Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34s fmv​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN CÓ NGUỒN GỐC
THỰC VẬT DỰA TRÊN TRÌNH TỰ PROMOTER
34S-FMV

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Vũ Việt Dũng
Sinh viên thực hiện

: Trần Quang Phát

MSSV: 1311100065

Lớp: 13DSH01


Đồ án tốt nghiệp

TP. Hồ Chí Minh, 2017
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không sao

chép dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân
thủ đúng nguyên tắc. Kết quả trình bày trong đề tài được thu thập trong quá trình
nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài nghiên cứu
này.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017
Sinh viên,

Trần Quang Phát


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô của trường Đại
học Công nghệ TP.HCM nói chung, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực
Phẩm - Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức, các
kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập.
Xin gửi đến TS. Nguyễn Tiến Dũng, ThS. Phạm Vũ Việt Dũng cùng với các anh
chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản
vùng 4 lời cảm ơn sâu sắc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu
dắt em trong suốt thời gian qua.
Xin ghi nhận công sức và những đóng góp quý báu, nhiệt tình của toàn thể các
bạn trong lớp 13DSH01 đã đóng góp ý kiến, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ đã nuôi dạy con đến ngày
khôn lớn và cho con ăn học thành tài.
Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian
ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự
góp ý của quý thầy cô để kiến thức của chúng em ngày càng hoàn thiện hơn, rút ra

được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập, làm việc sau này.
Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô của trường Đại học Công nghệ TP.HCM
dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình. Đồng kính chúc
quý thầy cô, anh chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học tại Trung tâm Chất lượng
Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thành công
tốt đẹp trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017
Sinh viên,

Trần Quang Phát


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................3
1.1. Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO)...................................................... 3
1.1.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO) .......................................3
1.1.2. Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen ............................................4
1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay .......... 5
1.2.1. Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới...................5
1.2.2. Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen..................................7
1.2.3. Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam 11
1.2.4. Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam ..............12
1.3. Các phương pháp xác định cây trồng biến đổi gen ...................................... 14
1.3.1. Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích ...........................14
1.3.2. Phương pháp sử dụng DNA đích ........................................................14
1.3.3. Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc ........15
1.3.4. Giới thiệu chung về phương pháp PCR ..............................................16

CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................18
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 18
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ...........................................................................18
2.1.2. Thời gian nghiên cứu...........................................................................18
2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 18
2.2.1. Nguồn mẫu ..........................................................................................18
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ...............................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 21
2.3.1. Phương pháp thu mẫu..........................................................................21
2.3.2. Phương pháp bảo quản mẫu ................................................................21
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA .............................................................21
2.3.4. Phản ứng PCR .....................................................................................24
2.3.5. Kỹ thuật điện di trên gel ......................................................................28

i


Đồ án tốt nghiệp

2.4. Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích GMO bằng kỹ thuật PCR ......... 31
2.5. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 32
2.5.1. Tách chiết DNA ..................................................................................32
2.5.2. Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR .....................................................32
2.5.3. Đánh giá các thông số kĩ thuật phương pháp ......................................34
2.6. Cải tiến phương pháp ................................................................................... 36
2.7. Khảo sát mẫu thị trường ............................................................................... 37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..........................................................38
3.1. Sản phẩm tách chiết DNA ............................................................................ 38
3.2. Tối ưu hóa phản ứng PCR............................................................................ 39
3.2.1. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi................................................39

3.2.2. Khảo sát tối ưu nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR ..40
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA
trong phản ứng PCR .......................................................................................42
3.3. Đánh giá hiệu lực phương pháp ................................................................... 44
3.4. Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế bằng kĩ thuật PCR ......................... 46
3.5. Cải tiến phương pháp bằng phản ứng Realtime – PCR ............................... 47
3.6. Kết quả khảo sát mẫu thực tế ....................................................................... 49
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................51
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 51
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................53
PHỤ LỤC

.............................................................................................................1

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
g

:

microgam

M

:

micromole/lít

BĐG

:

Biến đổi gen

Bp

:

base pair

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

dNTP

:

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

:

Ethylene diaminetetra acetic acid

Elisa

:

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EU

:

European Union

FMV

:

Virus dạng mosaic

GM

:

Genetically Modified

GMC

:

Genetically Modified Crop

GMO

:

Genetically Modified Organism

ISAAA

:

Tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học
trong nông nghiệp

IRRI

:

Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế

LOD

:

Limit of detection

mA

:

miliampe

mM

:

milimol/lít

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

RNA

:

Ribonucleic acid

Ta

:

Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)

TBE

:

Tris-borate-EDTA

Tm

:

Temperature melting

U

:

Đơn vị tính hoạt tính của Taq polymerase

UV

:

Ultra Violet

V

:

Volt

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG SỬ DỤNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13] ...........................18
Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật ..........................................................................19
Bảng 2.3. Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA .............................................22
Bảng 2.4. Chương trình phản ứng PCR ...............................................................27
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR .........................................28
Bảng 2.6. Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành
phần phản ứng PCR .............................................................................33
Bảng 2.7. Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng ............................................33
Bảng 2.8. So sánh kết quả thử khẳng định ..........................................................35
Bảng 2.9. Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR .................................36
Bảng 2.10.Chương trình phản ứng Realtime - PCR ............................................37
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ..................................................................................42
Bảng 3.2. Chương trình nhiệt chạy phản ứng PCR sau tối ưu ............................43
Bảng 3.3.Thành phần hóa chất sau khi tối ưu hóa...............................................44
Bảng 3.4.Kết quả phân tích phát hiện promoter FMV trên mẫu chuẩn
MON89788 5% ...................................................................................44
Bảng 3.5. Kết quả giá trị đánh giá các thông số của phương pháp .....................45
Bảng 3.6. Diễn giải kết quả điện di .....................................................................46

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm .............4

Hình 1.2. Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo ISAAA
...............................................................................................................9
Hình 1.3. Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm ..................10
Hình 1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18] .........................11
Hình 2.1. Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus ...................19
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No.
S1052 ...................................................................................................23
Hình 2.3. Các giai đoạn trong phản ứng PCR [1] ...............................................27
Hình 2.4. Các bước trong kỹ thuật điện di [1] ....................................................29
Hình 3.1. Kết quả điện di tách chiết DNA từ mẫu thị trường .............................39
Hình 3.2. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện dương
tính GMO với các chủng vi sinh vật khác. ..........................................40
Hình 3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên
phản ứng PCR phát hiện GMO ...........................................................41
Hình 3.4. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên
phản ứng PCR phát hiện GMO ...........................................................41
Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA
.............................................................................................................43
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế được đề xuất.............46
Hình 3.7. Kết quả khuếch đại Realtime – PCR mẫu chuẩn .................................48
Hình 3.8. Đường xác định nhiệt độ nóng chảy của kết quả real-time PCR khoảng
80ºC .....................................................................................................48
Hình 3.9. Kết quả chạy điện di của sản phẩm Realtime – PCR ..........................49
Hình 3.10. Kết quả mẫu xét nghiệm GMO thị trường. .......................................50

v


Đồ án tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học phát triển mở ra nhiều triển vọng cho cây trồng biến đổi
gen. Với những lợi ích mà cây trồng biến đổi gen mang lại (kháng sâu bệnh, tăng
năng suất, tăng giá trị dinh dưỡng...), cùng với những yêu cầu của con người ngày
càng tăng về vấn đề an ninh lương thực, nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng
và đặc biệt là đối phó với sự biến đổi của khí hậu... Cây trồng biến đổi gen được dự
báo sẽ tiếp tục tăng trong những năm tới [7]. Ở Việt Nam, để tạo đà cho phát triển
cây trồng biến đổi gen, nhiều cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long… đã có những
nghiên cứu cơ bản ban đầu như: sàng lọc các gen hữu ích, thiết kế vector chuyển
gen. Tới nay, đã có báo cáo kết quả ban đầu trong nghiên cứu cây chuyển gen đối
với cây ngô, đậu tương, lúa, bông ở Việt Nam nhưng còn rất hạn chế. Công tác
nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen ngày càng mạnh mẽ hơn, đặc biệt khi
việc khảo nghiệm đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của các
cây chuyển gen: ngô, bông vải và đậu tương với mục đích làm giống đã được Chính
phủ cho phép. Tại thị trường Việt Nam, một số hạt giống ngô chuyển gen đã được
cấp phép có nguồn gốc từ các công ty Syngenta, DEKALB, Pioneer Hi-bred đối với
tính trạng kháng sâu và thuốc trừ cỏ, bao gồm Bt11, GA21, bt11xGA21,
MON89034, NK603, MON89034xNK603, TC1507[28]. Các giống ngô này được
phép trồng khảo nghiệm trên diện rộng với mục đích làm thức ăn gia súc.
Mặc dù vẫn chưa có một khẳng định hợp pháp nào chứng minh thực phẩm biến
đổi gen có hại cho sức khỏe. Người tiêu dùng chúng ta có quyền lựa chọn việc sử
dụng hoặc không sử dụng thực phẩm biến đổi gen. Trước những tranh cãi như vậy,
có thể chọn mua các thực phẩm được chứng nhận là không chứa biến đổi gen (NonGMO) hoặc các thực phẩm hữu cơ - một loại thực phẩm hoàn toàn không chứa biến
đổi gen GMO có chứng nhận hữu cơ, hoặc tìm hiểu các cách nhận biết, hay phòng
tránh thực phẩm biến đổi gen trước khi có khẳng định chính thức từ loại thực phẩm
này. Sản phẩm GMO đã có mặt trên thị trường Việt Nam nhưng chưa được kiểm
soát chặt chẽ. Hiện nay GMO đã được quy định dán nhãn trên thị trường và được

1

Đồ án tốt nghiệp

phân tích phát hiện, định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau trong đó có
phương pháp khuếch đại DNA (PCR).
Hiện nay, đa số các phương pháp sàng lọc GMO dựa trên trình tự promoter 35SCaMV và terminator NOS. Để mở rộng thêm các trình tự sàng lọc GMO, chúng tôi
thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp phát hiện Genetically Modified Organism
- (GMO) dựa trên trình tự promoter 34S-FMV”. Đề tài được thực hiện tại Trung
tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4.
 Mục đích nghiên cứu:
Xây dựng hoàn chỉnh quy trình phát hiện GMO dựa trên trình tự promoter 34SFMV với các thông số về giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu đạt yêu cầu sử
dụng tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học của Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy
Sản vùng 4.
 Mục tiêu nghiên cứu:
Để hoàn thiện phương pháp đáp ứng yêu cầu đưa vào áp dụng thực tế, đề tài bao
gồm hai mục tiêu lớn:
-

Tối ưu các thông số để thực hiện phản ứng PCR như nồng độ MgCl2, nồng
độ primer, nhiệt độ bắt cặp.

-

Xác định các thông số của phương pháp: LOD50, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ
chính xác của phương pháp.

 Nội dung nghiên cứu:
-

Tách chiết DNA từ mẫu thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen và kiểm tra
mức độ tinh sạch của sản phẩm tách chiết.

-

Khảo sát và tối ưu nồng độ primer, nồng độ MgCl2, nhiệt độ bắt cặp của
mồi nhằm tối ưu hóa phản ứng PCR.

-

Đánh giá hiệu lực sử dụng của phương pháp thông qua các thông số: LOD,
độ nhạy, độ đặc hiệu.

-

Áp dụng quy trình để phân tích một số mẫu ngoài thị trường.

-

Một số đề xuất cải tiến phương pháp.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO)
1.1.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO)
GMO (Genetically Modified Organism): sinh vật biến đổi gen, là một sinh vật

mà vật liệu di truyền của nó đã bị biến đổi theo ý muốn chủ quan của con người.
Công nghệ này thường được gọi là “công nghệ sinh học hiện đại” hoặc “công nghệ
gen”, đôi khi còn “công nghệ tái tổ hợp DNA” hoặc “kỹ thuật di truyền”. Nó cho
phép chuyển các gen riêng lẻ từ một loài này sang một loài khác, cũng như giữa các
loài không liên quan [16]. Ngoài ra cũng có thể có những sinh vật được tạo ra do
quá trình lan truyền của gen trong tự nhiên. Ví dụ quá trình lai xa giữa cỏ dại với
cây trồng biến đổi gen có cùng họ hàng có thể tạo ra loài cỏ dại mang gen biến đổi.
Sinh vật biến đổi gen có nhiều loại khác nhau. Nó có thể là các dòng lúa mỳ
thương mại có gen bị biến đổi do tia điện từ hoặc tia phóng xạ từ những năm 1950.
Nó cũng có thể là các động vật thí nghiệm chuyển gen như chuột bạch hoặc là các
loại vi sinh vật bị biến đổi cho mục đích nghiên cứu di truyền. Tuy nhiên hiện nay,
thông thường khi nói đến GMO người ta thường đề cập đến các cơ thể sinh vật
mang các gen của một loài khác để tạo ra một dạng chưa hề tồn tại trong tự nhiên.
GMC (Genetically Modified Crop) là loại cây trồng được lai tạo ra bằng cách sử
dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ thuật di
truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số
gene chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn [16].
Về mặt bản chất, các giống lai từ trước đến nay (hay còn gọi là giống truyền
thống) đều là kết quả của quá trình cải biến di truyền. Điểm khác biệt duy nhất giữa
giống lai truyền thống và giống chuyển gen là vật liệu di truyền (DNA) được chọn
lọc một cách chính xác dựa trên khoa học công nghệ hiện đại và chuyển vào giống
cây trồng để đem lại một tính trạng mong muốn một cách có kiểm soát. Công nghệ
gen có thể được sử dụng theo nhiều cách, ví dụ như kỹ thuật chống chịu stress(căng
thẳng) phi sinh học như hạn hán, nhiệt độ cực đại hoặc độ mặn, và các stress sinh
học, như côn trùng và mầm bệnh, thường có thể gây hại cho sự phát triển và tồn tại

3


Đồ án tốt nghiệp

của cây trồng. Công nghệ này cũng có thể được sử dụng để cải thiện hàm lượng
dinh dưỡng của cây, một ứng dụng có thể được sử dụng đặc biệt ở các nước đang
phát triển.
1.1.2. Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen được tạo ra lần đầu tiên vào năm 1982 bằng việc sử dụng
loại cây thuốc lá chống kháng sinh. Những khu vực trồng thử nghiệm cây thuốc lá
có khả năng chống thuốc diệt cỏ đầu tiên là ở Pháp và Hoa Kỳ vào năm 1986.
Năm 1987, Plant Genetic Systems (Ghent, Bỉ) là công ty đầu tiên phát triển cây
trồng thiết kế gen di truyền (thuốc lá) có khả năng chống chịu côn trùng bằng cách
biểu hiện các gen mã hóa protein diệt côn trùng từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis
(Bt), được thành lập bởi Marc Van Montagu và Jeff Schell. Trung Quốc là quốc gia
đầu tiên chấp nhận cây công nghiệp chuyển đổi gen với cây thuốc lá kháng virus
được giới thiệu lần đầu vào năm 1992, nhưng rút khỏi thị trường Trung Quốc vào
năm 1997 [25].

Hình 1.1. Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm
Cây trồng biến đổi gen đầu tiên được phê chuẩn bán ở Mỹ vào năm 1994 là cà
chua FlavrSavr, có thời gian bảo quản lâu hơn các loại cà chua thông thường. Năm
1994, Liên minh châu Âu phê chuẩn cây thuốc lá có khả năng chống thuốc diệt cỏ
bromoxynil. Năm 1995, khoai tây Bt đã được phê duyệt an toàn bởi Cơ quan Bảo vệ
Môi trường, trở thành cây nông sản kháng sâu đầu tiên được phê duyệt tại Hoa Kỳ.

4


Đồ án tốt nghiệp

Các loại cây trồng chuyển đổi gen sau đó cũng được chấp thuận giao dịch ở Mỹ
vào năm 1995: cải dầu với thành phần chuyển đổi (Calgene), ngô bắp có vi khuẩn

Bacillus thuringiensis (Bt) (Ciba-Geigy), bông kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil
(Calgene), bông kháng côn trùng (Monsanto), đậu nành kháng thuốc diệt cỏ
glyphosate (Monsanto), bí kháng virus (Asgrow) và cà chua chín chậm (DNAP,
Zeneca/Peto và Monsanto). Tính đến giữa năm 1996 đã có tổng cộng 35 phê chuẩn
được cấp cho 8 loại cây công nghiệp chuyển đổi gen và 1 loại hoa cẩm chướng, với
8 điểm khác nhau tại 6 quốc gia cộng thêm EU.
Năm 2000, lần đầu tiên các nhà khoa học đã biến đổi gen thực phẩm để gia tăng
giá trị dinh dưỡng bằng việc sản xuất ra hạt gạo vàng. Đây là giống lúa chứa hàm
lượng vitamin A cao hơn bình thường do Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) tạo
ra. Đặc điểm của loại lúa này chứa hàm lượng beta-caroten rất lớn. Mục đích của
các nhà khoa học khi tạo ra giống lúa siêu vitamin A chống bệnh về mắt hay thiếu
hụt vitamin A [12].
1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay
1.2.1. Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới
1.2.1.1.

Cây trồng chống chịu thuốc diệt cỏ

Nhiều loại cây trồng đã được biến đổi gen nhằm kháng lại thuốc diệt cỏ phổ
rộng. Các cây trồng chuyển gen này chứa các gen giúp chúng phân hủy các thành
phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ, khiến chúng trở thành vô hại. Nông dân có thể
dễ dàng loại bỏ cỏ dại trong suốt vụ mùa và thoải mái chọn lựa thời điểm phun
thuốc. cây trồng kháng thuốc diệt cỏ không cần hoặc cần rất ít việc làm đất. Những
người phản đối cho rằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ có thể dẫn đến
tăng sử dụng thuốc diệt cỏ, kích thích sự kháng thuốc diệt cỏ ở cỏ dại và hủy hoại
đa dạng sinh học nông nghiệp.
Gần đây, hai hệ thống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được phát triển đối với đậu
nành, ngô, củ cải dầu và bông là: RoundupReady và Liberty Link. Một số sản phẩm
thương mại của nhóm này là:

5


Đồ án tốt nghiệp

-

GA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang gen kháng thuốc trừ
cỏ).

-

Bt11xGA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang tổ hợp 2 gen:
kháng sâu bộ cánh vảy và kháng thuốc trừ cỏ được tạo ra bằng phương
pháp lai truyền thống) [28].

1.2.1.2.

Cây trồng kháng bệnh

Các cây trồng có thể bị bệnh gây ta bởi các loài nấm, vi khuẩn, virus, giun tròn
và các tác nhân khác. Nhiều các phương pháp công nghệ cao được đề xuất nhằm
bảo vệ thực vật khỏi các tác hại này. Đến nay, hầu hết các mối quan tâm tập trung
vào các thực vật chuyển gen kháng virus, nhưng việc sử dụng công nghệ sinh học
để kháng nấm, vi khuẩn hay giun tròn cũng được quan tâm.
Hai ví dụ về tăng trưởng cây GM thương mại trong lĩnh vực này là các cây
kháng côn trùng thể hiện gen Bt (từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis) và đu đủ GM
kháng virus [9].
1.2.1.3.

Thực vật với thành phần thay đổi

Ngày càng nhiều giống cây trồng chuyển gen mới được khảo nghiệm với đặc
tính tăng giá trị và chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu công nghiệp và của
người tiêu dùng.
Các thực vật chuyển gen mới với thành phần biến đổi đem lại nhiều lợi ích cho
công nghiệp và người tiêu dùng. Chẳng hạn khoai tây với thành phần tinh bột biến
đổi và các hạt dầu được dùng để thay thế các sản phẩm dầu mỏ là mối quan tâm của
công nghiệp. Người tiêu dùng có nhiều lợi ích từ thế hệ cây trồng biến đổi gen tiếp
theo, thế hệ của gạo với mức độ tăng cường cao của sắt, vitamin A hay dầu thực vật
có thể làm giảm nguy cơ bệnh tim…
1.2.1.4.

Cây trồng chống chịu áp lực

Các nhà sinh học thực vật sử dụng công nghệ sinh học để hoàn thiện cách thức
khiến các thực vật có thể thích nghi hơn với các thách thức môi trường như hạn hán,
mặn hay nhiệt độ thích hợp.

6


Đồ án tốt nghiệp

- Chịu hạn: Một cách tạo ra thực vật chịu hạn là lấy gen từ thực vật có khả năng
chịu hạn và chuyển vào cây trồng. Các thực vật hồi sinh (Xerophyta viscosa), nguồn
gốc từ vùng khô hạn phía nam châu Phi, chứa gen mã hóa duy nhất một protein
trong thành tế bào. Thực nghiệm chỉ ra rằng các thực vật nhận gen này có khả năng
chịu áp lực của hạn hán và độ mặn cao [21].
- Chịu mặn: Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng các thực vật có khả năng chịu mặn

cao chứa nồng độ cao chất glycinebetaine. Hơn nữa, thực vật có khả năng chịu mặn
trung bình có nồng độ trung bình và thực vật với khả năng chịu mặn thấp có ít hay
không chứa chất glycinebetaine. Khoai tây chuyển gen với khả năng sản sinh nhiều
glycinebetaine tăng khả năng chịu mặn.
1.2.1.5.

Loại bỏ chất ô nhiễm

Thực vật và vi sinh vật có thể được cải biến để tăng khả năng hấp thu kim loại
nặng và phân hủy các sản phẩm dầu.
Các biện pháp công nghệ sinh học được áp dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm.
Thực vật biến đổi gen được biến đổi để tích lũy nồng độ cao các kim loại độc.
Một ví dụ của biện pháp này là sử dụng cây dương liễu với khả năng hút cadimi từ
đất ô nhiễm. Kim loại độc này được rễ cây hút nhanh chóng và sau đó được dự trữ
trong gỗ và lá để loại đi. Nhiều thực vật có khả năng hấp thu lượng nhỏ kim loại
nặng.
1.2.2. Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen
1.2.2.1.

Tình hình thương mại hóa trên thế giới

Tỷ lệ canh tác cây trồng BĐG trong năm 2016 hồi phục lại mức cao với tổng
diện tích 185,1 triệu ha trên toàn cầu.
Năm 2016, sau hai thập kỷ thương mại hóa, 26 quốc gia đã trồng được 185,1
triệu ha cây trồng BĐG – tăng 5,4 triệu ha tương đương với 3% so với năm 2015.
Ngoại trừ sự sụt giảm trong năm 2015, đây là lần tăng thứ 20 liên tiếp về tỷ lệ canh
tác, trong đó đáng chú ý có 12 năm đạt mức tăng trưởng hai con số [11]. Cây trồng
BĐG cung cấp lựa chọn đa dạng hơn cho người tiêu dùng.

7

Đồ án tốt nghiệp

Các cây trồng BĐG đã được mở rộng ngoài 4 loại cây chính (ngô, đậu nành,
bông và cải dầu) nhằm mang tới nhiều lựa chọn hơn cho người tiêu dùng trên thế
giới. Những loại cây BĐG mới này gồm củ cải đường, đu đủ, bí, cà tím và khoai tây
cùng với sự xuất hiện của táo vào năm 2017. Khoai tây là giống cây trồng quan
trọng và chủ lực thứ tư trên thế giới; còn cà tím là loại rau được tiêu dùng số một tại
châu Á. Giống táo và khoai tây không thâm nâu có thể góp phần giảm lãng phí thực
phẩm. Thêm vào đó, nghiên cứu thực hiện bởi các tổ chức công cộng đã đưa các
cây trồng như gạo, chuối, khoai tây, lúa mì, đậu hồi, đậu triều, mù tạt và mía đường
vào các giai đoạn đánh giá nâng cao, có khả năng cung cấp nhiều lựa chọn cho
người tiêu dùng, đặc biệt tại các nước đang phát triển.
Các tính trạng và cây trồng BĐG mới đang được nghiên cứu và giới thiệu nhằm
mang thêm lợi ích cho nông dân và người tiêu dùng.
Đáng chú ý là các tính trạng và giống cây BĐG mới đang được thử nghiệm thực
địa để cung cấp tới nông dân và người tiêu dùng. Các loại cây này bao gồm các
giống trọng yếu như giống gạo vàng giàu beta-carotene đang được thử nghiệm tại
Philippines và Bangladesh; giống chuối BĐG kháng virus đầu buồng trồng tại
Uganda; giống chuối BĐG chống rầy nâu và giống lúa mì BĐG kháng bệnh, chịu
hạn, biến đổi lượng dầu và cấu thành hạt đang được thử nghiệm tại Úc; giống lúa
mỳ có sinh khối và sản lượng cao tại Anh; các giống khoai tây kháng bệnh mốc
sương Desiree và Victoria tại Uganda, cùng giống khoai tây kháng giun tròn và
bệnh mốc sương Maris Piper, giống khoai tây ít thâm và ít acrylamide canh tác tại
châu Âu; đậu triều và đậu hồi kháng sâu bệnh cùng mù tạt BĐG, vốn là các loại rau
và nguồn dầu chủ lực, được thử nghiệm tại Ấn Độ; giống mía đường chịu hạn trồng
tại Ấn Độ và Indonesia và cải camelina giàu omega-3 tại châu Âu [11].
Diện tích canh tác cây trồng BĐG toàn cầu tăng gần 110 lần, từ 1,7 triệu ha năm
1996 tới 185,1 triệu ha vào năm 2016 – khiến cây trồng BĐG trở thành công nghệ

cây trồng được ứng dụng nhanh nhất tại thời điểm hiện tại. Diện tích cộng dồn đạt
2,1 tỷ ha có được sau 21 năm (1996 – 2016) thương mại hóa cây trồng BĐG. Diện
tích canh tác cây BĐG tại các quốc gia đang phát triển chiếm 54% diện tích canh

8


Đồ án tốt nghiệp

tác toàn cầu (99,6 triệu ha); trong khi diện tích này tại các nước công nghiệp chiếm
46% (85,5 triệu ha) [11].

Hình 1.2. Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo
ISAAA
Bốn loại cây trồng BĐG chủ lực gồm: đậu nành, ngô, bông và cải dầu là các
giống BĐG được ứng dụng nhiều nhất tại 26 quốc gia. Diện tích canh tác đậu nành
BĐG đạt mức cao nhất 91,4 triệu ha, tương đương 50% diện tích canh tác của tất cả
các giống cây BĐG trên toàn cầu (185,1 triệu ha). Mặc dù có sự sụt giảm nhẹ tương
đương mức biên 1% so với năm 2015 (92,7 triệu ha), khu vực canh tác đậu nành
vẫn giữ mức bền vững 91,4 triệu ha. Xét trên diện tích canh tác toàn cầu của từng

9


Đồ án tốt nghiệp

loại cây trồng riêng lẻ, trong năm 2016 có 78% đậu nành, 64% bông, 26% ngô và
24% cải dầu là giống cây BĐG [11].
Tính trạng biến đổi gen đơn chống chịu thuốc trừ cỏ trên cây đậu nành, cải dầu,
ngô, cỏ linh lăng và bông hiện vẫn giữ ngôi vị thống trị với 47% diện tích canh tác

toàn cầu. Tuy vậy, tỷ lệ này có xu hướng giảm đi, cùng với sự tăng lên của cây
BĐG đa tính trạng (kết hợp tính trạng kháng sâu bệnh, chống cỏ dại và các tính
trạng khác). Diện tích canh tác cây trồng với tính trạng kháng cỏ dại là 86,5 triệu ha
năm 2016, chiếm 47% tổng diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha). Mặt khác,
diện tích canh tác cây trồng đa tính trạng đã tăng 29% trong năm 2016, đạt 75,4
triệu ha từ 58,4 triệu ha năm 2015. Theo đó, cây trồng đa tính trạng hiện chiếm 41%
diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha). Ví dụ ở Hoa Kỳ, ngô GM kháng côn
trùng được trồng trên diện tích 10,6 triệu ha và bao gồm 35% ngô (GM và không
GM) trồng ở cả nước [6].

Hình 1.3. Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm
1.2.2.2.

Tình hình cây trồng biến đổi gen tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các sản phẩm từ cây trồng biến đổi gen được nhập khẩu về có kiểm
soát nhằm sử dụng chủ yếu trong sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Theo thống kê của Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong 9 tháng đầu năm
2015 nước ta nhập khẩu 2,59 tỷ USD thức ăn gia súc và nguyên liệu, trong đó thị
trường nhập khẩu chính là Argentina (42% thị phần), Mỹ (14% thị phần), Brazil
(7,8% thị phần) [22].
10


Đồ án tốt nghiệp

Hiện tại Việt Nam cho phép nhập khẩu những loại thực phẩm biến đổi gen và
được kiểm soát chặt chẽ đó là NK66 Bt; NK66 GT và NK66 Bt/Gt và Bt11, các
event MON89788, MON87705, 40-3-2, MON87705, MON87701, MON87708 của
đậu nành (Tham khảo tại phụ lục B, Danh mục cấp Giấy xác nhận thực vật biến đổi

gen).

Hình 1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18]
Đối với đậu tương, trong quý I năm 2017 đã nhập khẩu 137,1 nghìn tấn, trị giá
61,9 triệu USD, giảm 57,4% về lượng và giảm 52,1% về trị giá so với quý I năm
2016, tính riêng tháng 3/2017, nhập khẩu đậu tương tăng 27,8% về lượng và 28%
về trị giá so với tháng 2/2017, đây cũng là tháng tăng đầu tiên sau hai tháng suy
giảm liên tiếp đạt tương ứng 60,5 nghìn tấn, trị giá 27,3 triệu USD.
1.2.3. Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam
Trên thế giới có nhiều quốc gia cho phép nhập khẩu và sử dụng thực phẩm biến
đổi gen. Mỗi quốc gia đều đặt ra những quy định dán nhãn riêng. Mỹ là một trong
những quốc gia có yêu cầu cao về việc dán nhãn thực phẩm biến đổi gen GMO. Cụ
thể, từ ngày 01/07/2016 tất cả các sản phẩm GMO bày bán tại bang Vermont (Mỹ)
đều phải dán nhãn.
Brazil hiện là nước sản xuất cây trồng GMO lớn thứ hai trên thế giới cũng yêu
cầu dãn nhãn cho cả hai loại thực phẩm làm thức ăn cho người hoặc động vật nếu
có chứa hoặc được sản xuất từ GMO.
11


Đồ án tốt nghiệp

Trong khi đó tại một số nước, việc quy định dán nhãn dựa trên tỷ lệ GMO trong
một sản phẩm thực phẩm. Cụ thể, những nơi như Liên minh châu Âu, Ả-rập Saudi,
Thổ Nhĩ Kỳ và Úc tỷ lệ GMO ở ngưỡng 0,9%. Các nước khác cho phép đưa GMO
vào mức độ cao hơn như Hàn Quốc là 3% và Nhật Bản là 5% [27].
Theo thông tư liên tịch số 45 giữa Bộ Khoa học Công nghệ và Bộ Nông nghiệp
và Phát triển Nông thôn ban hành cuối tháng 11/2015 thì từ 08/01/2016, thực phẩm
GMO được đóng gói sẵn bắt buộc phải dán nhãn bằng tiếng Việt có ghi rõ “biến đổi
gen”. Bên cạnh đó, với sản phẩm đóng gói sẵn có ít nhất một thành phần nguyên

liệu GMO lớn hơn 5% tổng nguyên liệu được sử dụng đều phải ghi nhãn khi lưu
thông tại thị trường Việt Nam. Đối với những sản phẩm có diện tích để ghi nhãn
nhỏ hơn 10cm2 thì trên nhãn bắt buộc phải có tên hàng hóa và cụm từ “biến đổi
gen”; những nội dung bắt buộc còn lại không thể hiện trên nhãn thì phải được ghi
trong tài liệu kèm theo hàng hóa.
Theo thông tư 45, một số trường hợp được miễn ghi nhãn GMO bao gồm:
-

Thực phẩm mang theo người nhập khẩu để tiêu dùng cá nhân trong định
mức được miễn thuế nhập khẩu; thực phẩm trong túi ngoại giao, túi lãnh sự;
thực phẩm tạm nhập tái xuất, thực phẩm quá cảnh, chuyển khẩu; thực phẩm
gửi kho ngoại quan; thực phẩm là mẫu thử nghiệm hoặc nghiên cứu; thực
phẩm là mẫu trưng bày hội chợ, triển lãm;

-

Nguyên liệu, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, bao bì
chứa đựng thực phẩm, nhập khẩu về để sản xuất nội bộ không bán ra thị
trường, chỉ vận chuyển nội bộ giữa các kho từ tỉnh này qua tỉnh khác thuộc
cùng một hệ thống trong doanh nghiệp [5].

1.2.4. Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam
Công nghệ sinh học là một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam. Do đó, việc nghiên
cứu và ứng dụng GMO mới đang bước những bước đầu tiên trong quá trình phát
triển. Một vài nghiên cứu về GMO mới chỉ diễn ra trong quy mô phòng thí nghiệm
và tập trung ở một số viện nghiên cứu đầu ngành trong cả nước thuộc Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Trong đó,

12

Đồ án tốt nghiệp

tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các nghiên cứu tạo GMO chủ yếu trên
đối tượng vi sinh vật, thực vật, động vật và được tiến hành ở các phòng thí nghiệm
của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới. Tại Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn, các nghiên cứu thường được tiến hành trên đối tượng thực vật
tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng song Cửu
Long.
Nhìn chung, trong quy trình nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan
trọng đầu tiên được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý
có giá trị ứng dụng cao tiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên
những giống lý tưởng. Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao
gồm gen chịu hạn, lạnh, kháng bệnh ở lúa; gen cry và vip mã hóa các protein độc tố
có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gen mã hóa
protein bất hoạt hóa ribosome ở cây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây
đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng; gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh
đốm vòng ở cây đu đủ; gen mã hóa kháng nguyên vỏ của các chủng virus dại… Các
gen có giá trị y dược phải kể đến các gen mã hóa cho một số kháng nguyên của
virus và vi khuẩn như gen mã hóa kháng nguyên E của virus Dengue typ I và typ II
sử dụng trong chuẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue [23]. Song song với
những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị
chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng
thí nghiệm trên cả nước. Trên đối tượng thực vật, hướng nghiên cứu hoàn thiện các
phương pháp chuyển gen và các quy trình tái sinh cây khởi đầu cho những nghiên
cứu chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng cũng nhận được sự quan tâm
của nhiều nhóm tác giả. Gần đây, hướng nghiên cứu nuôi cấy tế bào động vật nhằm
hoàn thiện quy trình tiến tới sử dụng để biểu hiện gen trên tế bào động vật nuôi cấy
cũng bắt đầu được tiếp cận nghiên cứu.

13


Đồ án tốt nghiệp

1.3. Các phƣơng pháp xác định cây trồng biến đổi gen
1.3.1. Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích
Protein có thể phát hiện được bằng cách ứng dụng các kháng thể đặc thù. Trong
trường hợp này, một kháng thể đặc thù thường được tạo ra để phát hiện một protein.
Mức độ ái lực của các kháng thể đối với protein sẽ phụ thuộc vào cấu hình protein
sau khi tách chiết. Tính đặc trưng của kháng thể được sử dụng cần được chứng
minh (ví dụ: không có khả năng phản ứng chéo). Việc phát hiện sinh vật biến đổi
gen qua phân tích dòng đặc hiệu bằng định lượng protein không thể thực hiện được
chính xác nếu có nhiều hơn một sinh vật biến đổi gen có biểu hiện cùng một
protein.
Các phương pháp sàng lọc có thể có lợi cho việc đánh giá sản phẩm có chứa hay
không chứa các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen dựa trên sự có mặt
các protein biểu hiện. Các ví dụ về phương pháp sàng lọc là dạng mẫu que thử và
ELISA định tính. Việc định lượng sinh vật biến đổi gen trong một loại chất nền nhất
định có thể được thực hiện bằng các phương pháp dựa vào protein, chẳng hạn như
phương pháp dùng ELISA. Phương pháp này có thể phù hợp với chất nền cần phân
tích và các chất chuẩn có thể được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn để từ đó tính
được hàm lượng protein trong mẫu thử nghiệm.
1.3.2. Phương pháp sử dụng DNA đích
Đặc trưng của các phương pháp phân tích sử dụng DNA đích là để xác định sự
có mặt của các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, phụ thuộc vào các
tính chất cụ thể của trình tự DNA đích. Ứng dụng và phân loại khác của tính đặc
hiệu như sau:
Phương pháp dựa vào taxon đích: Tìm thấy các trình tự DNA trong một taxon
đích, thường là một loài nhưng có thể là cấp phân loại nhỏ hơn hoặc cao hơn. Các

phương pháp dựa vào taxon đích có thể dùng để đánh giá sự có mặt, chất lượng và
số lượng DNA có nguồn gốc từ taxon và đôi khi được sử dụng như là một điểm
chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen. Tính đặc hiệu
cần được xây dựng bằng các số liệu thực nghiệm.

14


Đồ án tốt nghiệp

Phương pháp sàng lọc tìm thấy: Các trình tự DNA đích trong một vài loài nhưng
không nhất thiết trong toàn bộ các dòng biến nạp. Các trình tự này cũng được tìm
thấy trong nguyên liệu không biến đổi gen, chẳng hạn do sự có mặt của virus và vi
khuẩn tự nhiên. Các phương pháp sàng lọc giúp cho việc đánh giá sự có mặt hay
không có mặt sản phẩm có chứa nguyên liệu có nguồn gốc biến đổi gen. Ví dụ,
phương pháp sàng lọc là định tính PCR để phát hiện đoạn khởi động 35S-CaMV
[3].
1.3.3. Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc
Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) 35S của
virus khảm súp lơ (CaMV): Do promoter 35S-CaMV có mặt trong một số thực vật
biến đổi gen. Đoạn DNA 195bp trong promoter 35S-CaMV được khuếch đại bằng
PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza sau khi tách (Phụ lục B,
TCVN 7605:2005).
Phát hiện trình tự kết thúc (terminator) trên gen nopalin synthaza (NOS) có
nguồn gốc từ Agrobacterium tumefaciens: Do nhiều thực vật biến đổi gen có chứa
trình tự NOS-terminator nên phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc sự
có mặt của thành phần từ thực vật biến đổi gen. Đoạn DNA có kích thước 118bp
nằm trong trình tự kết thúc (terminator) của NOS được khuếch đại bằng PCR và
được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza (Phụ lục B, TCVN 7605:2005).
Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) FMV 34S ở

cây cải dầu GM RT73. Do promoter 34S-FMV có mặt trong một số thực vật biến
đổi gen. Virus dạng mosaic (FMV) là một phân đoạn, virus RNA sợi đơn (mạch
âm) được xác định là tác nhân gây bệnh rêu mồi (Ficus carica) trên cây cải dầu.
FMV có thể gây ra một loạt các triệu chứng khác nhau ở mức độ nghiêm trọng,
trong đó có lá úa biến dạng và khảm hoặc đổi màu hoa văn, cũng như khảm trên hoa
quả non. Promoter FMV có chiều dài 196bp thường được chuyển các gen ở cây cải
dầu, đậu nành. Sự hiện diện của promoter 34S-FMV có trong nhiều cây biến đổi
gen, đặc biệt là trong hạt cải dầu, khoai tây, đậu nành, bông, cà chua, củ cải. Một số
event được phát hiện bởi promoter 34S-FMV RT73 cải dầu, MON1445, MON1698

15


Đồ án tốt nghiệp

và MON88913 của vải, MON89788 ở đậu nành, H7-1 ở củ cải đường. Một số event
không phát hiện được như đậu nành 40-3-3 và MON810, MON863, TC1507, giống
ngô Bt11, GA21, NK603, Bt176 (Phụ lục B, ISO 21569:2005/2013).
1.3.4. Giới thiệu chung về phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự
(Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các
nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.
 Nguyên tắc:
Đây là phương pháp invitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các
bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase.
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng
hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, đó
là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch
khuôn.

Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA

polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba
giai đoạn:
 Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành dạng mạch đơn.
 Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
 Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.
Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử
dụng máy giải trình tự tự động.
Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự
nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh
quang. Phương pháp này có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến trên các
phòng thí nghiệm thế giới.
Hiện nay có nhiều phương pháp PCR cải tiến như nested PCR, PCR đẳng nhiệt,
Realtime PCR.

16


Đồ án tốt nghiệp

Định nghĩa kỹ thuật Realtime PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc
kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu. Phương
pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát
huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết
quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.
Nguyên tắc thực chất hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối
với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR cho biết kết quả
lượng DNA hình thành ở từng thời điểm trong suốt tiến trình phản ứng Realtime

PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo
độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.
Multiplex PCR bao gồm nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất để tạo
ra bản sao kích thước khác nhau đặc trưng cho các trình tự DNA khác nhau. Với
nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc, nhiều thông tin thu được từ một lần
chạy mà không đòi hỏi nhiều hóa chất và thời gian thực hiện. Nhiệt độ gắn mồi phải
được tối ưu hóa cho từng cặp mồi để chúng có thể thực hiện chính xác trong một
cặp bazo phải khác nhau để tạo ra các băng có thể phân biệt bằng mắt thường khi
điện di [24].
Nested PCR làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu
do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu. Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng
PCR liên tiếp. Trong phản ứng đầu tiên, một cặp mồi được sử dụng để tạo ra các
sản phẩm DNA, bên cạnh đoạn DNA đích mà phản ứng hướng đến vẫn có thể bao
gồm các đoạn DNA khuếch đại không đặc hiệu. Các sản phẩm sau đó được sử dụng
tiếp phản ứng PCR thứ hại với cặp mồi mà vị trí gắn khác hoàn toàn hoặc khác một
phần từ vị trí 3 của mỗi mồi ở phản ứng đầu tiên. PCR lồng thường thành công hơn
phản ứng PCR thông thường, đặc biệt trong trường hợp khuếch đại các đoạn DNA
dài, nhưng nó cũng đòi hỏi thông tin chi tiết hơn về các trình tự đích [24].

17