Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của bò nuôi tại tỉnh Hà Giang và bò hoang dã ở Việt Nam bằng các kỹ thuật di truyền phân tử : Luận án TS. Sinh học: 62 42 70 01

MỤC LỤC

CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH................................................................................vi

MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................4
1.1. ĐA DẠNG DI TRUYỀN ..............................................................................4
1.1.1. Khái niệm ...............................................................................................4
1.1.2. Tầm quan trọng của đa dạng di truyền ....................................................4
1.1.3. Bảo tồn sự đa dạng di truyền...................................................................5
1.2. PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN ..............................5
1.3. KỸ THUẬT MICROSATELLITE .............................................................. 10
1.3.1. Giới thiệu ............................................................................................. 10
1.3.2 Sự phân bố của microsatellite trong cơ thể sinh vật............................... 11
1.3.3. Phân loại microsatellite và các dạng trình tự của microsatellite ............. 12
1.3.4. Vai trò của microsatellite ......................................................................13
1.3.5. Phƣơng pháp xác định microsatellite .................................................... 14
1.4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA) 16
1.5. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ NUÔI ....................................................... 18
1.5.1. Sự phân loại bò nuôi ............................................................................. 18
1.5.2. Nguồn gốc thuần hoá bò nuôi ............................................................... 21
1.5.3. Sự đa dạng và phân bố của bò nuôi ngày nay ........................................ 22
1.6. ĐẶC ĐIỂM QUẦN THỂ BÕ NUÔI Ở TỈNH HÀ GIANG ......................... 23
1.6.1. Điều kiện địa lý, xã hội của tỉnh Hà Giang ............................................ 23
1.6.2. Đặc điểm quần thể bò nuôi ở tỉnh Hà Giang......................................... 24
1.7. NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÕ NUÔI TRÊN
THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ......................................................................25
1.7.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền của bò nuôi trên thế giới ........................ 25
1.7.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền của vật nuôi nói chung và của bò
nói riêng ở Việt Nam ......................................................................... 28

1.8. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÕ RỪNG (BOS
JAVANICUS) ................................................................................................ 29
1.8.2. Đặc điểm và sự phân bố của bò tót (Bos gaurus) ..................................30
1.8.3. Hiện trạng và sự phân bố bò tót ở Việt Nam ......................................... 32
1.8.4. Đặc điểm và sự phân bố của bò rừng (Bos javanucus) .......................... 35
1.8.5. Hiện trạng và sự phân bố bò rừng ở Việt Nam ......................................36
1.9. NHỮNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Ở BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG ........... 39
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 41
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .....................................................................41
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 41
2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu đối với quần thể bò nuôi tại Hà Giang ........... 41
2.2.1.1. Thu thập mẫu .................................................................................. 41
2.2.1.2. Tách chiết ADN .............................................................................. 41
2.2.1.3. Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân .................... 42

iv


2.2.1.4. Phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể ................... 45
2.2.1.5. Phƣơng pháp phân tích thống kê ..................................................... 46
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu đối với quần thể bò hoang dã ..................... 50
2.2.2.1. Thu thập mẫu .................................................................................. 50
2.2.2.2. Tách chiết ADN từ mẫu phân.......................................................... 51
2.2.2.3. Xác định sự ảnh hƣởng của một số yếu tố bảo quản mẫu phân đến kết
quả tách chiết ADN...........................................................................52
2.2.2.4. Xác định loài và giới tính ................................................................ 53
2.2.2.5. Phân tích đa dạng di truyền ............................................................. 54
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 56
3. 1. ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ NUÔI TẠI HÀ GIANG .......... 56
3.1.1. Tính đa dạng về kiểu hình .....................................................................56

3.1.1.1. Đa dạng về màu sắc lông ................................................................ 56
3.1.1.2. Đa dạng về hình dáng sừng ............................................................. 56
3.1.2. Tính đa dạng về di truyền .....................................................................57
3.1.2.1. Kết quả phân tích kích thƣớc alen của các locút microsatellites ......57
3.1.2.2. Tính đa hình của các locút microsatellites ....................................... 61
3.1.2.3. Tính đa dạng di truyền và cân bằng Hardy-Weinberg..................... 61
3.1.2.4. Tính đa dạng và sự sai khác di truyền giữa các quần thể bò phân bố ở
các huyện ....................................................................................... 66
3.1.2.5. Mối tƣơng quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý .70
3.1.2.6. Đặc điểm cấu trúc di truyền quần thể bò nuôi ở Hà Giang............... 71
3.1.2.7. Tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể ............................................... 75
3.1.2.8. Mối quan hệ di truyền của bò ở Hà Giang với một số quần thể bò
khác ............................................................................................... 77
3.2. ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG ... ............ 81
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN ........................................................................ 81
3.2.2. Ảnh hƣởng của mốt sô yếu tố bảo quản mẫu đến kết quả tách ADN .....85
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản mẫu phân .................................85
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của dung dịch bảo quản đến kết quả tách chiết ADN ....86
3.2.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản mẫu phân ..................................87
3.2.3. Kết quả xác định loài ............................................................................ 87
3.2.4. Kết quả xác định giới tính .....................................................................92
3.2.5. Đa dạng di truyền của quần thể bò tót ................................................... 93
3.2.6. Đa dạng di truyền của quần thể bò rừng .............................................. 100
KẾT LUẬN ...................................................................................................... 1045
ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................... 106
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ......................................... 107
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 108

v

CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ADN:

Deoxyribonucleic acid (một dạng vật chất di truyền)

PCR:

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

SSCPs:

Single Strand Conformation Polymorphisms (đa hình cấu trúc sợi đơn)

AFLPs:

Amplified Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài các đoạn
nhân chọn lọc)

SNP:

Single Nucleotide Polymorphisms (đa hình các đơn nucleotid)

RFLP:

Restriction Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài các đoạn cắt
enzyme giới hạn)

RAPD:

Random Amplified Polymorphic DNA (đa hình độ dài các đoạn ADN
nhân ngẫu nhiên)

VNTR:

Variable Number of Tandem Repeats (chỉ các vùng của hệ gen đặc trƣng
bởi sự lặp lại của cùng một trình tự ADN)

MPX:

Multiplex PCR (phản ứng PCR đa mồi)

FAO :

Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lƣơng thế giới)

IUCN:

International Union for Consevation of Nature (Tổ chức bảo vệ tài nguyên
thiên nhiên quốc tế)

ISAG:

International Society of Animal Genetis (Hội di truyền động vật quốc tế)

EDTA:

Ethylen-Diamin-Tetra-Acetic acid

Bp:

Base pair (cặp bazơ)

Cyt b:

Cytochrome b (một gen trên phân tử ADN ty thể)

D-loop:

Displacement loop (vùng điều khiển trên phân tử ADN ty thể)

NJ:

Neighbor – Joining Method (phƣơng pháp liên kết nhóm liền kề)

UPGMA: Unweighted Paired Group Method of Arithmetic Average

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH TRONG LUẬN ÁN
Các bảng
Bảng 1.1: Đặc điểm của một số kỹ thuật phân tử đối với việc đánh giá đa dạng di
truyền ......................................................................................................9
Bảng 1.2:Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở vật nuôi sử dụng kỹ thuật
microsatellite. ........................................................................................ 16
Bảng 2.1: Một số thông tin về 30 cặp mồi microsatellite sử dụng nghiên cứu ........ 43
Bảng 2.2: Công thức tính các giá trị thống kê của quần thể ....................................47
Bảng 2.3: Địa điểm thu thập các mẫu sinh học của bò hoang dã ............................ 51
Bảng 2.4: Các điều kiện bảo quản mẫu phân bò để xác định các yếu tố ảnh hƣởng

đến kết quả tách chiết ADN ...................................................................52
Bảng 3.1: Số lƣợng alen và khoảng kích thƣớc alen của các locút microsatellite
nghiên cứu ở quần thể bò Hà Giang ....................................................... 62
Bảng 3.2: Tần số di hợp tử lý thuyết (Hep), quan sát (Hob), hệ số cận huyết (Fis) và
kết quả kiểm tra từng locút microsatlite với giả thiết không cân bằng di
truyền Hardy-Weinberg ......................................................................... 63
Bảng 3.3: So sánh tính đa dạng di truyền của quần thể bò ở Hà Giang với một số kết
quả nghiên cứu trên các quần thể bò khác .............................................. 65
Bảng 3.4: Tần số di hợp tử lý thuyết (Hep), tần số dị hợp tử quan sát (Hob), trung
bình số alen trên một locút (K), hệ số đồng huyết (Fis), kiểm định với giả
thiết không tuân theo định luật di truyền Hardy- Weinberg ở các quần thể
bò ở 8 huyện .......................................................................................... 66
Bảng 3.5: Ma trận sai khác di truyền (FST) giữa các quần thể bò ở 8 huyện............ 67
Bảng 3.6: Ma trận khoảng cách di truyền (Ds) giữa các quần thể bò phân bố ở 8
huyện theo Nei (1972) ........................................................................... 68
Bảng 3.7: Tỷ lệ hệ gen bò tại các xã nghiên cứu đƣợc chỉ định thuộc nhóm 1 và 2.
.............................................................................................................. 73
Bảng 3.8: Ma trận khoảng cách di truyền giữa các quần thể....................................77
Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân bò hoang dã ........... 83
Bảng 3.10: Ma trận khoảng cách di truyền giữa một số nhóm bò tót ...................... 99
Bảng 3.11: Ma trận khoảng cách di truyền giữa bò rừng mang các kiểu haplotype
khác nhau ............................................................................................ 101

vii


Các hình
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử ADN ty thể của bò nuôi............................................... 17
Hình 1.2: Hệ thống phân loại của bò nuôi, bò hoang dã và một số loài liên quan ... 19
Hình 1.3: Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng cổ .................................................... 20

Hình 1.4: Sự phổ biến của bò thuần hoá ở khắp nới trên thế giới cổ sinh .. ............ 22
Hình 1.5: Sự phân bố các loại bò ngày nay ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu ........ 23
Hình 1.6: Hình ảnh cá thể bò tót (Bos gaurus) tại Thảo Cầm Viên ........................ 31
Hình 1.7. Bản đồ phân bố bò tót ở một số khu vực trên thế giới ............................ 33
Hình 1.8: Bản đồ phân bố bò tót ở Việt Nam ........................................................ 34
Hình 1.9: Hình ảnh bò rừng (Bos javanicus) .......................................................... 35
Hình 1.10: Bản đồ phân bố bò rừng ở một số khu vực trên thế giới ....................... 37
Hình 1.11: Bản đồ phân bố bò rừng ở Việt Nam ................................................... 38
Hình 2.1: Vị trí các địa điểm thu mẫu sinh học bò nuôi tại tỉnh Hà Giang .............. 42
Hình 2.2: Hệ thống máy giải trình tự CEQ8000 .................................................... 44
Hình 3.1: Biểu đồ phân bố sự đa dạng màu sắc lông của quần thể bò ở Hà Giang .. 56
Hình 3.2: Biểu đồ phân bố sự đa dạng hình dáng sừng của quần thể bò ở Hà Giang
.............................................................................................................................. 57
Hình 3.3: Một số kết quả phân tích kích thƣớc alen của các locút microsatellite .... 60
Hình 3.4: Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các quần thể bò ở 8
huyện dạng có gốc (rooted tree)............................................................. 69
Hình 3.5: Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các quần thể bò ở 8
huyện dạng không gốc (unrooted tree) ................................................... 69
Hình 3.6: Tƣơng quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách đại lý .............. 70
Hình 3.7: Kết quả phân tích khả năng phân chia thành các nhóm trong quần thể bò ở
Hà Giang .............................................................................................. 71
Hình 3.8: Sự phân bố cấu trúc di truyền 2 nhóm bò (quần thể phụ) ở tỉnh Hà Giang
.............................................................................................................................. 74
Hình 3.9: Sự đa dạng trình tự vùng D-loop ty thể của 67 mẫu bò .......................... 76
Hình 3.10: Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền của 67 mẫu bò .............. 80
Hình 3.11: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR vùng D-loop ở bò hoang dã........ 82
Hình 3.12: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR với cặp mồi giới tính .................. 82
Hình 3.13: Biểu đồ kết quả phản ứng PCR xác định giới tính đối và thời gian bảo
quản mẫu ............................................................................................... 86
Hình 3.14: So sánh trình tự ADN đoạn gen Cytochrome b giữa bò nuôi, bò tót và bò

rừng ..................................................................................................... 89
Hình 3.15: So sánh trình tự ADN vùng D-loop giữa bò nuôi, bò tót và bò rừng ..... 91
Hình 3.16: So sánh trình tự ADN giữa các kiểu haplotype ở quần thể bò tót .......... 98
Hình 3.17: So sánh trình tự ADN giữa các kiểu haplotype ở quần thể bò rừng..... 103
Hình 3.18: Cây phân loại di truyền giữa bò tót, bò rừng, bò Tây Tạng, bò rừng Châu
Âu và bò nuôi.. .....................................................................................104

viii


MỞ ĐẦU
Đánh giá tính đa dạng và những đặc điểm di truyền của quần thể, giống vật
nuôi và động vật hoang dã ở mức độ phân tử đƣợc coi là công việc mở đầu và rất
cần thiết đối với một chƣơng trình bảo tồn [88]. Chính vì vậy, từ những năm 1990
tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO) đã xây dựng một chƣơng trình tổng thể sử dụng
các kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền trong bản thân một
quần thể và giữa các quần thể vật nuôi nhằm định hƣớng cho việc quản lý, bảo tồn
và sử dụng nguồn gen động vật nuôi trên toàn cầu.
Trong những năm gần đây, các phƣơng pháp sinh học phân tử đã đóng một vai
trò quan trọng trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và đa dạng di truyền.
Nhiều kỹ thuật di truyền phân tử đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di
truyền nhƣ: RFLP, RAPD, minisatellites, microsatellites và phân tích đa hình hệ
gen ty thể. Trong đó, kỹ thuật microsatellite và phân tích trình tự hệ gen ty thể đã
nhanh chóng trở thành những kỹ thuật hữu hiệu và đƣợc sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu di truyền quần thể ở nhiều loài vật nuôi và hoang dã khác nhau.
Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng tài nguyên thiên nhiên sinh
vật cao. Tuy nhiên, tính đa dạng của hệ động vật ở Việt Nam, đặc biệt là một số
quần thể vật nuôi bản địa ở các khu vực miền núi và quần thể động vật hoang dã có
giá trị sinh học và di sản đang bị đe doạ do nền kinh tế thị trƣờng phát triển và khai
thác, sử dụng quá mức của con ngƣời.

Bò nuôi ở Hà Giang là một trong những giống vật nuôi bản địa đƣợc thuần
hoá, chọn lọc, nuôi dƣỡng từ lâu đời của ngƣời H’mông vì vậy chúng đáp ứng tốt
với điều kiện khí hậu khô rét của vùng cao và rất có giá trị về văn hoá đồng thời
mang tính đặc hữu của tỉnh Hà Giang. Tuy nhiên, do hệ thống chăn nuôi thâm canh,
nhập giống ngoại có năng suất cao đƣợc đầu tƣ lớn đã dẫn đến nguy cơ mất đi giống
bò này.
Bên cạnh đó, hai loài bò hoang dã là bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos
javanicus), ngoài những giá trị sinh học nội tại còn là giá trị di sản đối với quốc gia

1


và là những nguồn gen quý cần đƣợc bảo tồn. Nhƣng do nạn săn bắt trái phép, phá
huỷ môi trƣờng sống và dịch bệnh đã dẫn đến tình trạng suy giảm nhanh các loài bò
hoang dã này. Số lƣợng bò tót trên cả nƣớc đã giảm xuống mức rất thấp, còn
khoảng 300 cá thể. Trong khi đó, số lƣợng bò rừng chỉ còn khoảng dƣới 100 cá thể.
Hiện nay, hai loài bò hoang này đang đứng bên bờ tuyệt chủng và rất có thể chúng
sẽ chịu chung số phận với loài bò xám (Bos sauveli), ngày nay đã bị coi là tuyệt
chủng ở Việt Nam.
Hiện tại, bò H’mông nuôi tại Hà Giang và hai loài bò tót và bò rừng hoang dã
là những đối tƣợng đƣợc bảo tồn đặc biệt của các chƣơng trình và dự án bảo tồn cấp
Quốc gia. Vì vậy, những thông tin về hiện trạng di truyền của các quần thể bò này
là rất cần thiết và quan trọng để hoạch định các chiến lƣợc bảo tồn bền vững. Xuất
phát từ ý nghĩa thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính
đa dạng di truyền của bò nuôi tại tỉnh Hà Giang và bò hoang dã ở Việt Nam bằng
các kỹ thuật di truyền phân tử”
Mục đích của đề tài
Xác định tính đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của bò nuôi tại tỉnh Hà
Giang ở mức độ phân tử làm cơ sở cho việc hoạch định kế hoạch chọn lọc, lai
tạo, phát triển và bảo tồn lâu dài.

Sử dụng các công cụ phân tử để xác định tính đa dạng di truyền của quần thể bò
tót và bò rừng hoang dã đang tồn tại ở một số khu vực của Việt Nam từ các mẫu
phân sinh học nhằm phục vụ cho việc xây dựng những hoạt động bảo tồn phù
hợp.
Nội dung nghiên cứu của đề tài
Sử dụng kỹ thuật microsatellite phân tích tính đa dạng di truyền và cấu trúc di
truyền của quần thể bò nuôi tại tỉnh Hà Giang.
Phân tích tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể ở bò nuôi tại Hà Giang sử dụng kỹ
thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop.

2


Chuẩn hoá phƣơng pháp và tách chiết ADN từ các mẫu phân sinh học của các
mẫu bò hoang dã.
Xác định loài và giới tính từ các mẫu phân.
Xác định tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể ở quần thể bò tót và bò rừng sử
dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá
tính đa dạng và cấu trúc di truyền ở bò nuôi và bò hoang dã phục vụ cho mục đích
bảo tồn đƣợc thực hiện ở Việt Nam. Lần đầu tiên ứng dụng các kỹ thuật sinh học
phân tử để tiến hành nghiên cứu di truyền trên quần thể bò tót và bò rừng từ các
mẫu sinh học đƣợc thu thập một cách gián tiếp không gây ảnh hƣởng tới con vật
nhƣ các mẫu phân, lông.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những thông tin cần thiết về những
đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử, góp phần làm cơ sở khoa học cho việc xây
dựng các kế hoạch bảo tồn quần thể bò nuôi tại Hà Giang và hai loài bò hoang dã là
bò tót và bò rừng ở Việt Nam.

3


CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐA DẠNG DI TRUYỀN

1.1.1. Khái niệm
Đa dạng di truyền là một mức độ của đa dạng sinh học liên quan tới toàn bộ
những đặc điểm đƣợc quy định bởi bản chất di truyền của một loài hay nói một cách
khác nó liên quan đến bất kỳ sự thay đổi nào đó ở mức độ nucleotide, gen, nhiễm
sắc thể hay toàn bộ hệ gen của các cơ thể sinh vật.
Thông thƣờng trong tự nhiên các cá thể của hầu hết các quần thể của các loài
đều rất đa dạng về mặt di truyền. Một số giả thiết đƣợc đƣa ra để giải thích về sự đa
dạng di truyền của quần thể nhƣ: i) Thuyết tiến hoá tự nhiên giả thiết rằng sự đa
dạng là kết quả của sự tích luỹ những thay thế các alen một cách tự nhiên, ii) Sự
chọn lọc đa dạng hoá với giả thiết hai quần thể phụ (subpopulation) của một loài
sống ở hai điều kiện môi trƣờng khác nhau chọn lọc các alen khác nhau tại một
locút nào đó, iii) Chọn lọc phụ thuộc vào tần số là sự chọn lọc nhằm vào các alen
hiếm để giữ chúng tồn tại trong quần thể. Vì vậy, nghiên cứu di truyền quần thể là
nghiên cứu về số lƣợng tần số alen, tần số kiểu gen và các dạng áp lực duy trì hoặc
biến đổi tần số alen và các kiểu gen cụ thể trong quần thể (Đỗ Lê Thăng và cộng sự
2007) [13].

1.1.2. Tầm quan trọng của đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền đóng một vai trò quan trọng đối với sự tồn tại và đáp ứng
của một quần thể. Khi điều kiện môi trƣờng của quần thể thay đổi, những đột biến
về gen là cần thiết cho sự đáp ứng và tồn tại của chúng. Một quần thể có mức độ đa

dạng di truyền lớn sẽ có có nhiều sự lựa chọn các alen thích hợp nhất, trong khi đó
những quần thể có độ đa dạng thấp sẽ đối mặt với sự nguy hiểm cao.

4


Đa dạng di truyền sẽ làm ổn định tính sinh sản tốt của quần thể. Một quần thể
có mức độ đa dạng di truyền thấp sẽ làm cho khả năng sinh sản trở nên khó khăn và
dẫn đến hiện tƣợng đồng huyết ở thế hệ sau.
Trong nông nghiệp, đa dạng di truyền đóng một vai trò rất quan trọng bởi nó
cung cấp nguồn biến dị cho quá trình chọn lọc để nâng cao năng suất, chất lƣợng
của cây trồng và vật nuôi.
Vì vậy, sự duy trì tính đa dạng di truyền là một trọng tâm chính của việc bảo
tồn sinh học, tổ chức Bảo vệ tài nguyên thiên nhiên quốc tế (IUCN) đã thừa nhận sự
cần thiết đối với việc bảo tồn đa dạng di truyền nhƣ một trong ba vấn đề ƣu tiên bảo
tồn trên toàn cầu (McNeely và cộng sự, 1990) [91].

1.1.3. Bảo tồn sự đa dạng di truyền
Bảo tồn sự đa dạng di truyền chính là sự duy trì đảm bảo tính đa dạng di
truyền của một quần thể hay một giống vật nuôi trong tự nhiên, hạn chế các yếu tố
tác động của môi trƣờng và con ngƣời có thể làm mất tính đa dạng di truyền. Do đó,
khi một chƣơng trình bảo tồn đƣợc thiết lập nhằm bảo tồn sự đa dạng di truyền và
gìn giữ các quần thể của các loài có tính nguy cấp, các nhà sinh học bảo tồn cần
phải biết đƣợc sự đa dạng di truyền đƣợc duy trì nhƣ thế nào trong suốt quá trình tự
nhiên hay nói một cách khác là biết đƣợc những yếu tố nào có thể tác động đến sự
đa dạng di truyền.
Vì vậy, những nghiên cứu nhằm đánh giá các đặc điểm di truyền và tính đa
dạng di truyền của một quần thể hay một giống vật nuôi đặc biệt đối với các các loài
quý hiếm có tính nguy cấp trƣớc khi đƣa ra quyết định bảo tồn là một công việc hết
sức cần thiết và rất quan trọng.

1.2. PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
Đa dạng di truyền có thể đƣợc đánh giá dựa trên nhiều đặc điểm khác nhau
bao gồm: các đặc điểm ngoại hình, protein, ADN hệ gen nhân và ADN hệ gen ty
thể. Trƣớc đây phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền chủ yếu sử dụng các kỹ

5


thuật phân tích sự đa hình protein nhƣng về sau này đƣợc thay thế bởi các phƣơng
pháp phân tích ở mức độ phân tử ADN (Bảng 1.1). Dƣới đây là một số dẫn liệu về
việc sử dụng các phƣơng pháp và kỹ thuật phân tử khác nhau để đánh giá đa dạng di
truyền.
Nghiên cứu đầu tiên về đa dạng di truyền ở mức độ sinh hoá đƣợc Landsteiner
thực hiện vào năm 1901 (trích dẫn của Cavalli-Sforza và cộng sự 1994) [35].
Nghiên cứu mở đầu này đã chỉ ra rằng mỗi cá thể ngƣời thể hiện sự đa dạng di
truyền ở hệ nhóm máu ABO. Kết quả này sau đó đƣợc Hirszfeld và cộng sự (1919),
lần đầu tiên ứng dụng để nghiên cứu sai khác di truyền ở các nhóm ngƣời khác nhau
(trích dẫn của Cavalli-Sforza và cộng sự 1994) [35]. Tuy nhiên, mãi đến những năm
1960 các nghiên cứu về quá trình tiến hoá dựa vào các kỹ thuật phân tử mới thực sự
đƣợc sử dụng. Năm 1966, lần đầu tiên tính chất đa hình tự nhiên của protein đƣợc
chứng minh bởi Harris (1966), Lewontin và Hubby (1966) [49], [74]. Các nhà khoa
học này đã sử dụng phƣơng pháp điện di protein để xác định enzym hoặc các sản
phẩm protein của các gen riêng biệt. Những nghiên cứu ban đầu trên đƣợc tiến hành
trên hai loài sinh vật rất khác nhau (ruồi giấm và ngƣời) đã cho thấy rằng hệ gen
động vật chứa đựng sự phong phú về đa dạng di truyền. Kết hợp những kết quả thực
nghiệm với các nghiên cứu lý thuyết đã dẫn đến hình thành lý thuyết về tiến hoá
phân tử (Kimura, 1968a) [66]. Những nghiên cứu về đa hình allozyme với những
thay đổi và cải tiến đã trở thành công cụ chuẩn để đánh giá đa dạng di truyền sinh
hoá trong vòng 20 năm sau đó.
Sử dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá sự khác nhau ở mức độ ADN đƣợc phát

triển lần đầu tiên vào những năm 1960, ban đầu kỹ thuật này dùng để nghiên cứu hệ
gen của các sinh vật nhân sơ (Britten và Kohne, 1968) [30] sau đó đƣợc ứng dụng
cho vấn đề tiến hoá phân tử và hệ thống học. Kỹ thuật này là phép lai giữa hai phân
tử ADN (DNA*DNA hybridization). Trong những năm 1980 kỹ thuật lai ADN đƣợc
sử dụng để xác định quan hệ nguồn gốc của một số loài, chủ yếu ở các loài chim
(avian) và các loài thú giống ngƣời (hominoid) (Sibley và Ahlquist, 1990) [117],
[118]. Tuy nhiên, trong những năm gần đây kỹ thuật này ít đƣợc sử dụng do những

6


khó khăn trong quá trình tiến hành thí nghiệm, hơn nữa do sự thay thế bởi các
phƣơng pháp mới thuận tiện hơn dựa trực tiếp trên trình tự ADN (Avise, 1994) [16].
Sinh học phân tử đã phát triển rất nhanh do việc hiện ra enzym giới hạn ở vi
khuẩn, các enzym giới hạn này có thể cắt hai sợi đơn của phân tử ADN tại những
trình tự nucleotide đặc thù (Meselson và Yuan, 1968) [94]. Hiện tại, hàng trăm loại
enzym giới hạn đã đƣợc xác định và chúng đã chứng tỏ cho thấy là những công cụ
hữu ích đối với các nghiên cứu về tiến hoá phân tử và di truyền quần thể. Kết hợp
với kỹ thuật lai ADN (southern hybridisation) chúng đã cung cấp một phƣơng pháp
rất hiệu quả để nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức độ phân tử. Sự đa hình ở mức
độ trình tự ADN có thể đƣợc quan sát bởi sự thay đổi trong các dạng cắt các phân
đoạn ADN khi đƣợc xử lý với một enzym giới hạn nào đó. Kỹ thuật đa hình này
đƣợc gọi là đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLPs) (Bostein và cộng sự, 1980) [25].
Mặc dù kỹ thuật RFLP đã đƣợc sử dụng thành công trong một số các nghiên cứu
tiến hoá phân tử ở hệ gen trong nhân, tuy vậy, hầu hết các nghiên cứu về di truyền
quần thể sử dụng kỹ thuật RFLP thƣờng tập trung vào hệ gen ty thể ở tế bào chất.
Một sự đột phá quan trọng khác của sinh học phân tử xảy ra trong những năm
1970 là sự phát triển phƣơng pháp xác định trực tiếp trình tự của một phân đoạn
ADN sau khi tinh sạch (Maxam và Gilbert, 1977; Sanger và cộng sự, 1977) [90],
[114]. Phân tích trình tự ADN sau đó trở thành một thành phần quan trọng của lĩnh

vực di truyền tiến hóa phân tử. Tuy nhiên, những quy trình thực hiện của phƣơng
pháp này tƣơng đối phức tạp và mất nhiều thời gian do phải nhân dòng và đọc trình
tự trong các vector của vi khuẩn, do vậy phƣơng pháp này đã hạn chế đối với một
số các nghiên cứu cần đánh giá phân loại ở mức độ cao, đặc biệt đối với các loài
càng có quan hệ gần nhau do cần phải thu đƣợc một số lƣợng nhiều dữ liệu.
Sự phát minh ra kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) bởi Mullis và cộng
sự năm 1986 đã thực sự làm thay đổi và đƣa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực
sinh học phân tử [8], [100]. Kỹ thuật này đã làm cho dễ dàng xác định trực tiếp trình
tự ADN từ một số lƣợng lớn các tổ chức cá thể. Đặc biệt, sự ra đời của kỹ thuật

7


PCR đã tác động sâu sắc tới những nghiên cứu về đa dạng trình tự ADN ty thể, cho
phép nghiên cứu trình tự ADN ty thể ở mức độ lớn trong bản thân và giữa các loài
có quan hệ gần gũi. Ngoài ra, sự ra đời của kỹ thuật PCR còn giúp khắc phục những
khó khăn khi tiến hành nghiên cứu di truyền của các quần thể động vật hoang dã do
số lƣợng và chất lƣợng ADN rất thấp đƣợc tách chiết từ các mẫu sinh học thu thập
bằng cách không gây hại cho sinh vật (non-invasive sampling) nhƣ phân, lông.
Trong những năm 1980, các nhà khoa học nghiên cứu về hệ gen đã tập trung
vào một dạng vùng trình tự ADN siêu biến đổi (supervariable), chúng đƣợc xác
định lần đầu tiên bằng phƣơng pháp phân tích lai ADN (southern blot) với các yếu
tố có tính lặp lại ở hệ gen ngƣời và đƣợc gọi là minisatellites (Jeffreys và cộng sự,
1985) [58]. Mỗi đơn vị lặp lại của minisatellite có chiều dài khoảng 16-64 bp.
Phƣơng pháp sử dụng xung quanh kỹ thuật này thƣờng đƣợc gọi là xác định dấu
vân ADN (DNA fingerprinting).
Mặc dù chỉ thị minisatellite có tính đa hình cao, đƣợc phát hiện ở nhiều thực
vật và động vật (bao gồm cả ở bò), tuy nhiên, chƣa có nghiên cứu nào thực sự thành
công khi áp dụng kỹ thuật này vào nghiên cứu về di truyền quần thể. Do tính chất
phức tạp của quá trình đọc kết quả từ các bản điện di do chúng có thể có tới hơn 20

băng khác nhau và khó thu đƣợc kết quả một cách thống nhất giữa các lần phân tích
vì vậy đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu di truyền tiến hóa.
Một phƣơng pháp nữa dựa trên kỹ thuật PCR đã đƣợc phát triển cho phép
nhân bản các vùng VNTR (Variable Number Tanderm Repeats) trong hệ gen
(Jeffreys và cộng sự, 1988) [57]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đã đƣợc thay thế do
sự phát hiện một loại chị thị (marker) mới có thể đƣợc phân tích bằng cách dùng kỹ
thuật PCR và tiện lợi hơn. Chỉ thị này đƣợc phát triển vào cuối những năm 1980 và
đƣợc gọi là microsatellite (Litt và Lutty, 1989; Tautz, 1989; Weber và May, 1989)
[77], [129], [138].
Một loại phân tích di truyền khác cũng đƣợc sử dụng để nghiên cứu di truyền
quần thể trong những năm gần đây là phƣơng pháp phân tích đa hình các đoạn ADN

8


đƣợc nhân bản ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA - RAPD). Phƣơng
pháp này đƣợc miêu tả lần đầu tiên bởi Williams và cộng sự (1990) [141], dựa trên
cơ sở của phản ứng PCR với các mồi ngắn (10 bp) có trình tự ngẫu nhiên để nhân
bản ngẫu nhiên các đoạn trình tự chƣa biết trong hệ gen. Phƣơng pháp này chủ yếu
đƣợc sử dụng để nghiên về di truyền quần thể ở thực vật.
Ngoài ra, còn có một số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR đƣợc phát triển
trong những năm 1990 để phân tích sự đa hình ADN của hệ gen bao gồm nhƣ
SSCPs (single strand conformation polymorphisms), AFLPs (amplified fragment
length polymorphisms), SNP (single nucleotide polymorphisms). Tuy nhiên, các
phƣơng pháp này ít đƣợc áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về tiến hoá và di
truyền quần thể.
Trong số những kỹ thuật phân tử kể trên thì kỹ thuật microsatellite và phân
tích trình tự ADN ty thể là những kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay để
nghiên cứu đa dạng di truyền của các quần thể vật nuôi và động vật hoang dã.
Bảng 1.1: Đặc điểm của một số kỹ thuật phân tử đƣợc sử dụng đánh giá dạng di

truyền

Phƣơng pháp

Nguồn
phân tích

Electrophoresis
(điện di)
Microsatellite
ADN fingerprints
RAPD
AFLP
RFLP
SSCP
Giải trình tự ADN
SNP

Máu, thận,
gan, lá cây
ADN
ADN
ADN
ADN
ADN
ADN
ADN
ADN

Áp dụng cho

các quần thể
hoang dã

Chi phí

Kiểu di
truyền

Không

Thấp

Đồng trội

Có
Không
Có
Có
Không
Có
Có
Có

Trung bình
Trung bình
Trung bình thấp
Trung bình cao
Trung bình
Trung bình
Trung bình

Trung bình cao

Đồng trội
Trội
Trội
Trội
Đồng trội
Đồng trội
Đồng trội
Đồng trội

9


1.3. KỸ THUẬT MICROSATELLITE

1.3.1. Giới thiệu
Thuật ngữ microsatellite đƣợc Litt và Luty giới thiệu vào năm 1989 nhằm chỉ
các trình tự ADN lặp lại một cách liên tiếp (Tandemly repeated DNA sequence), có
độ dài chỉ vài cặp bazơ (2-6 bp), có tính đa hình cao và có thể đƣợc nhân lên bằng
phản ứng PCR.
Các microsatellite phân bố trên toàn bộ hệ gen, tập trung thành những đám
nhỏ (clusters) khoảng < 200bp và đƣợc tìm thấy trong tất cả cơ thể sống đặc biệt là
ở những cơ thể sống có bộ gen lớn.
Bản chất đa hình của microsatellite có thể đƣợc sinh ra do sự nhân bội từ ADN
tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của
vùng lặp lại.
Microsatellite đƣợc gọi bằng một số thuật ngữ nhƣ: các trình tự đơn giản lặp
lại (SSRs), các chuỗi lặp lại có trình tự ngắn (STRs), các dạng chuỗi đơn giản
(SSMs), hoặc các chuỗi lặp lại 2 nucleotide (di-nucleotide repeat), 3 nucleotide (trinucleotide repeat), 4 nucleotide (tetre-nucleotide repeat) phụ thuộc vào độ dài các

đơn vị lặp lại của chúng. Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng sử dụng thuật ngữ
microsatellite để thay thế cho tất cả những thuật ngữ trên và đã đƣợc hầu hết mọi
ngƣời chấp nhận. Microsatellite có tính đa hình rất cao (cao nhất trong tất cả những
dạng trình tự ADN lặp lại có trật tự đã nêu ở trên) và dạng microsatellite có tính đa
hình cao nhất (dạng không bị ngắt quãng) đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích
nghiên cứu khác nhau. Nhƣng trong thực tế thì các microsatellite thƣờng bị ngắt
quãng, hoặc kết hợp giữa các loại trình tự lặp lại. Những chức năng rõ rệt của các
trình tự nhƣ vậy vẫn còn chƣa rõ ràng mặc dù ngƣời ta có tìm thấy chúng tồn tại
giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Nhìn chung, ADN
microsatellite là một dạng phụ của gen, nhƣng đôi khi, nó xuất hiện trong vùng
mang mã của một gen và làm tăng tính đa hình protein, trong một số trƣờng hợp, nó
có thể là biểu hiện bệnh. Ngoài ra, một số dạng cấu trúc bền hơn của trình tự ADN

10


lặp lại cũng đƣợc phát hiện trên gen. Các kiểu microsatellite xuất hiện nhiều hay ít
dọc theo chiều dài hệ gen của động vật nhân chuẩn nhƣng có thể đƣợc biểu hiện khi
nó nằm trong những vùng mang mã. Trong hệ gen microsatellite đƣợc phân bố rất
đều và ngẫu nhiên trên toàn hệ gen, ngƣời ta thấy rằng trung bình cứ 10000
nucleotide thì gặp một trình tự microsatellite.
Những đoạn lặp lại của polyA/polyT là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ
gen nhƣng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau ngoài ra còn có một số kiểu
lặp lại phổ biến khác nhƣ kiểu lặp lại 2 nucleotit nhƣ (CA)/(GT). Các nghiên cứu về
di truyền học và hóa sinh cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là
do sự trƣợt lỗi của enzym polymerase trong quá trình sao chép ADN.

1.3.2 Sự phân bố của microsatellite trong cơ thể sinh vật
Những trình tự của microsatellite đã đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả
hai đối tƣợng thực vật và động vật (Tauz và Renz, 1984; Bell và Ecker, 1994) [128],

[18]. Microsatellite đã đƣợc nghiên cứu lần đầu tiên trên ngƣời (Weber và cộng sự,
1989) và nó đƣợc gọi là thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử [138].
Cho đến nay microsatellite đã đƣợc tìm thấy và sử dụng để phân tích di truyền
học của rất nhiều sinh vật nhân chuẩn (Eukaryot). Ví dụ:
Ở thực vật: Tần số và số lƣợng microsatellite đã đƣợc xác định trên nhiều loại
cây một lá mầm và hai lá mầm (Wang và cộng sự, 1994); trên các cây rừng nhiệt
đới (Condit và Hubell, 1991); cây bắp cải (Lagercrantz và cộng sự, 1993); lúa mì
(Roder và cộng sự, 1995) và 34 giống cây trồng khác (Morgante và cộng sự, 1993)
[98], [137], [36], [71], [112].
Ở động vật: Microsatellite đã đƣợc tìm thấy và phân tích ở nhiều loài gia súc
(Moore và cộng sự, 1991; Moran C, 1993) [96], [97]; ở gia cầm (Crooijmans và
cộng sự, 1992) [38]; ở cá (Estoup và cộng sự, 1993) [43]; ở côn trùng (Tautz và
cộng sự, 1984) [128]; và ở chuột (Kondo và cộng sự, 1993) [70].

11


Những kết quả nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng: có sự khác nhau lớn về sự đa
dạng của nhiều loại microsatellite khác nhau trong cơ thể thực vật và động vật. Ở
thực vật, microsatellite mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với động vật, trong
khi đó ở động vật thì lại mang nhiều microsatellite có trình tự lặp lại kiểu (GT)n
hơn. Bên cạnh đó, Weber và cộng sự (1989) [138] cũng chỉ ra rằng các
microsatellite có trình tự lặp lại kiểu (CA)n lại xuất hiện nhiều trong hệ gen ngƣời
(khoảng 50.000 lần) với chỉ số n vào khoảng từ 10 đến 60 và trong hệ gen của nhiều
loài động vật nhai lại. Dạng lặp lại di-nucleotide đƣợc tìm thấy nhiều ở động vật có
vú chủ yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT, AT/TA. Còn dạng lặp lại tri-nucleotide
và tetra-nucleotide lại thấy xuất hiện phổ biến trong hệ gen ngƣời và trong hệ gen
thực vật, chúng xuất hiện chủ yếu dƣới dạng (AAG)n, (AAT)n.

1.3.3. Phân loại microsatellite và các dạng trình tự của microsatellite

Phân loại microsatellite: Weber và cộng sự (1989) đã phân loại
microsatellite thành 3 dạng chính sau: đoạn lặp lại hoàn hảo (không bị gián đoạn);
đoạn lặp lại không hoàn hảo (bị gián đoạn bởi các base không lặp lại) và đoạn lặp
lại hỗn hợp (kết hợp nhiều loại lặp lại).
Ví dụ:
CACACACACACA

(Hoàn hảo)

CACATTCACACATTCATT

(Gián đoạn, chèn TT)

CACACACAGAGAGA

(Phối hợp giữa CA và GA)

Ngoài ra, căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có các chuỗi
lặp lại 2 nucleotide (di-nucleotide repeat), chuỗi lặp lại 3 nucleotide (tri-nucleotide
repeat) và chuỗi lặp lại 4 nucleotide (tetra-nucleotide repeat).
Các dạng trình tự của microsatellite: PolyA/polyT là những trình tự phổ biến
nhất trong hệ gen ngƣời, nhƣng nó không phù hợp để sử dụng trong lập bản đồ,
phân tích quần thể bởi vì nó không bền vững và ổn định trong quá trình phân tích
bằng PCR. Trong quá trình này, dƣới tác động của enzym Taq-polymerase nó có thể

12


làm cho kích thƣớc allen bị thay đổi bằng cách thêm một nucleotide A vào cuối
đoạn hoặc chèn vào giữa của allen. Nhìn chung, trong hai dạng chuỗi đồng hợp tồn

tại thì dạng polyA/polyT nhiều hơn dạng polyC/polyG.
Bên cạnh đó, microsatellite dạng di-nucleotide poly(CG)/ poly(GC) rất hiếm
xảy ra do sự suy yếu của cấu trúc CpG. Những phân tích gần đây về các dạng của
những đoạn lặp lại chỉ ra rằng cặp CA/GT là loại thƣờng gặp hơn cả, gấp đôi so với
AT và gấp ba so với AG/TC.
Microsatellite dạng tri- và tetra-nucleotide thì tƣơng đối hiếm xảy ra, nhƣng
nó là những tín hiệu di truyền (markers) có ích hơn so với so với microsatellite dạng
di-nucleotide thông thƣờng.
Trong số 3 nucleotide lặp lại, CAG và ATT là nhiều nhất tuy nhiên tần số xuất
hiện các kiểu này tuỳ thuộc vào chủng loại hệ gen.

1.3.4. Vai trò của microsatellite
Các microsatellite đƣợc dùng nhƣ một chỉ thị (marker) di truyền để nghiên cứu
di truyền quần thể, quan hệ tiến hoá, lập bản đồ gen... Tuy nhiên có rất nhiều chứng
cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân
tố điều hòa. Nhân tố điều hoà microsatellite đƣợc tìm thấy ở khắp nơi trong phần
trƣớc của vùng bắt đầu phiên mã của trình tự mã hoá. Vùng điều khiển có chứa
microsatellite hoạt động nhƣ một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột
biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng
đƣợc thể hiện ra các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các
trình tự khởi động của gen, khi trình tự này đƣợc giải phóng thì gen có thể đƣợc
khởi động và sao mã. Rất nhiều nghiên cứu cho thấy ảnh hƣởng thúc đẩy của
microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại
trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Nhƣ một trình tự mang mã,
microsatellite đã đƣợc tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau ở số
lần lặp lại của một đoạn amino-acide giống nhau liên quan đến chức năng tác động.
Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, ảnh hƣởng chiều dài khác nhau

13

microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan đƣợc tổng kết lại nhƣ
một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite nhƣ
sự đột biến điểm dẫn đến những giả thuyết cho rằng microsatellite có thể là một
nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lƣợng và quá trình tiến hoá thích
nghi (Kashi và cộng sự, 1997) [60]. Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại
nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc hoặc trôi dạt, nó hoạt
động nhƣ một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh
nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hoá
(King và cộng sự, 1997, 1999) [67], [68].

1.3.5. Phƣơng pháp xác định microsatellite
Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ
Một phƣơng pháp hiệu quả và ban đầu đƣợc sử dụng đó là dùng đồng vị
phóng xạ để xác định microsatellite. Ngƣời ta có thể đánh dấu phóng xạ vào một
đầu của primer (end-labelling) hoặc trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide
A,T,G,C đƣợc đánh dấu (incorporation-labelling), nhƣng phƣơng pháp endlabelling thƣờng đƣợc dùng thƣờng xuyên hơn do có nhiều ƣu điểm. Ngày nay,
phƣơng pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít đƣợc sử dụng vì nguy hiểm tới sức khỏe
con ngƣời và việc xử lý chất thải.
Phương pháp phát hiện không dùng đồng vị phóng xạ
Phương pháp nhuộm bạc: phƣơng pháp này rẻ, không hại nhƣng độ nhạy
không cao, đòi hỏi một số thủ tục phức tạp khi nhuộm.
Phương pháp lai ghép phân tử: cho phép xác định chính xác kiểu
microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai cùng một lúc, có thể xác định đƣợc
nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau thậm chí cả hai đoạn PCR có
kích thƣớc bằng nhau. Tuy nhiên, việc xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế.
Phương pháp nhuộm huỳnh quang và sử dụng máy giải trình tự tự động:
phƣơng pháp này đƣợc phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự

14

nucleotide để phát hiện đƣợc sản phẩm PCR cần đƣợc đánh dấu bởi một chất
nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incoprration), khi kích thích bởi tia
lazer, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy có thể phát hiện
đƣợc bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với ADN chuẩn, chúng ta
có thể có kích thƣớc chính xác của đoạn ADN chúng ta quan tâm.
Trong các phƣơng pháp kể trên thì phƣơng pháp nhuộm huỳnh quang cho hiệu
quả cao nhất và hiện đang đƣợc sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm trên thế
giới. Ngƣời ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau,
trong cùng một phản ứng PCR và cùng một giếng điện di có thể chạy cùng nhau kể
cả kích thƣớc các đoạn bằng nhau nhƣng chúng ta vẫn có thể xác định đƣợc nhờ
màu huỳnh quang khác nhau.
Chất huỳnh quang này đƣợc gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại
này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Kết quả đƣợc thể hiện trên máy tính, qua
đó chúng ta có thể xác định đƣợc chính xác kích thƣớc của alen, loại trừ những
băng lặp lại (stuter band) hoặc thêm một nucleotide A. Trong quá trình nhỏ mẫu
ngƣời ta nhỏ cách nhau từng giếng sau đó nhỏ lại để có thể xác định đƣợc mức độ
sang lấn giếng bên cạnh. Ngƣời ta thƣờng thiết kế trong cùng một loại chất huỳnh
quang, kích thƣớc trung bình của các alen cách nhau 50bp và chiều dài tốt nhất của
các đoạn ADN là từ 100-300 bp, do vậy mỗi chất nhuộm huỳnh quang tốt nhất là
dùng xác định từ 3-5 locút.
Trong những năm gần đây, kỹ thụât microsatellite đã đƣợc ứng dụng để
nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền của nhiều quần thể vật nuôi và hoang dã
với số lƣợng các locút đƣợc sử dụng rất khác nhau (Bảng 1.2)

15


Bảng 1.2: Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở vật nuôi sử dụng kỹ thuật

microsatellite
Loài vật nuôi
Lợn

Tác giả

Đối tƣợng nghiên cứu

Kim và cộng sự Nghiên cứu cấu trúc di truyền
(2005) [65].

Số locút
microsatellite
16

của một số giống lợn của Hàn
Quốc và Trung Quốc.

Li và cộng sự Nghiên cứu đa dạng di truyền

20

của 10 quần thể lợn bản địa

(2004) [75]

Trung Quốc.
Dê

Oliveira

và Nghiên cứu cấu trúc và đa

13

cộng sự (2007) dạng di truyền của một số
[105]

giống dê Brazin.

Diez-Tascon và Nghiên cứu đa dạng di truyền

Cừu

cộng sự (2000)
Ngựa

Trâu

của 6 giống cừu Merino.

Canon và cộng Nghiên cứu đa dạng di truyền
sự (2000) [34]

13

của 7 giống ngựa Tây Ban Nha

Zhang và cộng Nghiên cứu sự đa dạng di
sự (2007) [144]

20

30

truyền và sự phân ly của quần
thể Trâu Trung Quốc.

Hƣơu
nhốt

nuôi Thevenon

và Nghiên cứu đa dạng di truyền

cộng sự (2004)

9

hƣơu sao Việt Nam

1.4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA)
ADN ty thể là một trong những chỉ thị di truyền đƣợc sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền quần thể (Nabholz và cộng sự, 2008)
[101]. Cấu trúc ADN ty thể ở động vật có dạng mạch vòng kín với độ dài vào
khoảng 15-20 kb và chứa đựng khoảng 37 gen (Hình 1.1).

16

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử ADN ty thể của bò nuôi
Vùng điều khiển D-loop (displacement loop) có kích thƣớc khoảng 1 kb có vai
trò khởi đầu quá trình sao chép và phiên mã. Ở ADN ty thể, đặc biệt là ở một số
đoạn của vùng điều khiển (D-loop), cytochrome b và locút 12S rARN chúng có
mức độ tiến hóa rất nhanh và đã đƣợc chứng minh là rất hiệu quả trong việc nghiên
cứu về cấu trúc và đa dạng di truyền [16]. Phân tử ADN ty thể không trải qua bất kỳ
một trạng thái tái tổ hợp nào. Hơn nữa, hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng
mẹ ở hầu hết các loài và vì vậy mỗi một dòng gen ty thể có sự di truyền độc lập. Do
đó, hệ gen ty thể rất phù hợp trong việc nghiên cứu về quan hệ nguồn gốc tiến hoá
(Giles và cộng sự, 1980) [45].
Sự đa dạng di truyền ADN ty thể có thể đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp
nhƣ: cắt bởi các enzym giới hạn (RFLP), SSCP (single strand conformation
polymorphisms) và giải trình tự, trong đó phƣơng pháp giải trình tự đƣợc sử dụng
phổ biến nhất hiện nay. Các cặp mồi đƣợc thiết kế để nhân PCR vùng điều khiển

17


(D-loop), locút cytochrome b và locút 12S rARN có thể áp dụng cho nhiều loài
khác nhau.
Trƣớc tiên đoạn ADN cần xác định trình tự đƣợc nhân lên bằng phƣơng pháp
PCR. Sau đó sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch để loại bỏ các dNTP và mồi thừa, tiếp
theo hai mạch phân tử ADN đƣợc tách rời nhau. Mỗi mạch đƣợc bắt cặp với một
mồi và phản ứng PCR đƣợc thực hiện nhờ các enzym và dideoxynucleotide đã đƣợc
đánh dấu bằng một fluochrom (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1997) [2]. Sau đó trình tự
các đoạn ADN này đƣợc xác định trên các máy giải trình tự tự động. Hiện nay, các
hãng sản xuất máy giải trình tự đã phát triển những bộ kít giải trình tự riêng cho
từng loại máy khác nhau do đó thủ tục thực hiện phản ứng giải trình tự rất đơn giản
và thuận tiện. Có hai loại máy giải trình tự hiện nay đƣợc phổ biến rộng rãi là của
hãng ABI Prism và Backman Coulter-Mỹ đều dựa trên nguyên lý điện di mao quản.

Sử dụng ADN hệ gen ty thể để nghiên cứu mối quan hệ nguồn gốc phát sinh
và đa dạng di truyền quần thể đã đƣợc thực hiện trên nhiều loài vật nuôi khác nhau
nhƣ ngựa, trâu, bò, lợn, dê (Cozzi và cộng sự, 2004; Van Hoof và cộng sự, 2003;
Bradley và cộng sự 1996; Liu và cộng sự, 2006) [27], [37], [78], [134].
1.5. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÒ NUÔI

1.5.1. Sự phân loại bò nuôi
Bò nuôi là thành viên của tông trâu bò hoang (Bovini) thuộc họ trâu bò
(Bovidae). Các thành viên khác của tông Bovini bao gồm bò rừng Bison - Mỹ
(Bison bison), bò rừng Châu Âu, bò rừng Banteng (Bos banteng), bò tót (Bos
gaurus) bò Tây Tạng-Yak (Poephagus mutus) và bò xám (Bos sauveli). Có hai loại
hình thái bò nuôi đã đƣợc xác định đó là bò Bos taurus (không có u) của Châu Âu,
Tây Phi, Bắc Á và bò Bos indicus hay còn gọi là bò zebu (bò có u) của Nam Châu
Á, Châu Phi. Hệ thống phân loại của các thành viên khác nhau thuộc tông Bovini
dựa trên cơ sở hình thái học cổ điển và các nghiên cứu phân tử gần đây đƣợc trình
bày ở hình 1.2.

18


Hình 1.2: Hệ thống phân loại của bò nuôi, bò hoang dã và một số loài liên quan
trong tông Bovini (nguồn: MacHugh 1996) [84]
Sự khác nhau về hình thái và sinh lý giữa 2 loài phụ bò nuôi Bos indicus và
Bos taurus phản ánh sự đáp ứng rõ rệt với các điều kiện môi trƣờng khác nhau. Bò
Bos indicus chủ yếu sống ở vùng khí hậu khô nóng hoặc bán khô nóng của Châu Á
và Châu Phi. Trong khi đó bò Bos taurus thƣờng sống ở những vùng ôn đới có
lƣợng mƣa cao. Bò Bos indicus có tỷ lệ trao đổi chất cơ bản và nhu cầu về nƣớc
thấp hơn, tuyến mồ hôi to và hoạt động mạnh hơn, chúng có khả năng kháng với
bệnh ve và bệnh ký sinh trùng tốt hơn bò Bos taurus (Payne, 1995) [106]. Hơn nữa,
Bos indicus còn thể hiện các tập tính nhạy cảm và bản năng tập trung bầy đàn mạnh

hơn so với bò Bos taurus.
Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng tổ tiên hoang dã của tất cả bò nuôi hiện
nay là bò rừng cổ đã tuyệt chủng - Bos primigenious (Epstein và Mason, 1984 [42].
Bò rừng cổ đƣợc cho rằng đã tiến hoá ở châu Á từ tổ tiên Bos acutfrons thuộc kỷ

19


Plioxen. Bò rừng cổ có phạm vi phân bố địa lý rất rộng, bằng chứng là những dấu
tích hoá thạch còn lại đã đƣợc tìm thấy tại những vị trí rất xa nhau nhƣ ở Anh và
Trung Quốc. Do sự phân bố trong phạm vi rộng nhƣ vậy nên dẫn đến hình thành các
loài phụ khác biệt về địa lý.
Có ít nhất 3 loài phụ bò rừng cổ đã đƣợc xác định: 1) Bos primigenius
primingenius ở phái Bắc vùng giáp châu Âu và châu Á, 2) Bos primigenius
opisthonomous ở Bắc Phi, 3) Bos primigenius mamadicus ở phía Nam Châu Á
(Epstein và Mason, 1984) [42]. Cả hai loài phụ ở Châu Phi và nam Châu Á đƣợc
cho rằng đã tuyệt chủng vào khoảng 2.000 năm trƣớc trong khi đó bò rừng cổ Châu
Âu đƣợc cho rằng đã tồn tại đến tận thế kỷ 17. Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng
cổ trong thời kỳ đồ đá khoảng 12.000 trƣớc Công Nguyên đƣợc thể hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3: Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng cổ vào khoảng 12000 năm trƣớc Công
Nguyên (nguồn MacHugh 1996) [84].

20