Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH
AFLATOXIN CỦA BACILLUS (CS1b) VÀ ỨNG DỤNG
TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1211100227

: Trịnh Thị Cẩm Tú
Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu , kết quả nêu trong
đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đồ án này đã được cảm ơn và

các thông tin trích dẫn trong Đồ án đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện đồ án

Trịnh Thị Cẩm Tú

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học
Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn
thành tốt khóa học 2012 – 2016.
Em xin cảm ơn thầy cô trong Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM –
MÔI TRƯỜNG đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng
tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng
vào công việc thực tiễn.
Em xin cảm ơn thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Khoa
CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG, Trường Đại học Công
nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn
thành tốt Đồ án tốt nghiệp này.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp
này.
Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ,
động viên khích lệ tinh thần , cùng trải qua những khó khăn trong suốt quá trình thực
hiện Đồ án tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình đã luôn bên
cạnh, cỗ vũ động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án

tốt nghiệp này.
TP. HCM, Ngày 19 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thục hiện
Trịnh Thị Cẩm Tú
ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC .......................................................................................................................... i
DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................vii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH ............................................... viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4
1.1 Các nấm gây hại trên hạt ......................................................................................... 4
1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc .............................................. 4
1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch ........................................................... 5
1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch ............................................................... 5
1.1.4 Độc tố của nấm................................................................................................. 6
1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản ......................................... 11
1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học ........................................................ 11
1.2.2 Kháng nấm bằng phương pháp sinh học: ...................................................... 12
1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông
sản. ............................................................................................................................... 15
1.3.1 Nấm Trichoderma spp ................................................................................... 15
1.3.2 Lactobacillus spp. .......................................................................................... 17
1.3.3 Bacillus subtilis spp........................................................................................ 19
1.4 Cơ chế kháng nấm của vi khuẩn ........................................................................... 21

1.4.1 Cấu tạo thành tế bào của một số nấm gây hại nông sản ................................ 21
1.4.2 Cơ chế tác động của một số enzyme ngoại bào. ............................................ 23
1.4.3 Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất. ....................................................... 25
1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme và hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn ....................................................................................................................... 26
1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao trong bảo quản hạt ................................ 30
1.6 Một số nghiên cứu nước ngoài ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp ..... 31
1.7 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp ...... 32
iii


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 33
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 33
2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất .................................................................................. 33
2.2.1 Vật liệu ........................................................................................................... 33
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................... 33
2.2.3 Môi trường - Hóa chất.................................................................................... 34
2.3 Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 35
2.3.1 Mục đích ......................................................................................................... 35
2.3.2 Mục tiêu .......................................................................................................... 35
2.3.3 Nội dung ......................................................................................................... 35
2.4 Bố trí thí nghiêm và phương pháp ........................................................................ 36
2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm. ................................................................ 36
2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo
quản hạt.................................................................................................................... 47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 50
3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm
cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b .................................................................................. 50

3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại ............. 51
3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm ................................................................................ 51
3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt ............................................................. 53
3.2.3 So sánh khả năng đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 của
dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và điều kiện xử lý nhiệt ................ 53
3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
CS1b sau ly tâm. .......................................................................................................... 55
3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học ................................. 55
3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, 𝜷- glucanase của protein kết tủa. ..... 56
3.3.3Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1 ........................................... 59
3.4 Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1. .................................. 60
3.4.1 Quá trình thu cao EA...................................................................................... 60

iv


Đồ án tốt nghiệp

3.4.2 Khảo sát sự ức chế của cao EA với nấm CĐP1 ............................................ 61
3.5 Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn
Bacillus sp. CS1b có hoat tính kháng nấm. ................................................................ 64
3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản
hạt. ............................................................................................................................... 66
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 76
4.1 Kết luận ................................................................................................................. 76
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................... 76
TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC ..................................................................... 78
TÀI LIỆU KHAM KHẢO .............................................................................................. 78
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 1

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TẮT
AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar
EA: ethyl acetate
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth MT:
Môi trường PDA: Potato dextrose agar
HPLC: High pressure liquid chromatography
TLC: Thin layer chromatography
UV: Ultraviolet
VK: vi khuẩn

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở
vật nuôi.. ......................................................................................................................9
Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học ..........13
Bảng 1.3: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm ..............................22
Bảng 1.4: Cơ chế tác động của mộ số hợp chất thứ cấp ............................................26
Bảng 2.1: Bố trí các thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng..................................47
Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) của dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1. ..........53
Bảng 3.2: Đường kính phân giải của enzyme của protein kết tủa bằng ethanol .......56

Bảng 3.3: Khả năng đối kháng với CĐP1 của protein kết tủa bằng ethanol.............58
Bảng 3.4: Tỷ lệ đối kháng (%) theo từng nồng độ của cao ethyl acetate với nấm
CĐP1……………………………………………………………………………….63
Bảng 3.5: Định tính một số chất có trong dịch sau ly tâm, protein kết tủa và cao ethyl
acetate .........................................................................................................................63
Bảng 3.6: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng được
bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b .................................................66
Bảng 3.7:Kết quả ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng………………. 71

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH
Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm
CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm. ................................................................36
Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1. ................................................................37
Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa bằng ethanol 960 ...................................40
Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA ...........................................................................42
Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao chitosan ..........46
Hình 3.1: Nấm CĐP1 trong môi trường PDB............................................................49
Hình 3.2: Kết quả đối kháng của dịch sau ly tâm của VK CS1b với nấm CĐP1 .....51
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở
từng thời gian nuôi cấy và từng điều kiện xử lý dịch sau ly tâm ..............................54
Hình 3.4: Khả năng phân giải chitin của protein kết tủa. ..........................................56
Hình 3.5: Khả năng phân giải casein của protein kết tủa. .........................................57
Hình 3.6 Khả năng phân giải 𝛽 − 𝑔𝑢𝑐𝑎𝑛 của protein kết tủa……………………...57
Hình 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc CĐP1 của dung dịch protein kết tủa………..59
Hình 3.8: Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA…………………………….61

Hình 3.9: : Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA, ...................................... ..62
Hình 3.10: Định tính một số chất có trong dịch nuôi cấy ly tâm (i), protein kết tủa
(ii),……………………………………………………….........................................64
Hình 3.11: Định tính lipid. .........................................................................................65
Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1…………………………………...72
Hình 3.13: Quy trình công nghệ sản xuất cao EA………………………………….73

viii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Lương thực, thực phẩm đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô,
khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người. Vì thế, việc
nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là vấn đề được các tổ chức quốc tế cũng
như các cơ quan khoa học về lương thực, thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm.
Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kỹ thuật bảo quản gìn giữ các
giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó, đồng thời
chế biến nông sản thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao là một trong
những phần cần thiết đối với ngành nông nghiệp nước ta.
Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc
cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…),
gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong
rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm
nhất. Mặc dù sự hiện diện của Aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với
việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn về
việc có thể nhiễm aflatoxin.

Ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí
thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa, trong khi các phương
tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo, thoáng mát
là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc cho thực phẩm và thức
ăn chăn nuôi. Khi phát triển trên lương thực nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng
gây ra tổn thất về lượng cũng như về chất của hạt. Không những thế, một số loài nấm
mốc khi phát triển sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin.

1


Đồ án tốt nghiệp

Nguy hiểm hơn những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gây ra độc cho
con người và động vật, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…),
gây quái thai, gây đột biến,…thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong.
Việc sử dụng các biện pháp phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáo sử
dụng. Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung và sự nhiễm
aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là không thể tránh được.
Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc bởi độc tính và
nguy cơ gây ung thư của nó. Bảo quản nông sản bằng áp dụng các chất chống mốc hóa
học có giá thành cao,thường có mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý và có thể ảnh
hưởng xấu lên sức khỏe người tiêu dùng. Để áp dụng “ bảo quản sinh học” trong việc
bảo quản các hạt nông sản, các sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường được áp
dụng. Đó là lý do chúng tôi đã chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả năng kháng nấm
sinh aflatoxin của Bacillus spp. (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản”.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1 Mục tiêu
Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin của sản phẩm trao đổi chất dịch
nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp. CS1b và ứng dụng trong việc bảo quản hạt đậu phộng.

2.2 Nội dung
1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng
nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b
2. Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. CS1b để khả năng đối
kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả năng kháng nấm
Aspergillus sp. CĐP1 cực đại.
3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn CS1b sau ly tâm.
2


Đồ án tốt nghiệp

4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy
sau ly tâm.
5. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn
Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm.
6. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong việc bảo vệ hạt đậu
phộng.
3. Kết cấu đồ án
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung này đề cập đến các nội dung liên quan
đến tài liệu nghiên cứu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các
dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài
thực hiện được và đưa ra thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề
tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.

3

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Các nấm gây hại trên hạt
1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc
Thế giới
Sự nhiễm nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu. Ví dụ: Ở Đức có
84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13 % số mẫu
lương thực như lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin. Ở Đan Mạch 19 trên
33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin. Ở Ấn Độ có 8 % số mẫu bánh dầu
hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời cả hai loại độc tố T-2 và ochratoxin. Ở Mỹ
có rất nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy sự nhiễm vomitoxin ( DON) ở mức 1000 ppb.
Ở Úc kiểm tra trên bắp thấy có cả 3 loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin và
zearalenon. Theo Tiến sĩ Bangalore ( Ấn Độ) thì các loại mycotoxin khác nhau có ưu
thế ở những vùng khác nhau trên thế giới: Ở Bắc Âu có ochratoxin và vomitoxin (
DON) là vấn đề đang được quan tâm nhất. Còn ở Nam Mỹ thì mycotoxin có ưu thế lại
là aflatoxin và fumonisin.
Việt Nam
Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phộng bằng bọng thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó
xếp thành chồng. Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi tường thích hợp cho nấm
phát triển. Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không
khí sẽ có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố
trong thức ăn. Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và
Penicillium. Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin,
rubratoxin và citrinin. Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra màng
bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể
gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con.
4

Đồ án tốt nghiệp

Riêng ở các trại gà giống độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở
giảm rất thấp. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu đậu phộng và 25 mẫu bắp thì
mức aflatoxin trong bánh dầu phộng 1200 ppb ( tối đa 5000 ppb), trong bắp 205 ppb (
tối đa 600 ppb). Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh đầu công
nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50 ppb.
1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch
Trong khi cây lương thực đang phát triển ngoài đồng hay sau khi thu hoạch nhưng
trước khi hạt được đập tuốt bị các nấm mốc này xâm nhập. Tùy từng loại ngũ cốc,
vùng địa lý, thời tiết mà các nấm mốc này phát triển nhiều hay ít. Các loại lúa mì, lúa
gạo, đại mạch, kiều mạch, và ngô thường nhiễm các loại nấm ngoài đồng như
Alternaria, Cladosporium, Helininthosporium và Furarium.
Tất cả các nấm ngoài đồng đòi hỏi độ ẩm cao ở hạt để phát triển. Độ ẩm ở trạng
thái cân bằng với độ ẩm tương đối 90% hay hơn nữa là điều kiện cho nấm phát triển.
Các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua nhiều năm ở hạt khô, nhưng chết tương đối
nhanh ở các hạt có độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối trên 70%, ở các
hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều này có nghĩa độ ẩm trên 14%.
Tóm lại, các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng đến bề ngoài và chất lượng
của hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước thu
hoạch có thể phát hiện bằng phương pháp giám định thông thường và nó không tiếp tục
tăng lên trong quá trình bảo quản.
1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch
Theo Christensen [1] các nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, trong
đó có năm loài phổ biến. Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema
và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn này. Những loài này có khả năng
phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 70% - 90%. Đa

5


Đồ án tốt nghiệp

số các nấm này thường ở trên các nguyên liệu giàu các chất hữu cơ và vô cơ, đặc biệt
trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi
trên thế giới và nhiễm trên tất cả các hạt lương thực và hạt giống.
Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 300C - 320C và tốc độ
phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Một vài chủng của nhóm A.glaucus phát
triển chậm ở nhiệt độ 100C – 150C. Một vài loài Aspergillus đề kháng với khô cạn, nó
có thể phát triển ở vài độ dưới điểm đóng băng.
1.1.4 Độc tố của nấm
Một số loại độc tố của nấm
Độc tố nấm còn gọi là mycototoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ
độc với động vật có vú, cá, gia cầm. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất
nhiều vào điều kiện sinh thái ( Morrau 1974) [2]. Những điều kiện đó là vùng sinh
thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng nước có trong cơ chất… Sự sản sinh
độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại của kiểu gen ( genotype) và điều kiện
phát triển của chúng ( Scheoedes và Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra
trong quá trình chuyển hóa.
Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Một loại
độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loại nấm có thể đồng thời
sản sinh ra nhiều loại độc tố. Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin có trong thực
phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm và được tạo bởi
năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria, Claviceps.
❖ Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin,
acid cyclopianzoic.

6


Đồ án tốt nghiệp

❖ Các độc tố của Penicillium: patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, acid
cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin, moniliformin.
❖ Các độc tố của Furarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin.
❖ Các độc tố của Alternaria: acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion.
❖ Các độc tố của Claviceps: các alkaloid Ergot.[1]
Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ
lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên độc vật thực nghiệm cho thấy độc tính của
mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển
của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo. Vì thế nó tạo khả năng không những cho
sự nhiễm trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào nguồn sữa, thịt.
Độc tố Aflatoxin:
Cơ chế gây độc của Aflatoxin
Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức
chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức
chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế
bào.
Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α, β -lacton không bão hòa có trong phân
tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton
này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng
bình thường của tế bào.
Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một
quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 –
dhd) ở trong gan, hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm

7

Đồ án tốt nghiệp

dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base),
gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính.
Độc tính của Aflatoxin
Theo Dương Thanh Liêm (2002) [1], aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ
thể con người và động vật. Những tác hại đó như sau:


Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin

đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại nặng. Tùy theo
mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau. Biểu hiện
chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng. Sau đó gan sưng to lên, mật
căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có
những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể.


Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó

khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng.


Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng

trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn.


Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do

đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử
vong cho thú.


Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản.



Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất

mùi thức ăn.


Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị hạ

thấp, làm vật nuôi chậm phát triển.


Làm giảm thấp sự sinh trưởng và giá trị kinh tế của vật nuôi. Hậu quả cuối cùng

là có thể gây chết cho vật nuôi.

8


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở

vật nuôi. (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003). [2]
Loại gia súc

Lượng

Thời kỳ nuôi

Tổn thương

Ảnh hưởng tới

aflatoxin trong

dưỡng (tuần)

gan

phát triển và

thức ăn hàng

hiệu quả thức

ngày (mg/kg)

ăn.

Lợn

0.14

12

Trung bình

Bình thường

(20 – 70 kg)

0.28

12

Nhẹ

Giảm sút

0.41

12

Nhẹ

Giảm sút

Lợn

0.28

20

Nhẹ

Giảm sút

(40 – 100 kg)

0.41

20

Nhẹ

Giảm sút

Lợn

0.69

7

Trung bình

Bình thường

Lợn nái

0.3

4

Rõ

Suy giảm và

(có chửa)

0.55

4

(70 – 100 kg)

một số con
chết

Gà tây

0.25

4

Rõ

(1 ngày tuổi)

Chậm phát
triển và giảm
trọng lượng

Gà tây

0.2

7

Nhẹ

Giảm trọng

(1 ngày tuổi)

0.42

7

Nhẹ

lượng trong 3

0.5

7

Nặng

tuần.

0.03

4

Đặc điểm điển

Giảm trọng

hình nhiễm

lượng, chết

aflatoxin

50%

Trung bình

Giảm trọng

Vịt
(7 ngày tuổi)

Bê

0.2

16

9

Đồ án tốt nghiệp

lượng từ 0 – 3

(4 ngày tuổi)

tháng
Bò sữa

15

4

Trung bình

Giảm lượng
sữa Aflatoxin
M1 có mặt
trong sữa.

Tình hình nhiễm độc Aflatoxin:
Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại hạt có
dầu như lạc, đậu tương và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị
Ngọc Diệp, 2003) [2]. Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản
phẩm nông nghiệp là rất đáng kể.
Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt trong
bảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh chóng của
Aspergillus flavus. Trong điều kiện thuận lợi, Asp. Flavus có thể tăng nhanh chỉ sau 3 –
7 ngày bảo quản.
Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn cho

ngành chăn nuôi. Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith (1976) trong
số 94 trường hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có đến 83 trường
hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trường hợp ở bò và 4 trường hợp ở gia cầm. Hàm lượng
aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô nguyên liệu làm
thức ăn là 518 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2]
Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988),
ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên tới 200 ppb. Ở Úc, theo
Barry J. Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm được phân tích thì có 13 mẫu
10


Đồ án tốt nghiệp

chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên đến 50 ppb.
(Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2].
1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản
1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học
Tình trạng sử dụng thuốc diệt nấm hóa học và tác hại
Hiện nay khi sử dụng thuốc Bảo vệ thực vật nói chung cũng như thuốc trừ nấm
bệnh hại cây trồng nói riêng, phần lớn bà con chúng ta vẫn làm theo cảm tính, cẩu thả,
không khoa học, việc bà con nông dân sử dụng không hợp lý thậm chí lạm dụng thuốc
bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đã và đang gây những hậu quả nghiêm
trọng.
Thuốc diệt nấm có thể gián tiếp có hại cho sức khỏe con người do các loại lương
thực, rau quả thu được từ các loại cây trồng được con người sử dụng và nó có thể gây
ra dị ứng cũng như nhiều triệu chứng khác như đau đầu, tiêu chảy, các tổn hại cho các
cơ quan cũng như gây ra các rối loạn nghiêm trọng và các loại bệnh tật liên quan
đến hệ thần kinh. Nó cũng có thể là nguy hiểm cho các hệ sinh thái do nó có thể thoát
đi và gây ô nhiễm môi trường nước và đất cũng như tích lũy sinh học và làm gia tăng
độc tính đối với các cơ thể sống trong hệ sinh thái.

Một số loại chất diệt nấm hóa học
 Amphotericin B (fungizon).
 Nystatin (fungicidin, mycostatin, monoral, nystan).
 Candicidin.
 Ketoconazol.
 Econazol.
 Thuốc dẫn chất Imidazol.

11


Đồ án tốt nghiệp

1.2.2 Kháng nấm bằng phương pháp sinh học:
Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp
dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể
tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng
con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa
chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào
thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất.
Màng bao chitosan có khả năng kháng nấm gây bệnh cho nông sản.
Chitosan là một polime sinh học có hoạt tính cao, đa dạng, dễ hòa hợp với cơ thể
sinh học có tính kháng nấm và dễ phân hủy khi tạo thành màng mỏng có tính bán thấm,
chống thấm … nên được ứng dụng trong kinh tế kỹ thuật khác nhau như y học, cộng
nghiệp dệt, giấy, mỹ phẩm, đặt biệt trong công nghệ bảo vệ rau quả tươi.
Ứng dụng trong xử lý hạt
Hạt giống xử lý bằng cách nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt hạt
bằng một màng chitin hay chitosan mỏng trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao
độ tăng trưởng. Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vi
khuẩn gây bệnh và nấm mốc.

Ứng dụng của màng chitosan trong tồn trữ và bảo quản chất lượng rau quả
tươi
Chitosan cũng có tiềm năng là một loại màng bảo quản trái cây. NOCC ( N,OCarboxymethyl chitosan) một dẫn xuất được tạo ra bởi phản ứng của chitosan với acid
monochloroacetic. Lớp phim được tạo ra bằng cách phun dung dịch NOCC hòa tan lên
trái cây hoặc bằng cách nhúng trái cây vào trong dung dịch. Kết quả tạo ra màng bán

12


Đồ án tốt nghiệp

thấm, màng chitosan có thể làm giảm khí quyển bên trong tốt như việc làm giảm sự
mất hơi nước thoát ra và làm trì hoãn quá trình chín của trái.
Ứng dụng chống vi sinh vật của chitin, chitosan
Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion
kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các
nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm amino của bề mặt thành tế
bào. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến ion
quan trọng.
Ứng dụng các vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm gây bệnh cho nông sản
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa
như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực
tiếp nhờ vi sinh vật. Một số vi sinh vật có khả năng đối kháng với các nấm gây bệnh
cho nông sản và cơ chế khử nhiễm bằng con đường sinh học được trình bày ở bảng 1.2.
Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học [3]
Tên vi khuẩn

Đối tượng

Cơ chế khử nhiễm

Tác giả

Bacillus pumilus

Aspergillus

Sử dụng các sản phẩm

C. Munimbazi

parasiticus

trao đổi chất ngoại

và

bào, sinh ra trong quá

LB.Bullerman,

trình nuôi cấy B.

1997

pumilus, ức chế sự
phát triển và quá trình
tổng hợp độc chất
aflatoxin của nấm
Asp.parasiticus.

13


Đồ án tốt nghiệp

Streptomyces sp.

Aspergillus

Streptomyces sp. tổng

M. Ono và ctv

parasiticus

hợp được aflastatin A,

,1996. T.

là hợp chất có bản

Kondo và ctv,

chất là protein, ức chế

2001

1 số enzyme esterase
tham gia quá trình

tổng hợp độc chất
aflatoxin của nấm
Asp. Parasiticus
Achromobacter

Aspergillus

A. xylosoxidan tổng

PS. Yan và ctv,

xylosoxidans

parasiticus

hợp Cyclo (Lleucyl-

2004.

L-prolyl), là 1
cyclodipeptide, ức
chế sự phát triển và
sự tổng hợp aflatoxin
của nấm Asp.
parasiticus.
Lactobacillus

Aspergillus flavus

casei

Sử dụng các sản phẩm

I. Chang và

trao đổi chất ngoại

JD. Kim, 2007.

bào, sinh ra trong quá
trình nuôi cấy L.
casei, ức chế sự phát
triển và quá trình tổng
hợp độc chất aflatoxin
của nấm Asp. flavus.
Bacillus subtilis

Aspergillus flavus

Hợp chất thứ cấp

14

Ting Zhang và


Đồ án tốt nghiệp

BFS06
Bacillus subtilis

ctv, 2007
Aspergillus flavus

B. subtilis tổng hợp

R. Thakaew và

các enzyme ngoại bào

ctv, 2013.

như protease,
chitinase, β-1,3glucanase làm ức chế
sự phát triển của nấm
Asp. Flavus
Serratia

Aspergillus

Sinh khối tổng hợp

Kai Wang và

marcescens

parasiticus và

enzyme chitinase

ctv, 2013

Strain JPP1

Aflatoxin

1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông
sản.
1.3.1 Nấm Trichoderma spp
Cơ chế đối kháng
Theo Harman (1996), nấm Trichoderma spp. có nhiều cơ chế đối kháng, cơ chế ký
sinh lên nấm bệnh, cơ chế tiết kháng sinh (antibiosis), cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và
không gian sống.
Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm bệnh
chủ yếu bằng 2 cơ chế:
 Thứ nhất: Nấm Trichoderma spp. bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh.
 Thứ hai: Nấm Trichoderma spp. tiết ra các loại enzyme thủy phân.
( Trích dẫn bởi Huỳnh Văn Phục, 2006) [4].

15


Đồ án tốt nghiệp

Ứng dụng trong nông nghiệp
Theo Elad (2000), có nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh học của
Trichoderma spp đối với nấm gây bệnh, nhưng chỉ có 3 cơ chế quan trọng là ký sinh,
cạnh tranh và tiết ra kháng sinh.
Okigbo và Ikediugw (2000), cho biết những loài Trichoderma spp. có hệ sợi nấm
nhỏ, mảnh là một nhân tố có triển vọng trong phòng trừ sinh học chống bệnh thối hạt,

thối rễ và quản lý bệnh hại sau thu hoạch.
Nấm Trichoderma spp được sử dụng rộng rãi trong phòng trừ sinh học để quản lý
bệnh hại do R.solani gây ra (Hardar và ctv, 1984).
Nấm Trichoderma spp tấn công trực tiếp bằng cách cuộn quanh và tiết ra enzyme
phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp
cây trồng kháng lại bệnh (Klein và Eveleigh, 1998).
Nấm Trichoderma spp sống ở rễ cây giúp biến đổi vật chất vô cơ, giúp tăng cường
khả năng sản xuất hormone ở cây trồng, làm tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng.
Bailey và Lumsden (1998) cho rằng khi dùng dịch huyền phù nấm Trichoderma
hazianum vào trong đất làm tăng sự nảy mầm, tăng khả năng ra hoa, tăng sinh khối và
chiều cao cây bắp, ớt, hoa cúc, cà chua, thuốc lá. Nòi T1290 của nấm Trichoderma
hazianum còn làm tăng số chồi và rễ cây bắp ngọt trong nhà lưới 66% so với đối chứng
(Harman, 2000).
Một số loại enzyme do Trichoderma tiết ra bao gồm glucan 1,3-beta-glucosidase,
endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (NAGase), trypsin,
chymotrypsin, cellulase, protease, lipase, khi kết hợp hai enzyme glucan 1,3-betaglucosidase và endochitinase sẽ ngăn cản được quá trình tăng trưởng của nhiều loại

16