Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

TRẦN MAI ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA 2013 - 2018

HÀ NỘI - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
------------

TRẦN MAI ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
KHÓA 2013 - 2018

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa
Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm
nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện
cho tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban
Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo
trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học
tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa. Chúng tôi xin cảm ơn Khoa Y - Dược,
Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số
CS.17.01).
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
bên cạnh, ủng hộ tôi trong quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Trần Mai Anh


CHỮ VIẾT TẮT
HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – performance liquid

chromatography)

MS

Khối phổ (Mass Spectrometry)

GC

Sắc ký khí (Gas Chromatography)

DAD

Đầu dò chuỗi diode (Diode Array Detector)

FLD

Đầu dò huỳnh quang (Fluorecence Detector)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

ICH

Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm
sử dụng cho con người (International conference on

Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human use)

EMA

Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

BP

Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)

EP

Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)

USP – NF Dược điển và Công thức Quốc gia Hoa Kỳ (United States
Pharmacopoeia – National Formulary)
Mã Giải phẫu – Điều trị – Hoá học (Anatomical – Therapeutic –
ATC
Chemical Code)
NSAIDs Nhóm thuốc chống viêm không steroid (Non–steroidal Anti–
inflammatory Drug)
Liều gây chết 50% sinh vật thí nghiệm (Lethal dose 50%)
LD50
ACN

Acetonitril

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen ........................................................... 3
1.1.1. Cấu trúc, tính chất ........................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng dược lý ............................................................................ 3
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang ..... 4
1.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................................... 4
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang
.....8
1.3. Các phương pháp định lượng flurbiprofen ......................................... 10
1.3.1. Phương pháp chuẩn độ .................................................................. 10
1.3.2. Phương pháp quang phổ phân tử ................................................. 10
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................... 11
1.3.4. Phương pháp sắc ký khí ................................................................ 15
1.4. Thẩm định quy trình phân tích ............................................................. 16
1.4.1. Tính đặc hiệu................................................................................. 17
1.4.2. Độ chính xác ................................................................................. 18
1.4.3. Độ đúng......................................................................................... 19
1.4.4. Tính tuyến tính .............................................................................. 20
1.4.5. Miền giá trị.................................................................................... 20
1.4.6. Giới hạn phát hiện ....................................................................... 21
1.4.7. Giới hạn định lượng ...................................................................... 22
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 23
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị.............................................................. 23

2.1.1. Dung môi, hóa chất ....................................................................... 23
2.1.2. Trang thiết bị ................................................................................. 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 24
2.2.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký .......................................................... 24
2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích...................................................... 29
2.2.3. Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén ....................... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 31
3.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký ................................................................. 31
3.1.1. Cài đặt các thông số ban đầu ........................................................ 31
3.1.2. Xác định nồng độ dung dịch khảo sát ........................................... 31
3.1.3. Xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu........ 32
3.2. Thẩm định quy trình phân tích ............................................................. 35
3.2.1. Tính đặc hiệu................................................................................. 35
3.2.2. Tính tuyến tính và miền giá trị...................................................... 37
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ................................... 38
3.2.4. Độ đúng......................................................................................... 39
3.2.5. Độ chính xác ................................................................................. 39
3.3. Ứng dụng định lượng flurbiprofen trong viên nén .............................. 42
3.4. Bàn luận ............................................................................................... 42
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN............................................................................. 50
4.1. Kết luận ................................................................................................ 50
4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Công bố kết quả nghiên cứu


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Bảng 1

Tên bảng
Đặc điểm của một số đầu dò

Số trang
11

Bảng 2

Điều kiện chạy nguồn hoá ESI

17

Bảng 3

Chương trình pha động gradient

17

Bảng 4

Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa
lớn nhất của ống quang tử

30

Bảng 5

Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng

độ dung dịch chuẩn và diện tích pic của flurbiprofen

41

Bảng 6

Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của phương pháp

43

Bảng 7

Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp

44

Bảng 8

Kết quả xác định độ chính xác trung gian của
phương pháp

45

Bảng 9

So sánh kết quả độ chính xác của các phương pháp
định lượng

45

Bảng 10

So sánh các thông số thẩm định quy trình định lượng
flurbiprofen của đầu dò DAD và đầu dò FLD

48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Số trang

Hình 1

Công thức cấu tạo của flurbiprofen

3

Hình 2

Sơ đồ hệ thống HPLC

5

Hình 3

Minh hoạ các thông số sắc ký

6

Hình 4

Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang

13

Hình 5

Thang độ nhạy của đầu dò FLD

29

Hình 6

Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ
400 ng/ml

35

Hình 7

Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ
100 ng/ml

36

Hình 8

Sơ bộ khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng
phát xạ tối ưu

37

Hình 9

Khảo sát bước sóng phát xạ cực đại

37

Hình 10

Khảo sát bước sóng kích thích cực đại

38

Hình 11

Sắc ký đồ ở điều kiện tối ưu hóa với đầu dò FLD

38

Hình 12

Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) và độ
trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu của các pic: sản
phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c)

40

Hình 13

Sắc ký đồ của mẫu phân huỷ dưới tác động của tác
nhân oxi hóa H2O2 với đầu dò FLD

41

Hình 14

Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ
flurbiprofen và diện tích pic

42


MỞ ĐẦU
Flurbiprofen là dẫn xuất của axit propionic thuộc nhóm thuốc chống
viêm không steroid (NSAIDs) có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt.
Khi sử dụng bằng đường uống, flurbiprofen thể hiện hiệu quả trong điều trị
tấn công các bệnh viêm gan cấp tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt
lưng [10]. Viên nén và gel dùng ngoài chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị
triệu chứng của bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm
cột sống dính khớp [10]. Thuốc cũng có thể được sử dụng giảm đau trong
các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình đi kèm với viêm
(viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13]. Bên cạnh chống
viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen còn cho thấy tác dụng ức chế kết tập
tiểu cầu rất mạnh và giảm nguy cơ cũng như trì hoàn sự xuất hiện của bện h
Alzheimer khi sử dụng lâu dài [17, 23, 25, 32]. Thuốc nhỏ mắt flurbiprofen

được sử dụng tại chỗ trước các phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn ngừa và
làm giảm co đồng tử trong lúc mổ [18].
Trên thế giới, đặc biệt là tại các nước thuộc châu Âu và Bắc Mỹ,
flurbiprofen đang được sử dụng rộng rãi dưới nhiều tên thương mại khác nhau
như Antadys, Amedolfen, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên
các thuốc này chưa phổ biến ở Việt Nam, trong dược điển Việt Nam IV cũng
không có chuyên luận về Flurbiprofen. Phát triển các nghiên cứu về
flurbiprofen là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có
thêm lựa chọn thuốc trong điều trị, nhất là với một thuốc có giá trị ứng dụng
lâm sàng cao và tác dụng đa dạng như flurbiprofen. Một tính chất đáng chú ý
là flurbiprofen kém tan trong nước, việc bào chế các hệ thuốc dẫn nano có cấu
trúc lipid như nanolipid rắn, nhũ tương nano,… đang là hướng nghiên cứu
được quan tâm trên thế giới [10, 18, 25, 35].
Trong quá trình tìm hiểu của chúng tôi, cho đến thời điểm hiện tại, trên
thế giới chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò
huỳnh quang để định lượng flurbiprofen trong dược phẩm tinh khiết và các
dạng bào chế được công bố. Số lượng các nghiên cứu sử dụng phương pháp
HPLC ghép đầu dò huỳnh quang để xác định flurbiprofen trong dịch sinh học

1


là không nhiều. Điều này càng cho thấy tính mới và cần thiết của việc xây
dựng quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao ghép đầu dò huỳnh quang.
Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã tiến hành Xây dựng quy trình
định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100mg bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò diode–array [2]. Mục tiêu của đề tài
này là tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên
nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh

quang theo hướng dẫn của Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European
Medicines Agency – EMA) [8] và Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục
đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human use) [33].

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về flurbiprofen
1.1.1. Cấu trúc, tính chất
Flurbiprofen có danh pháp quốc tế là 2 – (3–flouro–4–phenylphenyl)
propanoic acid. Flurbiprofen là một chất thuộc nhóm acid phenylalkanoic, có
công thức phân tử là C15H13FO2, khối lượng mol phân tử 244,26 g/mol [28].
Cấu trúc phân tử flurbiprofen được mô tả trong hình 1. Flurbiprofen có các
mã ATC là M01AE09, M02AA19, R02AX01, S01BC04 [36], mã Pubchem là
3394 [28] và mã Drugbank là DB00712 [16].

Hình 1. Công thức cấu tạo flurbiprofen
Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học
(+) S và (–) R. Hai dạng đồng phân này cùng thể hiện tính chất vật lý giống
nhau và có cùng độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 247 nm [12].
Flurbiprofen tồn tại ở dạng bột kết tinh có màu trắng hoặc gần như trắng
và nóng chảy ở 114 – 117oC. Độ tan trong nước của flurbiprofen ở 22oC là 8
mg/L (22oC), các chỉ số LogP và LogS lần lượt là 4,16 và - 4,49 [15, 16, 28].
1.1.2. Tác dụng dược lý
Flurbiprofen là thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) thuộc nhóm
acid 2–arylpropionic mạnh về hoạt động ức chế tổng hợp prostaglandin.
Cơ chế

Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và
cảm nhận đau. Flurbiprofen có tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase
3


(COX) không chọn lọc, từ đó ức chế hoạt động của cả hai enzyme COX–1 và
COX–2 – có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2)
và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit arachidonic. Nồng độ prostaglandin giảm
giúp cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt.
Tác dụng dược lý
Flurbiprofen trong các chế phẩm trên thị trường hiện này là hỗn hợp của
hai đồng phân quang học (+) S và (–) R. Đồng phân (+) S thể hiện hầu hết
trong tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có hoạt tính giảm
đau.
Thuốc được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài đối
với bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và viêm cột sống dính
khớp, đau thắt lưng, viêm gan cấp tính [10]. Thuốc cũng có thể được sử dụng
để giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình
đi kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13].
Bên cạnh chống viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen còn cho thấy tác dụng ức
chế kết tập tiểu cầu rất mạnh. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy việc sử
dụng lâu dài flurbiprofen làm giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và trì hoãn
sự xuất hiện của nó [17, 23, 25, 32]. Flurbiprofen được dùng trong phẫu thuật
nhãn khoa để phòng co đồng tử trong lúc mổ [18].
1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh
quang
1.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển
của pha động lỏng dưới áp suất cao.

4


Hình 2. Sơ đồ hệ thống HPLC

5


Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu nhỏ
đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao. Khi phân tích
sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân
tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với
nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như
không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong
khoa học và công nghiệp [6, 7, 11, 26, 34].
Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
–

Thời gian lưu

tR (Thời gian lưu) là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào
hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
t0 (Thời gian chết) là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký
tR’ (Thời gian lưu thực): tR’ = tR – t0
W: chiều rộng đáy pic.
W1/2: chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.

Hình 3. Minh hoạ các thông số sắc ký

-

Hệ số dung lượng k

6


Trong đó:
Vs : thể tích pha tĩnh; Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh; Qm: lượng chất trong pha động
Cần chọn cột, pha động ... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu 1 < k’< 8.
- Hệ số chọn lọc 

Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1. Để tách riêng
2 chất thường chọn 1,05 < a < 2,0.
- Hệ số bất đối xứng As
Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.
Trong đó:
W1/20 : chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2. Giá trị của As càng
gần 1 thì pic càng cân đối.
- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số Số đĩa lý thuyết N của cột:

Trong đó:
W: chiều rộng đo ở đáy pic.
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

- Độ phân giải Rs


Trong đó:
tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
WB , WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn
vị. Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5.
Quá trình định lượng bằng HPLC có thể chia thành 4 bước. Mỗi bước
đều có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng. Các bước này là:
-

Lấy mẫu thử
Tiến hành sắc ký
Đo tín hiệu đầu dò
Phương pháp định lượng

Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng
Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [5, 6]:
- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản,
trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện. Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích
(hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong
mẫu thử.
-

Phương pháp chuẩn nội: thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử
những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong
cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội. Từ những dữ kiện về

diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội
và mẫu thử có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng
trong mẫu thử một cách chính xác.
- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết
của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến
hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu


thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ lượng chất thêm vào và sự tăng
của diện tích hoặc chiều cao pic.
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một
chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích
pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò
huỳnh quang
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang dựa
trên cơ chế hấp phụ – chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ
và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ). Sắc kí hấp phụ được dùng nhiều để
tách các chất tương đối ít phân cực, các chất hữu cơ không tan trong nước
có phân tử lượng nhỏ hơn khoảng 5000đvC. Phương pháp này mạnh hơn
hẳn các phương pháp khác trong việc tách đồng phân.
Hiện tượng huỳnh quang
Hiện tượng quang – phát quang là sự hấp thụ ánh sáng có bước sóng
này để phát ra ánh sáng có bước sóng khác thường trong miền ánh sáng nhìn
thấy. Định luật Stokes về sự phát quang: ánh sáng phát quang có bước sóng
dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích λpq > λkt.
Huỳnh quang là sự phát quang (phát xạ bức xạ điện từ, thường là ánh
sáng nhìn thấy) thường xảy ra với chất lỏng và chất khí khi phân tử hấp thụ
năng lượng dạng nhiệt (phonon) hoặc dạng quang (photon). Hiện tượng phát
huỳnh quang có thời gian phát quang ngắn, huỳnh quang tắt sau khi ngừng

kích thích khoảng từ 10-8 đến 10-9s. Trong đó thời gian tồn tại của electron ở
trạng thái kích thích là rất thấp, cỡ 10-9 giây.
Quá trình phát xạ năng lượng của huỳnh quang có 2 bước. Bước 1 phát
xạ dưới dạng nhiệt (phonon), bước 2 phát xạ dưới dạng quang (photon) nên
năng lượng photon khi phát xạ sẽ không thể tương đương năng lượng mà
phân tử đã hấp thụ trước đó.
Đầu dò huỳnh quang
Đầu dò là một trong những bộ phận quan trọng được sử dụng trong


máy phân tích sắc ký. Đầu dò có khả năng phân tích cả định tính và định
lượng [1, 6].
Đầu dò huỳnh quang ứng dụng hiện tượng nhiều hợp chất có khả năng
hấp thụ chùm tia UV rồi sau đó phát ra bức xạ có bước sóng dài hơn ngay
lập tức (huỳnh quang) hoặc sau một thời gian ngắn (lân quang). Phần năng
lượng phát xạ trở lại sau khi bị hấp thụ thường tương đối thấp nhưng ở một
vài hợp chất, phần phát xạ trở lại có thể có độ lớn từ 0.1 – 1 năng lượng hấp
thụ nên thích hợp cho việc dò tìm huỳnh quang [1, 7].
Bảng 1. Đặc điểm của một số đầu dò
Thể tích
Giới hạn phát
Kiểu đầu dò
Đáp ứng
Mức ồn
3
hiện (g/cm ) buồng đo (μl)
-4
UV–VIS
Chọn lọc
1-8

10 a.u
10-8
Huỳnh quang
Chọn lọc
8-25
10-7 a.u
10-12
Đo độ dẫn
Chọn lọc
1-5
10-2 μS/cm
10-7
Đo chỉ số khúc xạ Phổ thông
5-15
10-7 r.i.u
10-6
Đầu dò huỳnh quang là ứng dụng của quang phổ huỳnh quang. Phổ
huỳnh quang là phổ phát xạ phân tử. Sau khi hấp thụ năng lượng của bức xạ
tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức xạ kích thích), phân tử bị
kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức
xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang F của một dung
dịch loãng tỉ lệ thuận với nồng độ C (mol/l) trong điều kiện xác định khi
cường độ và bước sóng kích thích là hằng số. Việc đo phổ huỳnh quang chỉ
nên tiến hành với dung dịch loãng C < 10-4 mol/l để tránh ảnh hưởng suy giảm
cường độ của bức xạ phát ra [6].

Hình 4. Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang


Đầu dò huỳnh quang (FLD) là đầu dò nhạy nhất trong số các đầu dò

hiện có của HPLC, có thể phát hiện sự hiện diện của một phân tử chất duy
nhất trong buồng đo. Thông thường, độ nhạy của đầu dò huỳnh quang cao
hơn 10 – 1000 lần so với đầu dò UV – Vis. Đầu dò huỳnh quang chính xác và
có tính chọn lọc hơn các đầu dò quang học khác.
Khoảng 15% các hợp chất trong tự nhiên có huỳnh quang. Đầu dò
huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các
dẫn suất có huỳnh quang. Sự hiện diện của các liên kết liên hợp, đặc biệt là
trong các thành phần thơm có nhiều nhân cho cường độ huỳnh quang cao
nhất. Nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể chuyển sang các dẫn
xuất có phổ này nhờ xử lý với những thuốc thử thích hợp [4, 7].
1.3. Các phương pháp định lượng flurbiprofen
1.3.1. Phương pháp chuẩn độ
Theo Dược điển châu Âu (EP) 2010 [14] và Dược điển và Công thức
Quốc gia Hoa Kỳ (USP 40 – NF 35) [15], phương pháp chuẩn độ dựa vào
phản ứng acid – base của gốc acid trong cấu trúc flurbiprofen. Phương pháp
được thực hiện bằng cách hòa tan 0,200 g trong 50 ml ethanol 96%, sau đó
chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 M, chỉ thị được dùng là phenolphthalein,
dừng lại khi dung dịch có màu hồng bền hơn 30 giây [15]. Có thể thay thế chỉ
thị phenolphthalein bằng phương pháp xác định điểm cuối bằng phép đo điện
thế [15]. 1 ml dung dịch NaOH 0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2.
Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng độ
chính xác thấp, độ nhạy kém, phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn và
người phân tích.
1.3.2. Phương pháp quang phổ phân tử
Phương pháp quang phổ phân tử: Phổ UV – Vis, phổ hồng ngoại, phổ
huỳnh quang đóng vai trò quan trọng trong kiểm nghiệm thuốc. Hầu hết các
dược điển đều áp dụng phương pháp này trong định tính, định lượng và thử
tinh khiết của thuốc và chế phẩm.
Nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã giới

thiệu hai phương pháp quang phổ phân tử định lượng flurbiprofen. Phương
pháp được tiến hành xây dựng và thẩm định theo hướng ICH và EMA [11].
Trong quy trình định lượng flurbiprofen bằng phương pháp đo độ hấp
thụ quang, hệ thống sử dụng máy quang phổ UV – Vis hai chùm tia
(HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambirdge, UK), cuvet 1 cm, tốc độ quét
600 nm/phút, dải quét 190 – 320 nm, độ rộng khe 2 nm. Tín hiệu được xử lý
trên phần mềm Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0
trong hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng
nồng độ 1 – 14 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,2%, giới hạn định lượng
(LOD) là 0,60 μg/ml.
Nghiên cứu cũng giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen
bằng máy đo huỳnh quang. Hệ thống gồm máy đo phổ huỳnh quang
SHIMADSU RF–5301 với đèn Xenon 150 W, thông số hoạt động với độ
rộng khe 5,0 nm, bước sóng kích thích λex= 248 nm, bước sóng phát xạ λem=
308 nm, phần mềm xử lý Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên
bản 10.0 trong hệ điều hành Windows. Độ tuyến tính được thiết lập trong
khoảng nồng độ 0,05 – 0,35 μg/ml, giá trị RSD thấp hơn 3,8% và LOQ có
giá trị là 0,03 μg/ml.
Các phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện ngắn, ít tốn
kém, độ chính xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện và định lượng mẫu ở các
nồng độ rất nhỏ. Vì vậy, những phương pháp này có thể được sử dụng thành
công để phân tích dược phẩm, liên quan đến kiểm soát chất lượng sản phẩm
thương mại và nghiên cứu dược động học. Tuy nhiên, phương pháp có độ đặc
hiệu không cao do bị ảnh hưởng bởi các tạp chất lạ và phải kết hợp với các
phương pháp khác để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu.
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
USP 40 – NF 35 [15] và BP 1993 [29] đều đề xuất phương pháp
HPLC để phân tích flurbiprofen tinh khiết và ở dạng phân liều (thuốc viên và
thuốc nhỏ mắt). Cả hai phương pháp đều đề nghị sử dụng pha động

acetonitril : nước :


acetic acid băng (60 : 35 : 5; v/v/v) ở tốc độ dòng 1
ml/phút.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò UV – Vis
Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ
thống HPLC – DAD [14]. Dung môi hoà tan mẫu là hỗn hợp acetonitril :
nước (45:55). Hòa tan 0,20 g chế phẩm được phân tích với dung môi trên để
được 100 ml. Pha tĩnh là octadecylsilyl silica gel kích thước 5 µm trong cột
thép kích thước 3,9 × 150 mm. Pha động là hỗn hợp axit axetic : acetonitril :
nước tỷ lệ 5 : 35 : 60. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Thể tích tiêm là 10 µl. Thời
gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, đầu dò DAD phát
hiện tại bước sóng 254 nm.
Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã xây dựng được quy trình định
lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò DAD. Pha tĩnh được sử dụng là cột silica gel
pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm), pha động là hỗn hợp acetonitril :
nước
: acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút. Mẫu
được tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký 8 phút, bước sóng phát hiện 247
nm. Thời gian lưu của flurbiprofen là 3,73 phút. Kết quả thực nghiệm cho
thấy trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml, diện tích pic y (mAU.min) và nồng
độ dung dịch x (μg/ml) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ theo phương
trình y
= 0,680x với bình phương hệ số tương quan tuyến tính R2 = 0,9993. Giới
hạn
phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml. Phương pháp
đảm bảo tính đặc hiệu với flurbiprofen, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ
lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,71%, độ

lệch chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34% [2].
Phương pháp có những ưu điểm là độ chính xác cao, nhạy với các nồng
độ nhỏ, tính đặc hiệu cao nên có khả năng tách các chất ra hoàn toàn và có thể
áp dụng được cho những chất không bền nhiệt, dễ bay hơi. Đặc biệt đầu dò
DAD có khả năng quét phổ hấp thụ, ứng dụng trong kiểm tra độ tinh khiết của


mẫu. Nhược điểm của phương pháp là phải sử dụng các loại dung môi đắt tiền
và đòi hỏi phải có hệ thống máy móc hiện đại.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ


Một số nghiên cứu đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen
và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học như huyết tương, nước tiểu bằng
hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ (LC – MS/MS) [22,
24, 26, 27].
Nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương bằng phương
pháp LC–MS/MS do các giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin, Jing Jin,
Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou Heng Zheng,
Hui Chen thực hiện (2015) [24] sử dụng hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu
UFLC LC–30 AD (Shimadzu, Nhật Bản) được ghép với máy khối phổ
QTRAR 4500 (AB SCIEX, Mỹ). Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ thuật
ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm. Điều kiện chạy nguồn
hoá ESI liệt kê trong bảng 2.
Bảng 2. Điều kiện chạy nguồn hoá ESI
Thông số

Giá trị

Áp suất khí phun

30 psi

Thế phun điện tử

–4,5

kV

Nhiệt độ mao quản

400 oC

Nguồn ion

40 psi

Đầu dò với các thông số Năng lượng va chạm (CE) = –12 V, Thế phân
nhóm (DP) = –26 V, Thế đầu vào (EP) = –8 V, Năng lượng (CXP) = –8 V.
Ion có dạng 242,9 → 198,7.
Pha tĩnh: cột silica gel C18 kích thước 5 µm, 2.1 × 50 mm kết nối với
một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex.
Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 3.
Bảng 3. Chương trình pha động gradient

Thời gian (phút)

Tốc độ dòng
(ml/phút)

0,1

0,4

Kênh B:
Kênh A: Nước:
Acetonitril: Acid
Acid formic (99,9 :
formic
0,1; v/v)
(99,9 : 0,1; v/v)
60

40


0,6

0,4

15

85

1

0,4

5

95

2

0,4

5

95

2,5

0,4

60

40

Nhiệt độ cột 40oC và thể tích tiêm mẫu là 5 µl. Phương pháp đã xác
định được khoảng định lượng là 0,04–10 μg/ml. Độ chính xác đạt 2,2 – 3,4%.
Phương pháp có độ nhạy và giới hạn phát hiện cao, độ đặc hiệu cao do
tính phân mảnh riêng biệt của các ion, thời gian phân tích nhanh, có thể định
lượng các chất có thời gian lưu giống nhau và độ phân giải cao. Nhược điểm
của phương pháp là không áp dụng cho những chất kém bền nhiệt, dễ bay hơi,
phương pháp sử dụng hệ thống đắt tiền.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh
quang
Phương pháp HPLC–MS / huỳnh quang đã được Kuma và các cộng sự
phát triển để định lượng flurbiprofen cùng dextromethorphan, midazolam và
các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong huyết tương lợn. Các chất được

phân tách bởi cột Luna C8(II) (50 mm L × 3 mm ID) (Phenomenex, Torrance,
CA) với thời gian cho 1 lần chạy mẫu là 20 phút. Flurbiprofen và 4 –
hydroxyl – flurbiprofen được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang còn các
chất còn lại (dextromethorphan, dextrorphan, midazolam và 1 – hydroxyl –
midazolam) được phát hiện bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ
bắn phá ion dương. Hệ thống sắc ký (Shimadzu, Nhật Bản) bao gồm hai máy
bơm LC–10ADVP, một máy khử khí DGU–14A và một bộ lấy mẫu tự động
SIL–10ADVP. Đầu dò sử dụng là đầu dò huỳnh quang RF10–XL (Shimadzu,
Nhật Bản) ghép đầu dò khối phổ LCMS–2010A (Shimadzu, Nhật Bản). Pha
động bao gồm methanol (dung môi A) và đệm ammonium acetate 20 mM
(điều chỉnh đến pH 3,9 với axit formic) (dung môi B). Tốc độ dòng 0,2 ml /
phút và thực hiện sắc ký ở nhiệt độ môi trường. Nồng độ của methanol trong
dung môi tăng từ 40% tại thời điểm tiêm mẫu đến 90% sau 10 phút và duy trì
đến hết quá trình sắc ký (20 phút). Flurbiprofen và 4 – hydroxyl flurbiprofen
được cài bước sóng kích thích λ Ex = 260nm và bước sóng phát xạ λEm =
320nm [21]. Có thể thấy cặp bước sóng kích thích λEx = 260nm và bước sóng


phát xạ λEm = 320nm được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác [19, 30].
Một nghiên cứu đã mô tả phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
đảo để xác định flurbiprofen trong huyết thanh người với mục đích nghiên
cứu dược động học đã sử dụng pha động axetonitrile : nước : acid phosphoric
(650 : 350 : 0,5; v/v/v). Tốc độ dòng là 1,0 ml / phút, thể tích tiêm mẫu 20ml
và thời gian chạy cho mỗi mẫu là 8 phút. Quy trình định lượng sử dụng đầu
dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λEx = 250nm và bước sóng phát xạ
λEm = 315nm. Thời gian lưu của flurbiprofen và acid 4 – biphenylacetic lần
lượt là 5 phút và 6,1 phút [9].
Nghiên cứu của Knadler và các cộng sự (1989) lại sử dụng pha động là
acetonitril : nước (62 : 38) với tốc độ dòng 1ml/phút qua cột C18. Quy trình
định lượng sử dụng đầu dò huỳnh quang đặt ở bước sóng kích thích λ Ex =

200nm và bước sóng phát xạ λEm = 320nm [20].
1.3.4. Phương pháp sắc ký khí
Cơ sở để tách bằng sắc kí khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha:
pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bề mặt tĩnh đó
[7].
Trong nghiêm cứu của Yilmaz, Bilal và Emrah Alkan (2015), các tác
giả đã xây dựng phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống sắc ký
khí ghép đầu dò khối phổ [37]. Trong đó, phân tích sắc ký thực hiện trên hệ
thống sắc ký khí Agilent 6890 N được trang bị đầu dò MS 5973, hệ thống
tiêm mẫu tự động 7673 và phần mềm điều khiển Agilent ChemStation
(Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Cột HP–5 MS có độ dày 0,25 μm (30
m x 0,25 mm, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách. Tiêm mẫu không chia dòng, khí
mang là helium ở tốc độ dòng 1 ml/phút. Nhiệt độ đầu phun và máy dò là
250°C. Các thông số của đầu dò MS: nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ
dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV. Miền giá trị được xây dựng
trong khoảng 0,25 – 5,0 μg/ml. Độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt
99,4%, LOD và LOQ là 0,05 và 0,15 μg/ml.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời nhiều chất,
độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột, độ nhạy cao nhờ đầu dò, thể tích
tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao. Phương pháp