Phương pháp định lượng Vitamin A bằng HPLC

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP
THỰC PHẨM Tp.HCM
PHÂN TÍCH HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
GV HD: Cô Vũ Hoàng Yến


Nhóm sinh viên thực hiện
 Lê Thị Huỳnh Như
 Phan Thanh Duy
 Nguyễn Thị Hương


Lý do chọn đề tài

• Vai trò của vitamin A đối với sức
khỏe con người.
• Một số phương pháp định lượng
vitamin A


Sơ lược về vitamin A
• Vitamin A tồn tại dưới hai dạng:
• Vitamin A1 C20H30O


• Vitamin A2


Tính chất vật lý

• Vitamin A tan trong dầu và các dung môi hữu
cơ,dễ bị oxi hóa khi tiếp xúc với oxi ngoài
không khí,tuy nhiên lại khá bền với acid và
bazo (điều kiện không tiếp xúc với oxi)
• Vitamin A1 có quang phổ hấp thu tối đa ở bước
sóng 610 đến 620 nm,vitamin A2 có bước sóng
692 đến 696 nmứng dụng phương pháp đo
quang để xác định hàm lượng vitamin A.


Tăng trưởng
Thị giác

Vai trò

Bảo vệ biểu mô
Miễn dịch
Tăng đề kháng,phòng
ngừa ung thư


Khô da

Viêm loét dạ dày

Triệu chứng khi thiếu hụt Vitamin A

Đục thuỷ tinh thể

Nhu cầu vitamin cho cơ thể
• Nhu cầu hàng ngày được khuyến cáo (RDI) về
vitamin A theo nhu cầu tham chiếu ăn uống
của Hoa Kỳ là:
• 900 microgam (3.000 IU) đối với nam giới
• 700 microgam (2.300 IU) đối với nữ giới
• Giới hạn trên – 3.000 microgam (10.000 IU).


Một số phương pháp xác định
hàm lượng vitamin A
• Phương pháp Sắc kí lỏng hiệu năng cao
• Phương pháp so màu
• Phương pháp hóa học


Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC


Pha tĩnh trong HPLC
• Sắc ký pha thường:
_pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực
_pha động:các dung môi hữu cơ không phân cực như

tách các chất không phân cực hay ít phân cực.
• Sắc ký pha ngược:
_pha tĩnh là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực,
loại thông dụng nhất là –C18H37
_pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril

tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân
cực, ít phân cực tới không phân cực


Pha động trong HPLC
• Pha động có độ phân cực thấp(xyclopentan, npentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan,
cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4,
toluene)
• Pha động có độ phân cực cao: nước(MeOH,
ACN)


Detector trong HPLC
• Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS:
• Detector huỳnh quang RF:
• Detector độ dẫn


PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH


Nguyên tắc
• Mẫu được xà phòng hóa với dung dịch kali
hydroxit trong etanol và vitamin A được tách
chiết trong dầu nhẹ. Loại bỏ dầu nhẹ bằng
cách cho bay hơi và phần cặn được hòa tan
trong 2-propanol. Nồng độ vitamin A trong
dịch chiết 2-propanol được xác định bằng sắc
ký lỏng pha đảo dưới các điều kiện cho pic
đơn lẻ đối với tất cả các đồng phân retinol.

Thiết bị
• Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS
của Thermo bao gồm: bộ phận bơm dung môi, bộ loại
khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS.
• Cột sắc ký C18 của Water (150mm × 4,6mm × 5μm).
• Máy lắc vortex.
• Máy đồng nhất mẫu.
• Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).
• Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).


Dụng cụ

•
•
•
•

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm các bộ phận sau:
Bơm, được cài đặt ở tốc độ dòng ổn định 1 ml/min.
Bộ phận bơm của HPLC.
. Cột, dài 250 mm, đường kính trong 4,6mm, được nhồi
bằng pha tĩnh gồm các nhóm octadecyl (C18) liên kết với
silica.
• Cột có ít nhất 4 000 đĩa lý thuyết và giá trị k' = 0,6, cả hai
cho thấy thỏa mãn đối với all-trans-retinol. Cỡ hạt không
được nhỏ hơn 5 m. và không lớn hơn 10m. Có thể sử
dụng các hệ thống khác với điều kiện là tách hết được

vitamin A ra khỏi các chất chiết cùng khác.
• Detector, cho phép đo bức xạ cực tím ở 325 nm và được
trang bị máy tích phân/hệ thống xử lý dữ liệu.


• Máy đo phổ UV (hoặc UV-nhìn thấy), có khả năng đo độ hấp thụ ở bước
sóng xác định trong 9.6, được trang bị các cuvet thạch anh có chiều dài
đường quang 10 mm.
• Nồi cách thủy đun sôi
• Bộ cô quay chân không, có nồi cách thủy ở 40 0C.
• Bộ chiết bao gồm các bộ phận sau đây:
– ống chiết hình trụ dung tích 1 lít có cổ bằng thủy tinh mài và có nút đậy;
– khớp nối thủy tinh mài, gắn với ống chiết và được trang bị một ống điều
chỉnh đi qua tâm; và
– ống nối bên cạnh.
• Ống điều chỉnh cần phải có một đầu dưới hình chữ U và một vòi phun phía
trên sao cho lớp chất lỏng phía trên trong ống chiết có thể được chuyển sang
phễu chiết dung tích 1 lít.
• Có thể sử dụng các dụng cụ chiết khác như các bình nón và các phễu chiết
thay cho thiết bị nêu trong Hình 1 với điều kiện là đạt được các độ thu hồi
vitamin A.
• Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 m, để lọc pha động và các dung dịch mẫu thử


• Lấy mẫu
• Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu
đại diện. Mẫu không bị hư hỏng thay đổi trong
suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
• Bảo quản mẫu sao cho không làm thay đổi
thành phần và giảm chất lượng của mẫu.

Dung môi, hóa chất
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết.
Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích.
Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).
Dung dịch kali hydroxit (KOH)
Hòa tan 500 g kali hydroxit trong nước và pha loãng bằng nước đến 1 lít.

Etanol, w(C2H5OH) = 95% (theo thể tích), hoặc dùng cồn đã metyl hóa công nghiệp tương đương.
2-propanol (C3H7OH).
Dầu nhẹ, có điểm sôi trong khoảng từ 400C đến 600C.
Lượng cặn còn lại sau khi bay hơi phải nhỏ hơn 20 mg/l.
Chất chuẩn vitamin A
All-trans-retinyl axetat, vitamin A axetat (C22H32O2) 328,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.
All-trans-retinol, ancol vitamin A (C20H30O), 286,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.
Metanol, dùng cho HPLC.
Pha động dùng cho sắc ký lỏng
Trộn metanol với nước theo tỷ lệ 770:30 (theo thể tích).
Lọc qua bộ lọc màng nếu cần.
Natri sulfat (Na2SO4), dạng khan.
Dung dịch natri ascorbat,  = 100 g/l.
Khí trơ, ví dụ: nitơ.


Cách tiến hành


Yêu cầu chung

• Vì vitamin A nhạy với bức xạ tia cực tím và
không khí, nên cần thực hiện tất cả các thao
tác nhanh tránh ánh sáng huỳnh quang tự nhiên
và mạnh. Sử dụng dụng cụ thủy tinh màu nâu
khi có thể. Hoàn thành phép thử trong một
ngày làm việc. Thực hiện việc xà phòng hóa và
chiết all-trans-retinyl axetat chuẩn và các mẫu
thức ăn chăn nuôi cùng một lúc.

Xà phòng hóa
• Cân khoảng 50 g mẫu thử nghiệm đã chuẩn bị, chính
xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 1 lít.
• Thêm 200 ml etanol Xoay bình để làm phân tán mẫu.
• Thêm 2 ml natri ascorbat và 50 ml dung dịch kali
hydroxitvà xoay bình để trộn.
• Lắp bình ngưng hồi lưu vào bình cầu và nhúng bình
cầu vào nồi cách thủy đun sôi.
• Để lượng chứa trong bình cầu hồi lưu trong 60 phút,
thỉnh thoảng xoay bình.
• Tháo bình cầu ra và để nguội đến nhiệt độ phòng càng
nhanh càng tốt dưới dòng nước lạnh.


Chiết xuất vitamin A (retinol)
• Chuyển lượng chứa trong bình cầu sang ống chiết hình trụ
• Rửa sạch bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 25 ml etanol hoặc cồn metyl công
nghiệp và chuyển nước tráng sang ống chiết hình trụ.
• Lặp lại việc rửa bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 125 ml dầu nhẹ và một phần
250 ml nước ,mỗi lần tráng chuyển nước rửa sang ống chiết hình trụ.
• Đậy nắp ống chiết hình trụ và lắc đều trong 1 min, thỉnh thoảng chú ý giải
phóng áp suất.
• Làm nguội ống chiết hình trụ dưới dòng nước lạnh trong khi đợi tách hai pha
lỏng, trước khi tháo bỏ nắp.
• Khi đã tách lớp, tháo bỏ nắp, rửa mặt trong nắp bằng một vài mililit dầu nhẹ và
chèn ống có thể điều chỉnh ,chỉnh vị trí đầu dưới sao cho chỉ hơi trên mức phân
lớp.
• Bằng cách áp dụng một áp lực nhẹ của khí trơ vào ống bên cạnh, chuyển lớp
dầu nhẹ phía trên sang phễu chiết 1 lít .