Mức độ nhiễm vi nấm sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trồng cà phê trọng điểm : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 40

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÝ THU HƢƠNG

MỨC ĐỘ NHIỄM VI NẤM SINH OCHRATOXIN A TRONG ĐẤT VÀ RỄ
CÂY CÀ PHÊ Ở MỘT SỐ VÙNG TRỒNG CÀ PHÊ TRỌNG ĐIỂM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------------

Lý Thu Hƣơng

MỨC ĐỘ NHIỄM VI NẤM SINH OCHRATOXIN A TRONG ĐẤT VÀ RỄ
CÂY CÀ PHÊ Ở MỘT SỐ VÙNG TRỒNG CÀ PHÊ TRỌNG ĐIỂM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS KIỀU HỮU ẢNH

Hà Nội - 2012


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tính chất hoá lý của các ochratoxins
Bảng 1.2: LD50 của ochratoxin A đối với một số loài động vật [24]
Bảng 1.3: Mức độ nhiễm ochratoxin A trong máu của người ở một số nước [24]
Bảng 1.4: Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng[25]
Bảng 1.5: Thời gian giảm 50% ochratoxin A trên lúa mỳ trong điều kiện nhiệt độ khác
nhau [24]
Bảng 3.1. Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả
năng sinh ochratoxin A trong đất trồng cà phê
Bảng 3.2. Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả
năng sinh ochratoxin A trong rễ cây cà phê
Bảng 3.3. Mức độ nhiễm nấm mốc A.niger và P.viridicatum có khả năng sinh ochratoxin
A trong đất và rễ cây cà phê ở Đắclắk, Đắc Nông
Bảng 3.4: Khả năng tạo độc tố ochratoxin A của 23 chủng Aspergillus niger đã phân
lập bằng phương pháp nuôi cấy trên cơ chất ngô
Bảng 3.5: Khả năng tạo độc tố ochratoxin A của 12 chủng Penicillium viridicatum đã
phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên cơ chất ngô
Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái của chủng A.niger AN1 sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy trên
môi trường PDA ở 28ºC
Bảng 3.7:Đặc điểm hình thái của chủng A.niger AN3 sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy trên
môi trường PDA ở 28ºC
Bảng 3.8: Đặc điểm hình thái của chủng P1 trên môi trường PDA


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1: Sắc ký đồ Ochratoxin A của các chủng AN1, AN8, P.viridicatum P8
(trước khi phun dung dịch)

Hình 3.2: Sắc ký đồ Ochratoxin A của các chủng AN1, AN8, P.viridicatum P8 (sau
khi phun dung dịch)
Hình 3.3: Hình thái của chủng A.niger AN1
Hình 3.4: Khuẩn lạc của chủng A.niger AN3
Hình 3.5: Bào tử của chủng A.niger AN4
Hình 3.6: Khuẩn lạc của chủng A.niger AN12 trên môi trường PDA
Hình 3.7: Khuẩn lạc của chủng A.niger AN23 trên môi trường PDA
Hình 3.8: Bào tử của chủng P.viridicatum P1
Hình 3.9: Khuẩn lạc của chủng P.viridicatum P5


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………...........
1.1. Đặt vấn đề ……………………………………………………………..
1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu……………………………………....
1.2.1. Mục tiêu………………………………………………………………
Chƣơng 1: TỔNG QUAN………………………………………………………
1.1. Hệ nấm mốc trên lƣơng thực…………………………………………...
1.1.1. Hệ nấm mốc ngoài đồng………………………………………….....
1.1.2. Hệ nấm mốc bảo quản………………………………………………
1.2. Đại cƣơng về độc tố nấm mốc…………………………………..............
1.3. Ochratoxin A………………………………………………………….....
1.3.1. Các loại độc tố ochratoxin…………………………………..............
1.3.2. Tính chất hoá lý của độc tố ochratoxin A…………………………..
1.3.3. Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc……………………….
1.3.4. Độc tính của ochratoxin A……………………………………...……
1.3.5. Phƣơng pháp phân tích……………………………………………...
1.3.6. Tình hình nhiễm ochratoxin A trên cà phê và các nông sản khác
ở thế giới và Việt Nam……………………………………………………….
1 .3.7. Tình hình nghiên cứu phòng chống ochratoxin A trên thế giới và

Việt Nam ………………………………………………………………….
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ….. ……….
2.1. Vật liệu…………………………………………………………...............
2.1.1. Đối tƣợng…………………………………………………………......
2.1.2. Môi trƣờng……………………………………………………………
2.1.3. Các hoá chất dùng cho phân tích độc tố ochratoxin A……………
2.1.4. Dụng cụ thí nghiệm………………………………………………….
2.1.5. Thiết bị………………………………………………………………..
2.2. Phƣơng pháp…………………………………………………….............
2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố ochratoxin A………..
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc từ đất và rễ cây cà phê…………
2.2.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất trồng cà phê………….…

1
1
2
2
3
3
3
3
4
6
6
7
8
8
10

2.2.2.2. Phương pháp phân lập nấm mốc từ rễ cây cà phê………………..

2.2.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản soi nấm mốc……………………............
2.2.4. Phƣơng pháp phân loại các loài nấm mốc………………………….
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích ochratoxin A………………………………
2.2.5.1. Chiết xuất………………………………………………………….
2.2.5.2. Làm sạch…………………………………………………...............

22
23
23
23
24
24

11
15
19
19
19
19
20
21
21
21
21
22
22


2.2.5.3. Định tính và định lượng ochratoxin A……………………………
26

2.2.5.4. Thử xác minh ochratoxin A bằng dung dich NH3………............... 26
2.2.6. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium
để kiểm tra khả năng sinh ochratoxin A …………………………………... 26
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………..……...28
3.1. Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum
có khả năng sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê……………….. 28
3.2. Xác định khả năng tạo độc tố ochratoxin A của các chủng
Aspergillus niger và Penicillium viridicatum đã phân lập ………………… 34
3.3. Đặc điểm phân loại chủng nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium
viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A đã phân lập………………...
38
3.3.1.Đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi của một số chủng
Aspergillus niger đặc trƣng đã phân lập từ đất và rễ cây cà phê………..... 39
3.3.1.1. Chủng A.niger AN 1…………………………………………………… 39
3.3.1.2. Chủng A.niger AN 3……………………………………………………. 40
3.3.1.3. Chủng A.niger AN 4……………………………………………………. 41
3.3.1.4. Chủng A.niger AN 12………………………………………………….. 42
3.3.1.5. Chủng A.niger AN 20………………………………………………….. 42
3.3.1.6. Chủng A.niger AN 23…………………………………………….......... 43
3.3.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi học của một số chủng
Penicillium viridicatum đặc trƣng đã phân lập……………………………. 43
3.3.2.1. Chủng P.viridicatum P1…………………………………………......... 43
3.3.2.2. Chủng P.viridicatum P2…………………………………………......... 45
3.3.2.3. Chủng P.viridicatum P5…………………………………………......... 45
KẾT LUẬN& KIẾN NGHỊ.........…………………………………………… 46


MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Cà phê là một trong những sản phẩm nông nghiệp chính có giá trị kinh tế cao

của nước ta. Cà phê là nông sản được xuất khẩu với số lượng lớn sang các nước
thuộc khối ASEAN, Nhật Bản, Cộng hoà liên bang Nga và một số nước Đông Âu.
Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cà phê nói riêng và các nông sản nói chung bao
gồm các kỹ thuật bảo hiểm trên nông sản đồng thời chế biến chúng thành những sản
phẩm có giá trị dinh dưỡng bảo quản giữ gìn các giá trị dinh dưỡng, ngăn cản các
chất độc hại cao đang ngày càng được quan tâm.
Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho nấm mốc
phát triển. Hàng năm, những tổn thất về lượng và chất của cà phê và các nông sản
khác do nấm mốc gây ra chiếm một phần đáng kể. Nguyên nhân nhiễm nấm mốc
trên nông sản là do nấm mốc trong đất đã nhiễm vào rễ của cây rồi từ đó nhiễm nội
sinh vào cây trồng, tiếp đó có thể nhiễm vào trong hạt. Nấm mốc phát triển trên hạt,
sử dụng dinh dưỡng của hạt như protein, hydrocacbon, vitamin,…Đặc biệt, rất
nhiều loài nấm mốc trong quá trình phát triển đã tạo ra các độc tố ảnh hưởng nguy
hiểm tới sức khỏe con người và động vật kinh tế. Ochratoxin A là độc tố đầu tiên
được phát hiện sau độc tố aflatoxin và là một trong những độc tố nguy hiểm nhất
thường nhiễm trên cà phê. Ochratoxin A gây suy giảm hệ miễn dịch, ảnh hưởng đến
hệ thần kinh, gây tổn thương cấp và mãn tính cho thận, ung thư thận và có thể gây
quái thai,…
Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên
lương thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống đã được coi là một vấn đề
quan trọng. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Nông Lương thế giới (FAO)
cũng như Bộ Nông nghiệp, Bộ Y Tế của nhiều nước đã đưa ra những chương trình
khuyến cáo về độc tố nấm mốc và xây dựng tiêu chuẩn về giới hạn cho phép của
độc tố nấm mốc trên lương thực.


Ở nước ta, vấn đề nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên lương

thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống độc tố nấm mốc đang ngày càng
được quan tâm. Tuy nhiên, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố
ochratoxin A trên cây cà phê và các nông sản khác thì còn rất mới mẻ.
Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Mức độ nhiễm vi nấm sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở
một số vùng trọng điểm trồng cà phê ”
1.2.
1.2.1.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu
Xác định được mức độ nhiễm nấm mốc sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây

cà phê ở một số vùng trọng điểm trồng cà phê ở Việt Nam.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sự nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum
sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê.
- Phân lập và phân loại chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum trong đất
và rễ cây cà phê.
- Xác định khả năng sinh ochratoxin A của các chủng nấm mốc A.niger và
P.viridicatum nhiễm trong đất và rễ cây cà phê.


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Hệ nấm mốc trên lƣơng thực
1.1.1. Hệ nấm mốc ngoài đồng
Các hạt lương thực hay hạt giống trước khi thu hoạch có thể bị nấm mốc xâm
nhiễm. Các nấm mốc ngoài đồng được phân biệt theo các loại ngũ cốc, vùng, địa lý
cư trú, thời tiết,… Một số loại nấm mốc ngoài đồng điển hình là Alternaria,
Cladosporium, Helminthosporium, và Fusarium. Tất cả các nấm mốc ngoài đồng có

thể sống qua được trong nhiều năm ở hạt khô.
Các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng tới bề ngoài và chất lượng của
hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước khi thu
hoạch có thể phát hiện ra bằng phương pháp giám định thông thường và không tiếp
tục tăng lên trong quá trình bảo quản. Điều này được nhận biết rõ nhất là bắp, khi
chín khô ngoài đồng, chưa thu hoạch kịp, gặp mưa có độ ẩm cao, các loại nấm mốc
có nguồn gốc từ đất tấn công vào nông sản. Muốn khắc phục tình trạng này cần phải
thu hoạch kịp thời, không nên để lâu ngoài đồng. Sau khi thu hoạch phải phơi sấy
ngay cho khô đến khi độ ẩm còn 13% mới đem bảo quản.
1.1.2. Hệ nấm mốc bảo quản
Các nấm mốc bảo quản thường thấy ở trên các nguyên liệu có nguồn gốc hữu
cơ và vô cơ đa dạng, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm.
Chúng nhiễm trên các hạt lương thực và hạt giống sau khi thu hoạch. Nguyên nhân
chủ yếu là do độ ẩm trong thức ăn còn cao (> 14%) đã đem dự trữ hoặc do độ ẩm
không khí trong kho cao hấp thu trở lại vào nguyên liệu, do chênh lệch nhiệt độ
ngày đêm làm cho nước ngưng tụ trên bề mặt lớp thức ăn gây ra hiện tượng ẩm cục
bộ, tạo điều kiện tốt cho nấm phát triển. Theo nghiên cứu của Christensen [9] hệ
nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, (trong đó chỉ năm loài là phổ
biến), một số loài Penicillium, các loài của Sporendonema,… Các loài nấm mốc
bảo quản có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có hàm ẩm cao, từ 70%- 90%.
Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 30º- 32ºC. Tốc độ phát


triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Muốn khắc phục tình trạng này phải thường
xuyên hút ẩm thông thoáng trong kho.
1.2. Đại cƣơng về độc tố nấm mốc
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối
lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc
đối với động vật có vú, cá và gia cầm [20]. Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả
của tác động qua lại giữa kiểu gen và điều kiện phát triển của chúng. Sự sinh

trưởng, phát triển của độc tố nấm mốc phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái
như vùng, khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất,…
Từ năm 1960, bệnh độc tố nấm mốc đã bắt đầu được nghiên cứu sâu. Vào
năm 1960, ở nước Anh người ta đã phát hiện bệnh X trên gà tây đã làm chết hàng
vạn con gà. Nguyên nhân là chúng đã ăn phải lạc bị nhiễm độc tố nấm mốc. Nghiên
cứu về các động vật thực nghiệm cho thấy tính độc của các mycotoxin là rất lớn. [7]
Nấm mốc có thể phát triển và sinh độc tố trên cơ chất là hầu hết các sản
phẩm thực vật do đó nó tạo khả năng nhiễm trực tiếp độc tố vào thực phẩm của con
người. Khi ăn các thức ăn có nhiễm độc tố, vật nuôi không chỉ chịu tác dụng độc
trực tiếp mà còn là nguồn mang độc tố vào sữa, thịt, và như vậy tạo sự nhiễm độc tố
tiếp theo cho con người. Thường thì con người và vật nuôi bị nhiễm độc tố nấm
mốc khi ăn phải lương thực, thực phẩm bị nhiễm độc tố.[2]
Hiện nay có khoảng 300 loại độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên
chỉ có khoảng 20 loại độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên
quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium,
Fusarium, Alternaria và Claviceps, chúng bao gồm:
Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin ( B1, B2, G1, G2, M1, M2 ), ochratoxin
A, stermatocystin, axit cyclopianxoic.
Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và
axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.
Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin.


Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether
alternarion.
Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà [45]
Độc tố nấm mốc ngày càng thu hút sự quan tâm, nghiên cứu của các nhà
khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Rất nhiều hội nghị quốc tế, hội thảo, chuyên
khảo, tạp chí và các bài báo nghiên cứu về vấn đề có tính cấp thiết này.
Những giải pháp phòng trừ Mycotoxin:

-

Nên chọn nguyên liệu mới làm thức ăn chăn nuôi.

- Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước, trong khi dự trữ và lúc sử dụng
để trộn thức ăn cho thú.
- Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ
nguyên liệu.
- Bảo quản nguyên liệu nơi khô ráo.
- Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho: côn trùng hô hấp
đốt chất dinh dưỡng sinh ra H2O làm ẩm nguyên liệu giúp nấm mốc phát triển đồng
thời khi di chuyển chúng đã mang theo bào tử nấm phát tán nhanh trong kho.
- Sử dụng hóa chất chống nấm mốc: có nhiều chất hóa học khác nhau có thể
khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn, hiện nay có thể nói chất tương đối an
toàn không độc hại và có hiệu lực cao ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức
ăn là acid propionic và các muối của nó
- Vô hiệu hóa độc lực mycotoxin bằng phương pháp vật lý và hóa học: ngoài
các biện pháp như xử lý nhiệt, ánh sáng, sử dụng ozone để oxi hóa mycotoxin và sử
dụng chất kiềm NH3 thì việc sử dụng chất hấp phụ bề mặt các lọai mycotoxin xem
ra có hiệu quả cao và ít chi phí nhất hiện nay.
+ Các loại đất sét: bentonite, zeolite và aluminosilicate, có nhiều kết quả đã
được kiểm chứng chỉ ra rằng các lọai đất sét kể trên đặc biệt là Hydrate sodium
calcium aluminosilicate (HSCAS) là có hiệu quả nhất với hàm lượng 10kg/tấn có
thể lọai bỏ được các tác hại của aflatoxin ở gà, heo và bò. Tuy nhiên, các lọai này
vẫn còn 1 số khuyết điểm như hàm lượng sử dụng cao, hiệu quả kết dính trong


phạm vi hẹp và chỉ có hiệu lực chủ yếu với aflatoxin còn các độc tố khác ít có hoặc
không có hiệu quả.
+ Các chất kết dính hữu cơ mà đại diện là EGC (Esther Glucomannan) là thế

hệ chất hấp phụ độc tố nấm mốc có nhiều thành quả nhất đáp ứng được hầu hết các
yêu cầu về một chất hấp phụ độc tố điều mà các loại đất sét còn thiếu sót.
1.3. Ochratoxin
1.3.1. Các loại độc tố ochratoxin
Sau aflatoxin thì ochratoxin là nhóm độc tố tiếp theo được phát hiện. Hiện
nay có 4 loại ochratoxin được biết đến là ochratoxin A, ochratoxin B, ochratoxin C
(este etyl của ochratoxin A) và este metyl của ochratoxin A. Ở các ochratoxin chủ
yếu là sự ghép một nhân phenylalanine và một nhân izocumarin. [6] Công thức cấu
tạo của độc tố ochratoxin A như sau:

Ochratoxin A
Claude Moneau và cộng sự [5] khi nghiên cứu tính chất hoá lý của
ochratoxin đã đưa ra những kết quả sau:


Bảng 1.1: Tính chất hoá lý của các ochratoxin
Ochratoxin

Công thức

Trọng lƣợng phân

Điểm nóng chảy

phân tử

tử (MW)

(ºC )

Ochratoxin A

C20H18O6NCl

417

105-110

Ochratoxin B

C20H19O6N

369,15

221

C22H22O6NCl

431

C21H20O6NCl

417,5

Ochratoxin C
(este etyl của ochratox
in A )
Este metyl của
ochratoxin A

1.3.2. Tính chất hoá lý của độc tố ochratoxin
Hợp chất đầu tiên được phát hiện trong nhóm độc tố ochratoxin là ochratoxin
A, được phân lập từ Aspergillus ochraceus. Ochratoxin A là tinh thể không màu,
phát quang màu xanh dưới ánh sáng cực tím. Muối natri của ochratoxin A hoà tan
trong nước, hoà tan nhẹ ở các dung môi phân cực như clorofom,
methanol,...Ochratoxin A tinh khiết bền ở nhiệt độ cao. Ochratoxin A ít hoặc không
bị phá huỷ ở điều kiện nấu bình thường. Tuy nhiên ochratoxin A bị phân huỷ dưới
tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Trong quá trình thuỷ phân axit ochratoxin
A sẽ tạo ra phenylalanine và axit lacton hoạt động về mặt quang học. Ochratoxin C
là chất trao đổi tìm thấy ở nước tiểu của động vật ăn thức ăn có nhiễm ochratoxin A.
[6]
1.3.3. Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc
Ochratoxin A đầu tiên được phân lập từ Aspergillus ochraceus nhưng những
nghiên cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và Penicillium
cũng tạo ochratoxin A.


Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Aspergillus gồm: A.ochraceus, A.
elegans, A.fresenii, A.melleus, A.ostianus, A.petrakii, A.screrotium, A.sulphureus.
Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Penicillium gồm: P.verrucosum,
P.viridicatum,

P.chrysogenum,

P.commune

và

P.cyclopium,

P.expansum,

P.palitans, P.purpurescence, P.nordiceum, P.variable.[4]
Ochratoxin A được tạo ở nhiệt độ tối thích từ 20º- 30ºC và hoạt độ nước
0,953 (39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt độ cao
hơn hàm ẩm yêu cầu cao hơn aw= 0,997 hay 52% ẩm. Các nấm Penicillium thường
tạo ochratoxin A trong điều kiện nhiệt độ thấp còn các nấm Aspergillus thường tạo
ochratoxin A ở nhiệt độ cao hơn. [1]
1.3.4. Độc tính của ochratoxin A
Tác dụng độc đầu tiên của ochratoxin A là ức chế sinh tổng hợp protein. Tác
dụng là đặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp phenylalanin
tRNAPhe. Thận là cơ quan nhạy cảm nhất đối với ochratoxin A. Ochratoxin A có thể
gây ra tổn thương cấp tính cũng như mãn tính cho thận. Ochratoxin A tác động lên
hệ miễn dịch, làm suy giảm hệ thống miễn dịch và có khả năng gây quái thai.
Ochratoxin A còn là một trong những chất gây ung thư. Những kết quả nghiên cứu
cho thấy, việc cho uống ochratoxin A trong thời gian 2 năm ở các liều từ 3500 đến
6000 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày ở chuột cái và 70 ng/kg trọng lượng cơ
thể/ngày ở chuột đực đã kích thích tạo các u, trước hết là các u thận. Bệnh thận địa
phương của vùng Balkan (BEN), chẳng hạn như vùng Vratza của Bulgari là một
bệnh nghiêm trọng. Bằng chứng đã rõ là với cách bảo quản truyền thống đã khiến
lương thực thực phẩm ở các địa phương này bị nhiễm các nấm mốc sinh độc tố
ochratoxin A [6].
Những nghiên cứu của Claude Moneau và cộng sự đã cho thấy độc tính của
ochratoxin A là nguy hiểm nhất trong các ochratoxin. Ochratoxin A làm giảm sản
lượng trứng, sữa, giảm chất lượng vỏ trứng, ảnh hưởng đến thận của các loại gia
cầm. Chó, mèo, lợn, gà, gà tây, vịt con rất nhạy cảm với loại độc tố này. LD 50 của


ochratoxin A đối với vịt con là 135- 170n/con. Nghiên cứu cho thấy ở lợn với hàm
lượng nhiễm ochratoxin A 200 ppb làm giảm tăng trọng, gây tổn thương thận nhẹ.

Theo nghiên cứu của Osweiler (1992) [44] thì liều gây chết gia súc trong vòng 5
đến 6 ngày là 1mg/1kg thể trọng. Còn ở gà mái Leghorn (Lơgo) trắng tuổi từ 14
tuần đến một năm ochratoxin A gây chậm thành thục sinh dục và đẻ ít trứng (với
nồng độ thấp), gây đẻ ít trứng rõ rệt, rối loạn gan và thận, đôi khi làm chết gà (ở
nồng độ cao).[49]
Bằng thực nghiệm người ta đã nhiễm độc cho vịt con và chuột, kết quả nhận
thấy vịt và chuột bị viêm ruột, rối loạn thận, hoại tử ở tiểu quản thận, rối loạn gan,
hoại tử các tế bào quanh cửa gan, thông thường nhiễm vào các tế bào riêng lẻ.
Ochratoxin A và dihidro- izocumarin, một trong những sản phẩm thuỷ phân của nó
gây ức chế nghiêm trọng sự hô hấp nhịp khi cho hai chất đó ở nồng độ thấp vào các
thể ty lạp riêng rẽ ở gan chuột. Ochratoxin A còn gây sẩy thai ở động vật thí nghiệm
và ở các động vật trong các trại chăn nuôi. Giá trị LD50 (liều gây chết tối thiểu 50%
số động vật thí nghiệm) của ochratoxin A đối với một số động vật được thể hiện qua
bảng 1.2 dưới đây.
Bảng 1.2: LD50 của ochratoxin A đối với một số loài động vật [24]
LD50 (mg/kg trọng lƣợng cơ thể)
Loài
Chuột mới sinh

Trong miệng

Trong màng bụng Trong tĩnh mạch

3,9

Chuột

46 - 58

Chó

0,2

Lợn

1

Gà

3,3

22 - 40

26 - 34


1.3.5. Phƣơng pháp phân tích
Phương pháp phân tích ochratoxin A gồm các bước: chiết xuất, làm sạch chất
chiết, định tính và định lượng.
Chiết xuất: Sử dụng hệ dung môi phù hợp để chiết được chọn lọc
ochratoxin A cần phân tích.
Làm sạch: Làm sạch bằng kỹ thuật vi cột ( sep- pack cartridge ). Sep- pak
cartridge là vi cột được nhồi 16 chất hấp phụ cho sắc ký pha thường, pha ngược và
sắc ký trao đổi ion. Ưu điểm của vi cột sep-pak là làm sạch mẫu triệt để, làm giàu
mẫu tốt, tốn ít dung môi và thao tác nhanh, sử dụng thuận tiện.
Định tính và định lượng: Việc áp dụng các phương pháp định tính và
định lượng của mỗi một độc tố phụ thuộc vào tính chất hoá học của chúng. Với
ochratoxin A có thể định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và
sắc ký lỏng cao áp.
Phương pháp sắc ký bản mỏng

Việc định tính bằng sắc ký bản mỏng có thể tiến hành nhờ vào khả năng phát
quang của ochratoxin A dưới đèn cực tím. Giới hạn phát hiện của phương pháp
tương đối thấp, đối với ochratoxin A là 0.25ppb. Có thể định lượng ochratoxin A
nhờ phương pháp sắc ký bản mỏng bằng cách so sánh cường độ phát quang của
mẫu thử so với mẫu chuẩn bằng mắt thường hoặc có thể tiến hành đo trên máy đo
mật độ huỳnh quang. Việc đo cường độ phát quang bằng máy là ưu thế hơn xác
định bằng mắt vì nó loại trừ được sai số cao được gây ra trong điều kiện của sắc ký
bản mỏng. Các nhà khoa học đã xác định được giới hạn chính xác của việc xác định
bằng mắt thường là 20- 28% trong điều kiện lý tưởng. [6]
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Ngoài sắc ký bản mỏng còn có thể định tính và định lượng ochratoxin A
bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp tách xác
định các chất dựa trên sự phân bố của chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao


bọc tạo thành một tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang)
được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp để định tính và định lượng các mycotoxin
trong đó có ochratoxin A được tiến hành dựa trên nguyên lý: mẫu được đưa qua bộ
phận tiêm mẫu vào dòng dung môi của pha di động được tạo bởi hệ thống phân chia
dung môi bao gồm một hay nhiều bơm cao áp chính xác. Dòng chảy của pha di
động truyền mẫu vào cột sắc ký có các hạt của pha tĩnh (5- 100 nm). Sau đó dung
dịch mẫu được chuyển vào cột. Sự phân tách các thành phần tiến hành ở dạng các
dải sắc ký phân tách. Những dải sắc ký này được chiết rút từ cột qua một hay nhiều
máy phát hiện. Tín hiệu xung động được khuếch đại và được ghi lại thành đồ thị ở
các đỉnh sắc ký.
Sắc ký lỏng cao áp là hệ thống thiết bị hoàn thiện với độ xác định chính
xác cao đối với việc phân tích các mycotoxin. Giới hạn phát hiện đối với ochratoxin
A là 0.5 ng/kg.
1.3.6. Tình hình nhiễm ochratoxin A trên cà phê và các nông sản khác trên thế

giới và ở Việt Nam.
Trên các loại nông sản như ngô, lạc, lúa mì, đại mạch, cà phê, bia, nho, các
loại thức ăn gia súc đã tìm thấy ochratoxin A. Ochratoxin A cũng đã được tìm thấy
trong máu của người ở các nước như Bulgari, Hungari, Nhật Bản, Canada. Kết quả
nghiên cứu về mức độ nhiễm ochratoxin A trong máu của người ở một số nước
đựơc trình bày trong bảng 1.3.
Bảng 1.3: Mức độ nhiễm ochratoxin A trong máu của người ở một số nước [24]
Thời kỳ
Quốc gia

Ba Lan

Số

mẫu Nồng độ

nhiễm/tổng số

(ng/ml)

nghiên
cứu

Tỷ lệ

Trung
%
bình

Khoảng

1983-84

25/397

0,21
6

1,0-1,3

Nguồn tham khảo

Golinski (1987)


1984-85

52/668

0,33
8

1,0-4,0
Petkova-

Bulgari

1984-90

9/127

7

Bocharova và cs.

1,0-1,3

(1991)
Canada

Cộng hoà

1994

144/144

1994

734/809

0

1

Đức

0,29 -2,4 Scott và cs. (1998)

9
0,23

0,1-14
Malir và cs. (1998

Séc

Croatia

1
0,23

1995

404/413

1997

148/249

1977

84/165

1985

89/141

1988

142/208

1995

291/355

1997

213/277

8

9

1

3

8

9
0,24

0,1-1,9

5
0,39

0,2-16

5

0,79

0,1-14

6
0,42

0,1-1,8

6
0,75

0,1-8,4

8
2

Peraica

và

cs.

(1999)

Bauer

& Gareis

(1987)

0,2-10

Solti và cs. (1997)

0,1-14

Tapai và cs. (1997)

Hungary

Italia

Nhật Bản

1992

1992-96

65/65

156/184

7
7

0

5

1
0,53

Breitholtz0,1-2,0

Emanuelsson

và

cs. (1994)
8
0,068

0,004
0,28

-

Ueno và cs. (1998)


Pháp

1991-92

97/500

1
9

0,1-12

Creppy

và

cs.

(1993)

Sangare- Tigori B và cộng sự [42] đã nghiên cứu sự cộng nhiễm aflatoxin B1,
ochratoxin A, fumonisin và zearalenon trên các loại ngũ cốc và lạc ở Cordivoir. Kết
quả cho thấy trong 30 mẫu phân tích thì có 86% mẫu nhiễm cả 4 loại độc tố. Các tác
giả cũng nghiên cứu sự nhiễm ochratoxin A trên lúa, miến, ngô, gạo và lạc ở
Cardivoir từ năm 1998 đến 2002. Kết quả cho thấy trong 33 mẫu ngô, 10 mẫu gạo
và 10 mẫu lạc phân tích, trừ 4 mẫu lạc còn lại tất cả các mẫu đã nhiễm ochratoxin A
từ 3 đến 1738 ng/kg, trong đó hàm lượng ochratoxin A trong lúa miến dao động từ
17 ng/ kg đến 204 ng/kg, trong ngô từ 3-1738 ng/kg, trong gạo từ 9-92 ng/kg, trong
lạc từ 0.6-64 ng/kg.
Các nhà khoa học khác trên thế giới cũng đã nghiên cứu mức nhiễm
ochratoxin A trên một số đối tượng như rễ cây cà phê, mỳ, bột mỳ, cám mỳ, lúa
mạch, ngô Bắc Mỹ, … Dưới đây là bảng 1.4 trình bày kết quả mức nhiễm
ochratoxin A trên một số đối tượng.


Bảng 1.4: Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng[25]
Đối tƣợng

Mức nhiễm ochratoxin A
( ng/g )

Lúa mỳ

0,41

Bột mỳ

1,2

Cám mỳ

3,8 – 4,5

Lúa mạch

0,8 - 14

Ngô Bắc Mỹ

0,8 - 40

Rượu trắng

0,01 – 1,8

Bia

0,01 – 1,4

Rễ cây cà phê

0,1 – 5,4

Tại Việt Nam, những nghiên cứu của Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự cho
thấy ngô bột của miền Bắc năm 1994 đã nhiễm 67% ochratoxin A với hàm lượng
trung bình là 1,8 ppb. Các mẫu ngô hạt nhiễm 88% ochratoxin A với hàm lượng
trung bình là 10ppb [7]. Nghiên cứu về mức độ nhiễm ochratoxin A trên gạo tại
Nha Trang của Nguyễn Minh Trí cho kết quả, 22/64 mẫu kiểm tra (34%) nhiễm
ochratoxin A nhưng chỉ có 9/64 (14%) mẫu có thể định lượng được với mức nhiễm
là 0,63 ng/g gạo, chỉ có một mẫu nhiễm 2,78 ng/g gạo.
Kết quả khảo sát 56 mẫu cà phê nhân Robusta ở 4 tỉnh Đắclắk (23 mẫu) ,
Gia Lai (14 mẫu), Lâm Đồng (12 mẫu), Đồng Nai (7 mẫu) của Lâm Thanh Hiền [ ]
cho thấy có 29 loài nấm mốc xâm chiếm hạt. Trong đó Aspergillus là giống xâm
chiếm hạt chủ yếu với 19/29 loài, chiếm ưu thế là A.niger,

A. awamori, A.

turbingensis, A. ficuum, A. ochraceus, A. flavus, A. tamarii, A. alliaceus, A.
fumigatus. Tiếp theo là giống Penicillium với 4 loài: P.viridicatum, P. canescens, P.
nigricans, P. purpurogenum , và P. rubrum. Phân tích hàm lượng ochratoxin A
trong hạt cà phê theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Kamimuna


(1999) và AOAC (1995) đã phát hiện 50/52 mẫu bị nhiễm độc tố ochratoxin A với
hàm lượng trung bình rất thấp: 0,38ppb và biến thiên từ 0,04 – 7,74ppb.
Trước sự nguy hiểm của ochratoxin A, tổ chức nông lương thế giới (FAO) và
tổ chức y tế thế giới (WHO) đã có những chương trình khuyến cáo về phòng chống
ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc và đưa ra giới hạn cho
phép về mức nhiễm ochratoxin A. Các quốc gia trên thế giới cũng đã đưa ra giới
hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm và thức ăn

gia súc cho quốc gia của mình.
Theo FAO và WHO thì giới hạn ochratoxin A trong nông sản thực phẩm là
10 ng/ kg trọng lượng cơ thể/tuần. Năm 2004, cộng đồng châu Âu đã đưa ra tiêu
chuẩn giới hạn ochratoxin A là 5ppb trong đất, rễ cà phê và 10ppb trong cà phê chế
biến. Tại Việt Nam giới hạn ochratoxin A trong nông sản là 35 ng/ kg [48].
Mức độ nhiễm ochratoxin A đã trở thành một trong những chỉ tiêu xuất khẩu
nông sản của các hợp đồng thương mại quốc tế.
1.3.7. Tình hình nghiên cứu phòng chống ochratoxin A trên thế giới và Việt
Nam
Bên cạnh việc kiểm tra, giám sát mức nhiễm ochratoxin A, việc phòng chống
ochratoxin A trên nông sản đã được nhiều quốc gia trên thế giới nghiên cứu. Một số
biện pháp được Bộ Nông nghiệp Mỹ và cộng đồng châu Âu khuyến cáo nhằm
phòng chống các mycotoxin nói chung và ochratoxin A nói riêng đó là:
-

Phát triển các cây trồng có khả năng đề kháng nấm

-

Kiểm soát sự nhiễm các loài nấm sinh độc tố trên cây trồng ở ngoài đồng

-

Xác định đúng thời gian trước thu hoạch, thu hoạch và sau thu hoạch cho cây
trồng

-

Giảm hàm ẩm của các hạt lương thực sau thu hoạch và trong quá trình bảo

quản
-

Bảo quản các nông sản ở nhiệt độ thấp nếu có thể


-

Sử dụng các chất diệt nấm và các chất bảo quản để ngăn chặn sự phát triển

của nấm mốc
-

Kiểm soát sự xâm nhiễm của các côn trùng trong bảo quản bằng việc sử dụng

các chất diệt côn trùng,…
Các nghiên cứu về nguyên nhân nhiễm nấm mốc trong quá trình bảo quản
nông sản của nhà khoa học Mỹ Christensen [9] cho thấy, đất là nơi phát sinh đầu
tiên của các nấm mốc. Các nấm này đã nhiễm vào rễ của cây rồi nhiễm nội sinh
vào cây trồng và từ đó nhiễm tiếp vào bên trong các hạt lương thực. Fernado E.
Vega và Francisco, các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã phát hiện trong số 11
chủng Penicillium sống nội sinh trong cây cà phê, 4 chủng có khả năng tạo
ochratoxin A là P.brevicompactum, P.crustosum, P.olsonii và P.oxalicum [43].
Hiện nay rất nhiều nước trên thế giới quan tâm đến việc phòng chống
ochratoxin A. Các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã nghiên cứu việc phòng
chống nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum sinh ochratoxin
A. Các tác giả Ringot D, Bejaoui H [18] cho thấy chủng A.niger không sinh độc tố
đã có khả năng ức chế chủng A.niger, A.ochraceus và các Penicillium sinh độc tố
theo cơ chế cạnh tranh. Cộng đồng châu Âu đã công nhận kết quả này và khuyến
cáo sử dụng chủng A.niger không sinh độc tố để phòng chống ochratoxin A.

Các biện pháp khử nhiễm ochratoxin A trong nông sản thực phẩm cũng được
các nhà khoa học trên thế giới nỗ lực nghiên cứu. Nhiều giải pháp được đưa ra
nhằm khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm. Boudra (1995) đã
nghiên cứu khả năng khử nhiễm ochratoxin A trên lúa mỳ bằng sức nóng. Kết quả
cho thấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau, khả năng giảm ochratoxin A là khác
nhau. Kết quả được thể hiện trong bảng 1.5 dưới đây.


Bảng 1.5: Thời gian giảm 50% ochratoxin A trên lúa mỳ trong điều kiện
nhiệt độ khác nhau [24]
Loại lúa mỳ

Nhiệt độ (ºC)

Thời gian giảm 50%
ochratoxin A (phút)

100

700

150

200

200

12

250

6

100

140

150

60

200

19

Lúa mỳ khô

Lúa mỳ ẩm
(50% lúa mỳ khô:50%
nước)

Tuy nhiên trong các giải pháp thì giải pháp sinh học được chứng minh là
phương pháp hứa hẹn nhất để khử nhiễm ochratoxin A. Bejaui và cộng sự [ 15 ] đã
phân lập được 40 chủng Aspergillus thuộc nhóm Aspergillus niger như
A.carbonazius, A.niger, A.japonicus từ các quả nho Pháp và đã đánh giá khả năng
phân huỷ ochratoxin A trên môi trường canh thang chất chiết nấm men và trên môi
trường dịch nho tổng hợp có nhiễm ochratoxin A ở nồng độ 2 mg/l. Kết qủa cho
thấy ở cả hai môi trường các nấm này đã có khả năng phân huỷ ochratoxin A thành
ochratoxinalpha. Tuy nhiên có sự khác nhau giữa các môi trường được thử. ở môi
trường dịch qủa nho và môi trường chất chiết nấm men 77% và 44 % các chủng

phân lập đã có khả năng phân huỷ 80 % ochratoxin A . Aspergillus được đánh giá là
loài có hiệu quả cao nhất đối với quá trình khử ochratoxin A, tiếp theo là
A.japonicus.
Varga J và cộng sự [39 ] đã nghiên cứu sự phân huỷ ochratoxin A và các độc
tố nấm mốc khác bằng các chủng Rhizopus. Kết quả cho thấy ochratoxin A đã được
phân huỷ một cách hiệu quả bằng nấm Rhizopus stolonifer, R.microsporus,


R.homothallicus, hai chủng R.oryae và bốn chủng Rhizopus khác chưa được định
loại. Các chủng Rhizopus đã phân lập có thể phân huỷ trên 95% ochratoxin A trong
vòng 16 ngày. Các chủng A.niger không sinh độc tố và Rhizopus stolonifer cũng đã
được cộng đồng châu Âu khuyến cáo để khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực
nhiễm độc tố này ở mức độ quá giới hạn.


Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tƣợng
Các mẫu đất và rễ cây cà phê được lấy ở các xã khác nhau của tỉnh ĐắkLắk
và ĐắkNông bao gồm: 50 mẫu đất và 30 mẫu rễ cây cà phê.
8 mẫu ở Tân Lập, Đắclắk.
15 mẫu ở Ea cúc, Đắclắk.
7 mẫu ở Eapole, Đắclắk.
10 mẫu ở Chư hlam, Đắclắk.
12 mẫu ở Krông păc,ĐắkNông.
9 mẫu ở Krông ana, Đắc Nông.
11 mẫu ở Kpach, Đắc Nông
8 mẫu ở Empa Cumgar, Đắklắk.
Các mẫu ngô dùng làm cơ chất để kiểm tra khả năng sinh Ochratoxin A của
các chủng đã phân lập được lấy ở các cửa hàng bán lẻ thuộc các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà

Tây.
2.1.2. Môi trƣờng
Môi trường thạch khoai tây (PDA) : 200 g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu đun
sôi với 4.500 ml nước. Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu dịch chiết khoai tây.
Dịch chiết khoai tây: 1000 ml
Glucoza:

20 g

Thạch:

20 g

Đun cho tan chảy thạch và glucoza. Thử pH = 5.5 - 5.8. Sau đó chia môi
trường vào các bình tam giác, khử trùng ở 121ºC (1 at) trong 30 phút.