tử
DNA để xác định gen thơm điều khiển tính trạng mùi thơm trong lúa gạo phục vụ công tác
chọn tạo giống lúa thơm, công trình được tiến hành từ năm 2007 đến 2008 tại Viện Cây
lương thực và Cây thực phẩm. Kết quả đã lựa chọn được 2 chỉ thị là L05 và BADH2 gồm 4
mồi: EAP, ESP, IFAP, INSP có thể sử dụng để phân biệt chính xác giữa các giống lúa có mùi
9


thơm do gen fgr điều khiển và giống lúa không thơm (không mang gen fgr). Sử dụng chỉ thị
BADH2 để phân biệt các dòng lúa thơm trong tổng số 420 dòng lúa từ các thế hệ F4 đến F6
và các dòng đơn bội kép, kết quả đã chọn ra được 73 dòng lúa mang gen thơm fgr đồng hợp
tử và 91 dòng lúa mang gen thơm fgr dị hợp tử [2].
Kết quả xác định gen thơm trong tập đoàn từ F4 tới F6 và một số dòng DH (dòng
thuần được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn) được chọn lọc từ các tổ hợp lai giữa các giống lúa
thơm và không thơm cho thấy: Trong 420 dòng lúa được đánh giá có 73 dòng mang gen
thơm đồng hợp tử (chiếm 17,4%), có 91 dòng mang gen thơm dị hợp tử (chiếm 21,7%) và
256 dòng không mang gen thơm (chiếm 60,9%). Các dòng lúa mang gen thơm đồng hợp tử
là các dòng đã thuần về tính trạng gen thơm fgr sẽ được đánh giá và đưa vào so sánh, đánh
giá các tính trạng nông học khác, các dòng mang gen thơm dị hợp tử sẽ được tiếp tục lựa
chọn để chọn ra các dòng thuần về gen thơm. Tuy nhiên, tỷ lệ rất cao của các dòng không
mang gen thơm trong tập đoàn các dòng lúa mới cho thấy việc cần thiết phải chọn các cá thể
và dòng mang gen thơm từ các thế hệ sớm hơn như F2, F3 để giảm khối lượng các dòng cần
phải đưa vào đánh giá và chọn lọc trong các thế hệ về sau.
Tác giả Nguyễn Thị Phương Đoài và cộng sự (2010) đã sử dụng 29 cặp mồi SSR trên
27 giống lúa nếp và lúa nương thu được tổng số 786 allele, trung bình 3,310 allele/mồi. Hệ
số PIC dao động từ 0 - 0,808 (trung bình 0,474). Các giống lúa nếp và lúa nương có độ
thuần di truyền rất khác nhau, tỉ lệ dị hợp của các mẫu nghiên cứu dao động từ 0 - 25%. Hệ

số tương đồng di truyền giữa các giống dao động trong khoảng từ 0,06 - 0,84 [5].
Tác giả Nguyễn thị Lang và Bùi Chí Bửu (2010) tiến hành xác định kiểu gen thơm
của 16 giống lúa địa phương và 49 giống cải tiến. Xác định mục tiêu gen bằng chỉ thị phân
tử SSR với mồi RM223 và STS (RG 28Fl-RB). RG28 được chuyển vào STS và khuếch đại
gen bằng kỹ thuật PCR từ các giống lúa khác nhau của gen mùi thơm. Kết quả cho thấy độ
chính xác 100% trong việc xác định gen thơm [4].
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu

10


Sử dụng 50 giống lúa Chất lượng được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, đang
được lưu giữ và bảo tồn tại Ngân hàng gen hạt của Trung tâm Tài Nguyên Thực vật (Bảng
2.1)
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 31cặp mồi SSR được sử dụng để phân tích
thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào
các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các
locus ở trên 12 NST khác nhau (Bảng 2.2)

11


Bảng 2.1: Danh sách 50 giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu
TT

SĐK

Tên giống

Nguồn gốc

Kí hiệu

TT

SĐK

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

233
259
268
287
290
305
307
313
314

316
317
1048

Tám tức Tây Bắc
Tám trắng Vĩnh Phúc
Tám đen Hà Đông
Tám thơm Hải Dương
Tám thơm Thái Bình
Tám tròn Hải Dương
Tám đứng Hải Dương
Tám xoăn có râu Hải Dương
Tám xoan Bắc Ninh
Tám nghệ hạt đỏ
Tám xoan Vĩnh Phúc
Tám xoan Hải Hậu

T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
T11
T12

26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37

6240
1406
1801
18
1982
1990
1997
8260
3963
4609
5104
7021

Tám cao cây
Khẩu tan pỏn
Nếp cái nương
Khẩu nua nương

Khẩu mường hun
Ne nương
Chiêm pua
Blào đang
Plề lẩu chùa
Kháu khỉnh
Ka tiêu
Khẩu lao

Yên Bái
Lào Cai
Lai Châu
Hoà Bình
-

T26
T27
T28
T29
T30
T31
T32
T33
T34
T35
T36
T37

13

2375

Tám thơm ấp bẹ

Tây Bắc
Vĩnh Phúc
Hà Nội
Hải Dương
Thái Bình
Hải Dương
Hải Dương
Hải Dương
Bắc Ninh
Vĩnh Phúc
Nam Định
Nam Định
Ninh Bình

T13

38

7186

Tẻ nương

-

T38

14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

5117
5118
5119
5120
5121
5122
5123
5124
5125
6212
6238
6239

Tám Xuân Đài
Tám tiêu
Tám Xuân Hồng
Tám Nghĩa Hồng

Tám con
Tám Nghĩa Lạc
Tám Xuân Bắc
Tám Hải Giang
Tám Nghĩa Sơn
Tám cổ rụt
Tám xoan
Tám nghển

Nam Định
Nam Định
Nam Định
Nam Định
Nam Định
Nam Định
-

T14
T15
T16
T17
T18
T19
T20
T21
T22
T23
T24
T25

39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50

5912
5927
5825
5857
3486

Mao chệt
Nếp ông táo
Nàng thơm đặc sản
Nàng thơm chợ đào
Lúa nàng thơm
OM 3536
Nàng Nhen
Thơm Lài
Thơm mắn
Thơm lùn mùa
Vàng Ba Danh

Huyết rồng 4

Quảng Ngãi
Long An
TPHCM
Long An
Bình Định
Vĩnh Long
An Giang
An Giang
Lâm Đồng
Cần Thơ
Bạc Liêu
Bạc Liêu

T39
T40
T41
T42
T43
T44
T45
T46
T47
T48
T49
T50

12

Tên giống

Nguồn gốc

Kí hiệu


Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

22
23
24
25
26
27
28
29
30
31

Tên mồi
RM 13
RM 30
RM 282
RM 135
RM 142
RM 143
RM 270
RM 153
RM 162
RM 171
RM 172
RM 174
RM 224
RM 245
RM 257
RM264
RM 316
RM 284

RM 302
RM 309
RM 286
RM 310
RM 318
RM 323
RM 337
RM 341
RM 515
RM 17
RM 229
RM 166
RM 223

Trình tự mồi
3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG-5’
5’-GGTGGCATTCGATTCCAG-3’
3’-GGTTAGGCATCGTCACGG-5’
5’-TCACCTCACCACACGACACG-3’
3’-CTGTGTCGAAAGGCTGCAC-5’
5’ –CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG-3’
3’-CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG-5’
5’-TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCTC-3’
3’-CTCGCTATCGCCATCGCCATCG-5’
5’-TCGAGCCATCGCTGGATGGAGG-3’
3’-GTCCCGAACCCTAGCCCGAGGG-5’
5’-AGAGGCCCTCCACATGGCGACC-3’
3’-GGCCGTTGGTTCTAAAATC-5’
5’-TGCGCAGTATCATCGGCGAG-3’
3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’

5’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-3’
3’ –CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG-5’
5’ - GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG-3’
3’-AACGCGAGGACACGTACTTAC-5’
5’-ACGAGATACGTACGCCTTTG-3’
3’-TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG-5’
5’-CAACCACGACACCGCCGTGTTG-3’
3’-AGCGACGCCAAGACAAGTCGGG-5’
5’-TCCACGTCGATCGACACGACGG-3’
3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’
5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’
3’-ATGCCGCCAGTGAATAGC-5’
5’-CTGAGAATCCAATTATCTGGGG-3’
3’-CAGTTCCGAGCAAGAGTACTC-5’
5’-GGATCGGACGTGGCATATG-3’
3’-GTTGCGTCCTACTGCTACTTC-5’
5’-GATCCGTGTCGATGATTAGC-3’
3’- CTAGTTGGGCATACGATGGC- 5’
5’-ACGCTTATATGTTACGTCAAC-3
3’-ATCTCTGATACTCCATCCATCC-5’
5’-CCTGTACGTTGATCCGAAGC-3’
3’-TCATGTCATCTACCATCACAC-5’
5’-ATGGAGAAGATGGAATACTTGC-3’
3’-GTAGATCACGCACCTTTCTGG-5’
5’-AGAAGGCCTCCGGTGAAG-3’
3’-GGCTTCATCTTTGGCGAC-5’
5’-CCGGATTCACGAGATAAACTC-3’
3’ -CCAAAACATTTAAAATATCATG-5’
5’ –GCTTGTTGGTCATTACCATTC-3’
3’-GTACGGAAAACATGGTAGGAAG-5’

5’-TCGAGGGAAGGATCTGGTC-3’
3’-CAACGAGCAAATCAGGTCAG-5’
5’-GTTTTGATCCTAAGGCTGCTG-3’
3’-GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG-5’
5’-CGATAGATAGCTAGATGTGGCC-3’
3’-CAAGAAACCTCAATCCGAGC-5’
5’-CTCCTCCCGATCCCAATC-3’
3’-TAGGACGACCAAAGGGTGAG-5’
5’-TGGCCTGCTCTCTCTCTCTC-3’
3’-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-5’
5’-GGTGATCCTTTCCCATTTCA-3’
3’-CACTCACACGAACGACTGAC-5’
5’-CACTCACACGAACGACTGAC-3’
3’GGTCCTGGGTCAATAATTGGGTTACC5’
5’-TTGCTGCATGATCCTAAACCGG-3’
3’-GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC-5’
5’-GAAGGCAAGTCTTGGCACTG-3’
13

NST
5
6
3
3
4
3
12
5
6
10

7
2
11
9
9
8

Kích thước (bp)
124-154
171-183

8
1
12
11
8
2
1
8
2

141-149
120-191
158-180
99-128

12

160-171

119-131
235-238
195-207
104-117
196-234
310-356
159-165
207-222
120-152
136-146
120-170
148-178

134-154
241-244
154-194
126-186


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Cheng và cs (2003). Ưu điểm
của phương pháp này là DNA tách chiết được khá nguyên vẹn do CTAB có khả năng tạo
phức với DNA. Quy trình tách chiết được tiến hành với các bước như sau:
1. Nghiền 1,5 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ.
2. Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã được
làm nóng đến 650C).
3. Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần.
4. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo
đều trong 10 phút.

5. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
6. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung một
thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30 phút.
7. Tủa DNA bằng máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3
lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.
8. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase A (10 mg/ml). Ủ ở
37oC trong 3h.
9. Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol - chloroform - isoamyl
alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.
10. Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và 3ml Ete bão hòa
hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.
11. Loại bỏ lớp Ete bên trên. Chuyển phần bên dưới vào ống mới
12. Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy DNA ra
bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh.
13. Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%.
14. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa.
14


15. Giữ dung dịch DNA ở - 20°C.
2.2.2. Đo độ tinh sạch của DNA
Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của DNA được đánh giá bằng phương
pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X và dùng DNAλ nồng độ
(50 ng/µl) làm thang chuẩn, trong 30 phút, điện thế 100V. Sau khi chạy điện di, tiến hành
nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm ethidium bromide. Việc chụp mẫu và đo nồng độ được
thực hiện bằng máy Molecular imager FX.
2.2.3 Phương pháp PCR với mồi SSR
Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler - personal. Tổng thể tích
phản ứng là 10µl, bao gồm: 1,0µl DNA; 1,5µl mồi xuôi 5µM; 1,5µl mồi ngược 5µM;
1,0µl dNTPs 10mM; Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM và 0.8µl Taq DNA polymerase

1U/µl.
Sau khi các ống eppendof đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến
hành xếp ống vào máy và đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR
được đặt như sau:
Các bước Nhiệt độ (oC)
I
94
94
II
56
72
IV
72
V
4

Thời gian Số chu kỳ
5 phút
1
1 phút
45 giây
35
1 phút
7 phút
1
30 phút
1

Bảo quản mẫu 40C
2.2.4. Kiểm tra kết quả trên gel Polyacrylamide

Sản phẩm thu được từ phản ứng PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide 6%,
trong môi trường đệm TAE 1X, các mẫu chạy với ladder 50 bp.
Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR được tiến hành cụ thể như sau:
15


Chuẩn bị kính:
Kính ngắn được lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% 3 lần, xử
lý chống dính bằng dung dịch Sigma Cote sau đó loại bỏ Sigma Cote dư thừa bằng lau
ethanol 95% hai lần.
Kính dài được lau sạch bằng nước cất 3 lần, lau lại bằng ethanol 95% 3 lần, rồi xử
lý dính bằng Bind Silane, sau đó lau lại kính bằng ethanol 95% hai lần.
Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau:
Dung dịch acrylamide 40%

14ml

10X TBE

4ml

Dung dịch APS 10%:

800µl

Dung dịch TEMED:

52µl

Nước đề ion

70ml

Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính.
Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn.
Điện di sản phẩm:
Khi gel đông lại (sau khoảng 30 - 60 phút), rút lược ra, vệ sinh bản gel bằng
TAE1X, cho khay chứa gel vào máy điện di có sẵn dung dịch đệm TAE 1X. Lấy 3µl mẫu
(chứa sản phẩm của quá trình PCR), trộn đều với 3µl dung dịch loading 1,5X và tra vào
các giếng. Để đo kích thước băng chúng tôi sử dụng ladder 50bp làm chuẩn. Sau đó, đặt
máy điện di ở chế độ 200V trong thời gian 2h.
Nhuộm gel và ghi nhận kết quả:
Sau khi điện di, tiến hành nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (0,5
ng/ml) trong 2 phút. Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của hãng
UVP, dựa vào đó xác định sản phẩm PCR thu được.
2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu
16


Những số liệu thống kê bao gồm số allele trên locus, tần số allele phổ biến nhất, số
allele độc nhất, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) được tính toán sử dụng
phần mềm Excel, trong đó:
- Chỉ số Tần số allele phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể xuất hiện
allele phổ biến nhất trên tổng số allele xuất hiện ở từng locus nghiên cứu
- Allele độc nhất của từng chỉ thị SSR được xác định là allele xuất hiện duy nhất ở 1
giống trong toàn bộ các giống lúa nghiên cứu.
- Đa dạng di truyền allele của các chỉ thị SSR được đánh giá thông qua hệ số PIC
(Botstein,1980) và được tính theo phương trình:

Trong đó:

Pij:là tần số xuất hiện của allele thứ j tương ứng với mồi i.

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng
lớn, càng nhiều allele được sinh ra.
Sự có mặt hay vắng mặt của các allele của từng chỉ thị SSR được ghi nhận cho tất
cả các giống lúa nghiên cứu, trong đó 0 là không có băng DNA và 1 là có băng DNA ở
cùng một vị trí. Số liệu được tổng hợp và xử lý thông qua chương trình NTSYS-pc v. 2.1
(Rohlf, 1997), xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice (Dice, 1945;
Nei and Li, 1979), tiếp theo là sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các
giống lúa nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA
(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages).
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Saghai Maroof và
cs. (1984) (đã được cải tiến) để tách chiết DNA hệ gen từ lá của các giống lúa nghiên
17


cứu. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất tẩy cetyl-trimethylamonium-bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng
tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ, DNA dễ hòa tan hơn nhiều so với các chất
khác. Vì vậy, CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic.
Sau khi thu được DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng DNA bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 30 phút (dùng 3µl và 5 µl ở
nồng độ 50ng/µl làm chuẩn để đo nồng độ DNA), sau đó nhuộm bằng ethidium bromide.
Sử dụng máy chuyên dụng (Molercular imager FX) để xác định nồng độ và chụp ảnh.
Ảnh điện di (hình 3.1) cho thấy các băng gọn sắc nét, DNA không bị đứt gẫy, có độ tinh
sạch cao đảm bảo cho thực hiện các phản ứng PCR và các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.1: DNA tổng số của 50 giống lúa nghiên cứu

18


3.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp mồi

Hình 3.2: Ảnh điện di sản phẩm PCR mồi RM245
Bảng 3.1: Số allele thể hiện và hệ số PIC của 31 cặp mồi SSR
TT

Tên
Mồi

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

RM13
RM30
RM282
RM135
RM142
RM143
RM270
RM153
RM162
RM171
RM172
RM174
RM224
RM245
RM257
RM264

Vị trí
trên
NST
5
6
3
3
4
3
12
5
6
10

7
2
11
9
9
8

Số
allele
4
3
5
3
1
7
6
5
2
3
5
2
5
3
5
6

PIC TT
0,71
0,44
0,56

0,50
0,00
0,46
0,66
0,49
0,31
0,45
0,61
0,45
0,68
0,55
0,70
0,74

17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31

Tên
Mồi

Vị trí
trên
NST

RM316
RM284
8
RM302
1
RM309
12
RM286
11
RM310
8
RM318
2
RM323
1
RM337
8
RM341
2
RM515
RM17
12
RM229

RM166
RM223
Tổng
Trung bình

Số
allele

PIC

3
2
4
3
5
5
2
1
4
5
8
6
3
3
4
123
2.46

0,50
0,44

0,52
0,25
0,72
0,70
0,42
0,00
0,49
0,72
0,73
0,56
0,63
0,58
0,62
16,18
0.32

Qua kết quả thu được ở bảng 3.1 chúng tôi thấy với 31 cặp mồi SSR được sử dụng
trong nghiên cứu đều cho kết quả đa hình. Tổng số allele thống kê được trên 31 cặp mồi
19


SSR là 123 allele, trung bình 2,46 allele/cặp mồi. Trong đó:
-

Số mồi thể hiện 8 allele: 1 mồi (RM 515)

-

Số mồi thể hiện 7 allele: 1 mồi (RM143)

-

Số mồi thể hiện 6 allele: 3 mồi (RM270, RM264, RM17)

-

Số mồi thể hiện 5 allele: 8 mồi (RM282, RM153, RM172, RM224, RM257,
RM286, RM310, RM341)

-

Số mồi thể hiện 4 allele: 3 mồi (RM13, RM302, RM337)

-

Số mồi thể hiện 3 allele: 8 mồi (RM30, RM135, RM171, RM245, RM316,
RM309, RM229, RM166)

-

Số mồi thể hiện 2 allele: 3 mồi (RM162, RM174, RM284, RM318)

-

Số mồi chỉ có 1 allele: 2 mồi (RM142, RM323)
Hệ số PIC trung bình của 31 cặp mồi nghiên cứu là 0,32. Trong đó, có 2 cặp mồi chỉ

thể hiện một allele có hệ số PIC = 0, hệ số PIC đạt giá trị cao nhất (0,73) ở cặp mồi
RM515 với 8 allele thể hiện.
3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng

nghiên cứu
Tỷ lệ dị hợp tử (H) và tỷ lệ số liệu khuyết (M) của các giống lúa Chất lượng
nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích với 31 cặp mồi SSR được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng
nghiên cứu
TT
1
2
3
4
5
6

Tên giống
Tám tức Tây Bắc
Tám trắng Vĩnh Phúc
Tám đen Hà Đông
Tám thơm Hải Dương
Tám thơm Thái Bình
Tám tròn Hải Dương

M%
0
0
3,33
3,33
0
0

H%

0
3,23
0
0
0
0
20

TT
27
28
29
30
31
32

Tên giống
Khẩu tan pỏn
Nếp cái nương
Khẩu nua nương
Khẩu mường hun
Ne nương
Chiêm pua

M%
3,33
10,71
3,33
3,33
0

3,33

H%
0
14,29
0
0
0
0


7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

26

Tám đứng Hải Dương
Tám xoăn có râu Hải
Tám xoan Bắc Ninh
Tám nghệ hạt đỏ
Tám xoan Vĩnh Phúc
Tám xoan Hải Hậu
Tám thơm ấp bẹ
Tám Xuân Đài
Tám tiêu
Tám Xuân Hồng
Tám Nghĩa Hồng
Tám con
Tám Nghĩa Lạc
Tám Xuân Bắc
Tám Hải Giang
Tám Nghĩa Sơn
Tám cổ rụt
Tám xoan
Tám nghển
Tám cao cây

0
0
0
0
3,33
3,33
0

0
0
0
3,33
0
3,33
0
3,33
6.9
3,33
0
0
3,33

3,23
0
0
0
0
3,33
3,23
0
0
6,45
0
6,45
3,33
3,23
0
0

6,68
0
3,23
3,33

33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50

Blào đang
Plề lẩu chùa
Kháu khỉnh
Ka tiêu
Khẩu lao
Tẻ nương

Mao chệt
Nếp ông táo
Nàng thơm đặc sản
Nàng thơm chợ đào
Lúa nàng thơm
OM 3536
Nàng Nhen
Thơm Lài
Thơm mắn
Thơm lùn mùa
Vàng Ba Danh
Huyết rồng 4
Tổng
Trung bình

10,71
3,33
6,9
0
3,33
0
0
3,33
3,33
3,33
0
0
0
0
0

0
3,33
6,9
92,12
1,84

7,14
0
3,45
0
0
0
9,68
0
0
0
0
9,68
3,23
0
9,68
6,45
6,68
0
106,17
2,12

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: Tỷ lệ khuyết số liệu (M) cao nhất ở 2 giống là T28
(Nếp cái nương), T33 (Blào đang) là 10,71%. Tiếp theo là ba giống T22 (Tám Nghĩa
Sơn), T35 (Kháu khỉnh), T50 (Huyết rồng 4) khuyết số liệu ở một cặp mồi ương ứng với

tỷ lệ 6,9%. Giống lúa T3 (Tám đen Hà Đông), T4 (Tám thơm Hải Dương), T11 (Tám
xoan Vĩnh Phúc), T12 (Tám xoan Hải Hậu), T17 (Tám Nghĩa Hồng), T19 (Tám Nghĩa
Lạc), T21 (Tám Hải Giang), T23 (Tám cổ rụt), T26 (Tám cao cây), T27 (Khẩu tan pỏn),
T29 (Khẩu nua nương), T30 (Khẩu mường hun), T32 (Chiêm pua), T34 (Plề lẩu chùa),
T37 (Khẩu lao), T40 (Nếp ông táo), T41 (Nàng thơm đặc sản), T42 (Nàng thơm chợ đào),
T49 (Vàng Ba Danh) khuyết số liệu ở một cặp mồi tương ứng với tỷ lệ 3,33%. Các giống
còn lại không bị khuyết số liệu. Tỉ lệ khuyết số liệu trung bình của 50 giống là 1,84
không có giống nào có tỷ lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 50 giống nghiên
cứu đều có ý nghĩa phân tích thống kê.

21


Tỷ lệ đồng hợp và dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác biệt và rõ ràng. Tỷ
lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở giống lúa T28 (Nếp cái nương) cao nhất là 14,29%, tiếp đến là
ba giống lúa T39 (Mao chệt), T44 (OM 3536), T49 (Vàng Ba Danh) tỷ lệ dị hợp tử là
9,68%. Giống lúa T33 (Blào đang) tỷ lệ dị hợp tử là 7,14% . Ba giống T16 (Tám Xuân
Hồng), T18 (Tám con), T48 (Thơm lùn mùa) có tỷ lệ dị hợp là 6,45%. Giống T35 (Kháu
khỉnh) có tỷ lệ dị hợp tử là 3,45%. Ba giống T12 (Tám xoan Hải Hậu), T19 (Tám Nghĩa
Lạc), T26 (Tám cao cây) có tỷ lệ dị hợp là 3,33%. Sáu giống có tỷ lệ dị hợp là 3,23%.
Còn lại 30 giống có tỷ lệ dị hợp tử 0% có nghĩa là trong phạm vi 31 mồi nghiên cứu các
giống này đều thể hiện đồng hợp (chỉ có một băng DNA duy nhất/mồi). Tỷ lệ dị hợp tử
trung bình của cả tập đoàn là 2,12.
3.4. Xác định các allele hiếm xuất hiện trong tập đoàn lúa chất lượng nghiên cứu
Thông thường, allele hiếm (rare allele) được định nghĩa dựa trên tần số xuất hiện
của chúng. Kimura đã định nghĩa allele hiếm là allele có tần số xuất hiện nhỏ hơn q với
những giá trị nhỏ xác định của q (như q = 0,01). Đối với số lượng mẫu lên đến 100 thì
một allele sẽ được xem là hiếm nếu nó xuất hiện không quá hai lần và số lần xuất hiện
của một allele hiếm sẽ là không quá 200 lần khi lượng mẫu đạt tới 10.000 (Kimura,
1983). Còn theo Zahida, allele hiếm là allele xuất hiện với tần số ≤ 0,05 trong tổng số

mẫu nghiên cứu (Zahida et al., 2009).

22


Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi
RM515(205 - 231 bp) và cặp mồi RM270 (104 - 117bp)
Kết quả thu được từ bộ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 31 cặp mồi SSR với
tập đoàn 50 giống lúa chất lượng đã thu được tổng số 123 loại allele, trong đó xuất hiện 8
allele hiếm ở 7 cặp mồi (allele chỉ xuất hiện duy nhất ở một mẫu giống có tần số <0,05).
Như vậy, tỷ lệ allele hiếm xuất hiện là 8/123 (6,5%), tỷ lệ allele hiếm trên mỗi locus trung
bình là 8/31 (25,8%). Số allele hiếm xuất hiện nhiều ở locus RM270 (xuất hiện 2 allele
hiếm ở các giống T23 - Tám cổ rụt và T24 - Tám xoan) (hình 3.3). Tiếp theo là các locus
RM28, RM143, RM153, RM RM310, RM337, RM515 xuất hiện một allele trên mỗi
locus ở các giống T17 (Tám Nghĩa Hồng), T19 (Tám Nghĩa Lạc), T10 (Tám nghệ hạt
đỏ), T36 (Ka tiêu), T3 (Tám đen Hà Đông), T2 (Tám trắng Vĩnh Phúc).
3.5. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các giống lúa Chất
lượng nghiên cứu
Số liệu thu được từ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 31 cặp mồi SSR với tập
đoàn 50 giống lúa chất lượng nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm
NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền (Bảng 3.3) và sơ đồ
hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa Chất lượng (hình 3.4).
Qua kết quả thu được ở bảng 3.3 và hình 3.4 cho thấy: Hệ số tương đồng di truyền
của 50 giống lúa Tám nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,11 (T10 - Tám nghệ hạt đỏ,
T11 - Tám xoan Vĩnh Phúc, T1 - Tám tức Tây Bắc) đến 0,82 (T5 - Tám thơm Thái Bình
và T8 - Tám xoăn có râu Hải Dương)

23

Dựa vào sơ đồ mối quan hệ di truyền của 50 giống lúa, xét ở mức tương đồng di
truyền 0,36 chúng tôi chia 50 mẫu giống lúa nghiên cứu thành 6 nhóm:
*Nhóm I: Có 23 giống lúa trong đó gồm các giống T1 (Tám tức Tây Bắc), T12 (Tám
xoan Hải Hậu), T18 (Tám con), T21 (Tám Hải Giang), T19 (Tám Nghĩa Lạc), T23 (Tám
cổ rụt), T24 (Tám xoan), T25 (Tám nghển), T26 (Tám cao cây), T20 (Tám Xuân Bắc), T5
(Tám thơm Thái Bình), T8 (Tám xoăn có râu Hải Dương), T7 (Tám đứng Hải Dương),
T9 (Tám xoan Bắc Ninh), T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc), T16 (Tám Xuân Hồng), T14 (Tám
Xuân Đài), T15 (Tám tiêu), T22 (Tám Nghĩa Sơn), T13 (Tám thơm ấp bẹ), T17 (Tám
Nghĩa Hồng), T6 (Tám tròn Hải Dương), T10 (Tám nghệ hạt đỏ). Xét tại vị trí có hệ số
tương đồng di truyền 0,52 được chia làm 4 nhóm phụ.
- Nhóm I.1: Gồm giống lúa T1 (Tám tức Tây Bắc), T12 (Tám xoan Hải Hậu), T18
(Tám con), T20 (Tám Xuân Bắc), T21 (Tám Hải Giang), T23 (Tám cổ rụt), T24
(Tám xoan), T25 (Tám nghển), T26 (Tám cao cây), T19 (Tám Nghĩa Lạc). Hệ số
tương đồng di truyền cao nhất là 0,8 (T25 và T24). Hệ số di truyền tương đồng
thấp (T20 và T21) là 0,35. Giống T1 và T19 có hệ số tương đồng di truyền là 0,5
- Nhóm I.2: Gồm giống lúa T5 (Tám thơm Thái Bình), T8 (Tám xoăn có râu Hải
Dương), T7 (Tám đứng Hải Dương). Trong đó hệ số tương đồng di truyền trong
khoảng từ 0,62 đến 0,82. T5 và T8 có hệ số tương đồng di truyền là 0,82.
- Nhóm I.3: Gồm giống lúa T9 (Tám xoan Bắc Ninh), T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc),
T16 (Tám Xuân Hồng), T14 (Tám Xuân Đài), T15 (Tám tiêu), T22 (Tám Nghĩa
Sơn), T13 (Tám thơm ấp bẹ), T17 (Tám Nghĩa Hồng). Trong đó có hệ số tương
đồng cao nhất là 0,82 (T15 và T22). Hệ số tương đồng di truyền các mẫu còn lại
(0,43 - 0.74)
- Nhóm I.4: Gồm giống lúa T6 (Tám tròn Hải Dương) và T10 (Tám nghệ hạt đỏ)
có hệ số tương đồng di truyền là 0,72

24


Hình 3.4: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa Chất lượng

nghiên cứu
*Nhóm II: Gồm giống lúa T27 (Khẩu tan pỏn), T28 (Nếp cái nương), T36, T31 (Ne
nương), T35 (Kháu khỉnh), T33 (Blào đang), T32 (Chiêm pua), T34 (Plề lẩu chùa), T38
(Tẻ nương), T29 (Khẩu nua nương) có hệ số tương đồng trong khoảng từ 0,33 - 0,69.
Nhóm này được chia làm 3 nhóm phụ gồm:
- Nhóm II.1 : Gồm T27 (Khẩu tan pỏn), T28 (Nếp cái nương) có hệ số tương
đồng là 0,55
25