Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học“phân lập và định danh vi khuẩn lactic lên men nem chuatỉnh đồng tháp và thành phố cần thơ”

Chương 1

GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Nem chua là thực phẩm lên men truyền thống được sản xuất thủ công, mang
sắc thái kinh nghiệm lưu truyền từ đời này sang đời khác của người Việt Nam. Tuy
nem chua không phải là một món ăn địi hỏi cần phải chế biến cơng phu, cầu kỳ và
trang trí đẹp mắt, nhưng nó lại ln là một món ăn được người dân u thích từ
trước đến nay. Hay cũng có thể nói chính sự đơn giản trong khâu chế biến cùng với
hương thơm và vị chua dễ chịu của nem chua đã mang lại lợi thế cho sản phẩm này.
Q trình chín của nem chua khơng qua phương pháp xử lí nhiệt, nên phần lớn các
chất dinh dưỡng quí trong thịt như các acid amin hịa tan khơng bị mất đi. Hương
thơm và vị chua đặc trưng của nem chua giúp cho người sử dụng có cảm giác dễ
chịu khi ăn cũng như quá trình tiêu hóa được dễ dàng hơn.
Từ trước đến nay, nem chua được chế biến theo phương pháp truyền thống
nên không thể tránh khỏi những nhược điểm của phương pháp này. Đó là phụ thuộc
vào hệ vi sinh vật có trong tự nhiên và có trong thịt, phụ thuộc vào điều kiện giết
mổ, chất lượng thịt, mơi trường bên ngồi, đặc biệt là nhiệt độ…Tất cả những yếu
tố đó khơng thể khống chế được, gây ra sự mất ổn định chất lượng của sản phẩm,
tăng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật khơng mong muốn từ mơi trường hay khó kiểm
sốt được sự phát triển của các tạp khuẩn có trong thịt gây nguy hiểm cho sức khoẻ
người tiêu dùng.
Trong chiến lược cơng nghiệp hóa qui trình sản xuất sản phẩm truyền thống
trên thị trường, việc tạo ra được một sản phẩm có chất lượng ổn định và mùi vị phù
hợp với thị hiếu tiêu dùng của người Việt Nam là cần thiết. Đề tài: “Phân lập và
định danh vi khuẩn lactic lên men nem chua tỉnh Đồng Tháp và Thành phố
Cần Thơ” nhằm mục đích là chủ động được giống vi khuẩn cho sản xuất nem chua,
từ đó làm cơ sở để tăng hương vị thơm ngon, tăng giá trị dinh dưỡng, rút ngắn thời
gian sản xuất, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng, giúp sản phẩm
được sản xuất với qui mô lớn, mang sản phẩm đến thị trường tiêu thụ rộng hơn.

1


1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua
- Khảo sát khả năng sinh acid lactic từ đường glucose
- Định danh một số vi khuẩn lactic bằng phương pháp PCR (polymerase chain
reaction) và giải trình tự gen

2


Chương 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU NGUYÊN LIỆU
2.1.1 Nem chua
Nem chua là một sản phẩm lên men thịt tươi được sản xuất và tiêu thụ nhiều ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Đây là một sản phẩm được sản xuất hồn
tồn thủ cơng, tùy theo kinh nghiệm của từng vùng mà chất lượng và khả năng bảo
quản nem chua rất khác nhau. Bản chất lên men là một quá trình chuyển hóa đường
(cho thêm vào khi chế biến) thành acid lactic nhờ hoạt động vi khuẩn Lactobacillus,
Pediococcus và Micrococcus. Trong đó nhiều nhất và đóng vai trị quan trọng là
Lactobacillus (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Việt Nam có nhiều vùng sản xuất nem nổi tiếng mang nét đặc trưng của từng
vùng như: nem Vẽ (Từ Liêm, Hà Nội), nem Phủ Từ (Bắc Ninh), nem chua Đông Ba
(Huế), nem chua Chợ Huyện (Bình Định), nem chua Ninh Hịa (Khánh Hịa), nem
Thủ Đức (Thành phố Hồ Chí Minh), Lai Vung (Đồng Tháp), Tân Hưng (Tiền

Giang),...( />Bảng 1 Thành phần dinh dưỡng của nem chua
Thành phần dinh dưỡng

Đơn vị

100 g ăn được

Năng lượng

Kcalo

410

H2O

g

68,0

Protein

g

21,7

Glucid tổng số

g

4,3

Lipid

g

3,7

Canxi

mg

24,0

Photpho

mg

78,0

(Nguồn />
3


2.1.2 Hệ vi sinh vật của thịt
Thịt của gia súc khỏe thường ít vi sinh vật, tuy nhiên thịt có thể bị nhiễm bẩn
khi giết mổ, vận chuyển và bảo quản. Hai nguồn chính gây nhiễm vi sinh vật trên
thịt là các cơ quan nội tạng có bệnh hoặc viêm nhễm, đặc biệt là các vi sinh vật ở
đường tiêu hóa và các vi sinh vật từ bên ngồi.
Vi sinh vật thường nhiễm nhiều ở trên bề mặt thịt và phát triển làm cho số
lượng tăng nhanh dần lên, đặc biệt là những miếng thịt giữ trong điều kiện nóng

làm cho số lượng vi sinh vật tăng nhanh, gây cho thịt chóng bị hư hỏng. Ở đây có
thể tìm thấy các bào tử của nấm mốc thuộc các giống như Mucor, Penicilium,… các
giống vi khuẩn như Bacillus, Salmonella,… trong đó các vi sinh vật phát triển trên
thịt ở nhiệt độ lạnh có Achromobacter, Pseudomonas…Ngồi ra nấm men cũng
được thấy phát triển trên thịt (Lương Đức Phẩm, 2002).
Sau khi vi sinh vật phát triển trên thịt sẽ dần ngấm sâu vào bên trong làm hư
hỏng thịt. Quá trình ngấm này phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật và vào những
điều kiện bên ngoài như ẩm độ, nhiệt độ, kỹ thuật bảo quản, phương pháp
chế biến… Vi khuẩn Salmonella trong điều kiện nhiệt độ bình thường sau 24-48 giờ
có thể ngấm sâu vào trong thịt được 14 cm; ở cùng điều kiện, các vi khuẩn hoại sinh
chỉ ngấm được từ 4-5 cm. Ở nhiệt độ thấp, vi khuẩn chỉ ngấm được 1 cm trong một
tháng (Lương Đức Phẩm, 2002).
2.1.3 Thịt nạc
Thịt nạc là nguyên liệu chính để tạo nên sản phẩm nem chua. Vì tính chất
quan trọng như vậy nên thịt heo dùng để sản xuất nem chua cần phải được lựa chọn
kỹ, đạt các yêu cầu như thịt mới mổ (thịt nóng), khơng dùng thịt ơi, sẫm màu.
Ngun liệu làm nem phải dùng thịt nạc đùi sau hoặc thịt mông, khơng rửa qua
nước. Thành phần hóa học của thịt thay đổi tùy theo vị trí miếng thịt trên cơ thể
động vật, trọng lượng cơ thể và giống vật nuôi.
( ).

4


Bảng 2 Thành phần hóa học của thịt
Loại thịt

Thành phần hóa học (g/100 g)
Nước

Bị
Lợn mỡ
Lợn ½ nạc
Lợn nạc

70,5
47,5
60,9
73

Protein Lipid
18
14,5
16,5
19

10,5
37,5
21,5
7

Khống Năng lượng (Cal)
1
0,7
1,1
1

171
406
268

143

Nguồn ( />
2.1.4 Da heo
Da heo có giá trị dinh dưỡng thấp hơn thịt nạc. Da heo được cấu tạo từ
protein colagen và elastin. Từ nguyên liệu da heo sau giết mổ, được rửa sạch sau đó
đem luộc chín, tách mỡ và cắt tạo hình. Da heo đã xử lý đóng vai trị như một chất
độn, chất kết dính các phần tử trong mơ cơ giúp định hình sản phẩm, làm tăng giá
trị cảm quan của nem chua, tăng độ giòn,...Tỉ lệ giữa lượng thịt nạc (heo) và da heo
dùng để sản xuất một mẻ nem chua thường khoảng là 3:7.
( />2.1.5 Các loại gia vị
2.1.5.1 Đường
Đường được sử dụng trong sản xuất nem chua ngồi tác dụng tạo hương vị,
nó cịn là cơ chất cho q trình lên men tạo acid. Do có tính chất háo nước nên
đường giúp trạng thái liên kết gel của thịt thêm chặt chẽ. Trong quá trình sản xuất
nhiều loại đường khác nhau được sử dụng là đường lactose, galactose, maltose,
saccarose...
Quá trình sản xuất nem chua ở phía Nam sử dụng rất nhiều đường, từ 30%35% so với trọng lượng của nguyên liệu chính, ngược lại lượng đường sử dụng ở
các tỉnh phía Bắc thường từ 10%-15% ( />
5


2.1.5.2 Muối
Muối có tác dụng làm tăng vị của sản phẩm, diệt khuẩn, hạn chế sự hoạt
động của vi sinh vật gây thối, tăng cường sự hoạt động của vi khuẩn lactic nên tạo
điều kiện lên men lactic và sản phẩm có hương vị thơm ngon, muối ở nồng độ cao
sẽ ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật, kể cả vi khuẩn lactic. Do đó có thể
điều chỉnh lượng acid lactic theo ý muốn bằng cách khống chế nồng độ muối ở mức
thích hợp (Nguyễn Văn Tiếp et al., 2003).
2.1.5.3 Tỏi

Tỏi được trồng khắp nơi trên thế giới, tỏi là loại gia vị dùng để ướp, khử mùi
hay tạo mùi cho nguyên liệu. Tỏi có vị cay, tính ơn, ngồi làm gia vị, các thành
phần khác trong tỏi cịn có tác dụng kháng sinh mạnh. Ngồi một ít iode và tinh dầu
(100 kg tỏi chứa 60-200 g tinh dầu), thành phần chủ yếu trong tỏi là chất kháng sinh
alicin (C6H10OS2) là một hợp chất sulfur có tác dụng diệt khuẩn rất mạnh đối với vi
sinh vật như Staphylococcus, Salmonella, Shigella…
( />2.1.5.4 Tiêu
Tiêu là một loại gia vị thường được sử dụng để tăng giá trị cảm quan cho sản
phẩm. Thành phần hóa học của tiêu gồm có tinh dầu và hai loại ankaloid là piperin
và chavicine. Ngoài ra cịn một số chất khác như cellulose và muối khống. Tiêu có
vai trị tạo vị cay, kháng vi khuẩn, kháng nấm mốc, kích thích tiêu hóa.
( />2.1.5.5 Ớt
Cũng như tỏi, ớt cũng là một loại gia vị tạo vị cay giúp tăng giá trị cảm quan
cho thực phẩm. Trong 100 g ớt có khoảng 91% nước, 1,3% protid, 5,7% glucid, 250
mg vitamin C, 10 mg caroten. Lượng tinh dầu trong ớt chiếm tỷ lệ khá cao 12%
gồm capsisina, casaicine (ankaloid). Ngoài ra trong ớt cịn có vitamin K và một số
chất khoáng ( />
6


2.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC
2.2.1 Định nghĩa quá trình lên men lactic
Lên men lactic là q trình chuyển hóa sinh học kị khí chứa các hợp chất
đường thành acid lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác (Nguyễn Thành Đạt,
2001).
2.2.2 Acid lactic
Acid lactic là sản phẩm của quá trình lên men lactic bởi vi khuẩn
Lactobacillus, sản phẩm cuối cùng của quá trình đường phân kị khí glucose. Acid
lactic là chất lỏng khơng màu, không mùi; khối lượng riêng 1,24 g/cm 3; tnc = 18oC; ts
= 119oC/12 mmHg, tan trong nước, etanol... Acid lactic tồn tại ở hai dạng đồng

phân quang học là D-acid lactic và L-acid lactic.
Công thức phân tử: C3H6O3
Công thức cấu tạo: CH3-CHOH-COOH
( />2.2.3 Vi khuẩn lactic
Năm 1780, nhà bác học Thụy Điển Schaele lần đầu tiên đã tách được acid
lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1857, L. Pasteur đã chứng minh rằng sữa chua
là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm
1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactis,
nay gọi là Streptococcus lactis (Nguyễn Thành Đạt, 2001).
2.2.3.1 Đặc điểm chung
Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu (hoặc hình ovan) và hình que, kích
thước 0,5-1,1 µm, đơi khi đến 1,6 µm, tạo khuẩn lạc nhỏ 2 mm-5 mm, khuẩn lạc có
đặc điểm bìa liền, lồi, nhẵn, sáng (Kandler và Weiss, 1986).
Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, Gram
dương, kị khí khơng bắt buộc. Các lồi vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành acid
lactic rất khác nhau trong môi trường và như vậy sức chịu acid (hay độ bền với

7


acid) cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn
(khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển
ở pH trong khoảng 3,8-4. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH
trong khoảng 5,5-6 (Lương Đức Phẩm, 2002).
Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 35 oC, các lồi
ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40oC-45oC, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối
thấp (5oC hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60 oC-80oC hầu hết chúng bị chết sau 1030 phút. Trong tự nhiên vi khuẩn lactic thường gặp trong đất, khơng khí, trong nước
nhưng chủ yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa,
thịt...) (Lương Đức Phẩm, 2002).
2.2.3.2 Một số giống vi khuẩn lactic

* Lactobacillus
Vi khuẩn Lactobacillus đều là Gram dương, kích thước 0,5-1,1µm đơi khi
lên tới 1,6 µm, dạng trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối thích
để Lactobacillus sinh trưởng là 30°C-40°C và pH từ 5,5-6,2. Lactobacillus phát
triển dưới điều kiện kị khí hoặc thiếu oxy. Khuẩn lạc có dạng bìa liền, lồi, nhẵn,
sáng (Kandler và Weiss, 1986).
Tùy vào điều kiện môi trường sống, hình dạng của vi khuẩn Lactobacillus
thay đổi từ que ngắn đến que dài, sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ.
Lactobacillus chiếm phần lớn nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, chúng rất phổ biến và
thơng thường là có lợi (Hồ Nhân, 2008).
* Streptococcus
Giống Streptococcus có dạng hình cầu hoặc hình ovan, đường kính tế bào
0,5-1 µm. Sau khi phân chia chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn.
Streptococcus thuộc dạng lên men lactic đồng hình, Gram dương, catalase âm tính,
khơng sinh bào tử, khơng di động và kỵ khí tùy ý (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
* Leuconostoc
Giống Leuconostoc có đường kính từ 0,5-0,8 µm và chiều dài khoảng 1,6
µm, trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi trịn, chiều dài khoảng 1,3 µm.

8


Sau khi phân chia Leuconostoc thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám
tập trung (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Leuconostoc thường là vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc và có nhu cầu cao về
dinh dưỡng. Leuconostoc phát triển từ 20°C-30°C và khơng phát triển ở 45°C. Đó là
những giống lây nhiễm thường xuyên trong thực phẩm và gây ra những rủi ro trong
quá trình sản xuất nhất là trong các sản phẩm đường, sản phẩm acid hay trong các
sản phẩm thực vật khác. Leuconostoc có vai trị chính trong q trình lên men
malolactic của rượu vang và chúng cần thiết cho sự lên men của một vài loại

phơmai. Ngồi ra, Leuconostoc cũng tham gia trong việc chế biến các sản phẩm
thức ăn gia súc lên men và trong các sản phẩm rau quả lên men (Roissart và Luquet,
1994; Guiraud, et al., 1998).
Leuconostoc thuộc nhóm lên men lactic dị hình, catalase âm tính.
Leuconostoc phát triển chậm, thường gây nên mơi trường có độ nhớt cao mặc dù
chúng có thể tạo ra các hợp chất thơm như axetyle, axetole,…(Larpent et al., 1997).
* Pediococcus
Pediococcus có dạng tứ cầu hoặc song cầu. Pediococcus cần nhu cầu dinh
dưỡng cao và hoạt tính thủy phân protein yếu. Khuẩn lạc có màu vàng xanh, kích
thước khuẩn lạc 1-3 mm, hình dạng khuẩn lạc trơn láng (Nguyễn Thành Đạt, 2001).
Vi khuẩn lactic cũng được phân loại tùy theo hình thức lên men của chúng,
chúng được chia làm hai loại gồm nhóm vi khuẩn lactic đồng hình và nhóm vi
khuẩn lactic dị hình.
* Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình
Lactobacillus plantarum thường hiện diện trong nước bọt và đường tiêu hóa
của người. Tên khác của Lactobacillus plantarum là Lactobacillus pentosus,
Lactobacillus arabinosus (Robert, 1957). Lactobacillus plantarum là vi khuẩn kị
khí, ngẫu nhiên, trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối thích cho
vi khuẩn này sinh trưởng là 30oC (Lương Đức Phẩm, 2002). Lactobacillus
plantarum thường được sử dụng trong q trình lên men thực phẩm (ví dụ một số
loại thực phẩm có chứa Lactobacillus plantarum như yaourt, phơmai, kim chi, xúc
xích, muối chua rau dưa ...) (Lương Đức Phẩm, 2002). Lactobacillus plantarum có

9


thể làm tăng hoạt động trao đổi chất trong tế bào đường ruột, kích thích phản ứng
miễn dịch (Nissen et al., 2009). Lactobacillus plantarum được chứng minh có khả
năng giảm cholesterol khi chủng riêng rẽ hoặc kết hợp với Lactobacillus paracasei
trong khẩu phần ăn của chuột (Hanaa et al., 2009). Ngồi ra, Lactobacillus

plantarum cịn có thể tạo ra bacteriocin ức chế sự tăng trưởng của Lactobacillus
casei, Lactobacillus sakei, Lactobacillus delbreckii subsp, Lactobacillus bulgaricus,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus cloacae và Pseudomonas
aeruginosa (Todorov và Dicks, 2005).
Lactobacillus acitophilus là trực khuẩn, Gram dương, có khả năng lên men
các loại đường như glucose, fructose, galactose, manose, mantose. Chúng hồn tồn
khơng có khả năng lên men xylose, arabinose, glycerol manitol, sorbitol. Trong quá
trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học của acid lactic. Nhiệt
độ tối ưu để Lactobacillus acitophilus phát triển là 45oC-50oC (Nguyễn Thành Đạt,
2001).
Lactobacillus farciminis thường được tìm thấy trong các thực phẩm như sản
phẩm thịt, xúc xích. Các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng Lactobacillus làm
giảm các cơn co thắt cơ bụng trong tình trạng viêm ruột kết ở chuột, có thể được
dùng trong điều trị hoặc phịng ngừa bệnh lý viêm mãn tính hay cấp tính ở ruột
(www.international.inra.fr/.../mechanisms_of_action_of_the_probiotic_lacto).
- Nhóm vi khuẩn lactic dị hình
Lactobacillus brevis được tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải,
dưa chuột nên còn được gọi là trực khuẩn bắp cải. Trong lên men, ngồi acid lactic
(1,2%) nó cịn tạo thành acid acetic, etanol (tới 2,4%), và CO 2, nó cịn tạo hương
làm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu (Lương Đức Phẩm, 2002).
Weissella paremesenteroides đã được tìm thấy trên dưa chuột về khả năng
sinh bacteriocin DFR-8 có thể ngăn chặn một số lượng lớn mầm bệnh như Listeria
monocytogenes (Pal và Ramana, 2010).
2.2.3.3 Ý nghĩa thực tế của lên men lactic
Vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là
trong công nghiệp chế biến sữa. Các vi khuẩn này có một ý nghĩa rất lớn trong sản
xuất sữa, phômai, trong việc muối chua rau quả ủ chua thức ăn chăn nuôi. Những

10

năm gần đây vi khuẩn lactic đã được đưa vào trong việc chế biến một số dạng giị
chả, xúc xích...
Trong công nghiệp đã xây dựng các dây chuyền công nghệ lên men để sản
xuất acid lactic. Acid lactic được dùng nhiều cho công nghệ đồ hộp và bánh kẹo,
sản xuất thức ăn kiêng, thức ăn chống suy dinh dưỡng ở người già và trẻ em...
nguyên liệu dùng trong sản xuất acid lactic là mật bột, tinh bột và những vật liệu
chứa tinh bột (Lương Đức Phẩm, 2002).
Trong quá trình lên men thịt, chức năng chính của vi khuẩn lactic là làm pH
của bột thịt giảm nhanh (tăng tính ổn định của sản phẩm và khả năng sống của vi
khuẩn lactic bằng cách ức chế những vi sinh vật gây hư hỏng khơng mong muốn).
Vi khuẩn lactic cịn góp phần tạo ra những thay đổi sinh hóa để có được những đặc
điểm cảm quan mới cho độ chín của sản phẩm (Ho et al., 2009).
Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh
vực probiotic (Champ et al., 1983). Hoạt động của Lactobacillus rất hiệu quả trong
việc tạo khả năng bám dính vào tế bào, loại trừ hoặc làm giảm sự lan truyền bệnh
(Muralihara, 1977).
Lactobacillus có vai trị sinh thái trong ống tiêu hóa của một số lồi cá như
sản xuất chất kháng khuẩn, tăng cường các phản ứng miễn dịch, tăng cường khả
năng hấp thu các chất dinh dưỡng và tăng sử dụng một số carbohydrate khó tiêu.
Ngồi ra Lactobacillus cũng hiện diện trong ống tiêu hóa của một số lồi động vật
khơng xương sống (Fuller, 1989; Havenaar et al., 1992).
2.2.6 Lên men lactic
Lên men lactic đồng hình là loại lên men lactic hầu như chỉ cho sản phẩm là
acid lactic.
C6H12O6

2C3H6O3 + 94 kcal

(Glucose)

(Acid lactic)

Lên men lactic dị hình là loại lên men, ngồi acid lactic cịn có các sản phẩm
khác như acid acetic, ethanol, CO2.
C6H12O6
(Glucose)

C3H6O3 + C2H4(COOH)2 + CH3COOH + C2H5OH + CO2 + H2
(Acid lactic) (acid succinic)

11

(acid acetic)

(etanol)


(Lương Đức Phẩm, 2002)
2.2.7 Điều kiện của quá trình lên men lactic
2.2.7.1 Các cấu tử môi trường
Glucid là một trong những thành phần chủ yếu của môi trường cần thiết cho
q trình lên men. Khi ni cấy các vi sinh vật khác nhau, người ta dùng nồng độ
đường khác nhau. Trong suốt q trình sinh hóa, các vi khuẩn lactic chuyển glucose
thành acid lactic, thành phần chính làm giảm pH. Việc sản sinh acid lactic giúp bảo
quản sản phẩm do vi khuẩn lactic ngăn chặn tác nhân gây bệnh, vi khuẩn gây hư
hỏng. Mặt khác vi khuẩn lactic góp phần tạo tính chất cảm quan đặc biệt của sản
phẩm thịt lên men. Vì vậy, có thể điều chỉnh tiến trình lên men thông qua việc điều
chỉnh lượng đường (Consuelo et al., 2006).
Ngồi ra, vi khuẩn lactic cịn có nhu cầu về chất dinh dưỡng phức tạp, không

một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên mơi trường muối khoáng
thuần khiết chứa glucose và NH 4, đa số chúng cần hàng loạt các vitamin như
lactoflavin, thiamin, acid pantotenic, acid folic, biotin…và các acid amin (Nguyễn
Lân Dũng et al., 1997).
2.2.7.2 Các nhân tố bên ngoài
* Nhiệt độ
Mỗi loài vi sinh vật đều có một u cầu nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển.
Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng, một số lồi có thể phát
triển ở 55oC trong khi một số lồi khác có thể phát triển được ở 5 oC. Nói chung, đa
số vi khuẩn lactic có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 10 oC-40oC. Ảnh hưởng
của nhiệt độ có lẽ nhiều nhất là đến các phản ứng enzym. Trong một khoảng nhiệt
độ nào đó thì tốc độ phản ứng enzym tăng khi nhiệt độ tăng, nếu tiếp tục tăng nhiệt
độ thì sẽ xảy ra sự biến tính protein (Đồng Thị Thanh Thu, 1995).
* pH của môi trường
Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzym của chúng, chịu tác
động mạnh của pH. Mỗi enzym đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của

12


enzym cao nhất. Các vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,6-6,2
(Lactobacillus); 5,5-6,5 (Pediococcus) (Trần Minh Tâm, 1998). Trong quá trình lên
men lactic, acid lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác. Sau
đó khi lượng acid tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế. Tốc độ
phát triển cũng như lượng sản phẩm trao đổi chất sẽ giảm khi lượng acid lactic quá
nhiều. Acid lactic sinh ra làm giảm pH của sản phẩm và là một phương thức bảo
quản sản phẩm hữu hiệu. pH < 4 vi khuẩn lactic ngừng hoạt động (Trần Minh Tâm,
1998).
* Oxy
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn yếm khí khơng bắt buộc. Do đó, oxy khơng ảnh

hưởng đến q lên men của vi khuẩn tuy nhiên càng thiếu oxy sẽ có lợi cho q
trình lên men lactic (Trần Minh Tâm, 1998).
2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA
Quá trình lên men lactic trong sản xuất nem chua xảy ra đồng thời hai q
trình sinh hóa là quá trình lên men lactic và quá trình thủy phân protein. Trong quá
trình lên men lactic, các vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa lượng đường có trong nem
thành acid lactic và các sản phẩm phụ tạo cho nem có vị chua và các mùi vị khác
đặc trưng. Trong quá trình lên men lactic, vi khuẩn lactic tạo ra một lượng nhỏ
protease góp phần vào q trình thủy phân protein. Song song với quá trình lên men
lactic là quá trình thủy phân protein được thực hiện bởi enzyme protease có sẵn
trong nguyên liệu và do vi sinh vật tạo ra trong q trình trao đổi chất của nó, tạo
thành các polypeptid, peptid, acid amin làm tăng chất lượng sản phẩm.
Mặt khác, acid lactic tạo thành từ quá trình lên men làm giảm pH của thịt
xuống thấp (khoảng 4,5) làm protein của thịt bị đơng tụ. Bên cạnh đó mơi trường
acid cịn giúp ức chế hoạt động của các vi khuẩn gây thối rữa, giúp miếng nem
không bị hư hỏng trong quá trình bảo quản. Tuy nhiên, ở pH này khơng ức chế
được nấm mốc phát triển, nên cần có biện pháp pháp chống nấm mốc để bảo quản
nem chua được lâu (Nguyễn Lân Dũng et al., 1997).

13


2.4 MỘT SỐ HIỆN TƯỢNG XẢY RA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
2.4.1 Sự acid hoá
Phản ứng đặc trưng nhất trong các quá trình lên men các sản phẩm thịt là sự
acid hố. Đây là kết quả của q trình dị hố đường bởi các vi sinh vật. Q trình
acid hố cần thiết để đạt được một cấu trúc và độ rắn chắc thích hợp của sản phẩm
cuối cùng. Các protein của cơ hồ tan bởi muối sẽ được keo hố trở lại nhờ q
trình acid hố. Q trình này đem lại hương vị cho sản phẩm, chủ yếu là hương vị
acid, cho phép đảm bảo tính khơng độc hại, sự ổn định của sản phẩm (Susanna,

2001).
2.4.2 Biến đổi màu sắc
Màu sắc đặc trưng của sản phẩm thịt được xác định bởi các sắc tố có trong
thịt. Myoglobin chính là sắc tố quyết định màu sắc của thịt, chất này chiếm khoảng
80% sắc tố của cơ. Sắc tố này có 3 dạng gồm Oxymyoglobin (màu đỏ tươi),
myoglobin dạng khử (màu đỏ tía), metmyoglobin hay myoglobin dạng oxy hố
(màu đỏ sẫm đến nâu). Màu sắc được gây nên bởi các yếu tố như tỉ lệ các sắc tố,
phụ thuộc vào chủng giống con vật, cấu trúc cơ thịt, cấu tạo của phân tử sắc tố ở
dạng oxy hoá hay dạng khử (Lê Ngọc Tú et al., 2003).
Cấu tạo hoá học của sắc tố còn phụ thuộc vào giá trị pH. pH cao thì
myoglobin ở dạng khử, khi pH giảm nhanh thì sắc tố ở dạng metmyoglobin (Lê
Ngọc Tú et al., 2003).

2.4.3 Biến đổi hương thơm
Các sản phẩm thịt lên men có hương thơm đặc trưng là nhờ muối gia vị, các
acid cùng tất cả các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các carbohydrate,
protein và chất béo.
Trong lên men tự nhiên, các vi sinh vật hiện diện chủ yếu là lồi
Micrococcus và Lactobacillus. Vai trị chính của Lactobacillus là sinh ra các acid
quan trọng trong việc hình thành các chất tham gia vào quá trình tạo hương. Các

14


lồi lên men dị hình đưa lại cho sản phẩm hương thơm nhờ việc sinh ra các acid dễ
bay hơi, rượu và CO2 (Susanna, 2001).
2.5 PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT PCR
2.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR do Mullis phát minh vào năm 1985 được sử dụng rộng rãi
nhất. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền

nhờ enzym polymerase) là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự ADN đặc hiệu in
vitro, không cần sự hiện diện của tế bào; chỉ với sự hiện diện của một cặp mồi
(primers pair) chuyên biệt, enzym ADN polymerase, các nucleotide tự do, dung
dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Đây là
sự khuếch đại theo cấp số nhân. Đoạn trình tự ADN đặc trưng sẽ được khuếch đại
với số lượng là 2n-1 với n là số chu kỳ phản ứng. Theo tính tốn sau 30 chu kỳ, sự
khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu. Mỗi chu kỳ phản ứng gồm
ba bước.
Giai đoạn biến tính (denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm
các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94oC- 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn lai (hybridization): nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các
mồi) cho phép các mồi bắt cặp vào khuôn; trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động
trong khoảng 40oC-70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây-1
phút.
Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elonggation): nhiệt độ được tăng lên đến
72oC giúp cho ADN polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động
tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại,
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Những phản ứng này được thực hiện nhờ Taq polymerase, và sự thay đổi chu
kỳ nhiệt độ một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ để tách dây đôi thành dây đơn và
nhiệt độ cho đoạn mồi gắn vào vùng mục tiêu trên dây nền (annealing).

15


Sự phát hiện và phân lập một ADN polymerase (Taq polymerase) có tính ổn
định cao đối với nhiệt độ, từ vi khuẩn chịu nhiệt (thermophilic) Thermus aquaticus
(Taq), cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây ADN có tính chất lặp lại nhiều lần

(Saiki et al, 1998), số lượng khuếch đại tăng theo hàm số mũ, làm cho công nghệ
sinh học có thêm một phương tiện rất có giá trị để ứng dụng cho nhiều lĩnh vực
nghiên cứu khác nhau (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004).
2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Mồi và nhiệt độ lai:
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có
hiệu quả cao. Trình tự của mồi được chọn sao cho khơng thể có sự bắt cặp bổ sung
giữa mồi xuôi (sense) và mồi ngược (antisense) và cũng khơng có những cấu trúc
“kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. Tm của mồi
xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau. Thành phần nucleotide của các mồi
phải cân bằng tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC. Các mồi được chọn phải đặc trưng
cho trình tự ADN cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lai trên gene.
Trình tự nằm giữa hai mồi xi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu
trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹthuat-PCR-can-ban-30k).
ADN mẫu
Phản ứng PCR tối ưu khi ADN thật tinh sạch. Tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩn
đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả đối với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào
hoặc ngay cả mẫu ADN không được bảo quản tốt. Ngoài ra, phản ứng PCR tối ưu
cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu. Lượng ADN mẫu sử dụng cũng có khuynh
hướng giảm (1 µg xuống cịn 100 ng) khi sử dụng các ADN polymerase cho hiệu
quả cao. Việc giảm lượng mẫu cịn hạn chế được sự khuếch đại “kí sinh” tạo những
sản phẩm phụ không mong muốn.
(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹthuat-PCR-can-ban-30k).

16


Enzym
Enzym được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I. Đây

là enzym không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Hiện nay, một số
enzym mới có hiệu quả hơn. ADN polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi
khuẩn hiện diện trong suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzym này được viết tắt
Taq polymerase. Polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt
động như một enzym phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mg 2+; ngược
lại, khi khuôn là ADN và có ion Mg 2+, enzym này lại xúc tác phản ứng khuếch đại
ADN (http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18Kỹ-thuat-PCR-can-ban-30k).
dNTP
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200 µM/mỗi
nucleotide. Nồng độ cao hơn dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Sự mất cân bằng
trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹthuat-PCR-can-ban-30k).
Nồng độ ion Mg2+
Mg2+ là cofactor cho hầu hết các ADN polymerase, đặc biệt là các ADN
polymerase chịu nhiệt thường dùng. Khi nồng độ Mg 2+ quá thấp (< 0,5 mM) làm
giảm phản ứng kéo dài mạch ADN do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế.
Ngược lại, nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn,
dẫn đến nhiều sản phẩm khơng đặc hiệu. Do đó, nồng độ tối ưu của Mg 2+ phải được
xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹthuat-PCR-can-ban-30k)
Số chu kì của phản ứng PCR
Trong thực tế, số lượng chu kì của phản ứng PCR khơng vượt q 40 chu kì
do hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của
phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được
tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau...

17


(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹthuat-PCR-can-ban-30k).

2.6 Điện di gel agarose
Sau phản ứng PCR, các ADN của vi khuẩn được nhuộm bởi Ethidium
bromide và điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV.
2.6.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các
nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.6.2 Gel agarose
Đây là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng
để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5-20 kb. Gel được đổ trên
một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một
hóa chất có tên là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các
base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Trong
thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điện di, gel được
chiếu sáng bằng tia tử ngoại, nucleic acid sẽ hiện dưới dạng những vạch màu đỏ
cam (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.7 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ADN
Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương
pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và
giải các nhầm lẫn do kỹ thuật. Có hai loại mồi xi và mồi ngược được sử dụng cho
mỗi mạch đơn ADN. Tiến hành biến tính ADN trong mơi trường có urea và nhiệt
độ cao (khoảng 55ºC), hai mạch đơn ADN tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau.

18


Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotide, từ đó tổng hợp

được trình tự sắp xếp các gen.
Các máy giải trình tự gen thơng dụng của hãng ALF II (Pharmacia), Simadu
(Nhật)...có kèm theo phần mềm xử lý số liệu, kit hóa chất tiêu chuẩn bán. Giải trình
tự gen cần tùy theo từng loại máy giải trình tự để tạo dung mơi và các điều kiện
thích hợp, đảm bảo độ chính xác kết quả (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.8 PHẦN MỀM PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ (BLAST)
BLAST là chương trình so sánh cấu trúc của chuỗi ADN, chuỗi amino acid
cần phân tích với các chuỗi tương ứng lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu, nhằm tìm
kiếm chuỗi (hay một số chuỗi) tương đồng nhất với chuỗi cần kiểm tra. Sau đó,
người phân tích sẽ khai thác các thơng tin về đặc điểm hay đặc tính đã biết của các
chuỗi trong ngân hàng để dự đoán xác định cấu trúc và đặc tính của chuỗi kiểm tra.
Trọng tâm của kỹ thuật phân tích là tìm kiếm xác định các vùng tương đồng nhau
về cấu trúc trên các chuỗi để xác định mức độ phân ly tương đối của chuỗi cần phân
tích với chuỗi khác trong ngân hàng dữ liệu. Về phương diện kỹ thuật chương trình
BLAST cho phép phát hiện sự tương đồng ở hai mức độ là mang tính cục bộ ở một
vùng hay mang tính tổng thể giữa hai chuỗi với nhau (Nguyễn Văn Cách, 2005).
Có 5 chương trình BLAST là BLAST N, BLAST P, BLAST X, TBLAST N,
TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide- Nucleotide BLAST) cho phép so
sánh cấu trúc chuỗi nucleotide cần phân tích với cấu trúc chuỗi nucleotide trong
ngân hàng dữ liệu (Madden, 2003)
Sử dụng phần mềm phân tích trình tự BLAST tại địa chỉ
và kết nối trực tiếp trên mạng để xác định
tên và trình tự cặp mồi sử dụng. Đồng thời hỗ trợ thêm của phần mềm ADN club để
chuyển trình tự của mạch đơn thành trình tự bổ sung.

19


Chương 3

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
3.1.1 Thời gian thực hiện
Từ tháng 06 năm 2009 đến tháng 07 năm 2010.
3.1.2 Địa điểm
Mẫu được thu từ 6 hiệu nem tại huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp gồm Út
Thẳng được kí hiệu là UT, Tư Kiên được kí hiệu là TK, Giáo Thơ được kí hiệu là
GT, Cơ Hiệp được kí hiệu là CH, Thanh Sơn được kí hiệu là TS, Sáu Xệ được kí
hiệu là SX và nem ở tại Cần Thơ gồm nem Cái Răng (Cơ Phúc được kí hiệu là CP),
Thanh Vân được kí hiệu là TV (Cần Thơ).
Thí nghiệm được thực hiện tại phịng thí nghiệm Sinh học Khoa Khoa Học
Tự nhiên và phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ .

Hình 1: Tên một số loại nem được dùng trong phân lập

20


3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1 Dụng cụ, thiết bị
- Các dụng cụ thơng thường trong phịng thí nghiệm: đĩa Petri, ống nghiệm,
que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, kính mang vật, kính đậy vật...
- Cân phân tích (Mettler Toler, Switzerland)
- Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)
- Máy lắc (Heidolph MR3001, Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt (HVE.50)
- Máy li tâm (Eppendorf, Đức)
- Tủ sấy (Memmer, Đức)

- Máy đo pH (Thermo Oriox, Belgium)

A

B

D
C
Hình 2 Một số dụng cụ trong phịng thí nghiệm

21


Chú thích: A: Máy PCR Perkin Elmer 9700
B: Khn đổ gel
C: Máy đọc và chụp Gel Bio-Rad UV 2000
D: Máy ly tâm Eppendorf

3.2.2 Hóa chất
Các hóa chất pha mơi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe )
Bảng 3 Môi trường MRS
Thành phần

Khối lượng (g/l)

Pepton from casein
Meat extract
Yeast extract

10,0
8,0
4,0

D (+) glucose

20,0

Dipotassium hydrogen phosphate

2,0

Tween 80

1,0 ml

Di-amonium hydrogen phosphate citrate

2,0

Sodium acetate

5,0

Magnesium sulfate

0,2

Manganese sulfate

0,04

Agar

14

Hóa chất dùng để nhuộm Gram
Dung dịch crystal violet
Dung dịch Lugol iodine
Dung dịch safranin
Hóa chất dùng để trích ADN vi khuẩn lactic
Mơi trường LB (Luria Bertani)

22


Bảng 4 Môi trường LB
Thành phần

Khối lượng (g/l)

Bacto yeast extract
Bacto tryptone
NaCl

5
10
10

TE để hòa tan ADN (gồm 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA).

Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% hòa tan ADN và giúp proteinase K hoạt
động tách protein khỏi ADN hiệu quả hơn.
Isopropanol nhằm tủa ADN và etanol 70% dùng rửa ADN
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75 M.
Proteinase K (20 mg/ml) để loại bỏ protein hoặc polysaccharid khỏi ADN.
Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) nhằm tủa protein và tạo màng ngăn
giữa ADN và protein.
Lysozyme và RNase A ; nước cất hai lần vơ trùng.
Hóa chất dùng để chạy PCR nhận diện vi khuẩn lactic
PCR buffer, Taq-polymerase
ADN vi khuẩn
Deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs) gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP
Nước cất vơ trùng, primer
Hóa chất dùng để chạy điện di sản phẩm PCR
Agarose 1%-1,2%, TAE buffer (hỗn hợp của Tris base, Acetic acid và
EDTA), loading buffer, Ethidium bromide (EtBr), ADN chuẩn để ước lượng kích
thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose.
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phân lập vi khuẩn lactic
2 g mẫu nem được cho vào bình tam giác 100 ml nước cất đã khử trùng, lắc
trên máy lắc khoảng 30 phút. 50 µl dung dịch sau khi lắc được cho vào dĩa petri có
chứa mơi trường đặc MRS đã chuẩn bị trước. Mẫu được trải đều và ủ ở 30 oC trong
3 ngày. Các dạng khuẩn lạc khác nhau tạo vòng tan CaCO 3 trên môi trường MRS

23


được chọn và cấy chuyển sang các dĩa môi trường khác cho đến khi các khuẩn lạc
được rời rạc qua các đường cấy. Cuối cùng chuyển một khuẩn lạc rời vào ống
nghiệm chứa mơi trường MRS đặc. Các dịng vi khuẩn được kiểm tra rịng trên

kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Sau đó các dịng vi khuẩn này được cấy ria
trên môi trường đặc MRS, ủ ở nhiệt độ 30 oC. Sau 3 ngày quan sát hình dạng của
khuẩn lạc.
Q trình phân lập trên được tóm tắt theo sơ đồ dưới đây
Mẫu

Cho 50 µl vào dĩa petri chứa môi trường MRS đặc
Trải vi khuẩn
Ủ ở 30oC trong 3 ngày

Cấy chuyền ra dĩa thạch

Tách ròng

Cấy vào ống thạch nghiêng

Trữ ở 4oC
3.3.2 Xác định vi khuẩn lactic bằng thử nghiệm sinh hóa
3.3.2.1 Nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi
Nhuộm Gram được thực hiện theo quy trình như sau:
Dùng que cấy đã khử trùng trải mỏng một ít vi sinh vật trên kính mang vật đã
chuẩn bị 10 µl nước cất vô trùng. Sau khi trải mỏng, mẫu vật được cố định bằng

24


cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó, vi khuẩn được nhuộm với một đến hai giọt
crystal violet trên kính mang vật trong 2 phút.
Sau khi rửa tiêu bản bằng nước cất vô trùng và để khô, tiếp tục cho một đến
hai giọt dung dịch iod lên kính mang vật trong 1 phút. Tiêu bản được rửa bằng nước

cất vô trùng hai lần và rửa bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy hết màu tím của crystal
violet. Sau đó tiêu bản được rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây và để khô.
Vi khuẩn được tiếp tục nhuộm bằng một đến hai giọt fushin, rồi trải đều bằng
que cấy trong 1 phút. Cuối cùng tiêu bản được rửa bằng nước cất vô trùng, để khô
và quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram
của vi khuẩn. Vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím xanh, vi khuẩn Gram âm có
màu hồng đỏ.
3.3.2.2 Phản ứng catalse
Enzym catalase được tìm thấy trong đa số vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn hiếu
khí, có khả năng biến đổi H 2O2 thành O2 và H2O. Catalase có thể được phát hiện
bởi một thí nghiệm đơn giản bằng cách cho một giọt H 2O2 vào mơi trường đặc có
khuẩn lạc vi khuẩn, nếu như có hiện diện của bọt khí chứng tỏ vi khuẩn có phản
ứng catalase và thí nghiệm dương tính, ngược lại khơng có bọt khí là trắc nghiệm
âm tính (Lê Duy Linh et al., 2001). Vi khuẩn lactic có phản ứng catalase âm tính
(Vũ Thị Minh Đức, 2001).
3.3.3 Thử khả năng sinh acid tổng của các dòng vi khuẩn phân lập với đường
glucose
Vi khuẩn sau khi nuôi một ngày trong môi trường MRS lỏng được đo mật độ
quang (OD) ở bước sóng 600 nm để xác định sinh khối tương đối của vi khuẩn. Sau
đó, các dịng vi khuẩn được pha lỗng cho cùng sinh khối trước khi cho vào mơi
trường nuôi để xác định khả năng sinh acid tổng bằng cách pha loãng ở cùng giá trị
mật độ quang.
Hàm lượng acid sinh ra được xác định bằng cách cho 45 ml nước cất chứa 1
ml dung dịch chỉ thị phenophtalein cho vào bình tam giác 250 ml. pH của dung dịch

25