Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ aspergillus spp ​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSANASE
TỪ ASPERGILLUS SPP.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGÔ ĐẠI NGHIỆP
Sinh viên thực hiện
MSSV: 0851110196

: PHẠM MINH SANG
Lớp: 08DSH6

TP. Hồ Chí Minh, 2012


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ................................................................................. ix

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ................................... Error! Bookmark not defined.
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ..................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Đại cương về chitin và chitosan .....................................................................6

1.1.1.

Lịch sử phát hiện .......................................................................................6

1.1.2.

Phân bố và đặc điểm sinh hóa ..................................................................7

1.1.2.1.

Phân bố ................................................................................................7

1.1.2.2.

Đặc điểm sinh hóa ...............................................................................7

1.1.3.

Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin ......................10

1.1.4.

Ứng dụng của Chitosan và các dẫn xuất thủy phân từ Chitosan .........13

1.2.

Đại cương về hệ enzyme Chitosanase..........................................................16

1.2.1.

Định nghĩa ...............................................................................................16

1.2.2.

Nguồn gốc và phân loại ..........................................................................16

1.2.3.

Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitosanase ...................................19

1.2.3.1.

Trọng lượng phân tử..........................................................................19

1.2.3.2.

Tính đặc hiệu cơ chất ........................................................................19

1.2.3.3.

Đặc tính thủy phân ............................................................................20

1.2.3.4.

Đặc tính động học .............................................................................21

i


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.2.3.5.

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của chitosanase ........22

1.2.3.6.

Chất hoạt hóa và chất ức chế ............................................................24

1.2.4.

Cảm ứng tổng hợp, tinh chế và xác định hoạt tính chitosanase ...........24

1.2.4.1.

Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase .................................................24

1.2.4.2.

Tinh chế chitosanase .........................................................................25

1.2.4.3.

Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase ...................................26

1.2.5.

Ứng dụng của chitosanase ......................................................................26

1.2.6.

Tình hình nghiên cứu chitosanase trên Thế giới và ở Việt Nam .........27

1.3.

1.2.6.1.

Tình hình nghiên cứu chitosanase trên thế giới ................................27

1.2.6.2.

Tình hình nghiên cứu chitosanase ở Việt Nam..................................28

Khái quát về lên men bán rắn ......................................................................29

1.3.1.

Định nghĩa lên men.................................................................................29

1.3.2.

Lên men bán rắn .....................................................................................29

1.3.3.

So sánh lên men bán rắn với lên men chìm ...........................................30

1.4.

Khái quát về Aspergillus spp. .......................................................................32

1.4.1.

Giới thiệu về Aspergillus spp. .................................................................32

1.4.2.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Aspergillus spp. ...................................33

1.4.3.

Một số ứng dụng của Aspergillus spp. ...................................................34

1.5.

Khái quát về nguồn nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu trong nước .............35

1.5.1.

Nguồn cám gạo trong nước ....................................................................35

1.5.2.

Nguồn vỏ trấu trong nước ......................................................................36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
2.1.

Vật liệu ...........................................................................................................38

2.1.1.

Chủng giống ............................................................................................38

ii


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.1.2.

Cơ chất cảm ứng .....................................................................................38

2.1.3.

Cơ chất nuôi cấy ......................................................................................38

2.1.4.

Hóa chất và thiết bị .................................................................................38

2.1.4.1.

Hóa chất ............................................................................................38

2.1.4.2.

Thiết bị ...............................................................................................39

2.1.5.

2.2.

Môi trường ...............................................................................................39

2.1.5.1.

Môi trường giữ giống ........................................................................39

2.1.5.2.

Môi trường nhân giống .....................................................................39

2.1.5.3.

Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme ..............................................40

2.1.5.4.

Môi trường lên men bán rắn .............................................................41

Phương pháp .................................................................................................41

2.2.1.

Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu ............................................41

2.2.2.

Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử ..................................42

2.2.2.1.

Cấy nhân sinh khối ............................................................................42

2.2.2.2.

Xác định số lượng bào tử bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm

hồng cầu ……………………………………………………………………...42
2.2.3.

Phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm

mốc có hoạt tính chitosanase cao.........................................................................43
2.2.3.1.

Nguyên tắc .........................................................................................43

2.2.3.2.

Tiến hành ...........................................................................................43

2.2.4.

Phương pháp khuếch tán thạch đĩa .......................................................44

2.2.5.

Phương pháp mô tả hình thái vi sinh vật ...............................................44

2.2.5.1.

Quan sát đại thể ................................................................................44

2.2.5.2.

Quan sát vi thể ...................................................................................44

iii


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.2.6.

Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn...................................44

2.2.7.

Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic)

xác định hoạt tính chitosanase .............................................................................45
2.2.7.1.

Nguyên tắc .........................................................................................45

2.2.7.2.

Tiến hành ...........................................................................................45

2.2.8.

Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein.........................47

2.2.8.1.

Nguyên tắc .........................................................................................47

2.2.8.2.

Tiến hành ...........................................................................................47

2.2.9.

Phương pháp trích ly enzyme chitosanase .............................................48

2.2.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý thống kê .................................49
2.2.10.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................49
2.2.10.2. Xử lý thống kê ....................................................................................49
2.2.11. Bố trí thí nghiệm .....................................................................................49

2.2.11.1. Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase
cao……………………………………………………………………………..49
2.2.11.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất cảm ứng ..............49
2.2.11.3. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí ..........................50
2.2.11.4. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ...................50
2.2.11.5. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống .........................50
2.2.11.6. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ...................51
2.2.11.7. Nuôi cấy thu enzyme chitosanase ......................................................51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1.

Khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát ..52

3.1.1.

Định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase .....................................52

iv


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

3.1.2.
3.2.

Định lượng khả năng sinh tổng hợp chitosanase..................................53

Hình thái đại thể và vi thể của chủng O2 ...................................................54

3.2.1.

Hình thái đại thể .....................................................................................54

3.2.2.

Hình thái vi thể ........................................................................................55

3.3.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase ...............................................................................................................55
3.4.

Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 58

3.5.

Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase ...............................................................................................................61
3.6.

Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 64

3.7.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase ...............................................................................................................67
3.8.

Kết quả lên men bán rắn thu nhận enzyme ................................................70

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận .............................................................................................................71
4.2. Kiến nghị ...........................................................................................................71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................72
PHỤ LỤC..................................................................................................................1

v


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CMC

Carboxy Methyl Cellulose

GlcN

Glucosamine

GlcNAc

N – acetyl glucosamine

kDa

Kilo Dalton

O1

Aspergillus oryzae – 1

O2

Aspergillus oryzae – 2

N1

Aspergillus niger – 1

N3

Aspergillus niger – 3

N7

Aspergillus niger – 7

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

PGA

Potato Glucose Agar

LSF

Liquid state fermentation

SSF

Solid state fermentation

vi


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC BẢNG
TT

Bảng

1

1.1

2

1.2

3

1.3

4

1.4

5

1.5

6
7
8
9
10
11
12

1.6
1.7
1.8
1.9
2.1
2.2
2.3

13

2.4

14

3.1

15

3.2

16

3.3

17

3.4

18

3.5

19

3.6

20

3.7

21

3.8

22

3.9

23

3.10

24

3.11

25

3.12

26

3.13

Nội dung
Trang
Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các
10
oligomer của chitosan
Các chitosanase trong Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên
17
kết glycoside

Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ các loài khác
18
nhau
Đặc điểm thủy phân của một số chitosanase vi sinh vật
20
Hằng số Michaelis và Vmax của chitosanase ở một số loài
20
tiêu biểu
Giá trị pH tối ưu của một số chitosanase
22
Nhiệt độ tối ưu của một số chitosanase
23
So sánh giữa các quá trình lên men lỏng và rắn
30
Thành phần xơ và giá trị dinh dưỡng của các nguyên liệu
35
Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine
36
bước tiến hành xác định hoạt tính đối với mẫu thí nghiệm
37
Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine
38
Các nghiệm thức khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng lên khả
39
năng sinh tổng hợp Chitosanase)
Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương
42
pháp cấy điểm của các chủng O1, O2, N1, N3, N7
Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các
43

chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh
46
tổng hợp chitosanase
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng
47
protein
Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp
49
chitosanase
Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein.
50
Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng
51
hợp chitosanase
Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein.
53
Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp
54
chitosanase.
Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein.
56
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng
57
hợp chitosanase.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein
58
Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với
60
chủng O2.

vii


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
1
2
3
4

5

6
7

8
9
10
11
12

Nội dung
Hình
Trang
1.1 Công thức cấu tạo của chitin
7
1.2 Công thức cấu tạo của chitosan

8
1.3 Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan
9
Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt
1.4
9
chitosan
Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn (SSF) (Moo –
Young và cộng sự, 1983) – sự sắp xếp các hạt chất rắn ẩm
1.5
30
và pha khí liên tục trong hệ thống SSF với hệ nấm sợi (bên
trái) và sinh vật đơn bào (bên phải).
Hình thái đại thể chủng O2, mặt trên khuẩn lạc (bên trái)
3.1
54
và mặt dưới khuẩn lạc.
Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi
3.2 chưa nhuộm - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính
55
40.
Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi
3.3 nhuộm Methylene Blue - ảnh được quan sát và ghi nhận ở
55
vật kính 40.
PL1 Khuẩn lạc và đường kính vành khuyên phân giải
1
PL2 Bình nhân giống chủng O2 trên môi trường lúa
2
PL3 Đường chuẩn D - glucosamine

3
PL4 Đường chuẩn Albumine
3

viii


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
TT

Biểu đồ

1

3.1

2

3.2

3

3.3

4

3.4

5

3.5

6

3.6

7

3.7

8

3.8

9

3.9

10

3.10

11

3.11

Nội dung
Trang

Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của
53
các chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng
56
sinh tổng hợp chitosanase
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng
58
protein
Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng
59
hợp chitosanase
Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein
60
Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh
61
tổng hợp chitosanase
Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein
63
Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng
65
hợp chitosanase
Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein
66
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
68
tổng hợp chitosanase
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein
69

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
TT

Sơ đồ

1

1.1

Nội dung
Trang
Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer
12
(Tokutake và cộng sự, 1986).

ix


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên; trong động
vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiêm tỷ lệ khá
cao, từ 14-35% so với trọng lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan và các dẫn
xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiêu lĩnh vực như trong nông
nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y
dược,... Do dó, việc nghiên cứu sản xuât chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng
đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu.
Các sản phẩm từ các loài giáp xác trên toàn thế giới ước tính tới 1,9 triệu tấn

mỗi năm, phần lớn các sản phẩm từ tôm được sản xuất từ các nước châu Á trong đó
có Việt Nam. Mỗi năm ngành công nghiệp này thải ra 1,4 triệu tấn chất thải với chủ
yếu là vỏ và đầu tôm. Phương thức xử lý phần thừa thông dụng hiện nay chủ yếu là
đốt bỏ, thải ra biển hoặc tập kết đến nơi xử lý rác. Cách làm này làm ô nhiễm vượt
mức cho phép tại các khu vực có kinh doanh khai thác chế biến các loại giáp xác. Ở
nước ta, sản lượng phế phụ phẩm từ các nhà máy chế biến thủy hải sản là rất lớn.
Theo ước tính mỗi năm riêng các nhà máy chế biến thủy, hải sản thải ra môi trường
hơn 70 nghìn tấn phế liệu là vỏ tôm, cua các loại.
Nếu các phế phẩm này được chế biến thành các sản phẩm có giá trị, ngoài
việc mang lại nguồn lợi cao, nó còn góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm và các chi
phí phát sinh trong quá trình xử lý chất thải.
Chitin, chitosan có thể được thủy phân để tạo thành những chất có hoạt tính
sinh học cao bằng phương pháp hóa học (acid HCl đậm đặc) hoặc bằng phương
pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicellulase,…). Việc thủy phân
chitin, chitosan bằng phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm như chi phí cao,
hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, gây hao mòn máy móc thiết bị cao và quan
trọng là sản phẩm thu được có hoạt tính không cao. Vì vậy, việc nghiên cứu sản
xuất các dẫn suất thủy phân từ chitin và chitosan bằng phương pháp sinh học là một

1


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng nhẹ, ít gây ô nhiễm môi trường
và nhất là sản phẩm thu được có chất lượng tốt.
Bên cạnh đó, nấm mốc là nguồn cung cấp hệ enzyme ngoại bào vô cùng
phong phú, khả năng sinh trưởng mạnh trên các nguồn cơ chất khác nhau. Vì vậy,
việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase trên nấm mốc là việc
làm cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho nguyên liệu, hóa chất và quan trọng là sẽ

dễ dàng đưa vào ứng dụng sản xuất với điều kiện trong nước.
Vì những lý do trên, tôi quyết định chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thu
nhận chitosanase từ Aspergillus spp.” trong khóa luận tốt nghiệp này.
2. Tình hình nghiên cứu
Trong nước:
+ Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ
Streptomyces griceus, Phạm Hồng Ngọc Thùy – Khoa chế biến trường đại
học Nha Trang (03/2008).
+ Thu nhận và mô tả đặc tính của enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1, Nguyễn Thị Phương Nhung – Trường Đại học Nông
Nghiệp Hà Nội (2012).
+ Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitosanase từ mẫu đất ở Phước Long – Nha Trang; Nguyễn Trọng Thăng và
Ngô Xuân Mạnh; Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông
nghiệp Hà Nội (2011).
+ Lâm Ngọc Tuyết, Đỗ Anh Tuấn, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước
(2003), Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa chitosanase trong E. Coli, Những
vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Hội nghị toàn quốc lần
thứ 2, Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp và Y học, Bộ Khoa
học và Công nghệ, Hội đồng Khoa học tự nhiên, Ngành Khoa học sự sống,
Huế.
+ Cao Thị Ngọc Phượng, Ngô Phước Hậu, Đỗ Anh Tuấn, Trần Linh Thước,
Jügen Pleiss (2003), Xây dựng cơ sở dữ liệu protein phục vụ nghiên cứu sinh

2


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

học: trường hợp chitinase và chitosanase, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn

quốc 2003, Bộ Khoa học và Công nghệ, Hội các ngành Sinh học Việt Nam,
Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà Nội.
Nước ngoài:
+

J. S. PRICE and R. STOCK;

Production, Purification, and

Characterization of an Extracellulase Chitosanase from Streptomyces;
Journal of Bacteriology (12/ 1975).
+ Tamo Fukamizo, Yuji Honda, Sachio Goto, Isabelle Boucher and Ryszard
Brzezinski; Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174;
Biochem. J. (1995). Great Britain.
+ Xiao-E Chen, Xu-Bo Fang và Wen-Sui Xia; Strain imvironment and
optimization of the media composition of chitosanase-producing fungus
Aspergillus sp. CJ 22-326; African Journal of Biotechnology Vol. 7 (14), 18
July, 2008.
+ Chih-Yu Cheng, Chu-Han Chang, Yue-Jin Wu, và Yaw-Kuen Li;
Exploration of Glycosyl Hydrolase Family 75, a chitosanase from
Aspergillus fumigatus; The Journal of Biological Chemistry Vol. 281, NO. 6,
February 10, 2006. U.S.A.
3. Mục đích nghiên cứu
-

Nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.

-

Làm phong phú thêm nguồn thu nhận chitosanase từ vi sinh vật.

-

Tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ 5 chủng Aspergillus ban đầu,
chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất để tiến hành
nghiên cứu.

-

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men.

-

Tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính chitosanase của chủng được chọn
trên môi trường tối ưu hóa.

3


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

5. Phương pháp nghiên cứu
Trong nuôi cấy vi sinh vật, khả năng thuần cũng như khả năng sinh ra các
hoạt chất cao của giống là yếu tố quyết định đến hiệu suất của quá trình. Vì vậy,
trước khi thực hiện, cần tiến hành khảo sát từ 5 chủng mốc giống được cung cấp để

chọn ra được chủng cho kết quả khảo sát tối ưu nhất trên môi trường thực hiện khảo
sát.
Sau khi đã chọn được chủng tiến hành nghiên cứu, thực hiện việc nghiên cứu
đối với chủng được chọn trên các yếu tố môi trường ảnh hưởng lên khả năng sinh
tổng hợp enzyme như: tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, độ thoáng khí, tỷ lệ tiếp giống, thời gian
nuôi cấy… Trong các thí nghiệm này, thông số thay đổi là mức của các yếu tố và
chỉ tiêu theo dõi chính là hoạt tính enzyme và hàm lượng protein thu được ở từng
mức của yếu tố khảo sát.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
-

Đã chọn ra được một chủng từ 5 chủng giống được cung cấp.

-

Đã tối ưu hóa được một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh
tổng hợp chitosanase.

-

Đã tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính của enzyme trên môi trường đã
tối ưu hóa.

7. Kết cấu của đồ án
-

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU – nội dung chương đề cập đến các
nội dung có liên quan đến đề tài nghiên cứu.

-

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP – nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ thiết bị và đặc biệt là các phương pháp thực nghiệm dùng
trong đồ án.

-

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN – nội dung chương đưa ra những
kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện chứng cho những kết
quả thu được.

4


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

-

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ – nội dung chương tóm tắt lại
những kết quả mà đề tài đạt được và đệ trình những phần cần thực hiện thêm
của đề tài.

5


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.1.

Đại cương về chitin và chitosan

1.1.1. Lịch sử phát hiện
Chitin được Braconnot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch
chiết của một loại nấm và ông đã đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra
nó. Năm 1823, Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là
“chitin” hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ. Nhưng không phát hiện ra sự có mặt của
Nitơ, cuối cùng cả Braconnot và Odier đều cho rằng cấu trúc của chitin giống cấu
trúc của cellulose [3].
Năm 1929, Karrer đun sôi chitin với dung dịch KOH 5% trong 24 giờ và đun
tiếp ở 160oC với kiềm bảo hòa trong 50 phút, ông thu được sản phẩm có phản ứng
màu đặc trưng với thuốc thử, sản phẩm đó chính là chitosan [3].
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và ứng dụng của
chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ X. Nhật, Mỹ, Ấn Độ, Trung
Quốc và Pháp là những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất
chitosan. Năm 1973, Nhật Bản là nước đầu tiên sản xuất chitosan thương phẩm với
sản lượng 20 tấn/năm, hiện nay đã lên tới hơn 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300
tấn/năm. Theo Know (1991), thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là
Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật Bản được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản
xuất và buôn bán chitin, chitosan. Theo như ước tính của các nhà phân tích, trong
những năm tới sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm, trong đó, Nhật và Mỹ
là những nước sản xuất chính [1].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan và ứng dụng trong
sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới mẻ. Vào những năm 1978 –
1980, trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan
của tác giả Đỗ Minh Phụng. Điều này đã mở đầu bước ngoặc quan trọng trong việc
nghiên cứu, tuy nhiên vẫn chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất [1].

6

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh hóa
1.1.2.1.

Phân bố

Chitin là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được
tổng hợp với năng suất trung bình là 20 g/năm/m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên,
chitin hiện diện ở động vật và thực vật. Ở động vật, chitin được tìm thấy trong lớp
vỏ ngoài của tôm, cua và các loài giáp xác; là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ
một số loài động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể và giun tròn. Ở
thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [11].
1.1.2.2.

Đặc điểm sinh hóa

Chitin là chất rắn vô định hình, bền, không tan trong nước, acid, kiềm, cồn
và các dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin cũng có thể bị thủy giải bởi acid vô
cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) hoặc bởi enzyme vi sinh vật [7].
Ngoài ra, chitin ít hiện diện ở trạng thái tự do, thường ở dạng phức hợp với các
protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác [3].
Chitin là polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các đơn phân N – acetyl
glucosamine (GlcNAc), có thể xem như là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (–
OH) ở C2 được thay thế bằng nhóm acetyl amino (-NHCOCH3). Như vậy, chitin là
poly N – acetyl – 2 – amino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose liên kết với nhau
bởi các liên kết 1,4 – β – glycoside. Trong đó, các mắc xích của chitin cũng được
đánh số như glucose [3].

Công thức phân tử: [C8H13NO5]n

Mchitin = (203,186)n
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin

7


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Phụ thuộc vào nguồn gốc đặc điểm từng vùng, chitin có hai loại cấu trúc đặc
trưng, gọi là dạng α và β. Sự khác nhau giữa hai dạng này được nhận biết bằng các
phương pháp phổ nghiệm như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR) chụp trạng thái rắn kết hợp với phân tích nhiễu xạ tia X (XRD). Dạng thứ
ba ít phổ biến hơn là γ – chitin, nhưng xuất phát từ các số liệu phân tích, theo một
số nhà phân tích thì dạng thứ ba chỉ là một dạng khác trong cấu trúc của α – chitin.
α – chitin là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, cua,
các loài nhuyễn thể là thức ăn của cá voi và trong biểu bì của các loại côn trùng…
hiếm hơn là dạng β – chitin, được tìm thấy trong protein của mực ống [7].
Chitin là một nguyên liệu bền, giúp các loài giáp xác chống lại các tác nhân
gây hại và áp suất của môi trường.
Để thủy phân hoàn toàn chitin, vi sinh vật có khả năng thủy phân chitin hầu
hết đều có một hệ gồm 2 loại enzyme thủy phân là chitinase và chitobiase (β – N –
acetylglucosaminidase hoặc β – N – acetylhexosaminidase) [13].
Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế
nhóm (–NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan có cấu trúc mạch thẳng được hình thành
từ các đơn phân D – glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – β – glycoside,
do vậy chitosan có thể gọi là poly 1,4 – β – 2 – amino – 2 – deoxy – D – glucose
hay poly 1,4 – β – D – glucosamin.

Công thức phân tử: [C6H11NO4]n
Mchitosan = (161,151)n

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitosan.
Chitosan được tạo thành từ quá trình hóa học hay enzyme đều không bị khử
hoàn toàn nhóm acetyl. Tỷ lệ acetyl còn lại trong chitosan khác nhau tùy theo

8


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

phương pháp khử acetyl và tính nhạy cảm của enzyme. Sự phân bố N – acetyl
glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN) trên mạch chitosan cũng ảnh hưởng
đến hoạt tính enzyme thủy phân chúng. Chitosan có hai dạng dị liên kết là GlcNAcGlcN, GlcN – GlcNAc và hai đồng liên kết là GlcNAc – GlcNAc, GlcN – GlcN. Do
vậy, sự thủy phân các liên kết này trong chitosan bằng enzyme cũng khác nhau [13].
Trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử
chitosan (khoảng 10%). Vì vậy, công thức chính xác của chitosan được thể hiện như
Hình 1.3, trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitin [8].

Hình 1.3. Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan.
Độ deacetyl hóa – DD (Degree of deacetylation), là tỷ lệ thay thế nhóm –
NHCOCH3 bằng nhóm –NH2 trong phân tử chitin (Hình 1.4.). Nếu DD < 50% thì
là chitin, DD ≥ 50% thì là chitosan [7].

Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt chitosan
Độ deacetyl hóa có thể được xác định dựa vào:
 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H – NMR).

9


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

 Phổ hồng ngoại IR.
 Chưng cất chitin, chitosan với acid phosphoric
 Phản ứng tạo màu với ninhydrin.
 Xác định theo Nitơ [32].
Khi hòa tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo
dương, nhờ đó mà không bị tủa khi có mặt một số ion kim loại nặng như: Pb 2+,
Hg+… chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một
heteropolymer của “polycation”, có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm
như protein, amino polysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có
mặt của nhóm amino (-NH2) [12]. Trong khi hầu hết các polysaccharide trong tự
nhiên như cellulose, dextran, pectin, agar, agarose… đều trung tính hay có tính acid
thì chitosan (chitin) lại có tính base cao [32].
Nhiệt độ nóng chảy của chitosan là 309 – 311oC.
Trọng lượng phân tử chitosan thay đổi từ vài kDa đến hơn hai ngàn kDa, tùy
thuộc vào nguồn gốc của chúng. Trong tự nhiên, chitosan được tìm thấy trong vách
tế bào một số loài nấm như Zygomycetes, trong tảo lục Chlorella sp., cũng như
trong lớp vỏ của côn trùng, tôm, cua [33].
1.1.3. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin
Nguyên liệu giàu chitin có nguồn gốc từ các loài giáp xác như: tôm, cua,
mực, sam… được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ và ngâm trong dung dịch acid loãng
(HCl 6 – 12%) để loại bỏ các khoáng canxi và tạp chất. Hỗn hợp này được nấu với
dung dịch NaOH loãng (8 – 15%) để loại các protein tạp; sau đó ngâm lần lượt
trong các hỗn hợp dung dịch KMnO4 0,5% và H2SO4 10% (1:1), oxalic acid 3% để
tẩy màu, thu nhận sản phẩm là chitin. Để thu nhận được chitosan thì phải qua quá
trình khử nhóm acetyl của chitin bằng cách đun với dung dịch NaOH (40 – 50%)
[9].
Việc thủy phân chitin thành oligomer có thể được thực hiện bằng phương
pháp dùng acid [29], enzyme [3]. Sự thủy phân mạch polysaccharide của chitosan
bằng acid sẽ cắt đứt các liên kết glycoside giữa các phân tử đường D – glucosamin

10


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

tạo ra một hỗn hợp các đoạn oligomer. Một số loại acid mạnh như acid
hydrochloric, acid nitric, acid phosphoric và hydrogen fluoride đã được sử dụng để
thủy phân chitosan tạo oligomer ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau
(Bảng 1.1.).
Bảng 1.1. Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các oligomer của
chitosan [9].
Acid
Hydrochloric

Nitric
Phosphoric
Hydrogen fluoride

Nồng độ acid
phản ứng
35%
11%
35%
1%
35%
0,4 mM
70 mM
60%
85%

100%

Nhiệt độ phản
ứng (oC)
53
100
80
100
72
37
0
70
37
20

Thời gian
phản ứng
48 giờ
34 giờ
2 giờ
5 giờ
1 giờ
15 giờ
9 giờ
4 giờ
4 tuần
19 giờ

Các oligomer có kích thước mong muốn sẽ được phân đoạn và thu nhận bằng
các phương pháp sắc ký trao đổi ion, HPLC và lọc gel. Tuy nhiên, những phương

pháp này khó có thể áp dụng ở quy mô lớn, cũng như rất khó để tách được các
oligomer có kích thước lớn. Ngoài sắc ký, phương pháp tủa các oligomer có trọng
lượng phân tử lớn ở nhiệt độ thấp cũng đã được nghiên cứu và sử dụng [20].
Quy trình thủy phân chitosan bằng HCl 35% trong 3 giờ ở 80oC được đề
nghị bởi Tokutake và cộng sự (1986) hiện được sử dụng khá phổ biến. Nguyên tắc
cơ bản của quy trình này là dùng acid mạnh để thủy phân chitosan trong một thời
gian nhất định để tạo ra hỗn hợp chitosan polymer và chitosan oligomer. Sau đó
dùng phương pháp tủa phân đoạn để thu nhận các sản phẩm chitosan oligomer tinh
sạch có các kích thước khác nhau (Sơ đồ 1.1.).

11


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Sơ đồ 1.1. Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer (Tokutake và
cộng sự, 1986).
Các phương pháp hóa học kể trên thường làm thay đổi trọng lượng phân tử,
mức độ acetyl hóa sản phẩm và thoái biến những protein có giá trị dinh dưỡng cao

12


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

trong nguyên liệu, đồng thời tạo những sản phẩm phụ gây ô nhiễm môi trường. Vì
vậy, những quy trình khử khoáng và khử acetyl của chitin từ nguyên liệu giàu chitin
bằng enzyme cũng đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Hiệu quả khử protein
bằng enzyme tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu vỏ giáp xác và điều kiện tiến
trình xử lý. Xử lý nhẹ nguyên liệu vỏ giáp xác bằng enzyme có thể loại bỏ 90%

protein và carotenoid, sản phẩm carotenoprotein tạo thành này thường dùng làm
chất bổ sung cho thức ăn gia súc [48].
Chitin và chitosan ở trạng thái rắn đều bị thủy phân bằng acid (như: HCl,
HF, H3PO4…) ở nồng độ cao. Thủy phân bằng enzyme đòi hỏi mức độ hòa tan cao
của cơ chất trong môi trường. Sự phân cắt ngẫu nhiên nội mạch sẽ tạo những sản
phẩm oligomer đa dạng. Phản ứng thủy phân chitosan bằng enzyme có tính đặc hiệu
cơ chất (theo nhóm acetyl) nên vị trí phân cắt do thủy phân có thể được điều khiển
tạo các chitooligosaccharide được quan tâm nhiều trong các ứng dụng thực tiễn. Vì
độ hòa tan trong dung dịch của chitosan thường thấp nên nồng độ
chitooligosaccharide tạo ra cũng thấp. Như vậy, việc nghiên cứu enzyme có khả
năng thủy phân chitosan hòa tan ở pH thấp vừa mang lại hiệu quả về kinh tế vừa an
toàn với môi trường hiện đang là một thách thức lớn cho các nhà nghiên cứu [8].
1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn xuất thủy phân từ Chitosan
Những nghiên cứu gần đây cho thấy chitin, chitosan và những dẫn xuất của
chúng được ứng dụng nhiều trong các ngành hóa học, công nghệ sinh học, y học,
thú y, nha khoa, nông nghiệp, chế biến thực phẩm và bảo vệ môi trường… Những
ứng dụng này chủ yếu dựa trên các đặc tính đặc biệt của sản phẩm dẫn xuất như: có
sự hiện diện của những nhóm chức phản ứng, có khả năng tạo thành dạng gel, khả
năng bám hút cao, kháng nấm và vi khuẩn, kháng ung thư và khả năng phân hủy
sinh học [41]…
Trong lĩnh vực y học, chitin và chitosan được xem là những vật liệu sinh học
được định nghĩa là “vật liệu tương tác” có khả năng tương thích với mô tế bào xung
quanh và không tạo ra đáp ứng đào thải của vật chủ [54]. Do đó, chitin và chitosan
có một số các ứng dụng sau:

13


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

- Nguyên liệu làm chỉ phẫu thuật tự hủy: Đại học Delaware Mỹ đã chế tạo
thành công chỉ phẫu thuật tự hủy từ chitosan.
- Chitin làm tăng mức kéo giãn của vị trí mổ ở chuột và thỏ. Chitin nguyên
chất xúc tiến khả năng lành vết thương và không gây phản ứng phụ bất lợi [54].
- Tạo da nhân tạo: da nhân tạo làm từ chitin được gọi là Beschitin W, giống
như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần cho đến khi vết thương
lành. Tấm Beschitin W sẽ tự phân hủy sinh học cho đến khi lớp biểu bì mới ở vết
thương hình thành. Da nhân tạo từ chitin có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo
bỏng phục hồi nhanh chóng.
- Chitosan có đặc tính tăng cường tính thấm, tính bám dính sinh học và một
số đặc tính lý – hóa khác nên có thể được dùng làm chất tải trong thuốc nhỏ mắt (hệ
thống dạng gel chitosan hay những phần tử có kích thước nano), trong sản xuất
thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng [12].
- Một số thử nghiệm trên động vật nhỏ như chuột, chó cho thấy chitosan có
khả năng tăng cường hiệu quả trên các vết thương ở mạch máu, da, xương… điều
này cho thấy, khi sử dụng làm vật liệu sinh học, chitosan đều đạt các thử nghiệm an
toàn về khả năng không gây đột biến, gây độc cấp tính, mãn tính, gây sốt…
Tuy có nhiều tiềm năng, nhưng trong thực tế có rất ít các sản phẩm từ chitin và
chitosan đạt được đầy đủ các yêu cầu của một vật liệu sinh học thương mại. Một
nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc sản xuất nguyên liệu sinh học từ chitin và
chitosan là khả năng hòa tan kém của chúng trong điều kiện ôn hòa [54].
- Chitosan còn có hiệu quả ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Ouchi và
cộng sự (1991) đã kết hợp chitosan hay chitosamino – oligosaccharide (COS) vào
5-fluorouracil (5FU) tạo thành hệ đại phân tử có hiệu quả kháng ung thư mạnh [50].
- Chitobiose và chitotriose có hoạt tính kháng oxy hóa in vivo ở đường tiêu
hóa trên chuột. Chúng ức chế sự thủy phân benzoate thành salicylate bởi H 2O2 với
sự hiện diện của Cu2+, trong khi glucosamine và N – acetylchito – oligosaccharide
(di – N – acetylchitobiose và tri – N – acetylchitotriose) không có biểu hiện hoạt
tính ức chế này. Chitobiose và chitotriose có hiệu lực lọc sạch những gốc hydroxyl.

14


Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Chitobiose còn có khả năng lọc sạch các gốc superoxide sinh ra bởi hệ thống thử
nghiệm (không dùng enzyme) sử dụng phenazine methosulfate và NADH [15].
Trong lĩnh vực công nghiệp, chitosan và các dẫn xuất thủy phân có một số
ứng dụng như sau [30]:
- Xử lý nước thải, làm sạch môi trường: loại bỏ các cặn bã và các kim loại
độc hại như: Ag+, Pb2+, Cu2+, Ni2+, Cadmium, Chromium…
- Công nghiệp giấy: sản xuất giấy chịu nhiệt, giấy hoa dán tường. Do cấu
trúc tương tự như cellulose nên việc bổ sung chitosan vào nguyên liệu làm giấy có
tác dụng làm tăng độ bền dai của giấy và tăng độ nét khi in.
- Công nghiệp dệt: dùng chất phối trộn để giữ màu hoa vải, sản xuất vải, vải
chịu nhiệt, vải chống thấm.
- Công nghiệp hóa mỹ phẩm: chitosan được dùng làm thành phần sản xuất
kem chống khô da dựa vào tính chất dễ cố định trên biểu bì da nhờ các nhóm NH 4+.
Sản xuất kem dưỡng da chống nắng dựa vào khả năng ngăn các chất lọc tia cực tím
của các nhóm NH4+.
- Công nghiệp thực phẩm: chitosan được dùng để tạo màng mỏng bao gói
bảo quản thực phẩm; tẩy lọc nguồn nước trong các nhà máy chế biến; khử màu các
sản phẩm thẫm màu như: dầu cá, nước mắm xuất khẩu…; được dùng làm các chất
giảm béo do có khả năng gắn với các chất béo trong dạ dày tạo thành phức hợp có
kích thước lớn khó hấp thu được.
- Công nghệ sinh học: chitosan được dùng làm giá thể để cố định enzyme và
cố định tế bào dùng trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích.
Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitosan được dùng để bao bọc hạt giống ngăn
ngừa sự tấn công của nấm trong đất, dùng để cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng
cường khả năng nẩy mầm của hạt. Dẫn xuất thủy phân của các chitosan ở dạng hỗn

hợp các oligomer của đường D – glucosamin cũng có nhiều ứng dụng đặc biệt trong
ngành y dược. Các dẫn xuất này được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với các chất có
hoạt tính sinh học khác như các vitamin, acid succinic, taurine [30]…
Một số tác dụng của các dẫn xuất thủy phân từ chitosan [30] là:

15