Xây dựng quy trình định lượng nồng độ bkv dna bằng kỹ thuật real time pcr và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus bk ở bệnh nhân ghép thận​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

LÊ THỊ BẢO QUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ
BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ
PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ
CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

LÊ THỊ BẢO QUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ
BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ
PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ
CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

Chuyên ngành Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS. Hoàng Xuân Sử
TS. Mai Thị Đàm Linh

Hà Nội - 2020


LỜI CẢM ƠN
Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS. Hoàng Xuân Sử, người
thầy đã truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học cũng như tận tình giúp đỡ, giảng giải
và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn
nghiên cứu này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Thị Đàm Linh, người thầy đã
hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đinh Thị Thu Hằng cùng các cán bộ nhân
viên trong phòng thí nghiệm “Vi sinh và các Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên
cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy, các cô trong bộ môn Vi sinh vật
cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp
đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Hà Nội, 18 tháng 2 năm 2020
Học viên

Lê Thị Bảo Quyên

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
aa

Axit amin

AIDS

Acquired Immunodeficiency Syndrome

Bp

Base pair

BKV

BK virus

BKVN

BK virus nephropathy

CMV

Cytomegalo virus

Ct

Cycle Threshold

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Enzyme - Linked - immunosorbent Assay
(Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme)

Etbr

Ethidium Bromide

EBV

Epstein-Barr Virus

HBV

Hepatitis B virus

HSV

Herpes Simplex Herpes

INF

Intravenous Nutritional Fluid

F/R

Forward/ Reverase

IPTG

Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside

IVD

In vitro diagnostic

JCV

JC virus

Kb

Kilobase pairs

LB

Luria-Bertani

NPV

Negative predictive value


PCR

Polymerase Chain Reaction

TNF

Tumor Necrosis Factors

PPV

Positive predictive value

RCF

Relative centrifugal force

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

ROC

Receiver operating characteristic

Rpm

Revolutions per minute

SOC

Super Optimal broth Catabolite repression
(Môi trường dinh dưỡng tối ưu)

TBE

Tris-boric-EDTA

UV

Ultra violet (Tử ngoại)


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1. Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ................30
Bảng 2. 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .....................................31
Bảng 2. 3. Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1....................35
Bảng 2. 4. Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm........................................42
Bảng 3. 1. Thành phần phản ứng real-time PCR ......................................................51
Bảng 3. 2. Đánh giá độ đặc hiệu ...............................................................................52
Bảng 3. 3. Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm .......56
Bảng 3. 4. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl ...................58
Bảng 3. 5. Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận ...............................................61
Bảng 3. 6. So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng.......................65
Bảng 3. 7. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép thận..66
Bảng 3. 8. Sự phân bố các phân nhóm của BKV ......................................................69
Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV ........................70
Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956) .............71
Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV .........................................................72
Bảng 3. 12. Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV .................73
Bảng 3. 13. So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu ...............................74
Bảng 3. 14. Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng .............................77

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV .................................................................................7
Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV .............................................9
Hình 1. 3. Các tế bào decoy trong nước tiểu . ...........................................................17
Hình 2. 1. Vector pGEM T easy ...............................................................................29
Hình 3. 1. Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng.......................................................45
Hình 3. 2. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường ...............................46
Hình 3. 3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme và AvaII .................................47
Hình 3. 4. Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen Quốc
tế bằng phần mềm Blast ............................................................................................48
Hình 3. 5. Kiểm tra lại trình tự mồi và probe cho real-time PCR .............................49
Hình 3. 6. Tối ưu nồng độ probe ...............................................................................50
Hình 3. 7. Tối ưu nồng độ mồi ..................................................................................50
Hình 3. 8. So sánh sự tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và LDA .....................53
Hình 3. 9. Xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn ......................................56
Hình 3. 10. Ngưỡng phát hiện BKV-DNA trên mẫu bệnh phẩm .............................57
Hình 3. 11. So sánh sự tương quan giữa hai bộ kit ...................................................58
Hình 3. 12. Phân tích sự khác biệt giữa hai bộ kit ....................................................59
Hình 3. 13. Đường cong ROC BKV-DNA trong máu nhằm phát hiện BKVN........63
Hình 3. 14. Đường cong ROC BKV-DNA trong nước tiểu nhằm phát hiện BKVN63
Hình 3. 15. Cây phát sinh loài trên vùng gen VP1-BKV (1630-1956) .....................68


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1.

Dịch tễ học ................................................................................................ 3

1.2.

Tổng quan về BKV .................................................................................. 5

1.2.1. Lịch sử phát hiện BKV ............................................................................... 5
1.2.2. Đặc điểm sinh học ..................................................................................... 6
1.3.

Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận ..................................... 11

1.3.1. Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận ............. 11
1.3.2. Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận ............................................ 13
1.4.

Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV .................................. 16

1.4.1. Tế bào học................................................................................................ 16
1.4.2. Sinh thiết thận .......................................................................................... 17
1.4.3. Chẩn đoán sinh học phân tử .................................................................... 17
1.5.

Tình hình nghiên cứu BKV ................................................................... 19

1.5.1. Tình hình nghiên cứu phát triển kit ......................................................... 19
1.5.2. Tình hình nghiên cứu hiện trạng nhiễm BKV .......................................... 21
1.6.

Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh ............................... 22

1.6.1. Định nghĩa ............................................................................................... 22
1.6.2. Đặc điểm của các phương pháp xây dựng cây chủng loại ...................... 23
1.6.3. Ứng dụng cây chủng loại phát sinh trong xác định genotype BKV ........ 25
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 27
2.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 27
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ........................................................................................ 27
2.1.2. Các vật liệu ............................................................................................... 27
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 29
2.2. Thiết bị chính ............................................................................................. 31
2.3.

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 33


2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................... 33
2.3.2. Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time
PCR .......................................................................................................... 34
2.3.3. Phân tích đặc điểm di truyền BKV ở bệnh nhân ghép thận .................... 43
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 45
3.1. Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA bằng real-time PCR ........ 45
3.1.1. Tách dòng vùng gen VP1 .......................................................................... 45
3.1.2. Thiết lập bộ mẫu chuẩn ............................................................................ 48
3.1.3. Thiết kế mồi và probe cho real-time PCR ................................................ 49
3.1.4. Tối ưu kỹ thuật real-time PCR.................................................................. 49
3.1.5. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR ............................................................. 52
3.1.6. Quy trình xác định tải lượng virus BK trong máu và nước tiểu ở bệnh
nhân ghép thận ........................................................................................ 60
3.2. Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV .............................. 61
3.2.1. Xác định tỷ lệ lưu hành BKV ở bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR61
3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN ................................ 62

3.2.3. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ............................... 66
3.3. Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV............................................ 67
3.3.1. Xác định kiểu gen BKV lưu hành tại Việt Nam ........................................ 67
3.3.2. Phân tích các vị trí SNP-BKV trên vùng gen VP1 ở bệnh nhân ghép thận70
3.3.3. Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV ..................... 77
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 79
KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 80
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 81


MỞ ĐẦU
Ghép thận là phương pháp điều trị thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho những
bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối. Ở nước ta, ước tính khoảng 80.000 bệnh
nhân suy thận mạn giai đoạn cuối, 90% bệnh nhân suy thận mạn dẫn đến tử vong do
không được điều trị và khoảng 4.000 bệnh nhân có nhu cầu ghép thận mỗi năm.
Cho đến nay nhiều cơ sở y tế trong cả nước đã triển khai thành công kỹ thuật này,
góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cũng như hiệu quả kinh tế cho những bệnh
nhân suy thận mạn giai đoạn cuối.
Với sự ra đời của các loại thuốc ức chế miễn dịch thế hệ mới kèm theo là sự
tái hoạt động mạnh của BK virus (BKV) được khẳng định là nguyên nhân quan
trọng hàng đầu dẫn đến rối loạn chức năng thận ghép, thậm chí mất mô ghép ở bệnh
nhân sau ghép thận. Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi ở những người nhận thận
ghép cho thấy sự xuất hiện rất sớm BKV trong máu và nước tiểu, thậm chí trong
những giờ đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao nhất xảy ra khoảng từ 1-3 tháng sau
ghép. Tỷ lệ BKVN (BK Virus Nephropathy: bệnh thận do BKV) ước tính khoảng 110% trong năm đầu sau ghép thận, trong đó 50% trường hợp BKVN bị thải ghép
hoàn toàn [8].
Hiện nay, vấn đề theo dõi và giám sát nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận tại
nước ta chưa nhận được sự quan tâm đúng mức trong các cơ sở y tế có khả năng
thực hiện ghép thận. Chẩn đoán BKVN ban đầu thường gặp nhiều khó khăn do biểu
hiện lâm sàng không đặc hiệu, nghèo triệu chứng, do đó dễ bỏ sót chẩn đoán hoặc

nhầm với giai đoạn thải ghép cấp. Sinh thiết thận được coi là tiêu chuẩn vàng trong
xác định BKVN, nhưng đây lại là phương pháp xâm lấn, đòi hỏi trang thiết bị đồng
bộ và đào tạo chuyên sâu. Trong khi đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng
BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR trong máu của bệnh nhân ghép thận đã
được công nhận là công cụ rất có giá trị tiên đoán BKVN [8]. Cho đến nay, chưa có
nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về BKV được công bố ở Việt Nam. Một số
cơ sở y tế đã sử dụng các kit thương mại như Realstar BKV PCR Kit (Altona
1


Diagnostics, Germany), Artus® BK Virus RG PCR Kit (Qiagen, Germany) … xác
định tải lượng BKV-DNA, tuy nhiên giá thành các kit này rất cao và đòi hỏi đầu tư
trang thiết bị đồng bộ, đồng thời còn chưa đề cập đến khía cạnh các kit này có thể
không phù hợp với một số chủng BKV lưu hành ở Việt Nam.
Một số nghiên cứu đề nghị rằng tải lượng BKV trong nước tiểu >107 copy/ml
hay trong máu >104 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm BKVN [35]. Tuy
nhiên con số chính xác về giá trị ngưỡng cho phép phát hiện BKVN phụ thuộc vào
độ nhạy kỹ thuật real-time PCR cũng như sự tương tác giữa virus và người bệnh ở
những khu vực địa lý khác nhau. Mặt khác, BKV genotype I-IV cũng như các biến
thể khác của virus đã được tìm thấy ở những bệnh nhân BKVN [7]. Giải trình tự
vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép nhấn
mạnh sự tồn tại của các “điểm nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời
gian ở hầu hết các trường hợp được theo dõi [18]. Các nghiên cứu in vitro gần đây
về các phân nhóm biến thể cho thấy sự thay thế axit amin có thể làm thay đổi khả
năng tương tác của virus với các tế bào chủ, do đó thay đổi độc lực của virus với
người bệnh [18]. Như vậy, sự đa dạng về đặc điểm di truyền BKV rất cần thiết để
tìm kiếm mối quan hệ tiềm năng giữa kiểu gen của BK virus và bệnh cảnh lâm sàng
sau ghép thận.
Cho đến nay, ở nước ta mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm
BKV ở bệnh nhân sau ghép thận. Nhận thấy tính cấp thiết của tình hình trên, chúng

tôi thực hiện đề tài với hai mục tiêu:
1. Xây dựng quy trình xác định tải lượng BK virus trong máu và nước
tiểu của bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR.
2. Xác định tỷ lệ lưu hành và kiểu gen BKV, kết hợp phân tích các đặc
điểm di truyền phân tử của BKV ở những bệnh nhân ghép thận tại Việt
Nam.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Dịch tễ học
BK virus là tác nhân gây nhiễm trùng phổ biến ở người nhưng không gây ra
triệu chứng lâm sàng, với tỷ lệ huyết thanh dương tính ở người trưởng thành là
80%. Các nghiên cứu dịch tễ học đã được thực hiện ở nhiều quốc gia khác nhau trên
thế giới, như Anh (tỷ lệ huyết thanh dương tính ở trẻ em, 83%), Phần Lan (60%),
Đức (71%), Ý (83%) [60]. Nhiễm trùng tiên phát thường xảy ra trong thời thơ ấu,
sau đó virus thiết lập trạng thái tiềm ẩn ở các tế bào biểu mô thận và biểu mô niệu
đạo, với khoảng 60-90% người trưởng thành có kháng thể kháng BKV trong
máu. Ở những người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả năng miễn dịch, hiện tượng
tái hoạt động của BKV và xuất hiện BKV trong nước tiểu rất hiếm khi xảy ra [38].
Sự tái hoạt động của BKV được kích hoạt khi phản ứng miễn dịch trung gian
qua tế bào suy giảm, điển hình ở các cá nhân bị suy giảm miễn dịch như AIDS, phụ
nữ có thai, bệnh nhân bị tiểu đường và đặc biệt là những trường hợp ghép tạng. Sau
khi nhân lên, BKV đi vào các mao mạch, xuất hiện trong nước tiểu và tấn công bộ
phận ghép, dẫn đến các tổn thương khác nhau. Khi sự nhân lên của BKV bắt đầu
xảy ra ở vùng vỏ thận thì có sự liên quan rõ rệt với sự hoại tử của tế bào biểu mô
ống thận và nồng độ creatinine huyết thanh tăng [42]. Người ta cho rằng cơ chế dẫn
đến rối loạn chức năng mô ghép thận đồng loại là do rò rỉ và sự chảy ngược nước

tiểu từ các ống thận bị tổn thương vào các khoang kẽ và các mao mạch quanh ống
thận. Do đó tổn thương và hoại tử ống thận cấp là đặc điểm quan trọng của bệnh
thận do BKV và là một yếu tố xác định BKVN [38]. Sự tổn thương thận mạn tính
do BKV dẫn đến xơ hóa mô kẽ của thận không thể hồi phục và teo ống thận.
Khoảng 1/3 số bệnh nhân xuất hiện BKV trong nước tiểu sẽ phát triển BKV trong
máu và nếu không được can thiệp kịp thời sẽ phát triển thành BKVN (tỷ lệ dao
động từ 1 đến 10%) [71]. Sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận lần đầu
tiên được chứng minh qua sự phát tán virus trong nước tiểu, với tỷ lệ từ 20% đến
60% bệnh nhân. Dữ liệu từ Mạng lưới chia sẻ nội tạng Hoa Kỳ (The United
3


Network for Organ Sharing) cho thấy tổn thương về thận ghép liên quan đến BKV
là 7,5% (70/938) trong năm 2009 và 5,7% (36/632) vào năm 2010 [68].
Một số yếu tố nguy cơ nhiễm BKV trước ghép bao gồm giới tính nữ, mô
ghép từ người cho chết não, những chấn thương gây thiếu máu cục bộ, kháng thể
đặc hiệu BKV cao ở người cho thận, sự không phù hợp HLA cũng như người cho là
người Mỹ gốc Phi [8]. Mức độ ức chế miễn dịch là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất
ở những bệnh nhân ghép thận dẫn tới nhiễm BKV cũng như phát triển BKVN, tuy
nhiên chưa có những tiêu chuẩn liều lượng ức chế miễn dịch liên quan chắc chắn
đến sự xuất hiện của BK trong nước tiểu. Bên cạnh đó, những giả thuyết cho rằng
kháng thể trong huyết thanh của người cho có thể là nguyên nhân chính làm tăng
nguy cơ nhiễm BKV cũng như BKVN ở bệnh nhân sau ghép thận còn gây nhiều
tranh cãi. Kết quả nghiên cứu của Shah và cộng sự (2000) [75], cho thấy những
trường hợp mà BKV âm tính trong huyết thanh người nhận nhưng dương tính với
huyết thanh người cho có nguy cơ phát triển BKVN cao nhất (43%). Trong khi đó,
Bohl và cộng sự (2005) [25], lại ghi nhận nhóm có nguy cơ cao nhất phát triển
BKVN (50%) là nhóm huyết thanh dương tính với BKV ở cả người cho và người
nhận. Mặt khác, trong cả hai nghiên cứu, đều đồng nhất kết quả nhiễm BKV thấp
nhất (10%) khi huyết thanh đồng thời của người cho và người nhận âm tính với

BKV. Hơn nữa, Bohl và cộng sự cũng chỉ ra sự vắng mặt của HLA-C7 ở người
nhận có liên quan đến tăng nguy cơ nhiễm trùng [25].
Các yếu tố nguy cơ sau ghép dẫn tới BKVN bao gồm tổn thương niệu quản,
đái tháo đường, độ trễ chức năng thận ghép, nhiễm cytomegalovirus, điều trị thải
ghép cấp tính bằng các loại thuốc ức chế calcineurin hoặc steroid. Ngoài ra, những
bệnh nhân có HLA và ABO không tương thích với người cho hoặc tổn thương niệu
quản do đặt stent niệu quản có thể dẫn tới nguy cơ bị BKVN cao hơn [8].
Một số báo cáo cũng cho thấy sự xuất hiện của BKV trong máu hoặc nước
tiểu có thể phát hiện ở những bệnh nhân ghép tạng khác [6], [49], như ghép tim,
phổi và gan, nhưng nhìn chung sự có mặt của BKV trong máu hoặc nước tiểu không

4


liên quan đến chức năng thận suy giảm ở những bệnh nhân này [60], [71]. Ở những
bệnh nhân ghép tế bào gốc, sự tái hoạt động của BKV gắn liền với tình trạng viêm
bàng quang xuất huyết với các triệu chứng như khó tiểu, tiểu ra máu. Tỷ lệ nhiễm
BKV trong nước tiểu dao động từ 50%-100% ở người nhận ghép tủy xương và ghép
tế bào gốc tạo máu trong vòng 2 tháng sau cấy ghép [18].
BKV cũng được báo cáo là nguyên nhân gây ra hẹp niệu quản, hội chứng
thận hư, viêm bàng quang, viêm phổi, hội chứng tan máu và bệnh đa hồng cầu liên
quan đến polyomavirus. BKV cũng có thể liên quan đến bệnh lupus ban đỏ hệ thống
bằng cách tạo ra các kháng thể chống lại DNA và histones cũng như liên quan đến
các khối u và ung thư [38]. Hẹp niệu quản liên quan đến BKV đã được báo cáo ở
những người nhận ghép thận cũng như những người ghép tế bào gốc tạo máu.
Barasa.N và cộng sự (2010) [63], đã ghi nhận trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu
xuất hiện một loạt các biến chứng sau ghép bao gồm hẹp niệu quản, viêm bàng
quang xuất huyết và hội chứng thận ứ nước. Bệnh nhân này được chỉ định xét
nghiệm máu với sự xuất hiện của herpes simplex virus (HSV) sau 21 ngày ghép, và
BKV sau 28 ngày. Mặt khác, sự lan rộng nhiễm trùng nội mô do BKV được ghi

nhận là có liên quan đến những tổn thương tế bào nội mô, dẫn đến tổn thương mao
mạch, phù nề và tăng sinh khối u trên cả hai bên thận. Báo cáo của Bratt G và cộng
sự (1999) [26], về một trường hợp bệnh nhân bị viêm võng mạc đang trong giai
đoạn AIDS tiến triển, ghi nhận BKV liên quan chặt chẽ tới viêm phổi. Hai trường
hợp tử vong do viêm phổi khác đã được báo cáo, trong đó 1 bệnh nhân sau ghép tế
bào gốc tạo máu và một bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mãn tính trong giai
đoạn hóa trị liệu [4], [89].
1.2. Tổng quan về BKV
1.2.1. Lịch sử phát hiện BKV
BKV được phát hiện lần đầu vào năm 1971, tại phòng thí nghiệm nghiên cứu
virus thuộc Lodon, Anh. Trong một nghiên cứu dịch tễ học về nhiễm
cytomegalovirus ở những người nhận ghép thận, Sylvia Gardner đã quan sát thấy

5


những mụn cóc sinh dục chứa hạt virus tương tự như papillomavirus ở một bệnh
nhân nam người Sudan. Những báo cáo tương tự về tình trạng mụn cóc xuất hiện
nhiều ở những bệnh nhân ghép thận cũng đã được công bố trước đó, tuy nhiên, yếu
tố quan trọng trong lâm sàng của bệnh nhân này là hiện tượng hẹp niệu quản, dẫn
tới phải can thiệp phẫu thuật. Sau khi tiêm nước tiểu của bệnh nhân vào tế bào thận
khỉ rhesus và các tế bào thận trong phôi thai người, xuất hiện bệnh học tế bào nhưng
không phải do papillomavirus. Do đó, virus này được xác định là virus mới, đặt tên
là BK theo tên viết tắt của bệnh nhân được phân lập lần đầu tiên [70].
1.2.2. Đặc điểm sinh học
1.2.2.1. Phân loại
BKV thuộc họ Polyomaviridae, chi Polyomavirus. BKV cùng họ với JC
virus (JCV) cũng như virus Simian 40 (SV40). BKV, JCV và SV40 là ba virus
thuộc họ polyomavirus, có tính tương đồng cao ở trình tự DNA và promassimotein.
Sự tương đồng trong trình tự gen giữa BKV – JCV và BKV - SV40 lần lượt là 72%

và 69%. Cả ba virus đều mã hóa cho 6 loại protein. Sự tương đồng axit amin trong
vùng sớm là 88% giữa BKV - JCV, 81% giữa BKV - SV40 và 79% giữa JCV SV40. Ở khu vực mã hóa muộn (các protein cấu trúc), sự tương đồng là 86% giữa
BKV- JCV, 85% giữa BKV - SV40 và 82% giữa JCV - SV40 [9].
1.2.2.2. Cấu trúc virion
BKV không có vỏ bao ngoài nhưng có vỏ capsid hình khối đa diện với 20
mặt tam giác đều, đường kính dao động từ 40-44 nm. Capsid gồm các protein cấu
trúc VP1, VP2 và VP3, bao quanh phân tử DNA kép mạch vòng được gắn kết cùng
với protein histone. Protein capsid được sắp xếp trong một cấu trúc đa diện 7 mặt có
chứa 360 phân tử VP1, sắp xếp thành 72 patamers. Mỗi patamer liên kết với bên
trong bằng một phân tử protein capsid VP2 hoặc VP3. Do đó, VP1 là protein duy
nhất bộc lộ bên ngoài virion, chịu trách nhiệm gắn kết virus với thụ thể tế bào chủ
cũng như thúc đẩy quá trình xâm nhập [3]. Trong những nghiên cứu gần đây, khi
quan sát BKV dưới kính hiển vi điện tử, các nhà khoa học thấy những điểm tương
6


tác giữa protein VP2, VP3 với protein histone và hệ gen. Nhiều giả thuyết đặt ra,
VP2 và VP3 là cầu nối giữa VP1 và cấu trúc chromatin [43].
Kích thước bộ gen BKV khoảng 5,3 kb, chứa các gen mã hóa cho protein cấu
trúc (VP1, VP2, VP3), các protein giúp cho quá trình nhân lên của virus (LTA:
Large T antigen, STA: Small T antigen, agnoprotein) và vùng không mã hóa
(NCCR: Non coding control region). NCCR là một vùng biến thể cao, có chứa các
vị trí liên kết khác nhau với các nhân tố điều hòa của tế bào chủ, do đó được xem là
vùng điều hòa biến thể (HVRR: Hypervariable Regulatory Region) [23]. Khung đọc
mở nằm ở trung tâm của bộ gen, thúc đẩy việc sao chép diễn ra theo hai chiều.
Trong quá trình nhân lên, LTA tạo thành một phức hợp đa phân liên kết với vị trí
khởi đầu sao chép (Ori) và hoạt động như một helicase để tạo điều kiện cho việc sao
chép vùng mã hóa muộn [86]. LTA cũng là một yếu tố điều hòa quan trọng, thúc
đẩy tế bào chủ đến pha S của chu trình tế bào bằng cách liên kết với các protein ức
chế khối u Rb, p107, p130 và p53 [39]. Bên cạnh đó, STA liên quan đến khả năng

nhân lên của virus, sự vận hành chu trình tế bào và biến nạp. Các protein capsid
VP1, VP2, VP3 được tạo ra trong tế bào chất, vận chuyển vào nhân thông qua các
tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins. Một khi các protein capsid xâm nhập
vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra [57].

Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV [3]
1.2.2.3. Con đường lây nhiễm
Con đường lây nhiễm BKV vẫn chưa được xác định rõ ràng [51]. Nhiều
bằng chứng cho thấy đường hô hấp và tiêu hóa là hai con đường lây truyền chính.
7


Các con đường lây nhiễm khác như truyền máu, đường sinh dục, ghép tạng (đặc
biệt là ghép thận đồng loại) và từ mẹ sang con cũng đã được báo cáo [3]. Nhiễm
trùng tiên phát thường hiếm khi xuất hiện các triệu chứng bệnh hoặc chỉ xuất hiện
triệu chứng viêm đường hô hấp nhẹ. Điều này cho thấy BKV thâm nhập đường máu
thông qua nhiễm trùng ở amidan. Sau khi thâm nhập vào các tế bào máu ngoại vi,
virus sẽ lan truyền sang các mô khác nhau, điển hình là thận [70]. Trong lần nhiễm
trùng tiên phát, BKV tồn tại dai dẳng trong các tế bào ống thận và sự tái hoạt động
không triệu chứng xảy ra khi virus được bài tiết trong nước tiểu. Trong khi đó, ở
những người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả năng miễn dịch, hiện tượng tái hoạt
động của BKV và sự xuất hiện của BKV trong nước tiểu rất hiếm khi xảy ra. BKV
cũng được tìm thấy trong tế bào bạch cầu, não, hạch bạch huyết với các bằng chứng
về sự xuất hiện BKV-DNA. Sự phát tán BKV trong nước tiểu phổ biến hơn ở những
bệnh nhân ghép thận so với người khỏe mạnh. Tuy nhiên, cơ chế về sự tồn tại dai
dẳng của BKV và những điều kiện dẫn tới sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân
suy giảm miễn dịch vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng [51].
1.2.2.4. Chu trình nhân lên
Quá trình nhân lên của BKV được bắt đầu bằng sự kiện kháng nguyên VP1
gắn với acid sialic hoặc GD1b/GT1b trên màng tế bào chủ [27]. Sau khi phức hợp

gắn kết, BKV thâm nhập tế bào bằng con đường nhập bào (endocytosis) và được
vận chuyển tới lưới nội chất nhờ các microtubule [29]. Thông qua VP2, VP3 và con
đường importin, BKV tiếp cận nhân và giải phóng DNA vào tế bào vật chủ. Tuy
nhiên, genome của BKV xâm nhập vào trong nhân của tế bào vật chủ nhưng không
tích hợp vào hệ gen người. Mặt khác, nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng tích
hợp genome BKV vào hệ gen ở động vật gặm nhấm dẫn đến sự hình thành và phát
triển các khối u [3]. Hơn nữa, những hiểu biết về cơ chế tương tác giữa BKV-DNA
với hệ gen động vật gặm nhấm để hình thành khối u còn nhiều hạn chế. Sau khi giải
phóng DNA vào nhân, nhờ phức hệ enzyme của tế bào chủ, quá trình phiên mã sớm
diễn ra nhằm tạo ra các protein hỗ trợ quá trình sao chép của virus (STA, LTA).
Tiếp theo, các protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3) được hình thành từ tế bào chất và
8


vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins.
Một khi các proteins capsid xâm nhập vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra.

Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV [3]
1.2.2.5. Đáp ứng miễn dịch
• Đáp ứng miễn dịch tự nhiên
Phần lớn các nghiên cứu về mối tương tác giữa BKV với hệ thống miễn dịch
tự nhiên tập trung vào thiết lập sự tái hoạt động của BKV và BKVN ở những bệnh
nhân ghép thận (KTRs: Kidney transplant recipients). Womer và cộng sự đã chỉ ra
rằng có sự giảm số lượng tế bào tua (DC: Dendritic cells) trong máu ngoại vi ở bệnh
nhân BKVN. Các nghiên cứu sâu hơn đã xác định các bệnh nhân có số lượng DC
thấp hơn trước khi ghép có nguy cơ bị BKVN cao hơn [88]. DC cũng thực hiện một

9

vai trò quan trọng trong việc kích hoạt đáp ứng miễn dịch thích ứng, đặc biệt là biệt
hóa thành các tế bào T đặc hiệu BKV [31].
Các tế bào giết tự nhiên (NKs: Natural Killer Cells) cũng có vai trò trong
việc kiểm soát lây nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận. Các thụ thể giống với kháng
thể của tế bào NK (KIR) có vai trò trong đề kháng miễn dịch đối với BKV. Các
nghiên cứu mới đây đã chỉ ra rằng chiến lược giám sát miễn dịch của BKV có thể
thông qua việc ức chế quá trình nhận diện của các tế bào NK. Các yếu tố trung gian
khác của hệ miễn dịch tự nhiên cũng đóng góp vào việc kiểm soát BKV, như
defensins thể hiện hoạt tính chống nhiễm trùng với đa số các virus, nấm và vi
khuẩn. Nghiên cứu của Dugna và cộng sự đã chỉ ra Defensins 5 của người (HD5) ức
chế sự bám của BKV vào tế bào chủ bằng cách kết tụ virus [28]. HD5 thường được
tìm thấy trong đường niệu sinh dục, cũng chính là vị trí khu trú của BKV và HD5
có thể bất hoạt BKV theo kiểu phụ thuộc huyết thanh, thực hiện một vai trò quan
trọng trong việc điều tiết sự tái hoạt động không triệu chứng nhiễm virus trong
đường tiết niệu sinh dục.
Yếu tố trung gian trong hệ miễn dịch tự nhiên cũng có khả năng tác động lên
việc làm mất mô ghép ở bệnh nhân ghép thận do nhiễm BKV. Hơn nữa, người ta
cũng chỉ ra rằng nhiễm BKV thúc đẩy sự xơ hóa mô ghép ở bệnh nhân BKVN với
bằng chứng là sự tăng biểu hiện collagens nền, các yếu tố tăng trưởng khối u beta
(TGF-β), MMP2 và -9, cũng như là tín hiệu của quá trình chuyển đổi biểu mô
(EMT) trong mẫu sinh thiết thận [3].
• Đáp ứng miễn dịch thích ứng
Đáp ứng dịch thể
Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống BKV thường diễn ra không lâu sau khi
tiếp xúc với kháng nguyên của virus. BKV thường lây nhiễm từ thời thơ ấu, dẫn đến
các đáp ứng kháng thể trung hòa đặc hiệu BKV. Nghiên cứu của Egli và cộng sự
(2009) [30] trên nhóm người khỏe mạnh chỉ ra rằng kháng thể IgG đặc hiệu BKV
xuất hiện ở 87% những người trẻ tuổi (20-29) và 71% ở nhóm người tuổi trung niên
(50-59). Tương tự, Randhawa và cộng sự (2002) [70], đã phát hiện 80% người cho
10

thận có kháng thể IgG và 22% có kháng thể IgA đặc hiệu BKV. Các báo cáo cũng
chứng minh sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu BKV không đủ để bảo vệ cơ thể
trước sự tái hoạt động mạnh mẽ của BKV và các bệnh liên quan. Mặt khác, các đột
biến kháng nguyên của virus có thể giúp virus trốn thoát khỏi sự trung hòa qua
trung gian kháng thể.
Đáp ứng miễn dịch tế bào
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh vai trò quan trọng của tế bào T trong
việc kiểm soát sự lây nhiễm BKV. Các phân tích tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu
với BKV ở trong máu ngoại vi và các tập hợp tế bào từ mẫu sinh thiết thận của bệnh
nhân BKVN cho thấy đáp ứng của tế bào T diễn ra rất mạnh và liên quan chặt chẽ
tới tải lượng cao của BKV. T-CD4 có thể kiểm soát sự tái kích hoạt BKV kể cả
trong hệ miễn dịch thiếu hụt tế bào T-CD8. Các thuốc ức chế miễn dịch ngăn cản
thải ghép ở bệnh nhân ghép thận có thể gây giảm biểu hiện các cytokine, như IFN-γ
và TNF. Một trong những trở ngại chính trong nghiên cứu tế bào T đặc hiệu BKV là
tỉ lệ thấp các tế bào tiền thân trong máu ngoại vi ở cả người cho và người ghép thận.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng sự tái lập tế bào T đặc hiệu (T-CD4 và T-CD8 ) với
BKV liên quan tới khả năng kiểm soát tải lượng BKV trong máu và trong nước tiểu
tốt hơn. Do đó việc theo dõi tỷ lệ tế bào T đặc hiệu với BKV sau ghép có thể đưa
gia chiến lược giúp tiên lượng nguy cơ sự tái hoạt động của BKV và BKVN [3].
1.3. Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận
1.3.1. Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận
Trước thời kỳ sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép là
cyclosporine, hẹp niệu quản là biến chứng thường gặp hơn là BKVN sau ghép thận.
Nhiều nghiên cứu đã phát hiện việc sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch chống thải
ghép làm gia tăng nhiễm BKV ở người ghép thận. Một số nghiên cứu tiến cứu đã
chỉ ra rằng BKV dương tính cả trong huyết thanh và nước tiểu thậm chí ngay sau
giờ đầu tiên, và tỷ lệ cao nhất từ 1 đến 3 tháng sau ghép thận. Điều này cho thấy giả
thuyết về nguồn gốc của BKV có thể xuất hiện từ người cho thận chứ không chỉ

đơn thuần là sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận. BKV được công
11


nhận như là một dấu ấn liên quan đến sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải
ghép với liều quá cao [35].
Năm 2002, một nghiên cứu tiến cứu theo dõi sự hoạt động của BKV ở bệnh
nhân ghép thận một cách có hệ thống được thực hiện bởi Hirsch và cộng sự trên 78
bệnh nhân ghép thận. Kết quả nghiên cứu đã xác định BKV trong máu trung bình ở
tuần thứ 23 sau ghép và có 5 bệnh nhân phát triển BKVN trung bình ở tuần thứ 28.
Tải lượng BKV-DNA ở bệnh nhân BKVN cao hơn ở bệnh nhân không BKVN [36].
Nghiên cứu khác của Thakur và cộng sự đã theo dõi sự tái hoạt động của BKV ở 32
bệnh nhân ghép thận trong thời gian 3 năm cho thấy tỷ lệ cao nhất của BKV trong
nước tiểu và trong máu khoảng 1 tháng sau ghép [69]. Almeras và cộng sự theo dõi
119 bệnh nhân trong 12 tháng, 10,9% bệnh nhân dương tính với BKV và thời gian
trung bình phát hiện được là 90 ngày (23-214 ngày), trong đó 77% bệnh nhân xuất
hiện virus trong máu trước tháng thứ 4. Tất cả các bệnh nhân có BKV trong máu
đều có sinh thiết mô ghép và chỉ một người được chẩn đoán BKVN, trong đó tất cả
bệnh nhân có tải lượng virus ban đầu <4 log copy/ml (từ 2,69-3,45 log) [20]. Tương
tự, nghiên cứu của Mitterhofer và cộng sự trên 36 bệnh nhân ghép thận chỉ ra tỷ lệ
cao nhiễm BKV có thể phát hiện được cả trong máu và nước tiểu trong 12 giờ sau
ghép và không thay đổi cho đến tháng thứ 6 [6]. Nghiên cứu gần đây nhất khảo sát
214 cặp bệnh nhân ghép thận từ người cho sống xác định 85 bệnh nhân nhận thận
ghép có BKV trong nước tiểu, trong đó 61 bệnh nhân có BKV trong máu và 22
bệnh nhân có BKVN. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng sự xuất hiện BKV trong
nước tiểu ở người cho và người nhận trước ghép là yếu tố nguy cơ cho sự xuất hiện
BKV trong nước tiểu và trong máu ở bệnh nhân sau ghép cũng như sự xuất hiện của
BKVN sau ghép [74].
Theo Hướng dẫn Thực hành bệnh truyền nhiễm Hội ghép tạng Hoa Kỳ AST (AST Infectious Disease Community of Practice) đã được công bố gần đây và
các hướng dẫn của Hội đồng cải thiện toàn cầu về bệnh thận (The Kidney Disease

Improving Global Outcomes, KDIGO) khuyến cao bắt đầu kiểm tra xét nghiệm
BKV từ tháng nhất sau khi ghép và sàng lọc thường xuyên hơn (sàng lọc huyết
12


tương hàng tháng trong 6 tháng đầu, sau đó 3 tháng một lần cho đến 2 năm sau) có
thể thích hợp hơn trong các trung tâm ghép tạng chuyên khoa. Xét nghiệm sàng lọc
BKV kết hợp với giảm liều thuốc ức chế miễn dịch là một biện pháp hiệu quả để
ngăn ngừa tổn thương mô ghép đồng loại do BKVN. Tỷ lệ thải ghép cấp tính được
báo cáo sau khi giảm liều thuốc ức chế miễn dịch dao động từ 8 đến 12% và hầu hết
đều đáp ứng với điều trị bằng steroid [63]. Những bệnh nhân nhiễm BKV khi giảm
liều thuốc ức chế miễn dịch nên được theo dõi cẩn thận kết hợp với creatinine huyết
thanh được kiểm tra 1-2 tuần/lần và tải lượng BKV-DNA lặp lại trong khoảng thời
gian từ 2-4 tuần [71].
Nhiều nghiên cứu đã xác định rằng, tải lượng BKV-DNA trong nước tiểu >
107 copy/ml hay trong máu > 104 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm
BKVN. Sau khi BKV tái hoạt động, virus này có thể phát tán ra trong nước tiểu và
xuất hiện virus trong máu sau vài tuần. Đã có báo cáo về những trường hợp bệnh
nhân phát triển virus trong máu mà không có virus nước tiểu, nhưng hiếm gặp.
BKV trong máu có giá trị chẩn đoán dương (PPV, positive predictive value) cao đối
với BKVN so với BKV nước tiểu; do đó việc sàng lọc cho BKV máu là chiến lược
sàng lọc lý tưởng của nhiều tổ chức chuyên ngành thận uy tín trên thế giới. Bệnh
nhân ghép thận nghi ngờ có BKVN trên lâm sàng nên được chỉ định làm xét nghiệm
real-time PCR để xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và trong nước tiểu [35].
Khi các chỉ số xét nghiệm BKV cao hơn giá trị ngưỡng cho phép chẩn đoán BKVN,
bệnh nhân cần được chỉ định sinh thiết thận để khẳng định chẩn đoán. Nếu bệnh
nhân không được điều trị thì nguy cơ không hồi phục chức năng thận ghép hoặc mất
thận ghép rất cao. Vì vậy, việc theo dõi và giám sát BKV hoạt động đóng vai trò rất
quan trọng trong chẩn đoán sớm BKVN và theo dõi điều trị thuốc ức chế miễn dịch
chống thải ghép [66].

1.3.2. Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận
BKV được phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau trên thế giới và được
chia thành bốn kiểu gen (BKV-I, II, III, IV) theo phương pháp huyết thanh học và

13


sinh học phân tử [80]. Kiểu gen I phổ biến nhất trong quần thể người khỏe mạnh
trên toàn thế giới (80%), tiếp đến là kiểu gen IV (15%), trong khi kiểu gen II và III
hiếm khi được phát hiện (2%). Xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa trên so sánh
trình tự toàn bộ gen hoặc trình tự vùng gen đặc trưng VP1, BKV-I tiếp tục được
chia thành 4 phân nhóm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c; trong khi đó BKV-IV đa dạng hơn
với 6 phân nhóm IV/a-1, IV/a-2, IV/b-1, IV/b-2, IV/c-1, IV/c-2 [64]. Sự phân bố đa
dạng của các kiểu gen BKV cũng như phân nhóm BKV ở quần thể người đã được
nghiên cứu ở nhiều nước [80], trong đó phân nhóm I/a phổ biến ở châu Phi, phân
nhóm I/b-1 phổ biến ở Đông Nam Á, phân nhóm I/b-2 phổ biến ở châu Âu và phân
nhóm I/c phổ biến ở Đông Bắc Á [54]. Cũng như phân nhóm I, mỗi phân nhóm
BKV-IV tương ứng với một vị trí địa lý nhất định [64].
Trong nghiên cứu huyết thanh học, các kiểu gen BKV (I-IV) là các kiểu
huyết thanh hoàn toàn khác biệt [67]. Ở những người khỏe mạnh, hầu hết có kháng
thể trung hòa kiểu gen I, trong khi đó không hình thành kháng thể trung hòa kiểu
gen III hoặc IV. Hơn nữa, các phân nhóm I/b-1, I/b-2 có thể hoạt động như các kiểu
huyết thanh riêng biệt. Phân tích huyết thanh học trên chuột được tiêm vắc-xin
BKV dựa trên hạt giống virus (VLP) cho thấy sự khác biệt này được chi phối chặt
chẽ bởi vị trí gắn kết thụ thể glycan của tế bào trên bề mặt virion. Trong khi đó, tất
cả các phân nhóm trong kiểu gen IV có cùng một kiểu huyết thanh duy nhất. Mỗi
kiểu huyết thanh trung hòa liên kết với một phổ riêng biệt của các thụ thể bề mặt tế
bào, cho thấy các kiểu gen BKV khác nhau có mức độ nhân lên và khả năng gây
bệnh khác nhau. Do đó, các cá thể đã nhiễm một kiểu huyết thanh BKV vẫn có
nguy cơ bị tổn thương khi nhiễm các kiểu huyết thanh BKV khác sau khi điều trị

bằng thuốc ức chế miễn dịch tế bào T [67]. Điều này rất quan trọng vì nhiễm BKV
sau ghép thận chủ yếu xuất phát từ người cho thận [8]. Hơn nữa, người nhận ghép
thiếu kháng thể trung hòa (NAb) chống lại BKV dẫn đến nguy cơ có nồng độ BKVDNA trong máu cao hơn sau ghép thận [68]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng 83 đến
98% dân số có phản ứng kháng thể trong huyết thanh với protein capsid chính
(VP1) của kiểu gen BKV-I khi họ 21 tuổi [79].
14


Các kiểu gen BKV I-IV cũng như các biến thể khác của BKV đã được tìm
thấy ở những bệnh nhân BKVN [7]. Giải trình tự vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết
thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép đã nhấn mạnh sự tồn tại của các “điểm
nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời gian ở hầu hết các trường hợp
được theo dõi. Các đột biến tập trung tại vòng lặp BC (thuộc vùng VP1) là nơi liên
kết với các thụ thể, liên quan trực tiếp đến khả năng lây nhiễm kém hơn so với
chủng hoang dại trên một số dòng tế bào nhưng những “điểm nóng” về đột biến có
thể mang lại lợi thế cho virus trong việc trốn thoát khỏi sự kiểm soát đối với hệ
miễn dịch của vật chủ [70]. Trong một số trường hợp, sự thay đổi chuỗi axit amin là
mối nguy cơ tiềm ẩn ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein.
Sự thay đổi axit amin trong khu vực VP1 đã được phát hiện trong các mẫu nước
tiểu thu thập từ cả nhóm bệnh nhân ghép thận không phát triển BKVN và nhóm
bệnh nhân BKVN. Các phân tích di truyền trên chuỗi VP1 cho thấy khu vực này
chứa vùng biến đổi cao bộ gen BKV từ nucleotide 1744 đến 1812 (axit amin 61 đến
83), trong đó một số sự thay thế axit amin luôn bảo tồn ở kiểu gen I-IV nhưng cũng
có một số thay thế chỉ mang tính tạm thời. Nghiên cứu của Tremolada S. và công sự
(2010) cho thấy sự thay đổi axit amin K69R và E73Q chỉ gặp ở những bệnh nhân
BKVN [84].
Các nghiên cứu in vitro gần đây về các phân nhóm biến thể cho thấy sự thay
thế axit amin có thể làm thay đổi khả năng tương tác của virus với các tế bào chủ,
do đó có thể làm thay đổi độc lực của virus với người bệnh [27]. Nghiên cứu của
Johannes Korth và cộng sự (2018) [52] tại Đức trên 56 bệnh nhân dương tính với

BKV trong máu cho thấy những bệnh nhân nhiễm BKV-II hoặc BKV-IV có nguy
cơ bị BKVN cao hơn so với nhiễm những kiểu gen khác. Trong khi đó, một số
nghiên cứu khác chỉ ra kiểu gen BKV-I/b-2 và BKV-IV thường dẫn đến nguy cơ
phát triển của BKVN cao hơn [73],[74] hoặc không có mối tương quan giữa các
phân nhóm BKV và sự phát triển của nhiễm BKV ở những người nhận ghép thận
[53]. Như vậy, vai trò của biến thể kiểu gen BKV trong sinh bệnh học các hội
chứng lâm sàng vẫn chưa được khẳng định rõ ràng và cần được làm sáng tỏ thêm.
15


Ngoài ra, những hiểu biết về kiểu gen BKV cần được hiểu rõ để đảm bảo
chất lượng của các xét nghiệm chẩn đoán được thực hiện trong các phòng thí
nghiệm sinh học phân tử. Có bằng chứng cho thấy kiểu gen III và IV không khuếch
đại tốt với một số bộ mồi PCR hiện đang được sử dụng. Việc xác định kiểu gen của
BKV cũng rất quan trọng để truy tìm dấu vết nhiễm trùng trong các nghiên cứu dịch
tễ học, ghi nhận các bệnh nhiễm trùng với nhiều chủng virus, xác định đáp ứng
miễn dịch đối với nhiễm virus và thiết kế vắc-xin với khả năng bảo vệ rộng
nhất. Mặt khác, kiểu gen liên quan mật thiết tới cách thức virus phát sinh, lây lan
trên toàn cầu từ điểm định vị địa lý đầu tiên để tiến hóa thành các chủng khác nhau
dưới tác động của chọn lọc tự nhiên.
1.4.

Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV

1.4.1. Tế bào học
Việc chẩn đoán sớm BKVN sau ghép thận ban đầu còn gặp nhiều khó khăn
và thách thức do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu, nhiều trường hợp có thể
nhầm với giai đoạn thải ghép cấp khi sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch chống
thải ghép.
Quy trình chẩn đoán được nhiều trung tâm hiện nay thực hiện bao gồm xét

nghiệm nước tiểu để tìm “tế bào bẫy” (decoy cell), thể "Haufen" hoặc định lượng
BKV trong nước tiểu và trong máu bằng kỹ thuật real-time PCR [71]. Thể Haufen
có thể phát hiện được bằng kính hiển vi điện tử. Việc xác định thể Haufen được báo
cáo liên quan đến BKVN có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, với giá trị chẩn đoán
dương tính (positive predictive value, PPV) và giá trị chẩn đoán âm tính (negative
predictive value, NPV) đều trên 97% [37]. Nước tiểu có thể được sàng lọc cho BKV
bằng phương pháp tế bào học hoặc định lượng BKV-DNA. Các tế bào biểu mô ống
thận có nhiễm BKV được đổ vào nước tiểu - tế bào decoy (Hình 1.3). Trong so sánh
tế bào học nước tiểu với PCR nước tiểu, tế bào decoy có độ nhạy chỉ 25% và độ đặc
hiệu 84% đối với BKVN so với PCR nước tiểu đạt độ nhạy, độ đặc hiệu tương tứng
là 100% và 78% [33]. Tuy nhiên, những kết quả ban đầu này cần được nghiên cứu

16