Dùng Trypsin thêm Axít Amin tách tế bào phôi gà và đánh giá sự phát triển các tế bào đó

BÒ GIAO DUO VÀ DÀO TAO
•

•

•

DAI HOC QUÓC GU HA NÓI
TRUÒNG DAI HOC KHOA HOC TUNHIÈN
****

CAO XUAN THINH

DÙNG TRYPSIN THÈM AXIT AMIN TÀCH
TÉ BÀO PHÒI GÀ VÀ DANH GIÀ SUPHÀT

TRIÉN

CÙA TÈ BÀO DÒ

LUAN AN THAC S? KHOA HOC HOA HOC

Qiuyèn ngành: Hoà HOu co
Masd:

01-04-02

Nguòrf hiróng dàn khoa hoc: GS.TS.KH Ngò Thi Thuàn
GS.TS.KH Nguyén Vàn Man

HA NÓI-2000

MUC LUC
Trang
MÒ DÀU
CHUONGLTÓNG QUAN
Ll.Tébào

4

7.7.7. Saluge lich sùtébào hgc

4

7.7.2. Màng bào tuoitg

5

1.1.3. Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giua càc té bào

10

7.7.-^. Suphàn chia té bào

19

1.2. Trypsin

19

7.2.7. Càc tién chat cùa enzym

19

7.2.2. Hogt hoà trypsinogen

20

1.2.J?. Dàc diém cùa trypsinogen - co che thuy phàn protein,
dnh huòiìg cùa nhiet dò va pll dai vói trypsin

23

1.2.4. Nhoni hydroxyl cùa serin

28

7.2.5. Axit amin

30

CHUONG 2. VÀT LIÈU VÀ PHUONG PHÀP
THUC NGHIÈM
2.1. Vatlieu
2.7.7. Trang thiét bi va dung cu can thiét

32
32

2.7.2. Càc mói truàng càn thiét dùng de tàch va nuói cày té bào 33

2.2. Phifimg phap thirc nghiem
2.2.7. Chuàn hi tritng gà co phói

37
37

2,2.2. Chuàn hi nuói cày té bào CEF
(Chick Embryos Fibroblast)

CHUONG 3. KÉT QUA VÀ THÀO LUÀN
3.1. So té bào song / mi dirgc tàch tir phói gà

39

40
40


3.2. So té bào chét / mi dugc tàch tir phói gà

42

3.3. So té bào song / gam dirgc tàch tir phòl gà

43

3.4. So té bào chét / gam dirgc tàch tir phói gà

44

3.5.Ty le té bào song / tong so té bào (%) tàch tir phói gà

45

3.6. Quan sàt sir phàt trién cùa té bào qua 2 ngày nuói cày

46

3.7. Su nhàn lén cùa virut trén té bào phói gà

48

3.8. Su phàn huy va tài tao té bào

51

3.9. Tàc dung cùa trypsin va trypsin axit amin

52

KÉT LUÀN

57

TÀI LIÈU THAMKHÀO

58


MODÀU

Tir dàu thàp nién 1950 viéc nghién culi va phàt trién càc vaexin da eó
dugc buóc tién bó nbày vgt nhó phuang phàp nuói cà'y té bào in vitro thành
cóng .
Thoat tién Goodpasture dà nuói cà'y tình dugc màng phói gà. Sau dò
Maitland dà cài tién nuói té bào thàn gà trong chai thuy tinli, dùng mói
truàng eó huyét thanh gà va mot sÓ muói khoàng de cà''y virut vaexin.
Khóng lAu ve sau, Gey da eó mot dóng góp dàng ké : óng de xuA't phuang
phàp quay tròn lién tue càc óng nghiém nuói té' bào dà cày virut vaexin va
bÀng ky thuAt này Gey dà thu hoach dugc lugng virut lón han gA'p bòi.
Cilng trong nhiTng nàm 50, Enders, Wella va Robbins thue hién nhiéu thf
nghiém cày virut trén té bào nguòi nuói in vitro, chù yéu là càc nguyén bào
xa (fibroblast) tu tÓ chirc da va ea cùa tré chét khi mói sinh. Bang phuang
phàp này càc tàc già dà dat dugc nhung két qua rat khà quan là dugc
polyovirut typ II Langsing vói khói lugng khà lón trong té bào nuói.
Thành cóng trong viéc su diing té' bào nuói in vitro de cày virut gay bénh
cho nguói dà ma ra mot ky nguyén mói nghién cuu va phàt trién mot loat càc
vaexin mai phòng càc bénh bai liét, dai, quai bj, thuy dàu, sai, v.v...
Gòng nghé nuói té bào a mot quy mó lón ngày càng dugc cài tién va hoàn
thién sé tao diéu kién thuAn Igi hon nùa cho viéc san xuà't càc vaexin va
nghién ciru sinh y hoc.
Bang phuang phap trypsin hoà nguòi ta dà tàch dugc càc té bào riéng ré
tìrmó [3]. Trypsin là mot trong nhung enzym phAn giài protein dac hiéu nhA't


san eó va cung dugc su dung róng rai nhàt [9]. Trypsin vói net dàc tnrng cùa
chuói peptit lién quan dé'n nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ea ban [22]. 0
diéu kién thieh hgp trypsin boat dóng rat huu hiéu trong viéc tàch mó, nhung
trypsin sé phà huy té' bào né'u kéo dai thòi gian trypsin hoà [26]. Tiì yéu cÀu
thue té càn lugng té bào song nhiéu han, nén chùng tói tién hành nghién cuu
de tài:

''Dùng trypsin thém axit amin tàch té bào phói gà va dành già su phàt
trién cùa té bào dò " .
Mue tiéu cùa de tài bao góm nhung vA'n de ehinh sau:
1 )Nghién cùru ành huong cùa trypsin va trypsin co axit
amin dén sir tàch té bào phói gà.
2) Dành già sir phàt trién cùa hai nhóm té' bào tàch
dugc theo càc phuang phàp trén.


Chuong 1
TÓNG QUAN
1.1. Té bào.
7.7.7, Saluge lich sùtébào

hgc.

Té bào dugc Robert Hook phàt hién lÀn dàu tién vào nàm 1665 nhò kmh
hién vi tir tao vói dò phóng dai 30X. Ong dà xuàt ban euón "Kinh hién vi"
mó ta nhiéu dói tugng ma óng dà quan sàt dugc. Ong mó tà càu tiiie cùa tiéu
bau thue vAt à dcing càc xoang róng eó thành bao quanh va dat tén là cella
[4].
Antoni Van Leuvenhock (1674) vói kmh hién vi eó dò phóng dai 270X dà
mó tà càc té bào dóng vAt va dà xàc djnli té bào khóng phài là xoang róng ma
eó cA'u trùc phùe tap.
Tu quan diém té bào là "xoang róng" dà chuyén sang quan niém té bào là
khói té bào chat eó chùa nhàn (R. Brawn, 1831) va dugc giói han bòi màng
té bào [4]. Nhiéu qua trình sinh ly quan trong cùa té bào dugc nghién cuu
làm ca sa cho sir phàt trién cùa di truyén hoc , sinh ly hoc va phói sinh hoc a
cuòi théky XIX va dàu théky XX [21].
Ca thè ehi song trong tiiròng hgp néu càc hgp phÀn cùa nò dugc càu tao

tir le bào. Mó cùa tA't cà càc ea thè déu bao góm nhung té bào gAn vói nhau
bÀng nhiìng lue bàm thóng thuòng. TA't cà càc mó va càc ca quan ehi là càc
khói té bào bién dang khàc nhau [11], té bào sinh ra bang eàch chia dói va co
cAu phàt biéu nói tié'ng : "Ngoài té bào khóng eó su song" [4].
Hoc thuyét té bào dirge Engels dành già là mot trong mhiìng su kién lón
nliAt cùa thè ky 19. Hoc thuyét cho rÀng:


+ Mèi ca thè song déu eó càu tao té bào va san phàm boat dóng song cùa
té bào.

+ Càc té bào mói duae hình thành ti^ su phAn chia té bào cu
+ Thành phàn hoà hoc va su chuyén hoà cùa chùng rat gió'ng nhau. Boat
tinh ca thè toàn ven bao góm boat tinh va su tàc dóng tuang hó cùa càc dan
vi té bào dóc lAp càu tao nén nò [5].
Té bào là dan vj só'ng ea ban dugc tao thành bòi càc thành phàn quan
trong lién quan màt thiét vói nhau góm 3 thành phàn ea ban: màng, té bào
chA't, nhàn [4].
7.7.2. Màng bào tuoyig
Trong de tài nghién cuu này bang phuang phàp trypsin hoà chùng tói da
tàch dugc iihùng té bào riéng ré tir mó (phói gà), de bié't dugc nhung tàc dung
tfch cuc cung nhu khóng tieh ciré trong viéc thuy phAn protein màng té bào
cùa trypsin. Chùng tói quan tAm rat nhiéu dé'n cA'u tiijc cùa màng, dac biét
dé'n càc phàn biét hoà cùa màng nói giua càc té bào vói nhau. Màng bào
tuong là màng ngàn, giói han su ngA'm thu dóng dàn dé'n két qua là màng dò
chi cho phép càc chA't di qua theo gradien nóng dò, nguòi ta thày ràng niróc
va nhung chA't eó kliói lugng phAn tir nhò di qua màng ngàn do mot eàch tu
do. Su vAn chuyén mot so chat nhu duòng, axit amin... co su tham già cùa càc
enzym. Càc enzynì làm tàng toc dò thAm thà'u cùa càc chat dò qua màng. He
thóng enzym này tham già vào thành phàn càu tao cùa ehinh màng va boat

dóng nhu "chat chuyén chò" khóng phii thuóc vào nàng lugng [5]
Màng té bào là mot màng rat mòng , khóng thè nhìn thA'y dugc duói kùih
hién vi quang hoc ma dugc nhìn thA'y duói knih hién vi dién tu . Màng bào
tuong boc quanh té bào cùng dugc xàc nhàn nhò càc hién tugng sau:


- Càc ch^t chùa trong té' bào bi chày ra, dàc biét là khi thié'u Ca^^ khi té'
bào bi tén thircfng.
- Càc loai phàn tu ngà'm vào tè' bào khòng cùng tó'c dò nhir nhau.
- Nhùng ion cùng nhu phàn tir mang dién tfch thàm nhàp vào té' bào chàm
han nhùng phan tir khòng mang dién tich.
- Nhùng phàn tir bé thàm nhap vào té' bào nhanh hon nhùng phàn tu lón.
a. Càu tao cùa bào tuong.
Overton (1902) nhàn thà'y nhùng chc'ft hoà tan trong lipit rà't de xàm nhàp
vào té' bào, dòng thòi òng ta nhftn thà'y ràng nhùng dung mòi cùa lipit va
nhùng men iipaza phà huy màt té' bào. Tu dò òng két luàn màng bào tuong
co chat lipit . Già thuyét duoc khàng dinh sau khi nguòi ta nhàn thày nhùng
hoc7t dóng men ò màt ngoài màng bào tuong. Tu dò két luàn màng bào tuong
dugc tao thành bòi lipit va protit. Bang phuong phàp hoà hoc té' bào, nguói ta
còli chùng minh su co màt mot lóp chat co tinh chat cùa polysaccarit o trén
màt té' bào. Phàn tfch hoà hoc, nhàn thày màng bào tuong tàch rói co lipit,
protit vói so lugng tuong duong, dóng thòi co thém polisaccarit [28].
Màng bào tuong là mot màng dàm, day eàch màng té' bào bòi mot vùng
sàng nhò hon dò là mot tnjóng hgp càc desmosom dà dugc biét hoà cao dò
[6]. Màng té' bào co thè két dfnh vói là trong. Màng bào tuong co thè cà'u trùc
kiéu màng, song song vói màt té' bào. Càc màng này lién két vói nhau trong
mot khuón co ban chat hoà hoc gàn giò'ng keratohyaline [18]. Càc sgi nhò
nói té bào (tonofilaments) là nhùng thành phàn quan trong nhà't cùa vùng lién
két. Tonofilaments co duòng kfnii 10 nm, xuyén qua càc màng bào tuong, va
chia ra tiiành càc tién sgi bàm vào càc tiéu thè protein nói màng. Càc

tonofilaments là mot thành phàn cùa bó xuong té bào, là chat sùng cùa té' bào


nguòi ta dành già rat cao già tri cùa gangliosit eó trén màng té bào. Nhfmg
chat này tuong tu nhu photpholipit nò là mot ehuói ki nuóc, nhung phàn eó
ciré thi dai va két thue boi axit neuramin, cài ma co mot nhóm eaeboxyl tir
do.
Cuc cuòi cùa phAn tu chùra N-axetyllactosamil, glaetosamil va diròng
glucose [17]. Dién tieh bé màt Am tinh nguòi ta cho ràng eó lién quan dé'n
nóng dò cùa doan cuòi axit neuramin. Sau khi hoà tan nhe vói neuraminidase
dac biét thi axit neuramin tan ra tir té bào song va tinh (-) cùa bé mat giàm.
Càc thành phÀn quan trong cùa gangliosit dóng vai trò trong vàn chuyén ion
va trong màng chùra neuron. Ben canh viéc tao nén càc nhóm eaeboxyl
ionogen trén bé mat té bào axit neuramin là thành phàn quan trong cùa mot
sé khàng nguyén bé màt (vimt va khàng nguyén toxin). Nhung diéu dò chi
ra ràng càc gangliosit là thành phàn cA'u trùc quan trong cùa màng té bào.
e. Su biét hoà màng bào tuong va su két dinh.
Càc té bào canh nhau cùa co thè dugc ngan eàch nhau boi nhung khoàng
gian bào, giàn doan tùng quàng tuy theo càc kiéu phùe hgp lién két. Càc té
bào dugc ràp lai vói nhau qua càc móng.
Càc khoàng gian bào: Càc té bào khòng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai
cùa chùng. Trong biéu mó hình lang kmh don giàn thày eó nhung kè ho giua
càc té bào, dò là càc khoàng gian bào. 0 dinh eó mot càu trùc ggi là khung té
bào, co tàc diing ngàn khóng cho dich lién bào thoàt ra va khóng cho chat
liéu bé mat biéu mó nhAp vào khoàng gian bào. Khoàng gian bào eó kieh
lluróc tuong dói bang dinh. Càc té bào lién két dugc vói nhau là do mot chA't
"kco" co chira càc protein

(fibroneetin, elastin, collagen). Su eó màt cùa

Mg'^ va Ca'' là cÀn thiét cho sir lién két giùa càc té bào [ 14].


1.1.3. Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giira càc té bào.
Càc té' bào dugc phàn eàch vói nhau bang mot khoàng gian bào hep hoàc
ròng. Càc té' bào khóng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai cùa chùng ma thà'y
co nhùng kè ho giùa càc tè' bào, dò là càc khoàng gian bào. Khoàng gian bào
co kfch thuóc tucmg dÓi hàng djnh [11].
Trong gian bào co djch khe vàn chuyè'n càc chà^t nuói duòng, càc chà't tié't
va càc chat thài [15]. Tai mot sÓ vùng càc màng tè' bào dinh lai vói nhau. Càc
vùng lién két này góm càc kiè'u lién két khàc nhau: (hình 2, 3, 4, 5a, 5b, 5c,
5d,5e )
- Càc lién két kiéu chat.
- Càc lién két kiéu khe.
- Càc lién két kiéu càu nói.
- Càc lién két kiéu desmosom.
a. Càc lién két kiéu chat.
Dò là càc vùng chuyén biét cùa màng, tai dò càc là ngoài lién ké't vói
nhau dén nói khòng con khoàng gian bào nùa, va nhu vày khòng con su van
chuyén chat giùa càc té' bào. Lién két kiéu chat thuòng thà'y ó nhiéu mó, nói
lién càc té' bào nói mó .Kiéu lién két chat này khòng con chó cho dich luu
chuyén giùa càc té' bào. Vi vày viéc trao dói ó day là giùa hai té' bào, chù
khòng phài là qua càc gian bào. Mòi màng té'bào thuóc lién két kiéu chat déu
co chùa pròtéin dugc ggi là càc connexin [4] (càc chat nói )(hình 2).

10


Hình 2- Lién két kiéu chat
b. Càc lién két kiéu khe.

Dò là càc vùng chuyén biét tai màng cùa hai té bào làn càn, nói hai màng
\:Ì\ vói nhau. Néu càt theo hình thuóc thg, lién ké't khe góm eó bay lóp :
- Càc là (hai là dàm va mot là sàng ) cùa mot trong hai té bào.
- Khoàng gian bào eó chiéu day 2-3 nm.
Ba là cua màng té bào lan can,

11


Nhu vay lién két kiéu khe góm co btfn là th^m thàu dugc
Nhung hai là ngoài sàt nhau qua nén khóng phin biét dugc. Do dò làm
tucmg lién két kiéu chat, vi vày khó xàc dinh dugc. Phài chùng minh su co
màt cùa gian bào bang Nitratlanthan. Vi chat này co thè nhàp vào càc gian
bào ké cà càc gian bào nhò. Nén dùng chat Nitratlanthan làm chat dành dàu
[10]. Qua hién vi dién tu, chat này due va de phàt hién. Néu ngàm mot tÓ
chùc trong dung dich Nitratlanthan thi de phàt hién dugc tà^t cà càc khoàng
gian bào. Càc phàn tu hgp thành connexon (mot hexame) càc connexon cùa
hai màng té bào làn càn dugc lién két vói nhau. Connexon co duòng kinh là 6
nm va co mot kénh trung tàm 2 nm, dugc bé trf theo mang luói hình lijc giàc
(hìnli 3).

Kénh giùa
cùa connexon

Hình 3-Lién két kiéu khe

12


e. Lién két kiéu cdu nói.

Day va càc vùng chuyén biét cùa màng té bào, dugc nói vói nhau bang
càu nói xuyén qua gian bào. Khoàng gian bào eó kieh thuóc 16 ^ 20 nm giua
càc màng té bào là càc càu nói, hình dàm (hình 4).

Hình 4 - Lién két kiéu càu nói
d. Càc lién két kiéu desmosom.
Giùa càc té bào biéu mó chùng ta hay thA'y desmosom. Cài này dugc nhìn
thày nhuòm màu tói trén kmh hién vi quang hoc, cài ma nguòi ta cho là cài

13


càu giùa càc té bào, nhùng sgi mòng euón vào desmosom txi dAy nguòi ta tin
ràng thóng qua càc càu eó thè dua tu té bào này sang té bào kia. Cuòi cùng
kinh hién vi dién tu da làm sàng tò càu bòi khóng eó vàn de ve su lién nhau
giùa càc té bào (hình 5a).

M

<-•«
».* *

':\

\

wi
~^ fi
-'> J

••'.Vtf'.-V

^z,

lu»>•

Hình 5(a)- Lién ké't kiéu desmosom

14

• »


Cài goi là phàn ''Khoà" thóng thuòng gap ò giGa càc té bào biéu mó hình
tru tnic tiép duói bé màt tu do (hình 5c).

rp=^

rr=^

vy^

Hình 5(c)- Lién két kiéu desmosom
Duói kinh hién vi dién tiJ nò tuong tu nhu Desmosom, màng day lén a
ben canh nò co mot chft màu tèi co thè gap nhung thóng thuòng khóng co sgi
ta.
Giùa càc bé màt té bào tiép xùc vói nhau co nhiéu hình thùc cài ràng
Urge co thè quan sàt. Mot trong vf dii mmh hoa là (hình 5d).

ifi

Desmosom là phàn day lén tal chó cùa càc màng té bào dÓi dién vói nliau,
tu nhung cài ma sgi nhò mòng tién thành hình tia di vào ben trong bào tucfng.
Giua càc Desmosom tliuòng xuàt hién nhung doan noi ma càu tao long léo va
ò day khoàng lién bào thuc chat da hình thànli. Tai day chat long tu do co thè
v9n chuyén (hình 5b).

Hình 5(b)- Lién két kiéu desmosom
Desmosom co thè tliày trong mot sÓ té bào bièu mO.

15


Hình 5(d)- Lién két kiéu desmosom
Nhung Desmosom va phàn "Khoà" ben canh bé màt chay theo làn song
dà làm cho mÓi lién két chat che hcfn.
Day là càc he phùc tap nhàt, biét hoà ò mùc cao nhàt, de lién két càc té
bào vói nliau, dugc phàn bÓ thành càc diém déu dàn doc theo duòng bién
giùa hai té bào làn càn. Hình trai xoan duòng k(nh lón là 400^500 nm duòng
kùili nhò 190 nm. Truc lón thuòng song song vói tnjc té bào. Cit theo hình
thiróc thg sé thày màng cùa càc té bào làn càn khòng hgp nhàt vói nhau, va
kliòng co tiép xùc truc tiép.

H»C- U - •

V.--

V» i

N

17

'

IJ ••

u!(,^


- Khoàng gian bào là 24 nm, co khi lón tói 50 nm (tniòng hgp desmosom
da dugc biét hoà cao dò) [26].
- Càc thành phàn ngoai té bào: "ào" khoàng gian bào cùa desmosom co
chùa càc chat hoà hoc giÓng nJiU cùa "ào". 0 day "ào" trò nén dàm hon eó
vai trò nhu xi màng gàn càc desmosom vói nhau [31] (hình 5e).

Demosom

Demosom

PHUC HO? CÀC DlEM NOI
GIUA HAI TE BÀO RUÒT

Hình 5(e)- Lién két kiéu desmosom

18


1.1.4. Su phàn chia té bào.

Co hai loai té bào: té bào soma (dinh duong) va té bào sinh dite. Té bào
don cùng nhu té bào trong càc mó cùa ea thè da bào thuòng phAn chia theo
kiéu nguyén phAn vói mot lÀn nhAn dói cùa phAn tu DNA va 4 kì phAn chia:
kì dàu, kì giùa, kì sau va kì cuòi, lui nam 1858 Virchov dà dua ra dinh de nói
tié'ng: *'té bào sinh ra tu té bào eó tiiróe" [5]. Tu té bào con mói dugc sinh ra
bang con duòng trao dói chA't tang truòng kJió'i lugng té bào chat va nhàn dàp
ùng càc boat dòng song. Té bào tàng truòng dén mot mue dò nào dò thi phAn
chia ra thành càc té bào mói [16].
1.2. Trypsin.
Trypsiiì là mot proteaza serin tuyén tuy vói net dac trung cùa chuói peptit
lien quan dén nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ca bàn là arginin va lysin.
Trypsin tinh khiét mot minh thiròng kém hiéu qua trong viéc tàch té bào mó,
vi no ehi ra tmh chon loc ft dÓi vói càc protein gian bào. Trypsin khi co su
két hgp vói chymotrypsin

va elastase thi eó hiéu qua trong viéc tàch mó

nhiéu hon. Hoat tmh cùa trypsin bi

IJTC

che' bòi Ca^^ va Mg^^. Vi vày, trypsin

nén dugc chuAn bi vói sir vAng mat cùa càc muói này.
7.2.7. Càc tién chat cùa enzym
PhÀn lón càc enzym dirgc tóng hgp thành càc phàn tu enzym eó boat tinh,
nlìtrng co nhiìng enzym dugc tóng hgp qua 1 dang trung gian khóng eó boat
tùih xùc tac goi là zymoenzym hay proenzym. Dò là nhung tién chA't de tao
(hành enzym, chù khóng phài là enzym thue su. Nhung chà't này phài trai qua
I qua trình bién dói, sAp xép hai cA'u trùc phAn tu mói trò thành enzym hoat

tinh. Qua trình dò bao góm su thùy phAn lién két peptit, loai bò 1 vài doan
peptit co tàc dung kìm hàm hocit dóng hoàc bao vAy che lA'p trung tAm hoat

19


dóng cùa enzym. Do dò ma phàn tt!r khÓi cùa enzym eó boat tinh thuòng nhò
hon phàn tu khÓi cùa ehinh tién chat tao ra no. Qua trình này ggi là su boat
hoà zymogen va nguòi ta cho ràng ehinh qua trình này da làm bóc lo hoàc da
tao ra tàm boat dòng cùa enzym. Qua trình hoat hoà eó thè là qua trình tu xùc
tàc hoàc do 1 enzym khàc xùc tàc [1].
Hoat dòng cùa trypsin là hién tugng tóng hgp ra càc zymogen eó mot y
nghTa sinh hoc quan trong, eó thè nói ràng, càc proteaza trong óng tiéu hoà
dugc tóng hgp qua giai doan tmng gian nhu vày ehinh là mot ca che tu bào
ve cùa ca thè vi néu khòng nhu vày thi ehinh càc tuyén da tóng hgp nén càc
loai enzym này sé bi tiéu hùy bòi ehnih nhung enzym do chùng tóng hgp nén
[6].
Ò loài ngiròi va nhiéu locii dóng vàt eó vù, càc enzym thuy phàn protit
(proteaza) trong óng tiéu hoà déu dugc tóng hgp ra duói dang tién chat cùa
enzym. Vi du trypsinogen cùa tuyén tuy là tién chat cùa trypsin. Càc chat này
déu ehi duge boat hoà thành dang enzym boat dóng sau khi da tié't vào long
óng tiéu hoà. Trypsinogen duge hoat hoà thành trypsin duói tàc diing cùa
chuìh trypsin hoàc enterokinaza.
7.2.2. llogt hoà

trypsinogen.

Su phAn lAp tinh khiét trypsinogen va trypsin cùng nliu su nghién cuu
dóng hoc cùa qua trinh hocit hoà trypsinogen thành trypsin dà dugc thirc hién
long lai trong truòng phài cùa Northrop. Trypsinogen tinh thè eó thè boat hoà

bang ehmh trypsin va nhu vày vói nhùng diéu kién thieh hgp, qua trình tu xùc
tàc dà dugc thue hién. Trypsinogen cùng duge boat hoà bang enterokinaza,
mot enzym thùy phàn protit eó trong dich tié't cùa ruót va 1 sÓ enzym tuang
tu tu nguón góc khàc nhau, vi dii nhu "kinaza^' cùa penicillinum sp. TA't cà
càc triròng hgp déu san xuA't ra cùng 1 loai trypsin.

20


Trong qua trình tu xùc tàc, co thè xày ra 2 phàn ùmg canh tranh nhau: mot
phàn ung (a) tao thành trypsin eó boat tinh va 1 phàn ùmg (b) tao thành 1
protein khóng eó hoat tinh enzym, su phàn phÓi pepsinogen cho 2 phàn ùng
này phu thuóc vào pH va sii eó mat cùa 1 sÓ ion. Ion Ca^^ làm tàng cuòng
phàn ung (a) va ngàn chàn phàn ung (b). Ké't qua là khi co màt 0,02 mol
CaClj va dugc khòi dàu vói sir eó mat cùa 1 lugng nliò (vét) enterokinaza thi
phàn ung sé xày ra nhu 1 qua trình tu xùc tàc thuàn nhà't. Ion Ca""^ va pH thàp
sé làm tàng hiéu suA't enzym eó hoat tinh, nhung ò pH thàp thi toc dò boat
hoà kém [2].
Hai phàn ung Ccinh tranh nhau trong qua trình hoat hoà trypsinogen eó thè
biéu thi nhu sau:
Trypsin
Trypsinogen

^
*-

.

Trypsni + Hcxapcpiil

(a)

Hoac "kina/a"

Trypsinogen

irypsin ^

Protein khóng co hoat tinh enzym

(b)

Kinaza cùa nàm mÓc eó su khàc biét rò lét vói càc "kinaza'' khàc ò ebÓ là
nò hoat dòng trong dung dich axit (pH thieh hgp nhà't vào khoàng 3,5) ma a
pH do trypsin khóng hoat dóng duge, do dò trong truòng hgp này su hoat hoà
khòng phài là hién tugng tu xùc tàc.
Trypsinogen cùa bò eó phAn tu khói vào khoàng 24.000 va trypsin cùa bò
eó phAn tu khói nhò han mot ehùt, nguòi ta cùng phàt hién thày 2 loai phAn
tu này eó su khàc biét nhau ve hA'p thu quang phó (tia tu ngoai). Mói loai
phAn tu ké trén déu chi do mot ehuói polypeptit càu tao nén va eó thè phàt
hién dugc nhóm a-amino tAn cùng, nhung khòng phàt hién dugc nhóm C tàn
l^ang eàch su dung eaeboxylpeptitaza. Diéu dò eó thè là do cA'u trùc vòng a
dàu này, nhung do su càn tra khóng gian nào do nén eaeboxylpeptitaza

21


khóng tàc dóng dugc. Nguòi ta da chung minh ràng, mot doan 6 axit amin dà
tàch ra khòi trypsin trong qua trình boat hoà va nguòi ta cùng phàn làp duge
1 hexapeptit góm 6 axit amin (Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Su loai bò

hexapeptit dà làm cho phàn tir thay dói hình dang khòng gian va eó le vi thè
da tao diéu kién cho su hình thành tàm boat dòng cùa enzym [1]. Trypsin
dugc boat boa bòi enteropeptitaza. Trypsin là mot chat khòi dàu thóng dung
cùa càc zymogen tiiy tang. Nò duge tóng hgp khi trypsinogen zymogen
khóng boat dóng va phài duge boat hoà bòi ehinh nò. Enzym hoat hoà trypsin
dugc ggi là enteropeptitaza, enzym thùy phàn protein nàm trong tà tràng. Nò
xùc tàc cho qua trình tàch doan chuói polypeptit ò trypsinogen giua góc
Lysin 6 va Isoleucin 7.
Su do niò tà su bién dói trypsinogen cùa bò thành trypsin

-f- Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys - ILcu-Val-Gly^

Peptit

Trypsin

Trén sa dò này, nguòi ta thà'y lién ké't peptit giua Lysin va Isoleucin dà bj
bé gay trong qua trình boat hoà.
Ngoài ra, nguòi ta cùng nghién cuu su boat boa cùa nhiéu trypsinogen tu
tuy cùa dòng vAt khàc. Trong khi boat hoà trypsinogen tiiy Ign, nguòi ta thà'y
oetapeptit (-Phe-Thr-Pro-Asp 4-Lys-) da duge giài phóng ra. Khóng gió'ng
nhu triròng hgp cùa bò, nguòi ta dà xàc dinh duge axit amin C tàn cùa
trypsinogen trong tiiy ign va xàc dinh dirge chuói thu tu ò dAu này là Ala-Asp
(NH^ hoac là Ileu-Ala-Glu (NH^). Trong qua trình bién dói trypsinogen
thành trypsin, dAu C tàn cùng cùa chuói khóng bi bién dói [1].

22


1.2.3. Dàc diém cùa trypsin - Ca che thùy phàn protein, dnh huong cùa

nhiet do va pH dai vói trypsin
a. Dac diém, càu truc cùa trypsin.
- Dàc diém.
Qua trình thùy phàn protein trong ruót dóng vàt eó vù duge dién ra trong
truc tràng a pH gàn = 6 bòi càc thành phàn chùa enzym eó trong qua trình
tié't ra dich tiiy. Qio dé'n khi eó su biéu hién cùa nhiéu locii protein hocit dòng
trong dich tuy, tbì nguòi ta vàn tin ràng qua trình này ehi chua duy nhA't I loai
proteaza, co tén là trypsin. Hón hgp cùa càc enzym thùy phAn protein trong
dich tiiy eó thè duge bÓ nbiém mot eàch thieh hgp han bòi tiiy tang, trypsin
dirge An dinh cho mot trong càc proteaza, va chymotrypsin dugc An dinh cho
mot proteaza khàc. Su hién dién cùa mot proteaza khàc trong tiiy tang dugc
chi ra do viéc tìm thày mot loai enzym (enzym dàn hói) ma xuàt hién tuang
dói dac trung trong qua trình làm giàm su dàn hói, mae dù càc protein khàc
cùng bi thùy phAn bòi enzym này. Han nùa, chùng eó là rat ro ràng cho su
tón tai cùa tnót "protaminaza" tuy tang [16].
- Càu trùc.
Càu trùc cùa chymotrypsin, trypsin va elastaza là tuang tu nhau, ea che
xùc tàc cùa chùng cho qua trình thuy phAn càc ehuÓi peptit là gàn nhu giò'ng
hét nhau. Ba loai proteaza serin này chi khàc nhau a 1 vài màt xich trén bé
mat va net dac tiirng ve góc cùa chùng. Chymotrypsin xùc tàc cho qua trình
thùy phAn càc chuói peptit ve phfa C tàn cùa càc chuói ben hydrophobic lón.
Trypsin xùc tàc cho qua trình thùy phàn cùa càc chuói peptit ve phia C tàn
cùa càc chuói ben ca bàn cùa arginili va lysin. Elastaza thuòng xùc tàc cho

23


qua trình thùy phàn cùa càc chuói peptit trong dò 1 glycin hoàc 1 phàn cùa
alanin bó sung cho phàn axyl [13] (hình 6).

ehymofryp

Mnogen

Hình 6- Sa dò càu trùc phàn tir cùa Chymotrypsinogen A va Trypsinogen.
b, Ca che thuy phàn protein
Trypsin eó dang tinh thè do Kunitz va Narthrop phàt hién, eó khÓi lugng
phàn tu klioàng 24000 va c6 diém ding dién ò pH =10,5, nò tàn cóng dugc
vào càc protein. Vi dii Casem boat dòng tÓi uu ò pH = 8, màc dù mot sÓ qua
trình tliuy phàn protein co thè dién ra Ò pH thàp = 6 [7]. GiÓng nhu pepsin,
trypsin dugc tìm thày là mot endopeptidaza ma co tàc dung tói càc lién két
CO-NH trong càc co chat tÓng hgp cùa càc càu trùc don giàn. Tu càc nghièn
cuu này cùa Bergmann va cOng su, nguòi ta di dén két luàn ràng net dàc
tnrng cùa trypsin là truc tiép tliùy phàn càc lién két peptit de tao thành dufti
L-arginin hoàc L-lysùi làm cho hàm lugng nhóm cacbonyl tàng lén. Do vSy,

24


càc ca chat tóng hgp eó thè phù hgp cho trypsin tinh thè là benzoyl-Larginamit hoàc benzoyl-L-lysinamit, càc chat này bj kbir amin va làn lugt tao
thành benzoyl-L-arginin va benzoyl-L-lysin. Su thay thè càc duói axit amin
bang càc chà't khàc nhau tao ra hgp chat chiù dugc tàc dung cùa trypsin [29].
Trypsin tinh thè cùng thùy phàn càc protamin va càc peptitlysin tÓng hgp
dugc tao bòi càc phàn ung tiìing hgp. Trypsin tinh thè eó thè co tàc dung tói
càc lién ké't este cùng nhu tói càc lién ké't amit, vói diéu kién là eó càc yéu
càu dàc biét khàc cùa enzym ma dà de càp a trén. Nhu vày, trypsin thùy phàn
benzoyl-L-arginin methyl este, nhung khóng thùy phàn benzoyl-L-leuein
metyl este, trong khi dò chymotrypsin eó khà nàng thùy phàn tà't cà càc lién
két este [19J.

H2N

C

NH

NH2

{Cìhh

(CTl2)4

Q,H,,CO-NH(^HCX)-Ì-NH2-a a

Cr,HsCX)-NHCHC04-NH2-a a

Il

HN

I

I '

Benzoyl-L-arginamit
H2N

Benzoyl-L-Lysinamit
C

NH

I

I

HN
(CH2)3
QHsCO-NHCHCO-foCH,
Benzoyl-L-arginin metyl este
Dàc trirng ciìa trypsin dò'i vói cac lién ké't co duói arginin hay lysin là
khòng chi ap dung dói vói cac co chat tóng hcfp ma con cà vói càc protein, do
vay, viéc tao ra enzym nhy là chft't phàn ihig vó cijng già tri trong viéc nghién
cuu càc chuói aminoaxid trong càc mach polypeptit phuc tap [23].
7

e. Anh huòiig cùa nhiet dò va pll ddi vói trypsin.
- Anh buòne cùa nhiét dò.

25