Lựa chọn thức ăn để nhân nuôi sâu khoang (spodoptera litura) phục vụ sản xuất nuclear polyhedrosis virus​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỰA CHỌN THỨC ĂN ĐỂ NHÂN NUÔI SÂU KHOANG
(Spodoptera litura) PHỤC VỤ SẢN XUẤT NUCLEAR
POLYHEDROSIS VIRUS

Ngành:

Công Nghệ Sinh Học

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110444

: Nguyễn Huỳnh Ngọc Diễm
Lớp: 11DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp này là do chính bản thân tôi thực hiện,
dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
Những kết quả đạt được trong đồ án là hoàn toàn không sao chép của bất cứ
tác giả nào. Các số liệu trình bày trong đồ án là hoàn toàn trung thực. Tôi xin

chịu trách nhiệm hoàn toàn về đồ án tốt nghiệp của mình.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày.... tháng.... năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Huỳnh Ngọc Diễm


LỜI CẢM ƠN
Nhờ sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể, em đã hoàn thành được đồ án
này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
TS. Nguyễn Thị Hai, người cô đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh
nghiệm, động viên tinh thần để em có thể hoàn thành đồ án của mình.
ThS. Huỳnh Văn Thành, ThS. Nguyễn Trung Dũng, những người thầy đã tạo
điều kiện, giúp đỡ để em có thể thực hiện được đồ án này.
Các thầy cô phụ trách bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Công
nghệ Tp.Hồ Chí Minh, đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt thời gian học
tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện đồ án.
Tập thể các bạn cùng thực hiện trong phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh Học
trường Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh, các bạn đã luôn quan tâm, ủng hộ và
động viên tinh thần giúp em vượt qua những khó khăn trong quá trình thực hiện đồ
án.
Và đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến với gia đình của em,
những người đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ những lúc em gặp khó khăn nhất
trong quá trình thực hiện.
Sau cùng em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ngôi trường Đại học
Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm học qua, giúp em có
thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày.... tháng.... năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Huỳnh Ngọc Diễm


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC .....................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..........................................................................................v
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................3
1.1.

Giới thiệu sơ lược về sâu khoang (Spodoptera litura) ..................................3

1.1.1.

Đặc điểm sinh học, hình thái của sâu khoang ........................................3

1.1.2.

Tác hại......................................................................................................5

1.1.3.

Biện pháp phòng trừ ................................................................................6

1.2.

Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng .................................................6

1.2.1.

Hình thái: .................................................................................................6

1.2.2.

Cấu trúc....................................................................................................8

1.2.3.

Bệnh lý......................................................................................................9

1.2.4.

Cơ chế gây bệnh của virus diệt côn trùng. ............................................10

1.2.5.

Triệu chứng của bệnh virus trên sâu khoang ........................................11

1.2.6.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của virus và các hạn chế khi sử

dụng chế phẩm virus............................................................................................13
1.2.7.

Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ

dịch hại ................................................................................................................15
1.3.

Nghiên cứu sử dụng thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang Spodoptera litura
.......................................................................................................................17

1.3.1.

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới ....................................................17

1.3.2.

Kết quả nghiên cứu tại Việt Nam ..........................................................23

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................25
2.1.

Vật liệu ..........................................................................................................25

2.1.1.

Dụng cụ ..................................................................................................25

2.1.2.

Nguyên liệu ............................................................................................25

i

Đồ án tốt nghiệp

2.1.3.
2.2.

Hóa chất .................................................................................................25

Nội dung và phương pháp nghiên cứu .........................................................26

2.2.1.

Nội dung nghiên cứu ..............................................................................26

2.2.2.

Phương pháp nghiên cứu.......................................................................26

2.2.3.

Phương pháp nuôi sâu. ..........................................................................31

2.2.4.

Quy trình vệ sinh ....................................................................................33

2.3.

Chỉ tiêu theo dõi............................................................................................33

3.1.

Ảnh hưởng của một số công thức thức ăn nhân tạo đến sự sinh trưởng của

sâu khoang. ..............................................................................................................35
3.1.1.

Ảnh hưởng của thức ăn đến kích thước của sâu. ..................................35

3.1.2.

Ảnh hưởng của thức ăn đến trọng lượng sâu khoang. ..........................37

3.1.3.

Ảnh hưởng của các loại thức ăn nhân tạo đến khả năng sống sót của

sâu khoang. ..........................................................................................................42
3.1.4.

Ảnh hưởng của các loại thức ăn nhân tạo đến khả năng sinh sản của

bướm.... ................................................................................................................43
3.2.

Ảnh hưởng của thức ăn đến hiệu quả sản xuất NPV sâu khoang. ...............47

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................49
4.1.

Kết luận. ........................................................................................................49

4.2.

Kiến nghị.......................................................................................................49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................50

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
MTTANT: Môi trường thức ăn nhân tạo.
NPV: virus đa diện nhân (Nuclear Polyhedrosis Virus).

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Thành phần môi trường thức ăn nhân tạo cải tiến....................................18
Bảng 1. 2. Thành phần thức ăn dựa trên môi trường thạch và bột sắn của Ấn Độ... 20
Bảng 3. 1. Kích thước cơ thể sâu khi nuôi trên các công thức .................................. 36
Bảng 3. 2. Trọng lượng cơ thể sâu khi nuôi trên các công thức................................ 37
Bảng 3. 3. Thời gian phát dục của sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn
nhân tạo....................................................................................................................... 41
Bảng 3. 4. Ảnh hưởng của các loại thức ăn nhân tạo đến khả năng sống của sâu

khoang.........................................................................................................................42
Bảng 3. 5. Khả năng sinh sản của bướm. ...................................................................43
Bảng 3. 6. Giá thành thức ăn nhân tạo nuôi sâu khoang. ..........................................45
Bảng 3. 7. Giá thành thức ăn nuôi sâu ở các công thức.............................................46
Bảng 3. 8. Tỷ lệ (%) sâu chết do virus ở các ngày sau nhiễm. ..................................47
Bảng 3. 9. Hiệu lực diệt sâu. ......................................................................................47

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Vòng đời sâu khoang...................................................................................5
Hình 1. 2. Cấu trúc của thể vùi.....................................................................................8
Hình 2. 1. Thức ăn nhân tạo công thức 1 (đậu xanh và casein). ...............................27
Hình 2. 2. Thức ăn nhân tạo công thức 2 (đậu xanh và đậu nành). ...........................28
Hình 2. 3. Thức ăn nhân tạo công thức 3 (đậu trắng). ...............................................29
Hình 2. 4. Thức ăn nhân tạo công thức 4 (mầm lúa mì). ...........................................30
Hình 3. 1. Kích thước sâu ở các công thức vào các ngày khi nuôi ........................... 36
Hình 3. 2. Trọng lượng sâu ở các công thức vào các ngày khi nuôi. ........................38
Hình 3. 3. Sâu khoang ngày tuổi thứ 7 trên các công thức........................................39
Hình 3. 4. Sâu khoang ngày tuổi thứ 9 trên các công thức........................................39
Hình 3. 5. Sâu khoang ngày tuổi thứ 11 trên các công thức......................................40
Hình 3. 6. Ổ trứng và sâu mới nở ...............................................................................44
Hình 3. 7. Sâu chết do virus. ......................................................................................48

v

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1.

Lý do chọn đề tài.
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên mang lại rất nhiều

thuận lợi cho nền nông nghiệp, nhưng bên cạnh đó, đây cũng là điều kiện thuận lợi
để phát sinh nhiều loại dịch bệnh trong nông nghiệp. Điển hình nhất là loài sâu
khoang ăn tạp (Spodoptera litura), gây hại với hơn 112 loại cây trồng thuộc 44 họ
thực vật (Chair và Patel, 1983) bao gồm các loại cây rau đậu, cây thực phẩm, cây
công nghiệp, cây lương thực,... Nông dân đã sử dụng rất nhiều biện pháp để phòng
trừ sâu khoang gây hại này và việc sử dụng thuốc hóa học luôn là sự lựa chọn hàng
đầu, vì nó không những có hiệu quả diệt sâu cao mà còn rút ngắn thời gian phòng
trừ. Tuy nhiên, những hệ lụy kèm theo sau đó thì vô cùng nguy hiểm như: gây hại
cho sức khỏe con người, tiêu diệt các loài sinh vật có ích, tạo ra các dòng kháng
thuốc hóa học, gây ô nhiễm môi trường,...
Trước thực trạng đó, việc tìm ra các biện pháp giải quyết để hướng đến một
nền nông nghiệp xanh, sạch và bền vững là yêu cầu cấp thiết. Biện pháp sinh học là
một giải pháp được cho là có hiệu quả, vì nó không những không gây hại cho
người, an toàn cho gia súc, không gây ảnh hưởng đến các loài sinh vật có ích mà
còn góp phần cải thiện môi trường vì giảm được sử dụng thuốc hóa học.
Hiện nay trên thế giới đã có không ít các công trình nghiên cứu sử dụng các
loài thiên địch để phòng trừ sâu khoang như: các loài ăn mồi, ong ký sinh, Bt, NPV.
Các công trình nghiên cứu đã chứng minh NPV ( Nuclear Polyhedrosis Virus) có
hiệu quả tiêu diệt sâu khoang cao, do khả năng gây chết và lây lan NPV trong quần
thể sâu. Chính vì vậy, việc tạo chế phẩm NPV để phòng trừ sâu khoang thay cho
thuốc hóa học là cần thiết. Biện pháp sản xuất sinh khối NPV hiện nay ở Việt Nam
cũng như nhiều quốc gia khác trên thế giới là nhân virus trong cơ thể sâu ký chủ.

Điều này đòi hỏi phải có sâu ký chủ khỏe, sạch và đồng đều. Yêu cầu này chỉ được
thỏa mãn khi nuôi trong điều kiện nhân tạo. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu
nhân nuôi sâu khoang. Nhưng ở Việt Nam, thức ăn nhân tạo để nhân nuôi sâu
khoang phù hợp với điều kiện nguồn vật liệu trong nước vẫn còn bỏ ngỏ. Chính vì

1


Đồ án tốt nghiệp

vậy, sinh viên thực hiện đề tài mang tên: “LỰA CHỌN THỨC ĂN NHÂN TẠO
ĐỂ NHÂN NUÔI SÂU KHOANG (Spodoptera litura) VÀ SẢN XUẤT
NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS”.
2. Mục đích nghiên cứu đề tài.
Tìm ra thành phần thức ăn nhân tạo để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn và
sản xuất NPV in vivo.
3.

Mục tiêu nghiên cứu đề tài.
-

Lựa chọn được công thức thức ăn nhân tạo tốt để nhân nuôi sâu khoang.

-

Xác định được ảnh hưởng của các công thức thức ăn nhân tạo đến sản xuất
NPV sâu khoang.

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu sơ lược về sâu khoang (Spodoptera litura).
Theo Feaking và Franz, (1977) sâu khoang là loài có phổ ký chủ rộng phân

bố ở vùng Châu Á, Châu Úc và cả những quần đảo thuộc biển Thái Bình Dương.
Đây là loài côn trùng gây hại quan trọng trong nông nghiệp vùng nhiệt đới. Ở vùng
Đông Nam Á, sâu khoang được xác định là loài gây hại quan trọng nhất, chúng xuất
hiện nhiều ở Malaysia và Việt Nam. Đây là loài đa thực, ước tính phá hoại trên 290
loại cây của 90 họ thực vật. Ở nước chúng ta gây hại quan trọng trên các loại rau
thập tự, cà chua, rau muống, đậu đũa, bầu bí... (Nguyễn Đức Khiêm, 2006).
1.1.1. Đặc điểm sinh học, hình thái của sâu khoang.
Họ: Noctuidae
Bộ: Lepidoptera
Tên khoa học: Spodoptera litura
Giai đoạn trứng: trứng được đẻ thành ổ có hình bán cầu, đường kính 0,4 - 0,5
mm. Ổ trứng có phủ lớp lông màu vàng từ bụng bướm mẹ. Trứng xếp với nhau
thành ổ có lông màu vàng phủ bên ngoài (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Bề mặt trứng
có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đáy trứng (36 – 39 đường) cắt ngang
bởi những đường khía ngang tạo nên những ô nhỏ. Trứng mới đẻ có màu trắng
vàng, sau chuyển thành màu vàng tro, lúc sắp nở có màu tro đậm. Thời gian ủ trứng
từ 4 – 7 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).
Giai đoạn phát triển của ấu trùng (Lava): kéo dài khoảng 9 – 14 ngày. Sâu
có 5 hoặc 6 tuổi tùy vào điều kiện môi trường, nếu điều kiện thuận lợi sâu có thể dài
từ 35 – 53 mm. Sâu non mới nở có màu xanh sáng, dài khoảng 1mm, đầu màu đen,
di chuyển như sâu đo, càng về sau màu sắc càng thay đổi và chuyển sang màu đen;

trên cơ thể có một sọc vàng chạy ở 2 bên hông, từ đốt thứ nhất tới đốt cuối của
bụng, dọc đường đó có những điểm hình bán nguyệt từ đốt thứ nhất đến đốt thứ 8
của bụng, mỗi đốt có chấm đen nhỏ nhưng 2 chấm đen ở đốt thứ nhất là rõ nét nhất.
Sâu càng lớn thì 2 chấm đen càng lớn, thể hiện càng rõ và gần như giao nhau tạo
thành khoang đen trên lưng, do đó chúng còn được gọi là sâu khoang.

3


Đồ án tốt nghiệp

Giai đoạn nhộng: kéo dài 7 – 10 ngày, nhộng có kích thước dài từ 18 – 20 mm,
có màu xanh nõn chuối, rất mềm ngay khi mới được hình thành, sau đó chuyển dần
sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu, thân cứng dần và có màu nâu đỏ. Khi
sắp vũ hóa, nhộng có màu nâu đen, các đốt cuối của nhộng có thể cử động được.
Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh mép trước đốt bụng thứ 5 – 7 có nhiều
chấm lõm, cuối bụng có một đôi gai ngắn.
Giai đoạn trưởng thành: trưởng thành có chiều dài thân 20 - 25 mm, sải cánh
rộng từ 35 – 45 mm. Cánh trước màu nâu vàng, phần giữa từ cạnh trước cánh tới
cạnh sau cánh có một vân ngang rộng màu trắng. Trong đường vân trắng này có 2
đường vân màu nâu. Cánh sau màu trắng óng ánh, khi đậu cánh xếp thành hình mái
nhà, vân trắng thu lại giống hình chữ “ V ”. Bướm có đời sống trung bình từ 1 - 2
tuần tuỳ điều kiện thức ăn. Trung bình một bướm cái có thể đẻ 300 trứng, nhưng
nếu điều kiện thích hợp bướm có thể đẻ từ 900 - 2000 trứng. Thời gian đẻ trứng
trung bình của bướm kéo dài từ 5 - 7 ngày đôi khi 10 - 12 ngày. Bướm thường vũ
hoá vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối, ban ngày bướm đậu ở mặt
sau của lá hoặc trong các bụi cỏ. Bướm hoạt động từ tối đến nửa đêm, có thể bay xa
đến vài chục mét và cao đến 6 - 7 mét. Sau khi vũ hoá vài giờ, bướm có thể bắt cặp
và một ngày sau đó có thể đẻ trứng. Bướm cái có màu nâu nhạt hơn bướm đực, con
cái thường to hơn và phần bụng cũng to hơn trong khi con đực nhỏ hơn và phần

bụng cũng hẹp hơn.

4


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1. 1. Vòng đời sâu khoang ( Spodoptera litura).
1.1.2. Tác hại
Sâu mới nở gặm vỏ trứng và sống tập trung 1 - 2 ngày, nếu bị động sâu bò phân
tán hoặc nhả tơ buông mình xuống đất. Sâu tuổi 1 - 2 thường sống tập trung, ăn hết
thịt lá, chừa lại biểu bì và gân.
Ở tuổi 3 – 4, sâu phân tán và ăn phá mạnh, cắn thủng lá và gân lá.
Ở tuổi 4 - 5, sâu có khả năng phá hại mạnh, ăn những mảng lá lớn, chừa lại gân
chính, đôi khi chừa lại cuống lá. Có phản ứng với ánh sáng rất mạnh. Khi thiếu thức
ăn, sâu còn tập quán ăn thịt lẫn nhau.
Tuổi 6 sâu hoạt động ít, ăn ít, cơ thể ngắn lại. Cuối tuổi 6 sâu không ăn, chui
xuống đất, hóa nhộng, đôi khi hóa nhộng trong lá khô hoặc tàn dư thực vật.
Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn
phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn
nắp. Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm. Sâu khoang gây
hại trên nhiều loại cây trồng như: cây họ đậu, họ cải, khoai tây, các cây công nghiệp
như cây bông,… và thường gây hại vào đầu vụ (Phạm Thị Thùy Dương, 2012).

5


Đồ án tốt nghiệp

1.1.3. Biện pháp phòng trừ

Biện pháp canh tác:
Vệ sinh đồng ruộng trước và sau khi trồng, cày ải phơi đất. Đất trước khi trồng
cần phải được cày, phơi và xử lý thuốc trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2 - 3 ngày
để diệt nhộng, sâu non có trong đất. Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời
phát hiện sâu, ngắt bỏ ổ trứng hoặc tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phân tán đi
xa.
Biện pháp cơ giới vật lý:
Diệt ổ trứng và sâu non bằng tay.
Dùng bẫy đèn để bắt trưởng thành.
Biện pháp sinh học:
Sâu khoang thường bị 4 nhóm ký sinh sau: côn trùng ký sinh (Ong thuộc họ
Braconidae và ruồi thuộc họ Tachinidae), nấm ký sinh (Beauveria sp. và Nomurea
sp.), NPV, vi khuẩn Bt.
Dùng bẫy pheromone hoặc bả chua ngọt để thu hút bướm khi chúng phát triển
rộ. Bả chua ngọt gồm: 4 phần giấm + 1 phần mật + 1 phần rượu + 1 phần nước. Sau
đó, đem bả mồi vào chậu rồi đặt ở ngoài ruộng vào buổi tối nơi thoáng gió có độ
cao 1 mét so với mặt đất.
Biện pháp hóa học:
Sử dụng thuốc Decis, Sherpa theo chỉ dẫn; Atabron được dùng làm nền phối
hợp với các loại thuốc còn lại hoặc với các loại thuốc Cúc tổng hợp sẽ cho hiệu quả
phòng trị rất tốt. Sâu ăn tạp cũng rất dễ kháng thuốc, nên luân phiên nhiều loại
thuốc để phun.
1.2. Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng
NPV thuộc nhóm Baculovirus, họ Baculoviridae, nên nó mang những đặc điểm
cấu tạo đặc trưng của họ này.
1.2.1. Hình thái:
NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau.
Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi.

6

Đồ án tốt nghiệp

7


Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Cấu trúc
Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích
thước từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ
GP6
4
Thể vùi

Vỏ ngoài
từ màng
tế bào vật
chủ

DNA virus

Vỏ bọc
ngoài virion

Nuleocapsid
e

Vỏ bọc

calyx của
polyhedra

Virus nảy
chồi
Virus nằm trong cấu trúc
polyhedra

Hình 1. 2. Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al, 2003).
lipoprotein bao
quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), trong có chứa các virion,
các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide. Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với
capside. DNA ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 106
các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi.
Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid
được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein
(gọi tắc là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi
một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều
nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn - Single
Nucleocapsid (NPV - SNPV); nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là
NPVs Nucleocapsid - Multiple

8


Đồ án tốt nghiệp

Phân tử DNA gồm hai sợi có dạng vòng, dài khoảng 40 µm (Burgess, S., 1977).
Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một phân tử DNA, phân tử DNA có chiều dài gấp 2
- 3 lần chiều dài nucleocapsid (Skuratovskaya et al, 1977).

Cấu tạo deoxyribo nucleo protein (DNP): Theo kết quả nghiên cứu của Bud,
H.M et al (1977) DNP được tạo thành do sự kết hợp giữa DNA và protein, sự kết
hợp này không đồng nhất. Đường kính DNP đo được 32 nm. DNP ở trong capsid
được sắp xếp chắc chắn, gọn gàng.
Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong,
đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao
gồm hai loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8
polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978).
Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc,
mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid.
Lớp vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972.,
Kelly, D.C., 1982, 1985).
Cấu tạo của khối đa diện (polyhedra): Theo Crook, N.E. et al (1982) thì
polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông
hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt,
bao quanh các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedra còn bao gồm
nhiều polypeptide. Protein polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972).
Polyhedra có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính. pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị
hòa tan (Faust, R.M. et al , 1966). Minon, F. et al (1979) còn cho biết polyhedra
hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng của lớp vỏ
này chưa được xác định.
1.2.3. Bệnh lý
Khi sâu mới nhiễm bệnh NPV, chromatin tụ tập và các hạt rất nhỏ chuyển động
mạnh ở vùng quanh nhân, gọi là propolyhedra có đường kính 0.2 - 0.4 µm, đó là
những hạt trong giai đoạn tiền phát triển của polyhedra. Kích thước nhân tế bào bị

9


Đồ án tốt nghiệp

nhiễm bệnh tăng lên do sự sinh sôi tràn đầy của các polyhedra và cuối cùng làm cho
tế bào bị phá vỡ; phần lớn các polyhedra được hoà lẫn trong huyết tương.
Trong nhân, toàn bộ các polyhedra được tạo thành một lần và sau đó kích thước
tăng dần (Bergold, G.M.,1953., Smith, K.M. et al, 1953). Ở các ký chủ thuộc bộ
cánh phấn, các polyhedra được tạo trong nhân của tế bào máu, tế bào thể béo, gian
bào ống và biểu bì, không có trong các tế bào thần kinh. Polyhedra có đường kính
0.5 - 1.5 µm. Kích thước và hình dạng phụ thuộc vào virus của các loài côn trùng
(Aikawak, 1995).
1.2.4. Cơ chế gây bệnh của virus diệt côn trùng.
Sau khi NPV vào cơ thể ký chủ côn trùng bằng đường tiêu hoá, sâu non ngừng
ăn. Cơ thể sâu biến đổi về màu sắc. Sau 1-2 ngày cơ thể sâu căng phồng, mọng
nước. Cơ thể có màu vàng hoặc trắng. Hạ bì dễ bị nứt, chuyển động chậm, chết
nhanh. Ngoài đồng ruộng sâu chết do virus thường quan sát thấy đầu chúc xuống
dưới, dịch trắng chảy ra ngoài.
Theo Vũ Mai Nam (2001) giải thích về cơ chế xâm nhiễm của NPVs như sau:
virus SpltNPV xâm nhập vào cơ thể sâu qua thức ăn, vào đến ruột giữa do tác động
của dịch ruột, vỏ protein vỡ ra. Sâu bị nhiễm có màu trắng bệch, lờ đờ. Hai hoặc ba
ngày sau khi bị nhiễm, sâu không ăn, nằm bất động cho đến khi cơ thể sưng lên, vỡ
dịch chảy ra ngoài và sâu chết hẳn.
Thời gian từ lúc virus xâm nhập vào cơ thể cho đến khi sâu chết thay đổi tùy
theo tuổi và loài sâu. Cơ chế giết sâu là ký sinh trên ký chủ và bắt đầu quá trình ký
sinh khác làm bệnh lây nhiễm nhanh chóng và lan rộng không ngừng. Mặt khác, xác
sâu chết trở thành thức ăn cho sâu sống vì thế sự lây nhiễm càng nhanh hơn.
Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi thức ăn có chứa virus NPVs vào ruột sâu non,
cũng như Bacillus thuringiensis, virus đã thực hiện quá trình hủy toàn bộ chức năng
của sâu làm sâu chết. Cơ chế được mô tả như sau: khi vào ruột các thể vùi (PIB) của
virus sẽ giải phóng ra các virion, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa, qua biểu bì mô
ruột giữa, các virion xâm nhập vào dịch huyết tương, chúng tiếp xúc với các tế bào

10


Đồ án tốt nghiệp

và xâm nhập vào bên trong để thực hiện quá trình gây bệnh cho sâu hại, quá trình
này trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài từ 6 - 12 giờ, đây là giai đoạn xâm nhập của các thể
vùi (polyhedral inclusion body) xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng
thích ra, chúng tự đính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột của
sâu.
Giai đoạn tăng trưởng (sinh sản): kéo dài 12 - 48 giờ, đây là giai đoạn tăng
nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu. Đối với sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32
giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần.
Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn tạo thể vùi tức là các thể virion được bao bọc
trong thể protein, côn trùng trong giai đoạn này có màu sáng bóng, màu sắc nhạt và
đôi khi có màu hồng. Sự phân giải tế bào và sự phân giải của mô cơ thể bắt đầu
ngay sau khi virus tạo thể vùi.
Thời kỳ ủ bệnh của các côn trùng bị bệnh thường kéo dài từ 3 - 12 ngày. Sâu
tuổi nhỏ chết trong khoảng 3 - 5 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm virus.
Nhưng sâu tuổi lớn thời gian ủ bệnh từ 4 - 6 ngày, có khi dài hơn phụ thuộc vào tuổi
của vật chủ, lượng thức ăn lây nhiễm, nhiệt độ, độ ẩm và các điều kiện khác của
môi trường. Hết thời kỳ ủ bệnh, sâu đã bị nhiễm bệnh hoàn toàn, cơ thể yếu dần rồi
chết.
Ngay sau khi sâu chết sâu trở nên mềm nhũn, da bị vỡ và giải phóng ra hàng tỷ
thể vùi bám trên các bộ phận của cây trồng, đó là nguồn virus lan truyền sang cá thể
khác.
Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus giống như cơ chế nhân lên của thực
khuẩn thể trong tế bào.
1.2.5. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu khoang.

Theo mô tả của Jayarasjs (1985):
Trong thời gian 2 - 3 ngày đầu của thời kỳ ủ bệnh, sâu non bị nhiễm bệnh
không có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt và không có sự thay đổi về sức ăn.

11


Đồ án tốt nghiệp

Các ngày sau, các đốt thân của sâu non căng phồng và mọng nước dần, sâu
chuyển động nhiều.
Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ.
Trước khi chết sâu thường trèo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây chúc đầu
xuống phía dưới.
Dịch trắng chảy ra ngoài và sâu chết.
Dịch trắng không có mùi hôi.
Thời gian từ khi cơ thể mọng nước đến khi sâu chết không quá 1 ngày.
Theo nghiên cứu của Abbas, M.S. et al (1988), thời gian ủ bệnh NPV của sâu
khoang thường là 4 - 10 ngày. Đối với nhộng, trong thời kỳ ủ bệnh, triệu chứng
bệnh không rõ, nhưng vào giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh thân nhộng xuất hiện
màu đục, da dễ vỡ, dịch trắng không có mùi hôi chảy ra và nhộng chết. Sâu trưởng
thành bị bệnh vào giai đoạn cuối da cũng bở, dễ vỡ và có dịch trắng chảy ra.
Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), từ việc khảo sát
những mẫu sâu thu được ở điều kiện ngoài đồng và trong phòng thí nghiệm ghi
nhận các triệu chứng như sau:
Dạng 1: sâu có màu trắng sáng đôi khi vàng hồng, cơ thể căng phồng lên, da dễ
vỡ và dịch màu sữa không có mùi hôi.
Dạng 2: sâu có màu đen, thân căng, da vỡ, dịch màu cà phê sữa, không hôi hoặc
có mùi hôi.
Dạng 3: sâu màu nâu đen hoặc đen, cơ thể căng phồng, da không vỡ chỉ rách ở

các ngắn trên thân, dịch màu nâu đen, không có hoặc có mùi hôi.
Dạng 1 là phổ biến nhất và thể hiện triệu chứng của NPV rõ rệt, sâu bị nhiễm sẽ
có màu nhạt vàng bóng và da dễ vỡ, cơ thể sâu chết phân rã rất nhanh, khi da bị vỡ
có dịch màu trắng sữa chảy ra, màu này sau đó sậm hơn, không có mùi hôi còn dạng
2, 3 thì có sự phối hợp của các nhóm vi khuẩn, siêu vi khuẩn và microsporidia gây
ra. Nếu bị nhiễm ở tuổi 1 và tuổi 2, sâu sẽ chết trong khoảng 2 ngày. Ở các tuổi lớn
hơn, sâu chết chậm hơn, nhưng ít khi quá 6 ngày sau khi nhiễm.

12


Đồ án tốt nghiệp

Nhộng sâu ăn tạp bị nhiễm SpltNPV thường bị méo mó, chảy nước màu vàng,
rất mềm, dễ bị nhũn. Một số nhộng bị nhiễm có thể chết hoặc vũ hóa thì khả năng
sinh sản giảm và truyền virus sang trứng (Nguyễn Thị Diễm Trang, 2008).
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của virus và các hạn chế khi sử dụng
chế phẩm virus.
Tia cực tím của ánh sáng mặt trời là yếu tố quan trọng làm giảm hiệu lực của
NPV (Phạm Thị Thùy, 2004). Hầu hết những virus hiện diện trên lá sẽ bị bất hoạt
trong vòng vài ngày, nếu bị chiếu sáng trực tiếp liên tục thì có thể bị bất hoạt chỉ
trong vòng vài giờ (Evan, 1986). Người ta cũng phát hiện ra tia sáng có bước sóng
ngắn 215 - 216 nm có khả năng khử hoạt tính PIB của NPV (Bullok, H.R., 1967.,
David, W.W.L et al,1968). Ignoffo, C.M. et al (1971) đã phát hiện : Dưới tác dụng
của ánh nắng mặt trời, thể vùi đa diện bị khử hoạt tính là do các peroxide hoặc các
gốc peroxide sản sinh từ các amino acid bị chiếu bức xạ bởi tia X. Tại Úc,
Bell,M.R.(1990) tiến hành thí nghiệm : cho sâu xanh 6 ngày tuổi ăn 2 ngày ngọn
cây hái sau khi phun NPV ngoài đồng ruộng 0,1,2,3,5,7,9 ngày tỉ lệ sâu xanh chết
bệnh tương ứng là : 96%,94%,82%,79%,76%,39%,32%.
Điều đó cho thấy sau khi phun càng nhiều ngày, hiệu lực của NPV trên cây

càng giảm. Ignoffo, C.M et al (1990) cũng cho biết PIB của NPV trong nước mẫn
cảm với tia cực tím gấp 3 lần PIB dạng khô. Theo Phạm Thị Thùy (2004), nhiệt độ
và ẩm độ ảnh hưởng không nhiều đến hoạt tính của thể vùi của HaNPV, ngoại trừ
nhiệt độ không khí quá cao trên 42oC.
Để duy trì hiệu lực của NPV khi phun ngoài đồng ruộng, nhiều tác giả đã
nghiên cứu trộn thêm các chất phụ gia vào dịch để lọc tia cực tím của ánh sáng mặt
trời, tăng sức ăn của sâu, tăng lượng NPV vào cơ thể sâu.
Ignoffo, C.M et al (1971) cho biết: các sản phẩm protein, thuốc màu thuốc
nhuộm, than hoạt tính, có khả năng lọc tia cực tím bảo vệ NPV.
Các nghiên cứu của Rabindra tại Ấn Độ cho kết quả: sữa, trứng tươi, nước dừa,
đường đen, bột hạt bông, dầu lạc, bột đậu đỏ trộn với NPV khi phun ra đồng ruộng
làm tăng hiệu lực diệt sâu của NPV, đặc biệt là đường đen 0.5 - 5% ( Rabindra, R.J.

13


Đồ án tốt nghiệp

et al, 1988,1989). Tại Đài Loan, Tuan, S.J. et al (1988) đã làm thí nghiệm trộn noãn
hoàn tố với lượng 50mg/ml dịch và 5mg/ml dịch NPV, tỷ lệ sâu chết NPV tương
ứng là 66.7% và 44.7%, đối chứng NPV đơn độc sâu chết là 28.3%. Ignoffo, C.M et
al (1995) cũng đã phát hiện thêm các aminoacid vòng thơm: Tryptophan với lượng
0.03mg/ml dịch NPV hoặc Tyrosine với lượng 0.5mg/ml dịch NPV có thể làm giảm
50% tác hại của ánh sáng mặt trời đối với hoạt tính của NPV.
Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lực của NPV.
Kobayashi et al (1981) đã tiến hành chủng nhộng của con tằm (Bombyx mori) với
NPV và quan sát chúng ở các nhiệt độ khác nhau. Kết quả những con nhộng được
chủng NPV khi được ủ ở 35oC thì sống lâu hơn những con nhộng được ủ ở 25oC.
Khi nhộng chủng NPV được ủ ở 35oC sau đó chuyển sang ủ ở 25oC sẽ kéo dài thời
gian ủ bệnh hơn những con nhộng được ủ ở 35oC. Johnson et al (1982) cũng thử

nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ cao lên loài Anticarsia gemmatalis, kết quả cho
thấy ở nhiệt độ trên 32oC làm chậm tiến trình bệnh của ký chủ. Ở 40oC, tất cả các
con sâu đều không phát triển bệnh.
Trong điều kiện nhiệt độ cao, NPV rất dễ bị mất hoạt tính. NPV ngài độc
(Porthetria dispar) ở 60oC chỉ tồn tại 18 giờ, ở 65oC chỉ 40 phút là mất hoạt tính
(Trần Văn Mão, 2002).
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh sản và sống sót của NPV
loài Autographa californica, Knittel and Faibrother (1987) thấy rằng không có sự
sinh sản và hình thành thể vùi của loài này ở 37oC.
Knittel and Faibrother cũng đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên NPV của
loài Autographa californica đã chỉ ra rằng virus bị bất hoạt ngay lập tức ở pH = 2,
và bị bất hoạt trong vòng 1 giờ ở pH = 4. Virus bị suy yếu ở pH = 5 và sống sót ở
pH = 6.
Ngoài ra, trong quần thể sâu hại tự nhiên côn trùng không chỉ bị một bệnh do
một loại virus gây ra mà còn bị nhiễm bệnh hỗn hợp của 2 loại virus. Thông thường
đó là hỗn hợp giữa NPV và CPV. Có loài côn trùng cùng một lúc có tới 9 virus gây

14


Đồ án tốt nghiệp

bệnh. Đến nay sự nhiễm bệnh hỗn hợp của nhiều loại virus đã được biết ở 198 loại
côn trùng.
Tác động qua lại giữa các virus trong quá trình nhiễm bệnh biểu hiện theo ba
kiểu: Đồng tác động, tác động không phụ thuộc vào nhau và tác động gây nhiễu cho
nhau. Khi có hiện tượng đồng tác động các virus trong cùng một cơ thể vật chủ sẽ
làm tăng tỷ lệ chết của sâu và rút ngắn thời gian gây chết xuống 50%. Điều này rất
có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất. Ngược lại hiện tượng tác động nhiễu làm giảm
hiệu lực gây bệnh của virus và làm giảm hiệu quả của chế phẩm, vì vậy khi sản xuất

chế phẩm cần loại trừ các virus có tác động nhiễu. Chế phẩm NPV không được
dùng trong quần thể sâu hại có bệnh CPV vì giữa hai nhóm này thường có tác động
nhiễu lên nhau.
1.2.7. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch
hại
Ưu Điểm:
- Hiệu lực diệt sâu của NPV tương đương như thuốc hóa học nhưng không độc
hại cho người và gia súc, không nhiễm bẩn môi trường sống, không ô nhiễm môi
trường, thân thiện với môi trường.
Theo Szewczyk et al (2009), Baculovirus chỉ gây bệnh cho duy nhất ngành chân
đốt mà không làm ảnh hưởng đến động vật có xương sống, cây trồng và các vi sinh
vật khác. Tuy nhiên trong điều kiện đặc biệt thuận lợi nào đó thì chúng có thể xâm
nhập vào trong tế bào của động vật mặc dù chúng sẽ bị bất hoạt ngay sau khi xâm
nhập. Điều này có nghĩa là Baculovirus không làm ô nhiễm môi trường sống, chúng
ta không cần phải quan tâm đến vấn đề ngộ độc thuốc hay lưu tồn… như khi sử
dụng thuốc hóa học.
- Không làm mất đi những nguồn tài nguyên sinh vật có ích như các loại ký
sinh thiên địch và những vi sinh vật có lợi với con người.
Baculovirus là chủng có tính chọn lọc ký chủ rất cao so với các nhóm virus
thiên địch khác (Frances et al, 1998) do đó mà không làm hại đến các loài côn trùng
có ích khác như thuốc hóa học.

15


Đồ án tốt nghiệp

- Chưa tạo nên tính kháng thuốc của sâu hại.
- Không ảnh hưởng đến chất lượng, phẩm chất nông sản, không ảnh hưởng đến
đất trồng, không khí trong môi trường (do không để lại dư lượng).

- Nếu sử dụng hợp lý, đúng phương pháp, đúng kỹ thuật trong điều kiện nhiệt
độ thích hợp sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao.
- Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp
lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo.
- Hiệu lực diệt sâu của virus là không thay đổi theo thời gian.
- Baculovirus có cấu trúc với thể bọc bảo vệ, tránh các yếu tố bất lợi của môi
trường nên có thể duy trì khả năng sống trong tự nhiên ngoài cơ thể vật chủ (Phạm
Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Cũng theo Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) thì Baculovirus rất thuận
lợi khi sản xuất chế phẩm thương mại vì thường có thể đạt nồng độ cao trong mô
của ấu trùng (1010 virus/ấu trùng). Chế phẩm có thể giữ hoạt tính trong thời gian rất
dài (10 - 15 năm) ngoài cơ thể côn trùng.
Nhược Điểm:
- Chế phẩm virus rất khó bảo quản, chúng đòi hỏi điều kiện môi trường phải
thích hợp để giữ chúng ở trạng thái nghỉ, đồng thời sản phẩm rất dễ bị nhiễm vi
khuẩn gây thối.
- So với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của virus chậm hơn nhiều. Nông dân
muốn rằng sau khi phun thuốc thì sâu phải bị tiêu diệt ngay do đó chế phẩm virus
chưa được người dân ưa thích sử dụng.
Phổ tác dụng của thuốc hẹp nên gặp khó khăn về vấn đề thương mại. Do
Baculovirus rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ có nhiều
loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một
loài dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm virus cũng khó khăn hơn
thuốc hóa học vì virus phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển
trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên.

16


Đồ án tốt nghiệp

- NPV bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết nếu như phun không đúng kỹ thuật,
phun trong điều kiện không thích hợp sẽ khó đạt hiệu quả. Do là tác nhân sinh học
nên Baculovirus dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng không thích hợp (nhiệt
độ, độ ẩm,…) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi bằng thuốc hóa học. Một
khuyết điểm khác nữa là trong điều kiện tự nhiên, các loài sinh vật có thể tiêu diệt
lẫn nhau làm giảm tác động của thuốc trong việc phòng trừ dịch hại (Quang Chân
Chân, 2002).
- NPV có công nghệ sản xuất phức tạp thủ công nên giá thành cao ở Việt Nam.
Nghiên cứu sử dụng thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang Spodoptera

1.3.
litura.

1.3.1. Các kết quả nghiên cứu trên thế giới.
Bottger (1942) là người đầu tiên đã tiến hành nuôi sâu cánh vảy, cụ thể là loài
sâu đục thân bắp (Ostrinia nubilalis) bằng thức ăn nhân tạo. Sau đó, sâu hồng
Pectinophora gossypiella là loài sâu đa thực đầu tiên được nuôi trên thức ăn nhân
tạo có cơ chất chính là lúa mì bởi Vanderant và Reiser (1956). Từ đó, nhiều loại
thức ăn nhân tạo đã được phát triển để nuôi nhiều loài sâu bộ cánh vảy khác.
Công thức thức ăn nhân tạo nuôi sâu bộ cánh vảy: Giống như các loài động vật
khác, ấu trùng bộ cánh vảy cũng đòi hỏi nguồn protein, carbohydrate, lipid, vitamin,
muối khoáng và nước để phát triển. Đối với nguồn protein, nhiều tác giả sử dụng
casein, sữa bột hay bột đậu nành… Nguồn carbohydrate có thể là đường sucrose
hoặc nguồn đường khác. Lipid được cung cấp bởi phôi lúa mì (wheat germ), lá phơi
khô, dầu bắp. Vitamin được cung cấp dưới dạng hỗn hợp các vitamin hoặc sử dụng
men hoặc dịch chiết men. Muối khoáng thường được cung cấp theo thành phần của
muối Wesson. Ngoài ra, hầu hết các loài côn trùng đều cần vitamin C và choline
(Morton, 1979).
Thành phần muối Wesson (năm 2010) gồm: 1,55g CaCO3; 0,0029g

CuSO4.5H2O; 0,1103g FePO4; 0,0015g MnCl2; 0,675g MgSO4; 0,007g KAI(SO4),
0,9g KCl; 2,325g KH2PO4; 0,0038g KCl; 0.785g NaCl; 0.0043 NaF; 1,12g
Ca3(PO4)2.

17