Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long​

New Text Document.txt
Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm
trắng trên cây Thanh long
Nguyễn Thị Bích Tuyền
Nguyễn Thị Hai (giảng viên hướng dẫn)

Page 1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỤC LỤC .........................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .......................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................... 2
4. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 3
5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp ....................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 5
1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp. ...................................................................... 5
1.1.1 Phân loại. .......................................................................................................... 5
1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập ....................................... 5
1.1.3 Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 8
1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................................................................. 10
1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây
bệnh cây trồng ......................................................................................................... 11
1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động

enzyme chitinase của Trichoderma spp.. ................................................................ 17

i


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.7 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp. trên thế giới và ở
Việt Nam ................................................................................................................. 18
1.1.8 Ứng dụng của Trichoderma spp. trong nông nghiệp ..................................... 21
1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây
Thanh long .................................................................................................................. 24
1.2.1 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum .............................................. 24
1.2.2 Khái quát về bệnh đốm trắng trên Thanh long .............................................. 25
1.2.3 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum ....................................... 26
1.2.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long ................... 32
1.3 Thực trạng về phế phẩm Thanh long và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ
sinh học ....................................................................................................................... 34
1.3.1 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long tại Việt Nam .............................. 34
1.3.2 Sản xuất và sử dụng phân compost ................................................................ 34
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 41
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ....................................................................... 41
2.2 Vật liệu .................................................................................................................. 41
2.2.1 Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh ..................................................... 41
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................... 41
2.2.3 Hóa chất .......................................................................................................... 42
2.2.4 Các loại môi trường ........................................................................................ 42
2.3 Phương pháp nghiên cứu. ..................................................................................... 45
2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm ............................................................. 46
Giải thích sơ đồ ....................................................................................................... 46

ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm........................................................ 48
2.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh
long .......................................................................................................................... 49
2.3.4 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma ..
................................................................................................................................. 50
2.3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây
bệnh đốm trắng trên cây thanh long ........................................................................ 52
2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều
kiện trong chậu ........................................................................................................ 54
2.3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng
ruộng ........................................................................................................................ 55
2.3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của nấm Trichoderma ....... 57
2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 60
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 61
3.1 Kết quả phân lập nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long .......................... 61
3.2 Kết quả khảo sát một số đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của các chủng
nấm Trichoderma spp. ................................................................................................ 63
3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập ............................. 63
3.2.2 Đặc điểm sinh trưởng ..................................................................................... 75
3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma
spp. sau 2 ngày nuôi cấy .......................................................................................... 78
3.3 Khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây
bệnh đốm trắng trên thanh long .................................................................................. 83
3.4 Kết quả định danh chủng Trichoderma T3 ........................................................... 88
iii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.5 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện
trong chậu ................................................................................................................... 89
3.6 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng
.................................................................................................................................... 92
3.7 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma
asperellum ................................................................................................................... 95
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 98
4.1

Kết luận............................................................................................................. 98

4.2

Kiến nghị .......................................................................................................... 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 100
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1
Phụ lục A. Bảng số liệu thô .............................................................................................. 1
A.1. Tốc độ tăng tưởng của các chủng Trichoderma spp. sau 2 ngày. ............................ 1
A.2. Đường kính trung bình vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma
sau 2 ngày ......................................................................................................................... 3
A.3 Đường kính trung bình vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma sau
2 ngày ............................................................................................................................... 5
A.4. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 2 ngày đối kháng invitro.
.......................................................................................................................................... 7
A.5. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 4 ngày đối kháng invitro.

.......................................................................................................................................... 9
A.6. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 6 ngày đối kháng invitro.
........................................................................................................................................ 11

iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A7. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 7 ngày đối kháng invitro.
........................................................................................................................................ 13
Phụ lục B: Hình ảnh ....................................................................................................... 16
B1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp. sau 2 ngày nuôi cấy trên
môi trường PDA ............................................................................................................. 16
B2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitin (cm) của các chủng
Trichoderma 2NSC ........................................................................................................ 18
B3 Kết quả khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm
gây bệnh đốm trắng trên thanh long ............................................................................... 25
B4. Lô thí nghiệm và lô đối chứng trong thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh của chế
phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng ............................................................................ 30

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CMC: Carboxymethyl cellulose.
NT: nghiệm thức.
ĐC: Đối chứng.

PDA: Potato D-glucose Agar.
VSV: Vi sinh vật
NSC: ngày sau cấy

vi


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma ........................................... 5
Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí ............. 37
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Trichederma asperellum ..
....................................................................................................................................... 54
Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái của chủng nấm phân lập được và nấm
Neoscytalidium dimidiatum theo mô tả bởi Crous & Slippes (2006) ........................... 61
Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập ............................ 62
Bảng 3.3 Đường kính tản nấm Trichodema spp. (cm) sau 2 ngày nuôi cấy ................ 75
Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng Trichodema spp ......... 78
Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichodema spp .............. 80
Bảng 3.6 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp. với Neoscytalidium
dimidiatum..................................................................................................................... 82
Bảng 3.7 Chiều dài và khối lượng thanh long trong từng công thức sau 30 ngày thử
nghiệm. .......................................................................................................................... 90
Bảng 3.8 Tình hình bệnh đốm trắng thanh long ở các công thức ................................. 94
Bảng 3.9 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu
ban đầu và 15 ngày sau ủ .............................................................................................. 94

vii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum ................................................. 5
Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp ..................................... 9
Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia solan
....................................................................................................................................... 13
Hình 1.4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết
ra từ Trichoderma harzianum ....................................................................................... 16
Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp ............................................ 21
Hình 1.6 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose ................................................... 35
Hình 1.7 Hợp chất cao phân tử Cellulose ..................................................................... 35
Hình 3.1 Hình thái đại thể của chủng nấm gây bệnh đốm trắng sau 3 ngày nuôi cấy
trên môi trường PDA ..................................................................................................... 60
Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử..................... 61
Hình 3.3 Hình thái đại thể của chủng nấm Trichoderma T3, T22 và T26 sau 2 ngày nuôi
cấy trên môi trường PDA .............................................................................................. 77
Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng Trichoderma.T22, TC15 và
TC6 ................................................................................................................................................................................................. 79
Hình 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng Trichoderma T22, T3 và TC7 ......
....................................................................................................................................... 82
Hình 3.6 Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 2,4,6,7NSC .................... 86

viii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 2,4,6,7 NSC ............................................. 86
Hình 3.8 Sợi nấm Trichoderma T3 tấn công Neoscytalidium dimidiatum dưới kính hiển
vi quang học với độ phóng đại 100X ............................................................................ 86
Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen 18S ......................................................................... 87
Hình 3.10 Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm Trichoderma spp ....
....................................................................................................................................... 87
Hình 3.11 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều
kiện trong chậu .............................................................................................................. 88
Hình 3.12 Kết quả thử nghiệm ở điều kiện trong chậu ................................................ 89
Hình 3.13 Tỷ lệ bệnh của thanh long trong từng công thức 30 ngày sau tưới ............. 90
Hình 3.14 Sinh viên thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm Trichoderma asperellum
ngoài đồng ruộng........................................................................................................... 92
Hình 3.15 Cây thanh long ở công thức đối chứng và thí nghiệm ................................ 93
Hình 3.16 Cành thanh long bị nhiễm bệnh ở công thức đối chứng (a) và thí nghiệm (b)
....................................................................................................................................... 93
Hình 3.17 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm ............. 95
Hình 3.18 Thanh long ở công thức đối chứng 15 ngày sau ủ ...................................... 95
Hình 3.19 Thanh long ở công thức thí nghiệm 15 ngày sau ủ ..................................... 96

ix


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây Thanh long (Hylocereus undulatus Haw) thuộc họ xương rồng có nguồn gốc
ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Đây là cây ăn quả nhiệt đới, thích hợp
khí hậu nắng nóng, chịu hạn tốt nhưng không chịu úng, sau khi trồng một năm cây bắt
đầu cho quả. Cây Thanh long thích hợp với nhiều chân đất như đất xám, đất phù sa, đất

đỏ và đất phèn, quả có nhiều chất dinh dưỡng nên có hiệu quả kinh tế cao do giá bán
cao và có giá trị xuất khẩu. Trên thế giới, Thanh long đã và đang là cây ăn quả quan
trọng đem lại hiệu quả kinh tế lớn cho nhiều nước như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia,
Trung Quốc,…
Thanh long được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam khoảng 100 năm nay,
nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980. Thanh long gồm có 3
loại: ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ và ruột trắng vỏ vàng nhưng phổ biến ở Việt Nam
là hai giống ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ.
Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho cây Thanh long
sinh trưởng phát triển tốt. Theo Cục Bảo vệ thực vật (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông
thôn), trên cả nước hiện trồng khoảng 33.600 ha cây thanh long thương phẩm. Trong
đó, tại tỉnh Bình Thuận có 24.000 ha, Long An có 5.400 ha và tỉnh Tiền Giang trồng
4.200 ha (năm 2014) [39].
Tuy nhiên, nhiệt độ cao lượng mưa lớn cũng là điều kiện thuận lợi cho các vi sinh
vật phát triển và gây hại. Trong quá trình sinh trưởng, Thanh long bị gây hại bởi một số
loại dịch hại như kiến, bọ xít, ruồi vàng, bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm
nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành
(Sphaceloma sp) và gần đây là bệnh đốm trắng do nấm gây ra.

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bệnh đốm trắng mới phát hiện tại nước ta từ tháng 6 năm 2013, gây hại trên thân,
quả và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Bệnh gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát
triển của cây, làm giảm năng suất, chất lượng quả ở các vùng sản xuất Thanh long tập
trung như Bình Thuận, Tiền Giang. Đặc biệt, các vết đốm tồn tại trên quả đã làm giảm
giá trị thương phẩm. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên cây Thanh long ở Việt
Nam hầu như rất ít. Xuất phát từ thực trạng trên, việc nghiên cứu tìm hiểu tình trạng

dịch bệnh đặc biệt là bệnh đốm trắng trên cây Thanh long là vấn đề rất quan trọng được
các nhà chuyên môn, tổ chức trong nước và quốc tế quan tâm. Theo Võ Thị Thu Oanh
(2015), nấm gây bệnh đốm trắng thanh long có trong đất, việc lây lan cũng bắt đầu từ
đất và nguồn nấm bệnh trên cành, quả. Hiện vẫn chưa có giải pháp quản lý bệnh hiệu
quả, việc phòng trừ bệnh đốm trắng thanh long chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học để
phun lên cây, nhưng hiệu quả không cao. Hơn nữa, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật
trong sản phẩm là rào cản lớn nhất để xuất khẩu thanh long ra các thị trường khó tính
như EU, Mỹ, Nhật... Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiến hành thực hiện đề tài:
“Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. với nấm gây
bệnh đốm trắng trên cây Thanh long”, nhằm tìm ra biện pháp an toàn để quản lý tác
nhân này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm kiếm các chủng Trichoderma spp. có khả năng phòng trừ nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long. Đồng thời bổ
sung các chủng mới cho bộ sưu tập nấm Trichoderma spp. của phòng thí nghiệm Công
nghệ sinh học trường đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
3. Nội dung nghiên cứu
– Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long.
– Xác định khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp
2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

– Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Trichoderma spp.
– Tuyển chọn chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây hại trên thanh long, từ đó đánh giá khả năng
phòng trừ bệnh trên đồng ruộng.
– Xử lí các phế phẩm thanh long bằng phương pháp ủ compost.
4. Đối tượng nghiên cứu

- Các dòng nấm đối kháng thuộc chi Trichoderma.
- Bệnh đốm trắng thanh long.
- Cây trồng: Thanh long.
5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp
“Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. với nấm
gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long” có tất cả 3 chương gồm:
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân
bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây thanh long ở Việt Nam. Qua
đó, trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của nấm bệnh
Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long. Từ đó, đưa ra các kết quả
nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm
Trichoderma spp. trong quản lý bệnh hại trên cây thanh long, cụ thể như khả năng
phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối kháng với nấm bệnh cây trồng.
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương
pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm
tiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu
tập trung ở nấm bệnh, cũng như đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma
spp. đối với nấm bệnh bằng phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS.

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm bệnh
Neoscytalidium dimidiatum. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm
Trichoderma với nấm bệnh trên cây thanh long đã được phân lập.

4

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp.
1.1.1 Phân loại.
Chi Trichoderma được mô tả bởi Christiaan Hendrik Persoon năm 1794, nhưng
các nguyên tắc phân loại vẫn khó xác định. Theo truyền thống, hệ thống phân loại
thường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và
quá trình sinh sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc
phân loại [38]:
Giới:

Fungi

Ngành:

Ascomycota

Lớp:

Sordariomycetes

Bộ:

Hypocreales

Họ:

Hypocreaceae

Chi:

Trichoderma

Hình 1. 1 Hình thái vi thể của
Trichoderma harzianum [38].

1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập
Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng tùy
từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [6]

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Một số loài Trichoderma spp. được ứng dụng trong phòng trừ sinh học:
Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma
Tên loài

Đặc điểm

Hình ảnh

Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh,
đạt 8 - 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở

20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày,
trơn láng rộng 2 - 14µm. Bào tử màu
Trichoderma

xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục

atroviride

đường kính từ 4 - 12µm, khi nấm già
thường mất màu hay màu vàng nhạt
hoặc xám, bào tử già phát ra mùi
hương dừa (Kubicek và Harman,
1998) [6].
Đại thể: Môi trường có nhiệt độ từ
15 - 350C, pH: 3,7 - 4,7 rất thích
hợp cho sự phát triển của nấm
(Dosmch và Gams, 1980). Khuẩn

Trichoderma

lạc phát triển nhanh, đường kính

hazianum

khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở
nhiệt độ 200C. Bào tử đính có hình
cầu méo đến bầu dục ngắn, màu
xanh lục, vách trơn láng, kích thước
(2,7 - 3,2)x(2,5 - 2,8)µm

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến
trong đất (cook và baker, 1983), nảy
mầm tốt nhất trong môi trường mùn
cưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch
và Gams,1980) [5].
Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính
3 - 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở
nhiệt độ 200C, bào tử có hình trụ
ngắn, vách trơn láng, kích thước
Trichoderma
koningii

(3,0 - 4,8)x(1,9 - 2,8)µm.
Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp
đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cm
vẫn có sự hiện diện của loài nấm
này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ
từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốc
của loài, pH: 3,7 - 6,0 [6].
Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt
7 cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200C.
Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng

Trichoderma

elip, có kích thước khác nhau tùy

hamatum

theo

chủng

(Domsch

và

Gams,1980).
Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3,7
- 4,7 là những điều kiện rất thuận
lợi

cho

sự

phát

triển

7

của

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trichoderma hamatum và chúng
phát triển chậm lại ở 00C (Domsch
và Gams,1980) [5].
Đại thể: Bào tử màu xanh lục, vách
xù xì, dạng hình cầu, kích thước (45)x(2,5-3)µm.

(cook

và

baker,

1983) [6].
Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai
Trichoderma

nguồn nitrogen đơn giản và phức

viride

tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng
trên nguồn cacbonhydrate như là
nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì
ammonium được sử dụng tốt hơn là
nitrate (Danielson và Davey, 1973)
[19].

1.1.3 Đặc điểm hình thái [9].

8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp [38].
Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất.
Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất,
trên vỏ cây mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của
cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi
mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và
Eveleigh,1998). Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có
liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung
tính hoặc kiềm.
Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân
nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình
trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Bào tử của
hầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3)
rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5
µm.
Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9
cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998). Chúng
phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng
tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%). Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả
năng này mất dần đi. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học
của Trichoderma.
Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến
hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất. Độ nhạy của đất kháng nấm được
công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acide. Các bào tử phân sinh kháng nấm

nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh. Thiết lập quần

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: VSV trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều
loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau. Khi sợi nấm non
(chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh hưởng nhiều bởi thành phần môi trường đất. Bào tử
sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong
đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất).
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma
harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.
Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của
Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên
Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.
1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp
nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là
monosaccharide, disaccharide, polysaccharide…NH3 là nguồn đạm mà nấm
Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta
thường bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường
có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng
sinh trưởng của Trichoderma [28].
Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C, có một vài loài Trichoderma tăng
trưởng được ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C. Trichoderma phát triển tốt ở đất có
độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt
ở pH trung tính [16].
Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác

nhau. Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống
trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum
10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu
ấm áp.
Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá
trình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá
trình chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa. Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ
đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998). Quá
trình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng
hoặc ánh sáng. Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát triển trong cảm ứng tối do
thiếu dinh dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâm
của khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết. Mặt khác, việc hình thành bào
tử được cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triển
trong tối, trước khi để chiếu sáng [26].
1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây
bệnh cây trồng
Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại các loài nấm gây hại
như: Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytisspp.
và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu
riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà chua
[1].
Nấm Trichoderma spp. đối kháng với nấm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau: ký
sinh, tiết kháng sinh để tiêu diệt nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh nơi
sống với nấm bệnh [29].

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.5.1 Cạnh tranh.
Dinh dưỡng có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của VSV. Thiếu
dinh dưỡng là được coi là nguyên nhân gây chết rất phổ biến. Trichoderma cạnh tranh
khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng
chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores).
Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và
Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng
chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử
dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm
Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và
Sclerotina spp. [18].
Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium
spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào
tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự
nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào
tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây
bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương,
do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh [18].
Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng
trưởng khác với nấm bệnh. T. harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây
bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại
những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự
cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. harzianum sử dụng để kiểm soát
nấm bệnh F. oxysporum [26].

12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.5.2 Kí sinh [11].
Là hiện tượng "giao thoa sợi nấm". Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung
quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi
nấm. Cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của
nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm bệnh. Những
nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho
thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự
xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy
phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi
nấm vật chủ. Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá
rối từng phần hoặc hoàn toàn.

Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm
gây bệnh Rhizoctonia solani [22]
Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng
các sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma. Một điều quan trọng cho sự ký sinh
của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bao tử của nấm Trichoderma sau
khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thành
được thể giác bám. Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

của nấm vật chủ. Tỷ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm
Trichoderma với nấm vật chủ.
1.1.5.3 Tiết kháng sinh [9].
Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký
sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của
nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động
của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh.
Howell (1987), thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng ký sinh
nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh
Rhizoctonia solani tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh
không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng
sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một
trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức
chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác.
Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau. Chúng gồm:
– Gliotoxin: chất kháng sinh này được R. Weindling và O. Emerson mô tả năm
1936 do nấm T. lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh
ra. Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm
(Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia…).
– Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo
thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945.
Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như
một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm, được sản xuất từ T.
virens.

14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

– Trichodermin và Dermadin: Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát
hiện được hai chất kháng sinh Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài
T. koningii và T. aureoviride.
Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có
liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides,
isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T. harzianum sinh ra; các kháng sinh
gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T. virens sinh ra.
Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt
các hợp chất hóa học. Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể
được phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl - α – pyrone
(6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii)
peptaibol. Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22
aminoacid có chứa nhiều α - aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa
một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T. polysporum, harzianum,
koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình
thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự
phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh.
Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của
Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh.
Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T. harzianum bổ sung vào môi trường nuôi
cấy của chủng Pythium ultimum. Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) môi trường có chứa
kháng sinh 6PP được tiết ra từ chủng T. harzianum, ức chế sự phát triển của chủng
Pythium ultimum [23].

15