LUAN VAN THAC SI CONG NGHE SINH HOC: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBSX TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN THÁI THÀNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM
CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ
MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 60420201
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

TRẦN THÁI THÀNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM
CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ
MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 60420201
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng


TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2020
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày 04 tháng 05năm 2020

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Trần Thái Thành

Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 02/06/1994

Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 1841880003

I- Tên đề tài:
Nghiên cứu xác định hàm lượng Tinopal CBS-X trong mốt số thực phẩm có
nguồn gốc từ tinh bột và rau củ muối chua bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao.

II- Nhiệm vụ và nội dung:
+ Nghiên cứu phương pháp sàng lọc mẫu.
+ Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lượng Tinopal CBS-X
trong nền mẫu.
+ Nghiên cứu điều kiện định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS.
III- Ngày giao nhiệm vụ: 05/10/2019
IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 04/05/2020
V- Cán bộ hướng dẫn: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)



1

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn
(Ký và ghi rõ họ tên)


2

LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn này, em đã nhận được sự hỗ trợ, giúp
đỡ cũng như là quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan và cá nhân. Luận văn cũng được
hoàn thành dựa trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liên
quan, các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các trường Đại học. Đặc biệt hơn
nữa là sự hợp tác của giáo viên trường Đại học Công nghệ Tp.HCM và sự giúp đỡ, tạo
điều kiện về vật chất và tinh thần từ phía gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Ngọc Hồng – người
trực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn em
trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn.
Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám đốc Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc – Mỹ
phẩm – Thực phẩm cùng toàn thể các anh chị công tác trong phòng Thực phẩm đã tận
tình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên
cứu.
Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn!
Hồ Chí Minh, 4 tháng 5 năm 2020
Tác giả

Trần Thái Thành


3

TÓM TẮT
Tinopal CBS-X là chất làm trắng dạng bột là chất cấm dùng trong thực phẩm
thường được dùng làm trắng các sản phẩm từ tinh bột. Mục tiêu của nghiên cứu là xác
định phương pháp tối ưu của quá trình định lượng Tinopal CBS-X trong thực phẩm. Điều
kiện định lượng bao gồm 2 yếu tố được khảo sát bằng thực nghiệm là dung môi chiết tách
và thông số hệ thống. Phương pháp HPLC đầu dò UV-VIS được sử dụng để khảo sát

xuyên suốt đề tài.
Kết quả nghiên cứu ở những mẫu thực phẩm bị làm trắng bởi Tinopal CBS-X
gồm mẫu chứa tinh bột và mẫu giàu chất xơ như củ kiệu, măng thì với phương pháp
định tính bằng máy soi UV bước sóng 365 nm được xây dựng với LOD: 25,0 µg/kg.
Đối với phương pháp định lượng độ thu hồi đạt 81 % – 108 %, dung môi thích hợp
được sử dụng là acetonitril có mặt 4 % H 3PO4. Các thông số điều kiện tối ưu trên hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UV-VIS để phân tích Tinopal CBS-X gồm: Cột
sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ hay tương
đương; bước sóng: 347 nm; pha động gồm ACN và đệm ammonium formate pH 5
(gradient); tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 10 µl; giới hạn phát hiện và định
lượng tính trên nền mầu thử lần lượt là 0,4 mg/kg và 2,0 mg/kg. Từ đó nghiên cứu
thêm ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chế biến cho thấy Tinopal CBS-X dễ bị
phân hủy ở nhiệt độ cao với độ thu hồi giảm đi 50 % so với mẫu chuẩn.
Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu để mở rộng phạm vi áp dụng cho các nền thực
phẩm cần độ trắng cảm quan khác trong những đề tài tiếp theo, tiếp tục đánh giá các
phương pháp, quy trình và kết quả thu được; ứng dụng nhiều trong thực tiễn để phát
triển phương pháp có độ thu hồi cao và giới hạn phát hiện thấp hơn trong việc xác định
nồng độ Tinopal CBS-X trong thực phẩm.


4

ABSTRACT
Tinopal CBS-X is fluorescent whitening agent, which is banned from food use,
and often used to bleach starch products. The objective of the study is to determine the
optimal method of quantifying Tinopal CBS-X in food product. The quantitative
conditions include two factors, which are experimentally examined, such as extraction
solvent and system parameters. The HPLC UV-VIS probe method is used for examination
throughout the topic.
Research results on samples of food whitened by Tinopal CBS-X include samples

containing starch and samples rich in fiber such as beets, bamboo shoots, with qualitative
methods using 365 nm UV scanner built with LOD: 25.0 µg/kg. For the method of
quantitative recovery of 81 % - 108 %, the required solvent is Acetonitrile in H3PO4 4 %.
Optimal parameters on high-performance liquid chromatography UV-VIS detector for
Tinopal CBS-X analysis include: Eclipse C18 reverse-phase liquid chromatography
column (250 mm x 4.6 mm x 5 µm) and recolumn; wavelength: 347 nm; mobile phase:
ACN and buffer ammonium formate pH 5 (gradient); flow rate: 1.0 ml/min. Injection
volume: 10 µl; The limit of detection and quantification is 0.4 mg/kg and 2.0 mg/kg,
respectively. Rased on the study, the effect of temperature during the process shows that
Tinopal CBS-X easily decomposes at high temperatures with a recovery of 50 % less than
the standard sample does.
The research will continue to expand the scope of the application for other sensory
evalution such as whiteness in food in next topics, evaluate the methods, processes and
results obtained; develop practical applications for high-recovery methods and lower
detection limits for the determination of Tinopal CBS-X concentrations in food.


5

MỤC LỤC
Chương 1....................................................................................................................................16
TỔNG QUAN............................................................................................................................16

1.1 Sơ lược về các thực phẩm nhiễm Tinopal CBS-X...........................................16
1.1.1 Các sản phẩm về tinh bột gạo...........................................................................................16
1.1.2 Các sản phẩm có nguồn gốc từ củ kiệu, măng..................................................................18

1.2 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang............................19
1.2.1 Giới thiệu..........................................................................................................................19
1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học ...........................................19

Các chất làm trắng quang học có thể được phân loại dựa trên cấu trúc và thuộc tính, vào
khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc khác nhau, hàng trăm hợp chất, và
hàng ngàn công thức khác nhau. Tất cả OBs đa vòng hydrocarbon thơm, cấu trúc có chứa
nhiều liên kết đôi có thể được kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím. Hàng ngàn công thức OBs
đã được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất làm trắng, nhưng tương đối ít đáp ứng
được yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất làm trắng làm trắng huỳnh quang (FWAs) đã
được nghiên cứu sử dụng...........................................................................................................19

1.3 Tinopal CBS-X................................................................................................21
1.3.1 Khái niệm..........................................................................................................................21
Theo Enzyclopediaof Industrial Chemistry, sản xuất distyrylbiphenylsulfonate bắt đầu với
biphenyl, được sản xuất cùng với các hợp chất thơm khác trong tinh chế dầu thô. Nó phản ứng
nhanh với hydrogen chloride và formaldehyde và tạo thành 4, 4’–bis(chloromethyl)biphenyl,
sau đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra 4,4’-bis(dimethoxyphosphonomethyl)biphenyl.
Biphenylphosphonate đối xứng này được phản ứng với hai phân tử benzaldehyde-2-sulphonic
acid, được sản xuất từ một hợp chất là 2- chlorbenzaldehyde và natri sunfit. Thành phần sản
phẩm hoạt chất sinh ra là xấp xỉ 90 %, các tạp chất khác < 1,2 % bao gồm các sản phẩm và số
dư là natri clorua và nước[8].....................................................................................................22
1.3.2 Cơ chế làm trắng...............................................................................................................22
1.3.3 Ứng dụng của Tinopal CBS-X..........................................................................................23


6

Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trong công nghiệp
sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làm chất làm trắng trong
gia dụng để làm trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng[13], [14], [22]..........................23

1.4 Một số kết nghiên cứu và phương pháp xác định............................................23
1.4.1 Phương pháp soi bằng đèn cực tím...................................................................................25

1.4.2 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò huỳnh quang.............................................26
1.4.3 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò tử ngoại khả kiến......................................27

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)............................................28
1.5.1 Cơ sở phương pháp và phạm vi ứng dụng........................................................................28
1.5.2 Khái niệm..........................................................................................................................29
1.5.3 Phân loại...........................................................................................................................29
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng, HPLC được phân thành 4 loại:..............29
1.5.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)............................................................30
1.5.5 Ứng dụng của HPLC........................................................................................................33

1.6 Các tiêu chí đánh giá thẩm định phương pháp.................................................34
1.6.1 Tính đặc hiệu....................................................................................................................34
1.6.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn..................................................................................36
1.6.3 Giới hạn phát hiện.............................................................................................................38
1.6.4 Giới hạn định lượng..........................................................................................................39
1.6.5 Độ chính xác (độ đúng và độ chụm).................................................................................40
1.6.5.1 Độ chụm.........................................................................................................41
1.6.5.2 Độ đúng (trueness).........................................................................................................45
* Định nghĩa..............................................................................................................................45
Chương 2....................................................................................................................................47
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.............................................................................................47

2.1 Vật liệu............................................................................................................47
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................................47
2.1.2 Hóa chất và chất chuẩn[3]:...............................................................................................48
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ...........................................................................................................49
2.1.4 Dụng cụ.............................................................................................................................49

7

2.2 Nội dung nghiên cứu.......................................................................................50
2.2.1 Phương pháp chiết tách chất phân tích.............................................................................50
2.2.2 Khảo sát chương trình gradient.........................................................................................52
2.2.3 Nghiên cứu phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm.....................53
2.2.3.1 Chuẩn bị.........................................................................................................53
2.2.3.2 Tiến hành........................................................................................................54
2.2.3.3 Giới hạn phát hiện..........................................................................................54
2.2.3.4 Độ chính xác..................................................................................................55
2.2.4 Kiểm tra phương pháp phân tích......................................................................................55
2.2.4.1 Tính đặc hiệu..................................................................................................55
2.2.4.2 Tính tuyến tính...............................................................................................56
2.2.4.3 Độ chụm và độ thu hồi của phương pháp......................................................56
2.2.4.4 Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp......................................57
2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm giảm nồng độ Tinopal............................58
CBS-X........................................................................................................................................58
2.2.6 Khảo sát độ nhạy, độ chính xác của phương pháp định lượng Tinopal CBS-X đo quang
phổ và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao........................................................................59
Chương 3....................................................................................................................................60
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN......................................................................60

3.1 Phương pháp chiết tách chất phân tích............................................................60
3.2 Khảo sát chương trình gradient........................................................................61
3.3 Nghiên cứu phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm.....65
3.3.1 Giới hạn phát hiện phương pháp.......................................................................................65
3.3.2 Độ lặp lại...........................................................................................................................71

3.4 Kiểm tra phương pháp phân tích.....................................................................73
3.4.1 Tính đặc hiệu....................................................................................................................73

3.4.2 Tính tuyến tính..................................................................................................................79
3.4.4 Độ chụm và độ thu hồi của phương pháp.........................................................................81

3.4.5 Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp.....................................84
3.5 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm giảm nồng độ Tinopal CBS-X..................85

3.6 Khảo sát độ nhạy, độ chính xác của phương pháp định lượng Tinopal CBS-X
bằng phương pháp đo quang phổ và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao......87


8

3.7 Quy trình định lượng Tinopal CBS-X sau quá trình nghiên cứu......................87
Thuyết minh quy trình:..............................................................................................................88
Chương 4....................................................................................................................................89
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................................89

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
- FWAs (Fluorescent Whitening Agent): Chất làm trắng huỳnh quang.
- HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- HPLC UV-VIS (High Performance Liquid Chromatography/ Ultraviolet visible): Sắc
ký lỏng hiệu năng cao - đầu dò tử ngoại – khả kiến.
- HPLC-RF (High Performance Liquid Chromatography / Fluorescence): Sắc ký lỏng
hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang.
- ICP-AES (Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy): Đầu dò phổ
phát xạ nguyên tử.
- LC/MS (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry): Sắc ký lỏng ghép khối phổ
một lần.
- LC/MS/MS (Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry): Sắc ký lỏng
ghép khối phổ hai lần.

- LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện.


9

- LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lượng.
- Obs (Optical Brighteners): Chất làm trắng quang học.
- RSD (Relative Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối (%).
- ACN (Acetonitrile): Acetonitril
- MeOH (Methanol): Methanol

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Chương trình theo tỷ lệ Gradient dung môi...................................................27
Bảng 1.2 : Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn......................34
Bảng 1.3: Sự khác nhau giữa độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lập.....................41
Bảng 1.4: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau..................................44
Bảng 1.5 : Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau............................................47
Bảng 2.1: Bảng tỷ lệ H3PO4 cần khảo sát trong MeOH và ACN....................................52
Bảng 2.2: Chương trình gradient pha động 1.................................................................53
Bảng 2.3: Chương trình gradient pha động 2 ................................................................53
Bảng 3.1: Chương tình theo tỷ lệ gradient dung môi.....................................................65
Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bánh canh tại nồng độ
2,5 mg/kg....................................................................................................................... 71
Bảng 3.3: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bánh phở tại nồng độ 2,5
mg/kg............................................................................................................................. 72


10

Bảng 3.4: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bún tại nồng độ 2,5

mg/kg............................................................................................................................. 73
Bảng 3.5: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của măng chua tại nồng độ
2,5 mg/kg....................................................................................................................... 74
Bảng 3.6: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của củ kiệu tại nồng độ 2,5
mg/kg............................................................................................................................. 75
Bảng 3.7: Diện tích dung dịch chuẩn 0,5 – 5 mg/ lngày 1..............................................76
Bảng 3.8: Diện tích dung dịch chuẩn 0,5 – 5 mg/l ngày 2..............................................77
Bảng 3.9: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 mg/kg
ngày1.............................................................................................................................. 78
Bảng 3.10: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 2,5 mg/kg
ngày 1............................................................................................................................. 79
Bảng 3.11: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 mg/kg
ngày 1............................................................................................................................. 79
Bảng 3.12: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 mg/kg
ngày 2............................................................................................................................. 80
Bảng 3.13: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 2,5 mg/kg
ngày 2............................................................................................................................. 81
Bảng 3.14: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 mg/kg
ngày 2............................................................................................................................. 81


11

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6- morpholino-1,3,5triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate................................................................20
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2, 2’- ([1, 1’ - biphenyl] - 4, 4’ - diyldi - 2, 1 ethenediyl) bis, dạng muối đinatri..................................................................................20
Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của Tinopal CBS-X..................................................24
Hình 1.4: Phát hiện FWA theo dãy chuẩn pha loãng liên-tiếp từ bên trái sang bên phải
bằng đèn phát cực tím cầm tay.......................................................................................25
Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ............................26

Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC).......................................................................................................................... 30
Hình 1.7: Cách xác định khoảng tuyến tính...................................................................36
Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính......................................40


12

Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng Shimadzu, đầu dò UV-VIS đặt tại phòng kiểm nghiệm Thực
phẩm.............................................................................................................................. 49
Hình 2.2: Sơ đồ phương pháp tách chiết chất phân tích.................................................51
Hình 2.3: Sơ đồ phương pháp sàng lọc mẫu...................................................................54
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng làm giản nồng độ Tinopal CBS-X........................59
Hình 3.1 Đồ thị biểu thị độ thu hồi chiết Tinopal CBS-X bằng MeOH .........................61
Hình 3.2: Đồ thị biểu thị độ thu hồi chiết Tinopal CBS-X bằng ACN...........................62
Hình 3.3 Dãy chuẩn Tinopal CBS-X trên hệ dung môi Đệm-Acetonnitril.....................63
Hình 3.4 Dãy chuẩn Tinopal CBS-X trên hệ dung môi Đệm- MeOH ...........................64
Hình 3.5: Đồ thị thể hiện tỷ lệ ACN: đệm theo chương trình gradient...........................65
Hình 3.6: Dãy chuẩn Tinopal CBS-X dưới đèn soi UV ở bước sóng 365 nm có nồng độ
từ 0,5 mg/l đến 5,0 mg/l.................................................................................................66
Hình 3.7: Dãy chuẩn Tinopal CBS-X dưới đèn soi UV ở bước sóng 365 nm có nồng độ
từ 0,25 mg/l đến 2,5 µg/l................................................................................................67
Hình 3.8: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 µg/l............................68
Hình 3.9: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 10,0 µg/l..........................69
Hình 3.10: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 25,0 µg/l........................70
Hình 3.11: Đường chuẩn khảo sát khoảng nồng độ 0,5 – 5,0 mg/l................................76
Hình 3.12: Đường chuẩn khảo sát khoảng nồng độ 0,5 – 5,0 mg/l ngày 2....................77
Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu thử sau khi xử lý so với mẫu chuẩn...............................83
Hình 3.14: Đồ thị so sánh kết qua đo mẫu giữa hai máy UV-VIS và quang phổ UV.....84
Hình 3.15: Sơ đồ quy trình định lượng Tinopal CBS-X.................................................85

13

MỞ ĐẦU
Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm trong cả nước đang gây ra nhiều lo lắng
cho người tiêu dùng. Tình trạng một số cơ sở sản xuất sử dụng các hóa chất cấm dùng
trong nuôi trồng, chế biến nông sản, thủy sản, thực phẩm; Việc sản xuất các sản phẩm
kém chất lượng đang gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và người tiêu dùng. Trong đó
các sản phẩm làm từ tinh bột như bún, hủ tiếu, bánh phở,… thường bị sử dụng chất
Tinopal CBS-X trong sản xuất để làm tăng độ trắng sáng, cải thiện độ bóng bề mặt và
làm cho sản phẩm hấp dẫn hơn.
Thay vì dùng bột gạo hoàn toàn, họ pha trộn thêm bột khoai mì tươi, bột lọc vì giá
bột này rẻ hơn gạo (khoảng 1.800 đ/kg). Giá bán sỉ của loại bún này cũng rẻ hơn bún gạo
hoàn toàn, chỉ 2.500-2.800 đ/kg[30]. Tuy nhiên, bún làm bằng bột khoai mì tươi, bột lọc
thường có màu xám đen, trụng nước sôi thì bị bở, vụn. Vì vậy, những cơ sở sản xuất loại
bún này phải dùng hóa chất Tinopal CBS-X để làm trắng và làm dai sợi bún. Với loại bún


14

có pha trộn chất Tinopal CBS-X nhìn rất trắng, bóng, đẹp mắt, hoàn toàn không để lại
mùi vị, khi đưa ra ánh sáng mặt trời sợi bún thường trắng óng ánh.
Những năm gần đây, bên cạnh việc sử dụng trái phép Tinopal CBS-X trong thực
phẩm không chỉ có trong các sản phẩm có nguồn gốc từ tinh bột, các cơ sở và hộ kinh
doanh đã sử dụng Tinopal CBS-X trong các sản phẩm như măng, củ kiệu,…. để làm
trắng và tăng thị hiếu người dùng. Vì các sản phẩm này rất dễ bị oxy hóa nếu không xử
lý đúng cách từ đó gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan. Do đó sử dụng Tinopal
CBS-X trong việc làm trắng thực phẩm đã gây ra nỗi lo ngại về sức khỏe đối với người
tiêu dùng.

Tinopal CBS-X là một chất làm trắng quang học có tên khoa học là 4,4- bis(2sulfostyryl) biphenyl, công thức phân tử C 28H2ONa2O6S2[16]. Tinopal CBS-X là chất làm
trắng huỳnh quang có khả năng phát huỳnh quang (fluorescence) và gây ra hiệu ứng
tán xạ trên bề mặt sản phẩm mà chúng bám vào làm cho sản phẩm có cảm giác trắng
hơn.
Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trong
công nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làm
chất làm trắng trong gia dụng để làm trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng,…
nhưng không được phép sử dụng trong thực phẩm[3].
Để kiểm soát Tinopal CBS-X trong thực phẩm, ngày 16 tháng 8 năm 2013, Cục
An toàn thực phẩm – Bộ Y Tế đã có công văn số 1731/ATTP-KN về việc áp dụng quy
trình kiểm nghiệm Tinopal CBS-X trong thực phẩm[1].
Hiện nay, đã có nhiều phương pháp phân tích hàm lượng Tinopal CBS-X trong
các đối tượng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau. Phương pháp kiểm tra sàng lọc
Tinopal CBS-X bằng cách soi duới ánh sáng đèn tử ngoại UV 365 nm trong buồng
tối[18]. Với thiết bị phân tích Tinopal CBS-X là máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
để định lượng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi thiết bị mà phương pháp có độ nhạy và độ
chọn lọc khác nhau nhưng đầu dò tử ngoại- khả kiến được xem là đầu dò có độ chọn


15

lọc, độ nhạy tốt, thời gian trả kết quả nhanh và chính xác. Nghiên cứu này mở rộng
thêm phạm vi nền mẫu ở các mẫu thường cần độ trắng cảm quan như măng, củ kiệu với
độ thu hồi đạt được 81 – 108 % tin cậy. Tuy nhiên, khi áp dụng quy trình kiểm tra
Tinopal CBS-X trên đối tuợng là các loại thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột thì thấy
rất ít công trình nghiên cứu, do đó cần phải xây dựng, đánh giá và kiểm định phương
pháp thích hợp trên mỗi thiết bị khác nhau.
Để kiểm soát triệt để việc sử dụng Tinopal CBS-X trong sản xuất, kinh doanh
thực phẩm, Cục An toàn thực phẩm đã có Công văn gửi các Sở Y Tế các tỉnh thành phố
trực thuộc Trung ương về việc phối hợp truy nguyên nguồn gốc nguyên liệu, kiểm soát

Tinopal CBS-X trong sản xuất thực phẩm. Nhận thấy được điều đó, Trung tâm kiểm
nghiệm Thuốc – Mỹ Phẩm – Thực phẩm đang rất quan tâm đến vấn đề phân tích định
lượng hàm lượng Tinopal CBS-X trong các loại thực phẩm. Trên cơ sở đó, đề tài
“Nghiên cứu xác định hàm lượng Tinopal CBS-X trong một số thực phẩm có nguồn
gốc từ tinh bột và rau củ muối chua bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
được thực hiện.
Trong luận văn này, đề tài có các mục tiêu nghiên cứu:
+ Xây dựng phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm.
+ Xây dựng phương pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lượng Tinopal CBS-X
trong nền mẫu.
+ Các điều kiện định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS.


16

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 Sơ lược về các thực phẩm nhiễm Tinopal CBS-X
1.1.1 Các sản phẩm về tinh bột gạo.
Gạo là nguyên liệu chủ yếu trong bữa ăn chính của nhiều nước Châu Á thì bột
gạo là thành phần chính của rất nhiều loại thực phẩm dùng hằng ngày.
Tinh bột là cấu tử chính của gạo (chiếm đến 90 % chất khô). Hàm lượng
amylose trong gạo tẻ có thể chiếm từ 7 % đến 33 % chất khô. Amilopectin là cấu tử
chính của tinh bột và thành phần duy nhất của gạo nếp. Tinh bột gạo nếp chiếm từ 0,8
% đến 1,3 % amyloza, tập trung chủ yếu ở tâm hạt tinh bột. Tinh bột lúa nếp bị nhuộm
màu đỏ hay nâu với iot còn gạo tẻ thì nhuộm màu xanh hay xanh tím. Hàm lượng
amylose phụ thuộc vào trị số và hình dạng hạt tinh bột.
Hạt tinh bột lúa nếp và lúa thường có nhiệt độ hồ hóa giống nhau. Nhiệt độ hồ
hóa có thể dao động từ 55 0C đến 790C phụ thuộc vào giống và điều kiện canh tác.

17

Nhiệt độ hồ hóa phản ánh độ bền của hạt tinh bột tới sự tác động của các loại thuốc thử
khác nhau. Những sự khác biệt về nhiệt độ hồ hóa phản ánh rõ tới thời gian nấu gạo.
Nấu gạo có nhiệt độ hồ hóa cao sẽ kéo dài thời gian vài phút so với gạo có nhiệt
độ hồ hóa thấp. Gạo có nhiệt độ hồ hóa thấp khi nấu sẽ bắt đầu hút nước và trương nở
ở nhiệt độ thấp hơn so với gạo có nhiệt độ hồ hóa cao. Nhiệt độ hồ hóa cũng có thể
phản ánh độ rỗng tương đối của nội nhũ.
Tỷ lệ amylose: Amilopectin xác định các tính chất của cơm. Hàm lượng
amylose càng cao, các hạt tinh bột hút nước càng mạnh, thể tích các hạt tinh bột tăng
nhưng cấu trúc không bị phá hủy nhờ khả năng của amylose tạo thành các liên kết
nước ở mức cao. Độ chắc của cơm và độ bóng bề mặt của nó được quyết định bởi tỷ số
amylose: amilopecin trong tinh bột[6].
Cách tách tinh bột gạo: Hạt tinh bột gạo có kích thước nhỏ (3 – 8 µm) được bao
bởi một lớp vỏ protein cứng, chặt và không hoà tan trong nước, nên để tách được tinh
bột cần phải xử lý hoá học để tách protein ra khỏi tinh bột.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch kiềm loãng (0,25 % - 0,35 %) trong một
thời gian dài để làm mềm hạt. Tách hết kiềm, rửa bằng nước, sau đó gạo được nghiền
để phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt tinh bột. Tiếp đó khối nghiền được khuấy đều
với một lượng dư dung dịch kiềm loãng. Phần lớn protein sẽ bị hoà tan và chuyển vào
lớp trên của dung dịch kiềm nên có thể tách ra bằng cách gạn.
Khuếch tán khối tinh bột vào nước để tạo ra dịch sữa tinh bột rồi cho qua rây có
kích thước nhất định để loại bỏ các tạp chất. Tinh bột được rửa và lắng gạn, lặp đi lặp
lại nhiều lần sẽ thu được tinh bột tinh sạch.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch SO 2 ở nhiệt độ và thời gian nhất định
(50oC, 72h) để làm cho khung protein bị trương lên và bị khuếch tán vào dung dịch dễ
dàng. Tiếp đó, gạo được nghiền trong cối nghiền. Khối nghiền cho qua sàng quay và
sàng rung để tách vỏ và xơ. Sau đó khuấy đều với dung dịch NaOH để tạo ra huyền

phù rồi cho vào ly tâm để tách ra làm 2 lớp: lớp chất lỏng ở phía trong (quanh tâm của


18

máy ly tâm) chứa nhiều protein và lớp đặc có khối lượng riêng lớn thì ở vòng ngoài
chứa chủ yếu là tinh bột có lẫn ít protein. Ly tâm nhiều lần dịch sữa tinh bột trong
kiềm, rồi trong nước sẽ thu được tinh bột tinh sạch[6].
Có rất nhiều loại sản phẩm có thành phần chính là tinh bột gạo như bánh tráng,
bánh phở, hủ tiếu, bún tươi, bún khô, các loại bột gạo, ... Các sản phẩm này được làm
từ tinh bột gạo được chế biến qua nhiều công đoạn, quá trình chế biến rất quan trọng là
đảm bảo về vệ sinh an toàn thực phẩm.
Một số cơ sở sản xuất các sản phẩm từ bột gạo cho các chất phụ gia bị cấm như:
hàn the, Tinopal CBS-X, formol, chất bảo quản và các chất màu vào trong sản phẩm
làm gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng.
1.1.2 Các sản phẩm có nguồn gốc từ củ kiệu, măng.
Củ kiệu là củ của cây kiệu, là cây thảo nhỏ thuộc họ hành, có thân hành màu
trắng, hình trái xoan thuôn. Lá mọc ở gốc, hình dải hẹp, nửa hình trụ, dài 15 – 60 cm,
rộng 1,5 – 4 mm.
Cụm hoa hình tán kép trên một cuống hoa dài 15 – 60 cm, mang 6 – 30 tán hoa
màu hồng hay màu tím, củ có màu trắng, hình tròn hoặc tròn dài giống củ hành nhưng
thường nhỏ hơn, củ có nhiều vảy mỏng bọc bên ngoài.
Ngoài tên gọi là củ kiệu còn có tên gọi khác tiểu toán (tỏi nhỏ), tiểu căn toán, dã
toán, đại đầu thái tử, hỏa thông… Cây kiệu được trồng khắp nơi, nhân dân thường
trồng để lấy củ muối dưa, dùng lá làm gia vị như một loại rau thơm[29].
Măng là các cây non mọc lên khỏi mặt đất của các loài tre, nứa, trúc. Măng
được sử dụng làm thực phẩm ở nhiều nước châu Á và được bán dưới nhiều hình thức
như măng khô, măng tươi và măng đóng hộp.
Người ta thu hoạch măng tre vào mùa xuân khi chồi nhú khỏi mặt đất cao 15-20
cm. Lột mo nang, rửa sạch, thường dùng tươi. Măng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát

bình, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, mát gan, chỉ khát tiêu đờm, làm se, nhuận táo,
chống co thắt.


19

Bởi bản chất màu trắng của mình nhưng lại rất khó giữ được độ trắng trong quá
trình bảo quản nhất là đối với các cơ sở buôn bán trong thời gian dài, nên việc sử dụng
Tinopal CBS-X để làm trắng cho các sản phẩm củ kiệu, măng gây nên ảnh hưởng sức
khỏe của người sử dụng.
1.2 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang.
1.2.1 Giới thiệu.
Chất làm trắng quang học (OBs) được dùng trong ngành công nghiệp hóa chất,
hoặc các chất làm trắng huỳnh quang (FWAs) được dùng trong ngành công nghiệp chất
làm trắng, là những hợp chất có thể hấp thụ ở bước sóng 350 - 365 nm của ánh sáng
UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở bước sóng 400 - 440 nm [8]. Electron
trong phân tử huỳnh quang được kích thích lên một trạng thái năng lượng cao hơn bằng
cách hấp thụ photon ánh sáng thích hợp sau đó phân tử chuyển một lượng nhỏ năng
lượng thành nhiệt huỳnh quang, phần còn lại phát xạ thành photon của bức xạ huỳnh
quang khi các electron quay trở lại trạng thái cơ bản của nó. Nhiệt huỳnh quang được
tạo ra từ trạng thái kích thích thứ nhất có thể được đo được bằng thiết bị nhưng rất
phức tạp và tốn kém. Bức xạ huỳnh quang trong trạng thái kích thích thứ hai được đo
bằng thiết bị gọi là fluorometers [13],[14],[22].
1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học .
Các chất làm trắng quang học có thể được phân loại dựa trên cấu trúc và thuộc
tính, vào khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc khác nhau, hàng trăm
hợp chất, và hàng ngàn công thức khác nhau. Tất cả OBs đa vòng hydrocarbon thơm,
cấu trúc có chứa nhiều liên kết đôi có thể được kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím.
Hàng ngàn công thức OBs đã được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất làm
trắng, nhưng tương đối ít đáp ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất làm

trắng làm trắng huỳnh quang (FWAs) đã được nghiên cứu sử dụng.
FWAs được sử dụng nhiều trong các chất làm trắng bao gồm các hợp chất stilben như:


20

+ FWA-1 có tên hóa học: Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6-morpholino1,3,5triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate[8].
Công thức cấu tạo hóa học:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6- morpholino-1,3,5triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate[14].
+ FWA-5 có tên hóa học: Benzenesulfonicacid, 2,2’-([1,1’- biphenyl]- 4,4’diyldi-2,1-ethenediyl)bis-disodiumsalt.

FWA-5

(Distyrylbiphenylsulfonate) hoặc Tinopal CBS-X.
Công thức cấu tạo hóa học:

thường

được

gọi

là

DSBP


21

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2,2’- ([1,1’-biphenyl] - 4,4’ - diyldi - 2,1 - ethenediyl)
bis, dạng muối đinatri[8].
1.3 Tinopal CBS-X.
1.3.1 Khái niệm.
Tên thường được gọi là DSBP (Distyrylbiphenylsulfonate).
Tên hóa học: 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’–diyldi-2,1-ethenediyl)bis, dạng muối đinatri..
Công thức phân tử: C28H20Na2O6S2
Công thức cấu tạo hóa học: xem hình 1.2
Tính chất
+ Khối lượng phân tử: 562,58 g/mol.
+ Màu sắc: màu vàng.
+ Điểm nóng chảy: > 300°C.
+ Điểm sôi: N/A.
+ Áp suất hơi ở 25 °C: < 7E-16 ở 25°C.
+ Hệ số phân số octanol - nước [log10]: - 2,32 ở pH 6,8; 25°C.
+ Độ tan trong nước [mg/l]: 17’600 ở 2°C.
+ Hằng số Henry: < 1E-15 ở 25°C.
+ Hằng số KOC: 125 L/kg.