Xây dựng phương pháp phát hiện 6, monoacetylmorphin trong mẫu nước tiểu bằng GC và MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT



XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
6-MONOACETYLMORPHIN TRONG
MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC









HÀ NỘI 2013
 1

 2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT



XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
6-MONOACETYLMORPHIN TRONG
MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410





Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Trường

HÀ NỘI 2013
LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ Dược học, em xin được gửi
lời trân trọng cảm ơn tới thầy hướng dẫn TS. Nguyễn Xuân Trường. Cám
ơn sự tận tình chỉ bảo, cũng như sự động viên của thầy đã giúp em vượt
qua những khó khăn để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Sự hiểu biết sâu
sắc của thầy đã thắp sang
tình yêu khoa học cho mỗi học viên may mắn được thầy hướng dẫn.
Em
cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, đặc biệt các thầy cô
trong bộ môn kiểm nghiệm thuốc- độc chất, Trường Đại học Dược Hà
Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Tôi xin được cảm ơn tới các anh chị đồng nghiệp nơi tôi công tác,
cùng các anh chị công tác tại Trung tâm Giám định ma túy-Viện Khoa
học Hình sự, đặc biệt là Th.s Đỗ Duy
Nam, Th.s Hoàng Ngọc Mai đã
giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, chồng, em trai đã động
viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt khóa học.
Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013
Học viên


Nguyễn Thị Minh Nguyệt

 3

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Vài nét về các nhóm ma túy 3
1.1.1 Một số khái niệm về chất ma túy 3
1.1.2.Phân loại các chất ma túy
4
1.2. Các chất ma túy nhóm opiat
5
1.2.1. Lịch sử
5
1.2.2. Cấu trúc, và tác dụng của các chất nhóm opiat [
5] 5
1.3. Chất chuyển hóa 6-M
AM 11
1.3.1. Cấu tạo, tính chất 6-MAM
11
1.3.2. Các phương pháp phân tích 6-MAM.
14
1.4. Kĩ thuật chuẩn bị mẫu
24
1.4.1. Kiểm tra sơ bộ
24
1.4.2. Tách chiết mẫu
25
1.4.3. Dẫn xuất hóa mẫu phân tích 25
1.4.4. Chất nội chuẩn
26
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI

ÊN CỨU 27
2.1. Đối tượng nghiên cứu
27
2.2. Hóa chất và thiết bị: 27
2.3. Phương pháp và nội dung nghiên cứu 27
2.3.1. Điều kiện làm việc của hệ sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) 27
2.3.2. Khảo sát chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 28
2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng 6- MAM trong nước tiểu bằng
GC- MS
29
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
32

 4
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 33
3.1. Xây dựng quy trình chiết, phân tích 6-MAM trong nước tiểu 33
3.1.1. Lựa chọn điều kiện phân tích 6-MAM trên GC-FID 33
3.1.2. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết
34
3.1.3. Khảo sát lựa chọn pH môi trường chiết xuất 6-MAM trong mẫu
nước tiểu
38
3.1.4. Khảo sát sự ổn định 6-M
AM trong mẫu nước tiểu 40
3.1.5. Lựa chọn điều kiện dẫn xuất 6-MAM và phân tích trên GC-MS
trong mẫu nước tiểu
44
3.1.6. Quy trình phân tích 6-MAM trong mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng-
lỏng, dẫn xuất hóa và phân tíc
h trên GC-MS 47

3.2. T
hẩm định phương pháp định lượng 6-MAM trong nước tiểu
bằng GC-MS 49
3.2.1. Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu
49
3.2.2 Đường chuẩn, khoảng làm việc, Giới hạn phát hiện (
LOD) , ngưỡng
phát hiện (Cut off) 51
3.2.3. Độ đúng 53
3.2.
4. Độ chính xác 54
3.2.5. Độ thu hồi
55
3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực tế
56
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
60
4.1 Về thẩm định phương pháp phân tích 6-MAM trong nước tiểu 60
4.2 Về phân tích mẫu thực tế 60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63


 5
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT/ KÝ HIỆU

6 – MAM 6 – monoacetylmorphine
AC Acetylcodein
BSA N, O-bis-trimethylsilylacetamit
BSTFA N, O-bis-trimethylsilyifluoroacetamide
Clof Chloroform

DCM Dichlorometan
Ete Diethylete
EI Kỹ thuật ion hóa bằng va chạm electron
EtAc Ethylacetat
GC-MS Sắc ký khí – khối phổ
HPLC (High performance
liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IS (Internal Standard) Chất nội chuẩn
LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện
LOQ (Limit of Quantification) Giới hạn định lượng
M-3-G Morphin – 3 – glucuronic
M-6-G Morphin – 6 – glucuronic
PFPA Anhydric pentafluoropropionic
RSD Phương sai
SD Độ lệch chuẩn
 6
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Morphin 6
Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm
opiat 10
Hình 1.3. Công thức cấu tạo 6-MAM 11
Hình 1.4. Sơ đồ máy
khối phổ 21
Hình 1.5. Sơ đồ quá trình i
on hóa bằng EI 22
Hình 1.6. Sơ đồ bẫy ion tứ cực 24
Hình 3.1: Phổ đồ của hỗn hợp chất chuẩn m
ethadone, morphine, 6-MAM,
Octacosan trong CTSK GC-FID 34
Hình 3.2: Phổ đồ GC của mẫu c

hiết bằng chloroform trong trường hợp không
loại tạp 36
Hình 3.3 : Phổ đồ GC của mẫu c
hiết bằng chloroform trong trường hợp đã
loại tạp 36
Hình 3.4: Biểu đồ biểu thị hiệu suất chiết 6-MAM của các dung m
ôi 37
Hình 3.5: Đồ thị biểu thị khả năng chiết 6-MAM trong nước t
iểu ở các giá trị
pH 39
Hình 3.6: Phổ đồ GC của mẫu c
hiết với chloroform ở pH=9 40
Hình 3.7: Phổ đồ GC của mẫu c
hiết trong ngày đầu 41
Hình 3.8: Phổ đồ GC của mẫu c
hiết trong ngày thứ 5 42
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ 6-M
AM trong thời gian bảo
quản 42
Hình 3.10: Sơ đồ phản ứng dẫn xuất 6-MAM + PFP
A 44
Hình 3.11: Sự thay đổi hình dạng, chiều cao, thời gian lưu pic khi dẫn xuất:
6-MAM cho pic tại 11,92 phút và 6-MAM-PFP cho pic tại 10,67 phút 46
Hình 3.12: Đồ thị đường chuẩn định lượng 53
Hình 3.13: Phổ đồ kết quả phân tích của mẫu M03 59

 7
DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của các chất nhóm opiat 6

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát dung m
ôi chiết trong trường hợp đã loại tạp 37
Bảng 3.
2: Kết quả khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu phụ thuộc vào
pH mẫu 39
Bảng 3.3: Kết quả sự thay đổi tỷ lệ diện tích pic của 6-MAM và chất nội
chuẩn trong quá trình bảo quản mẫu nước tiểu 41
Bảng 3.4: Kết quả hiệu suất chiết 6-MAM theo quy trình đã lựa chọn 43
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống 51
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát xây dựng đường chuẩn, xác định LOD, LOQ 52
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát xác định độ đúng 54
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp 56
Bảng 3.9: Một số thông tin ban đầu về mẫu nước tiểu thực tế 57
Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế 58

 8
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ma túy là một vấn nạn, không chỉ trong nội bộ của một quốc gia mà
còn là vấn đề cần được quan tâm của nhiều nước. Toàn cầu hóa đã mang lại
nhiều cơ hội cho sự phát triển kinh tế- xã hội, song cũng đặt ra nhiều thách
thức lớn trong công cuộc đấu tranh với tệ nạn ma túy, đặc biệt ở các nước
đang phát triển. Hiện nay, do mức độ nghiêm trọng từ phương thức đến t
hủ
đoạn sản xuất, vận chuyển, buôn bán ma tuý ngày càng tinh vi đã ảnh hưởng
không nhỏ đến công tác quản lý, đấu tranh ngăn chặn ma túy của các nước.
Cũng như các quốc gia khác trong khu vực và quốc tế, Việt Nam đã có
nhận thức sâu sắc về tác hại của ma túy đối với cá nhân, cộng đồng và xã hội.
Việc đấu tranh phòng, chống ma túy ở Việt Nam là một mặt trận nóng bỏng,
được cả xã hội q

uan tâm. Quốc hội Việt Nam đã thông qua Luật phòng, chống
ma túy năm 2001, Luật sửa đổi, bổ sung một số điều của Luật phòng, chống
ma túy năm 2008. Chính phủ Việt Nam đã tập trung chỉ đạo thực hiện các
luật, nghị quyết của Quốc hội, ban hành được nhiều văn bản hướng dẫn thi
hành pháp luật về phòng, chống ma túy, cũng như đã thành lập Ủy ban Quốc
gia về phòng, chống ma túy.
Trong những năm
qua, việc phòng, chống ma tuý tại Việt Nam đã đạt
được những kết quả quan trọng. Tuy vậy, tệ nạn ma túy vẫn diễn biến phức
tạp và tiếp tục gây ra các hậu quả nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chiến lược
phát triển kinh tế, trật tự, an toàn xã hội và phát triển nòi giống. Điều này đòi
hỏi Việt Nam cần tiếp tục có các giải pháp đồng bộ trong việc đấu tranh ngăn
chặn các tệ nạn và tội phạm
liên quan đến ma túy. Một trong những biện pháp
hỗ trợ cho công tác phòng ngừa là phát hiện, đánh giá mức độ sử dụng ma túy
của các đối tượng sử dụng các chất ma túy [2].
Theo thời gian, các đối tượng sử dụng chất ma túy ngày càng đa dạng,
tinh vi hơn. Điều này thể hiện không chỉ trong việc tàng trữ, sử dụng các chất
 1
ma túy mà còn trong quá trình khai báo khi bị bắt. Một số thuốc có sản phẩm
chuyển hóa giống sản phẩm chuyển hóa của một số chất ma túy, điều này
thường được các đối tượng lợi dụng trong quá trình khai báo nhằm thoát tội.
Vì vậy công tác phát hiện các chất ma túy đòi hỏi ngày càng hoàn thiện hơn
khắc phục những lỗ hổng mà tội phạm có thể lợi dụng được [2], [9].
Heroin là một trong những chất ma túy nguy hiểm nhất và phổ biến
nhất trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Heroin được bán tổng hợp từ
Morphine. Khi vào cơ thể, một trong những sản phẩm
chuyển hóa cuối cùng
của heroin được tìm thấy là Morphine, đây cũng là sản phẩm chuyển hóa của
một số thuốc chứa hoạt chất codein, morphine, opium. Vì vậy khi phát hiện

Morphintrong dịch sinh học không thể kết luận đối tượng đã sử dụng Heroin.

6-Monoacetylmorphin(6-MAM) là sản phẩm chuyển hóa trung gian của
Heroin trong cơ thể, đồng thời cũng là “chìa khóa” để phân biệt Heroin với
các opiat khác. Tuy nhiên, nồng độ của 6-MAM trong nước tiểu thường rất
nhỏ, cần có những thiết bị phân tích hiện đại, có độ nhạy cao để nhận dạng.
Trên thế giới để xác định việc sử dụng Heroin người ta thường tiến hành phân
tích sản phẩm chuyển hóa trung gian 6-MAM. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có
công trình nghiên cứu toàn diện về vấn đề này [6]
, [11].
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nhiệm vụ “xây dựng
phương pháp phát hiện 6-Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng
GC-MS” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phát hiện 6-
Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí – khối
phổ (GC-MS).
2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu nước tiểu thực tế.
 2
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về các nhóm ma túy
1.1.1 Một số kh
ái niệm về chất ma túy
Trong quá trình phát triển, con người đã biết sử dụng một số loại cây cỏ
giúp cho tinh thần sảng khoái, chống mệt mỏi. Từ thế kỉ thứ 3 trước công
nguyên đã có tài liệu ghi nhận việc sử dụng thuốc phiện. Thuốc phiện được
coi như một loại thần dược chữa bách bệnh. Điều đó dẫn tới việc lạm dụng
thuốc phiện của loài người. Năm 1806, Serturner đã phân lập được một c
hất
tinh khiết đặc trưng cho tác dụng chính của thuốc phiện và gọi tên là
Morphine. Nó còn được gọi tên là Narcotic, nghĩa là mê mẩn, túy lúy. Ở Việt

Nam, ban đầu thuật ngữ “ma túy” dùng để chỉ thuốc phiện. Tuy nhiên cho tới
ngày nay khái niệm đó đã được mở rộng, nó bao gồm thuốc phiện, các sản
phẩm thiên nhiên khác như cần sa, cô ca… và hàng loạt các sản phẩm
bán
tổng hợp, tổng hợp khác. Một cách tổng quát nhất, ma túy được định nghĩa:
“các chất ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi trạng thái tâm lý,
sinh lý người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự phụ thuộc về
tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó” [6], [9], [11].
Tại Việt Nam, điều 2 luật phòng chống ma túy được Quốc hội khóa X,
kỳ họp thứ 8 thông qua ngày 9 tháng 12 năm
2000 quy định:
a. Chất ma túy là các chất gây nghiện, chất hướng thần được quy định
trong các danh mục do Chính phủ ban hành.
b. Chất gây nghiện là chất kích thích hoặc ức chế thần kinh, dễ gây tình
trạng nghiện ðối với ngýời sử dụng.
c. Chất hýớng thần là chất kích thích, ức chế thần kinh hoặc gây ảo
giác, nếu sử dụng nhiều lần có thể dẫn tới tình trạng nghiện ðối với ngýời sử
dụng [4]
.
 3
Theo Nghị định số 82/2013/NĐ-CP của Chính phủ ngày 19 tháng 7
năm 2013 ban hành danh mục các chất ma túy và tiền chất, hiện nay các chất
ma túy gồm 235 chất chia làm 3 danh mục và 41 tiền chất [7].
1.1.2. Phân loại các chất ma túy.
Có nhiều cách phân loại các chất ma túy [6], [9], [19]:
 Dựa theo nguồn gốc:
- Ma túy tự nhiên: thuốc phiện, Morphine, Cocain, Cần sa
- Ma túy bán tổng hợp: Heroin ðýợc bán tổng hợp từ Morphine
- Ma túy tổng hợp: Methamphetamin,
 Phân loại theo tác dụng tâm, sinh lý:

- Các chất ức chế thần ki
nh trung ýõng, có tác dụng giảm ðau, gây
ngủ gồm thuốc phiện, các chất Opiat và các chất tác dụng kiểu Morphine.
- Các chất kích thích thần kinh trung ýõng nhý Amphetamin,
Methamphetamin, các dẫn chất mạch vòng của Amphetamin, Cocainm, cây
Khat
- Các chất gây ảo giác nhý Cần sa, LSD, nấm Peyote, Mescalin…
- Các chất an thần, gây ngủ nhý các chất nhóm Benzodiazepin, nhóm
Barbiturat.
- Một số các chất dung môi bay hõi nhý Ete, Etyl acetat…
 Phân loại theo tính chất hóa học:
- Nhóm alkaloid : Morphine, Codein, Cocain, Heroin
- Nhóm amin thõm: Amphetamin, Methamphetamin…
 Phân loại theo trạng thái vật lý: rắn, lỏng…
 4
Trên thực tế cách phân loại theo tác dụng tâm sinh lý được dùng phổ biến
nhất trên thế giới, cách phân loại theo trạng thái vật lý ít được sử dụng vì đa
số các chất ma túy ở trạng thái rắn dưới dạng tinh thể hoặc vô định hình, trừ
một số ít chất lỏng như cần sa và các dung môi bay hơi. Trong phạm vi đề tài
này Heroin và sản phẩm chuyển hóa của nó là đối tượng chính.
1.2. Các chất ma túy nhóm opiat.
1.2.1. Lịch sử

Thuật ngữ “opiat” được dùng để chỉ những chất có trong thuốc phiện,
là một sản phẩm tự nhiên thu được từ nhựa quả cây thuốc phiện, tên khoa học
là Papaver sonmiferum L, bao gồm morphine, codein, thebain, và các chất
bán tổng hợp từ chúng như heroin, oxycodone, hydromorphone.
Đầu thế kỷ XIX, lần đầu tiên morphinđược phân lập từ cây thuốc phiện,
vào năm 1874 việc tổng hợp diacetylmorphinđược báo cáo. Năm 1898, sản
phẩm thương mại được r

a đời bởi công ty Bayer, người ta đặt tên cho loại
thuốc mới này là Heroin. Đầu thế kỉ XX, Heroin được chấp nhận rộng rãi như
một loại thuốc chuyên dụng, dùng thay thế Codein và Morphintrong điều trị
bệnh lao và các bệnh về đường hô hấp khác. Cũng trong thời gian này, Heroin
lần đầu tiên xuất hiện tại Trung Quốc. Vài năm sau, công ước quốc tế về ma
túy năm 1925, kiểm soát quốc tế bắt đầu giới hạn việc cung cấp Heroin và

cũng từ đây xuất hiện hành vi sản xuất heroin trái phép.
Trên thế giới thuốc phiện được phân bố ở bốn khu vực chính là vùng
tam giác vàng, lưỡi liềm vàng (chiếm 70% sản lượng trên thế giới), Nam Mỹ,
và phía nam của Bắc- Trung Mỹ. Tại Việt Nam, cây thuốc phiện được trồng ở
các tỉnh miền núi phía bắc, tuy nhiên việc trồng cây thuốc phiên đã bị cấm,
diện tích trồng còn rất ít, chiếm khoảng 400 hecta [2], [6
], [9]
1.2.2. Cấu trúc, và tác dụng của các chất nhóm opiat [5]
 5
Trong thuốc phiện có khoảng 40 alkaloid khác nhau, dựa vào cấu trúc
hóa học có thể chia làm 2 nhóm chính: nhóm có chứa nhân Phenanthren (gồm
morphine, codein, thebain…) và nhóm chứa nhâm Benzylisoquinolin (như
narcotin, papaverin…) ngoài ra thuốc phiện còn chứa acid meconic…
1.2.2.1. Cấu trúc hóa học:

Cấu tạo phân tử morphin
A: vòng thơm
B: vòng cyclohexan
C: vòng alcol
D: vòng piperidin
E: vòng tetrahydrofuran (cầu nối ete 4,5)
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Morphin
Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của các chất nhóm opiat

Các nhóm thế ở vị trí số

Dẫn chất opiat
3 6 17

Ghi chú
Morphin OH OH CH
3

Heroin OCOCH
3
OCOCH
3
CH
3

Codein CH
3
OH CH
3

Thebain OCH
3
OCH
3
CH
3

Nalorphin OH OH CH
2

CH=CH
2
(1), (2)
Naloxone OH =O CH
2
CH=CH
2
(1)
Hydromorphone OH =O CH
3
(1), (3)
Levophanol OH H CH
3
(1), (2)
Oxycodon OCH
3
=O CH
3
(1), (2)
 6
Naltrexone OH =O CH
2
-CPropan
(1): liên kết C7 và C8 là liên kết đơn
thren tương tự
o h
tử m
orphin thì một số tác dụng dược lý và đặc
nh ư
ảm ho tăng l

ên, đồng thời sinh khả dụng đường uống cũng
t n
ơn, tác dụng giảm đau gây nghiện tăng, ví dụ diacetyl
morphin
nhưng thời gian tác dụng lại ngắn như
xy
o m
l –CH
2
-CH=CH
2

i morphin [5], [6].

(2): thêm OH vào C14
(3): giữa C4 và C5 không có O
1.2.2.2. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng

- Các chất trong nhóm đều có cấu trúc nhân phenan
m rp in, là cấu trúc quyết định tác dụng giảm đau của nhóm.
- Các nhóm chức có liên quan đến tác dụng là nhóm –OH phenol ở vị
trí 3, nhóm –OH alcol ở vị trí 6, và nhóm thế ở vị trí 17. Khi thay đổi nhóm –
OH ở vị trí C
3
,

C
6
trong phân
tí d ợc động học thay đổi:

+ Khi methyl hóa nhóm -OH ở vị trí C
3
, tác dụng giảm đau gây nghiện
giảm, tác dụng gi
tố hơ morphin.
+ Acetyl hóa nhóm –OH ở vị trí C
3
,

C
6
thuốc thâm nhập hàng rào máu
não tốt h
(Heroin)
+ Khử H của –OH ở C
6
tạo nhóm ceton hoặc ester hóa thì tác dụng
giảm đau và độc tính tăng
o m rphon, hydro orphon.
+ Thay –CH
3
ở vị trí 17 của morphin bằng nhóm ally
thì được nalorphin, tác dụng đối kháng vớ
1.2.2.3. Dược động học của nhóm opiat

Hấp thu: các chất opiat có thể đưa vào cơ thể bằng nhiều cách khác
nhau, như hút, hít, uống, tiêm, nhai… tùy thuộc vào dạng có sẵn. Tuy nhiên,
 7
khi dùng đường uống, các chất này bị chuyển hóa đáng kể bởi chu trình gan-
mật, sinh khả dụng thấp 25% đối với morphin, 35% đối với heroin, codein có

ưới dạng hút, hít, tiêm để có tác dụng nhanh chóng, tăng sinh khả
nhau thai, sữa mẹ. Tuy nhiên heroin qua hàng rào máu não tốt hơn
ản phẩm t
hủy phân tách loại acetyl của tạp chất acetylcodein có
sinh khả dụng đường uống cao hơn cả. Chúng thường được người nghiện sử
dụng d
dụng.

Phân bố: khoảng 30% morphin liên kết với protein huyết tương, trong
khi heroin chỉ liên kết với protein khi đã được chuyển hóa thành morphin.
Tập trung nhiều ở cơ vân, gan, phổi, thận. Các chất này qua được hàng rào
máu não,
m
orphin.
Chuyển hóa và thải trừ: các chất opiat chủ yếu chuyển hóa ở gan. Quá
trình chuyển hóa bao gồm rất nhiều phản ứng, trong đó phổ biến nhất là các
phản ứng thủy phân được nối tiếp bởi các phản ứng liên hợp với acid
glucuronic, đồng thời có cả các phản ứng loại nhóm alkyl gắn vào Nitơ.
Trong quá trình chuyển hóa, heroin nhanh chóng bị thủy phân, loại acet
yl tạo
6-monoacetylmorphin, chất này tiếp tục bị loại acetyl, nhưng với tốc độ chậm
hơn tạo morphin. Phần lớn lượng morphin tạo ra được chuyển hóa dưới dạng
liên hợp với acid glucuronic tạo thành 2 dạng sản phẩm, dạng có hoạt tính
morphin-6-glucuronic (M-6-G) và dạng không có hoạt tính morphin-3-
glucuronic (M-3-G). M-6-G giữ vai trò rất quan trong đối với tác dụng trên hệ
thần kinh của morphin. Đối với codein, xảy ra quá trình l
oại acetyl ở C
3
tạo
morphin, các giai đoạn còn lại giống nhau đối với cả heroin và morphin. Bên

cạnh đó, codein cũng được tìm thấy trong nước tiểu người sử dụng heroin, tuy
nhiên đây là s
trong heroin.
 8
Các sản phẩm chuyển hóa được lọc qua cầu thận, sau khi tiêm tĩnh
mạch heroin 20-40 giờ, lượng M-3-G trong nước tiểu là 38,2%, morphin tự do
là 4,2%, 6-MAM là 1,3% và heroin tự do là 1,3%. Khoảng 90% sản phẩm
chuyển hóa được bài tiết vào nước tiểu trong 24 giờ đầu. Tuy nhiên, do quá
trình chuyển hóa có chu kỳ gan ruột nên có một lượng nhỏ morphin có thể tồn
tại trong phân, trong nước tiểu vài ngày. thời gian bán thải của morphin
dein, m
orphin. Điều đó chứng tỏ vì sao 6- MAM
c ghi nhận là dấu hiệu đặc hiệu chứng minh cho việc sử dụng heroin ở
người nghiện [5], [6], [9]

khoảng 2-3 giờ ở người bình thường. Thời gian bán thải (t
1/2
) của heroin
khoảng 5 phút. Quá trình này xảy ra tương tự morphin.
Dựa vào quá trình chuyển hóa của các chất nhóm opiat, người ta xác định
6- MAM chính là sự khác biệt của heroin so với các nhóm opiat được phép sử
dụng trong y học như co
đượ
 9

Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm opiat
 10
1.3. Chất chuyển hóa 6-MAM
1.3.1. Cấu tạo, tính chất 6-MAM
- Cấu trúc hóa học 

Tên gọi:
6-m
onoacetylmorphin,
6-acetylmorphin, 6-MAM
Công thức phân tử: C
19
H
21
NO
4


Phân tử lượng: 327,374 g/mol

Hình 1.3. Công thức cấu tạo 6-MAM

3-hydroxy-6-acetyl-(5α,6α)-7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-methylmorphinan
- Tính chất:
6-MAM tồn tại ở 2 dạng: dạng base và dạng muối ngậm 1 phân tử
hydroclorid hoặc hydrat ngậm 3 phân tử nước.
Dạng base có nhiệt nóng chảy 200
0
C, 190
0
C (DSC), tan rất ít trong
nước, tan tốt trong methanol, ethanol, chloroform.
Dạng muối có nhiệt nóng chảy 265- 267
0
C, 313
0

C (DSC), tan trong
nước và các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, chloroform [28].
- Đặc điểm
6-MAM có thời gian bán thải ngắn 0,6giờ. Thời gian phát hiện 6-MAM
trong nước tiểu ngắn, khoảng 2-8 giờ, nồng độ 6-MAM trong nước tiểu rất
thấp so với morphine, vì vậy rất khó để phát hiện. Có nhiều tài liệu khác nhau
về sự ổn định của 6-MAM trong nước tiểu.
Rop và các cộng sự cho rằng 6-MAM được thủy phân hoàn toàn trong
nước trong vòng 7 ngày ở nhiệt độ phòng, và 9% bị thủy phân sau 14 ngày ở
nhiệt độ -20
0
C [24].
 11
Poochikian và Cradock thấy rằng hơn 50% 6-MAM bị mất đi sau 9
ngày giữ trong môi trường pH 8.6 ở nhiệt độ phòng [23].
Paul và các cộng sự cho hay 44% 6-MAM bị mất sau 2 tuần trong nước
tiểu (pH=6,8), trong khi Barrett và các cộng sự phát hiện 6- MAM không bị
thủy phân ở pH 4,0- 7,4 trong cùng điều kiện [22].
Fuller và Anderson nhận thấy rằng cần 12 tuần để thủy phân hoàn toàn
6- MAM trong nước tiểu thành morphintrong điều kiện pH 8,0 tại nhiệt độ
phòng. Tỷ lệ thủy phân của 6- MAM biến thiên trong khoảng rộng là do sự
khác biệt về lực ion của mỗi hệ đệm sử dụng t
rong mỗi nghiên cứu khác nhau
[16].
- Tình hình nghiên cứu 6-MAM trên thế giới
Trên thế giới, định lượng 6-MAM trong nước tiểu được thực hiện từ
khá lâu. Năm 1989, B.D.Paul và các cộng sự đã tiến hành định lượng 6-MAM
trong nước tiểu bằng phương pháp GC-MS. Năm 1992, P.P. Rop và các cộng
sự thực hiện phát hiện 6-MAM trong huyết tương, máu, nước tiểu bằng
phương pháp HPLC. Tuy nhiên về cơ bản phương pháp GC-MS vẫn được sử

dụng nhiều hơn cả [22]
, [24].
Xung quanh việc 6-MAM có phải là dấu hiệu đặc hiệu trong phân tích,
phát hiện đối tượng sử dụng heroin cũng có nhiều nghiên cứu:
Năm 1997, Carol L.O’Neal và Alphonse Poklis nghiên cứu về việc bổ
sung acetylcodein (AC) như một dấu hiệu phát hiện người sử dụng heroin.
AC là một tạp được tìm thấy trong heroin, có lượng thay đổi p
hụ thuộc vào
nguồn gốc heroin, độ ổn định trong nước tiểu cao hơn so với 6-MAM. Trong
nghiên cứu này độ nhạy của AC với GC-MS cũng rất tốt. Giới hạn phát hiện
(LOD) của AC là 0,5µg/L, giới hạn định lượng (LOQ) là 1.0µg/L. Trong khi
 12
đó LOD và LOQ của 6-MAM là 2,0µg/L. Tuy nhiên hai tác giả cũng kết luận
rằng AC được tìm thấy ở ít mẫu và nồng độ ít hơn 6-MAM. Vì vậy, nghiên
cứu năm 1998 của 2 tác giả chỉ ra AC không phải là dấu hiệu đáng tin cậy để
kết luận đối tượng sử dụng heroin [20].
Năm 2006, hai tác giả Sue Paterson và Rosa Cordero có nghiên cứu so
sánh giữa chất chuyển hóa của tạp chất heroin và 6-MAM trong việc sử dụng
làm dấu hiệu phát hiện đối tượng sử dụng heroi
n. Nghiên cứu này chỉ ra phân
tích chất chuyển hóa của papaverine nhạy cảm hơn 6-MAM, lượng mẫu tìm
thấy chất chuyển hóa của papaverine cao hơn 6-MAM rất nhiều lần. Nhưng,
cũng bởi papaverine là một tạp chất của heroin, thay đổi lượng theo nguồn
gốc, cách sản xuất heroin nên sự vắng mặt chất chuyển hóa papaverine trong
mẫu không đủ để kết luận đối tượng không sử dụng heroin [21].
Cho
tới nay, 6-MAM vẫn là dấu hiệu duy nhất chứng minh việc sử
dụng heroin của các đối tượng. Ở Việt Nam, heroin chủ yếu là loại heroin
Đông Nam Á có hàm hượng diacetylmorphincao, các tạp chất liên quan rất ít.
Do vậy việc phát hiện Heroin thông qua phân tích 6-MAM càng trở lên đặc

hiệu [9], [11].
- Tình hình nghiên cứu trong nước
 Khóa luận tốt nghiệp Đại học Dược năm 2009, tác giả Bạch Thị Thắm có
xây dựng phương pháp phân tích Heroin, Cocain và các sản phẩm trung gian
trong nước tiểu trong đó có 6-MAM bằng GC-MS. Khóa luận có phạm vi
nghiên cứu rộng, 6-MAM là một trong số nhiều đối tượng nghiên cứu của
khóa luận. Cũng như một số công trình nghiên cứu khác, cho đến nay ở trong
nước chưa có công trình nghiên cứu nào xây dựng và thấm định phương pháp
giám định 6-MAM trong mẫu nước tiểu một cách to
àn diện [8]
 13
1.3.2. Các phương pháp phân tích 6-MAM.
1.3.2.1. Phân tích miễn dịch

Phân tích miễn dịch là phương pháp được khuyến khích sử dụng để
phát hiện sơ bộ. Phương pháp này dựa vào độ hoạt động phóng xạ (RIA), hoạt
tính men (EIA), độ phân cực huỳnh quang…hạn chế của phương pháp này là
tính kháng chéo của các kháng thể sử dụng trong các phương pháp phân tích
miễn dịch. Trong quá trình phân tích có thể gây ra các kết quả dương tính giả
của một số loại thuốc giảm đau, chất tương tự, hay chất đối kháng của
m
orphincó độ kháng chéo cao [27], [28].
1.3.2.2. Phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
H
òa tan cặn chiết sau khi đã cô đuổi dung môi vào một lượng nhỏ
methanol và tiến hành sắc ký bản mỏng theo các điều kiện sau:
Bản mỏng: bảo mỏng Silica gel G đã được hoạt hóa, độ dày lớp chất
hấp thụ 0,25 mm. Nếu có điều kiện sử dụng bản mỏng có thêm chất phát
quang ở đèn tử ngoại 254mm.
Hệ dung môi triển khai:có thể sử dụng các hệ dung m

ôi sau, trong đó
hệ A,B,C,D thường hay được sử dung hơn:
Hệ A: Toluene/ Aceton/ Ethanol/ NH
4
OH đặc theo tỷ lệ thể tích tương
ứng: 45/45/7/3
Hệ B: Ethylacetat/Methanol/NH
4
OH: 85/10/5.
Hệ C: Methanol/NH
4
OH : 100/1,5
Hệ D: Chloroform/Methanol : 90/10
Hệ E: Ethanol/ Isopropanol/ Xylen/ Chloroform : 12,5/12,5/25/50
Hệ F: Toluen/ Dioxan/ Ethanol/NH
4
OH: 50/40/5/5
 14
vv…
Chất chuẩn: 6-MAM
Phát hiện:
Thuốc thử Dragendroff: cho các vết da cam trên nền vàng.
Thuốc thử Iodoplatinate: cho các vết màu xanh tím [12], [13].
Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm cho vết phát quang
 Ưu điểm của phương pháp phân tích bằng TLC:
Thiết bị sử dụng đơn giản, rẻ tiền, nhanh.
Phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha
động
Có thể thực hiện tách các mẫu có nhiều thành phần: Có thể thực hiện
sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn.

 Nhược điểm:
Độ lặp lại thấp do thành phần pha động thay đổi trong quá
trình khai triển sắc ký khí. Tăng độ giãn rộng pic. Độ nhạy kém hơn các
phương pháp khác [27], [28].
1.3.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Cặn chiết nước tiểu hòa tan vào một lượng nhỏ acetonitrile hoặc dung

môi pha động và tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng cao đồng thời với chất
chuẩn theo các điều kiện sau.
Phương pháp 1:
Cột tách: Octadecylsilica Hypersil, chiều dài 100mm, đường kính
trong 2,1mm, đường kính hạt 3 µm.
 15
Pha động: A: dung dịch đệm phosphat 10mM (pH 6,8)
B: acetonitril
Chạy 100% dung dịch đệm A trong 5 phút, sau đó áp dụng kỹ thuật
gradient tới tỷ lệ A/B là 60/40 (%) trong 30 phút.
Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút
Nhiệt độ cột: 20
0
C
Detector: photodiod array detector (bước sóng 218 nm).
Thời gian lưu của 6-MAM là 24,5 phút.
Phương pháp 2:
Cột tách: silica, chiều dài 30 cm, đường kính trong 4 mm, đường kính
hat 5 µm.
Pha động: Acetonitril- Methanol- dung dịch A- dung dịch B theo tỷ lệ
thể tích (75:25:0,04:0,216).
Dung dịch A: hỗn hợp NH
4

OH/ Methanol tỷ lệ ½
Dung dịch B: Hỗn hợp acid acetic băng/ Methanol tỷ lệ 1/1
Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút
Detector: 218 nm.
Phương pháp này có một số những hạn chế như: cần dùng nhiều dung
môi, hóa chất có độ tinh khiết cao nên bất lợi về kinh tế, thời gian phân tích
dài [12], [13]
 16
1.3.2.4. Phương pháp sắc ký khí- khối phổ [3], [4]
a. Đại cương về sắc ký khí.
- Định nghĩa
Sắc ký khí là kĩ thuật chia tách trong đó các thành phần của mẫu phân
tích phân bố giữa hai pha: pha tĩnh với diện tích tiếp xúc rất lớn, pha động có
bản chất khí. Mẫu được hóa hơi và mang bởi pha động (khí mang) đi qua cột.
Mẫu phân bố trên pha tĩnh lỏng dựa vào độ hòa tan ở nhiệt độ nhất định. Các
thành phần của mẫu phân tách khỏi nhau dựa trên áp suất hơi tương đối và ái
lực khác n
hau của chúng đối với pha tĩnh.
- Thiết bị sắc ký khí
Máy sắc ký khí được mô tả như sơ đồ hình. Nó bao gồm các bộ phận
sau:
- Pha động: Khí mang đưa mẫu đi qua cột.
- Pha tĩnh: Cột sắc ký đặt trong lò cột.
- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột.
- Detector: Phát hiện chất phân tích trong mẫu
- Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu.
- Hệ cấp pha động.
Trong sắc ký khí pha động thường là khí trơ như: heli, argon, nitơ hoặc
khí carbonic và khí hydro. Lựa chọn khí
trơ nào phụ thuộc vào detector cần

dùng. Nhiệm vụ của pha động là đưa chất tan qua cột, vì vậy người ta gọi pha
động là khí mang. Đi kèm với bình cấp khí mang có van giảm áp, đồng hồ
kiểm tra lưu lượng khí
 17