Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu (lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo được

M U ........................................................................................................4
Ch ơng 1. Tổng quan tài liệu ........................................................................... 6
1.1. Giới thiệu về cây lạc ............................................................................. 6
Ch ơng 2. ( ngắn gọn và gộp những cáci gì giữa vừng và lạc) ......................... 6
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại, và phân bố ................................................ 6
2.1.1.1. Nguồn gốc ............................................................................ 6
2.1.1.2. Phân loại .............................................................................. 6
2.1.1.3. Sự phân bố của lạc ............................................................... 7
a. Diện tích, sản lợng trồng lạc của các nớc trên thế giới....................................................8
2.1.2. Di truyền học cây lạc .................................................................... 8
2.1.3. Tình hình sản xuất lạc .................................................................. 8
2.1.3.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ....................................... 8
2.1.3.2. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam ........................................ 9
2.1.4. Một số ph ơng pháp chọn tạo giống cây lạc và vừng ................... 11
2.1.4.1. Xây dựng tập đoàn giống và cảI tiến quần thể .................... 11
2.1.4.2. Chọn tạo giống lạc bằng ph ơng pháp lai hữu tính ............... 11
2.1.4.3. Xử lý đột biến ...................................................................... 12
2.2. Giới thiệu về cây vừng ........................................................................ 13
2.2.1. Nguồn gốc, Phân loại và phân bố ............................................... 13
2.2.2. Tình hình sản xuất vừng ............................................................. 14
2.3. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phân tích đa hình kiểu
gen ............................................................................................................ 15
2.3.1. Ph ơng pháp phân tích RAPD (Random Aplified Polymorphic
DNA) ..................................................................................................... 15
2.3.1.1. Nguyên lý ........................................................................... 15
2.3.1.3. u nh ợc điểm của ph ơng pháp RAPD ................................... 17
2.3.1.4. ứng dụng ............................................................................ 17
2.3.2. Ph ơng pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats) ........... 19
2.3.2.1. Nguyên lý ........................................................................... 19
2.3.2.2. Ph ơng pháp ........................................................................ 20
2.3.2.3. u nh ợc điểm ....................................................................... 20

2.3.2.4. ứng dụng ............................................................................ 21
Ch ơng 3. Nguyên liệu và ph ơng pháp .......................................................... 22
3.1. Nguyên liệu nghiên cứu ...................................................................... 22
3.1.1. Nguyên liệu thực vật .................................................................. 22
1
3.1.2. Thiết bị và hóa chất .................................................................... 22
3.2. Ph ơng pháp nghiên cứu ..................................................................... 22
3.2.1. Tách chiết ADN từ lá ................................................................. 22
3.2.2. Xác định hàm l ợng và độ tinh sạch của ADN .............................. 24
3.2.2.1. Ph ơng pháp đo quang phổ ................................................. 24
3.2.2.2. Ph ơng pháp điện di trên gen agarose ................................. 25
3.2.3. Ph ơng pháp phân tích tính đa hình ADN ..................................... 26
3.2.3.1. Ph ơng pháp PCR-RAPD .................................................... 26
3.2.4. Ph ơng pháp PCR-SSR ............................................................... 27
3.2.5. Phân tích số liệu ........................................................................ 29
Ch ơng 4. Kết quả và thảo luận ..................................................................... 30
4.1. kết quả Tách ADN tổng số ................................................................ 30
4.1.1. Cải tiến quy trình tách ADN tổng số (Phải nêu rõ cải tiến ở chỗ
nào?? Và theo cô thì phân fnày không cân fthiết cho vào LV) ............... 30
4.1.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số .................................................. 32
b. Phổ hấp thụ của ADN tách chiết.................................................................................32
c. Điện di kiểm tra ADN tổng số.....................................................................................33
4.2. đánh giá tính đa hình ADN tập đoàn giống lạc và vừng ...................... 33
4.2.1. Phân tích tính đa hình ADN lạc bằng ph ơng pháp SSR .............. 33
4.2.1.1. Cặp mồi L37 ....................................................................... 34
d. Sản phẩm SSR của mồi L37 điện di trên gen polyacrylamide 6%.............................35
4.2.1.2. Cặp mồi L36 ....................................................................... 36
e. Sản phẩm SSR của mồi L36 điện di trên gen acrylamide 6%.....................................36
4.2.1.3. Kết quả phân tích ADN tập đoàn lạc bằng ph ơng pháp SSR
.......................................................................................................... 37

4.2.1.4. Mối quan hệ di truyền giữa các giống lạc dựa trên phân tích
SSR. ................................................................................................. 39
f. Sơ đồ hình cây tập đoàn giống lạc theo hệ số của và kiểu phân nhóm gì??....42
g. Biểu đồ đa chiều (MDS) biểu diễn mối quan hệ giữa các giống lạc nghiên cứu (chú ý: thứ tự
ký hiệu các giống theo phụ lục 1).....................................................................................................43
4.2.2. Phân tích tính đa hình ADN vừng bằng ph ơng pháp RAPD ........ 43
4.2.2.1. Số phân đoạn và tần số xuất hiện các phân đoạn ............. 44
4.2.2.2. Sản phẩm RAPD với mồi UBC336 ...................................... 46
h. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của quần thể vừng với mồi UBC336..................47
4.2.2.3. Sản phẩm RAPD với mồi UBC302 ...................................... 47
i. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của tập đoàn vừng nghiên cứu với mồi UBC302.48
4.2.2.4. Mối quan hệ di truyền của các giống vừng nghiên cứu ....... 49
j. Sơ đồ hình cây các giống vừng nghiên cứu.................................................................51
2
k. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các giống vừng dùng trong nghiên cứu........................51
4.3. Xác định mức độ sai khác của các dòng lạc/vừng đột biến bằng ph ơng
pháp phân tử ............................................................................................. 52
4.3.1. Xác định mức sai khác của các dòng lạc đột biến bằng ph ơng
pháp SSR .............................................................................................. 52
4.3.1.1. Sản phẩn SSR của mồi L25 đối với các dòng lạc đột biến .. 52
l. Kết quả điện di sản phẩm SSR của các dòng lạc đột biến với mồi L25....................52
4.3.1.2. Sản phẩm SSR của mồi L41 đối với các dòng lạc đột biến . 53
m. Kết quả điện di sản phẩm SSR của các dòng lạc đột biến nghiên cứu với mồi L29 53
4.3.1.3. Số phân đoạn và tần số xuất hiện các phân đoạn ............. 54
n. Sơ đồ hình cây các dòng lạc đột biến từ giống lạc VD2 nghiên cứu.........................57
o. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các dòng lạc đột biến từ giống lạc VD2 dùng trong nghiên cứu
...........................................................................................................................................................57
p. Sơ đồ hình cây các dòng lạc đột bién từ giống lạc L9801 nghiên cứu.......................60
q. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các dòng lạc đột biến từ giống lạc L9801 dùng trong nghiên cứu
...........................................................................................................................................................60

4.3.2. Xác định mức sai khác của các dòng vừng đột biến bằng ph ơng
pháp RAPD ........................................................................................... 60
4.3.2.1. Sản phẩn RAPD của mồi RA159 đối với các dòng vừng đột
biến ................................................................................................... 61
r. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của các dòng vừng đột biến nghiên cứu với mồi RA159
...........................................................................................................................................................61
4.3.2.2. Số phân đoạn và tần số xuất hiện các phân đoạn ............. 62
s. Sơ đồ hình cây các dòng vừng đột bién từ giống vừng VD2 nghiên cứu..................66
t. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các dòng vừng đột biến từ giống vừng V6 dùng trong nghiên cứu
...........................................................................................................................................................66
u. Sơ đồ hình cây các dòng vừng đột biến từ giống vừng V36 nghiên cứu...................68
v. Biểu đồ đa chiều (MDS) của các dòng vừng đột biến từ giống vừng V36 dùng trong nghiên
cứu.....................................................................................................................................................69
Kết luận và đề nghị......................................................................................69
1.Kết luận..................................................................................69
2. Đề nghị..................................................................................70
Tài liệu tham khảo:.......................................................................................71
Tài liệu tiếng Việt:......................................................................71
Tài liệu tiếng Anh.......................................................................72
3
MỞ ĐẦU
Lạc, vừng là những cây lấy dầu quan trọng ở Việt Nam. Trong đó cây lạc
được Bộ công nghiệp đề ra mục tiêu quy hoạch phát triển quy mô rộng từ năm 2001
đến 2010. Riêng cây vừng mặc dù có hàm lượng dầu rất cao chiếm hơn 50%, nhưng
do năng suất thấp, hay bị rủi ro nên hiện chưa được đầu tư thích đáng [15].
Trong những năn gần đây, hạn hán ngày càng trở nên khắc nghiệt. Vì vậy,
trồng nhóm cây đậu đỗ sẽ kinh tế hơn so với trồng lúa nước. Đặc biệt đối với những
vùng đất bạc màu có khó khăn về tưới nước thì trồng vừng được xem như là có hiệu
quả kinh tế hơn cả. Cho nên, một số tỉnh bị hạn hán không có điều kiện tưới đã và
đang tăng dần diện tích trồng các loại cây này.

4
Việc cải thiện giống bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo, đột biến
đã làm năng suất tăng đáng kể đối với cây lạc, vừng. Chọn tạo giống cổ điển thường
mất rất nhiều thời gian và công sức.. Hơn nữa, vệc lựa chọn các giống làm bố mẹ
thường chỉ dựa vào kiểu hình để đánh giá kiểu gen, vì thế nên hiệu quả tạo giống
chưa cao.. Với sự hỗ trợ của sinh học phân tử đã giúp đẩy nhanh quá trình chọn tạo
giống mà không bị chi phối bởi môi trường. Hàng loạt các chỉ thị phân tử dựa trên
các kĩ thuật như: AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Radom
Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat)… đã được nghiên
cứu và từng bước áp dụng vào chọn giống cây trồng trong đó có mục đích để bảo tồn
giống và đánh giá đa dạng kiểu gen. Chỉ thị phân tử đã khắc phục được những thiếu
sót, hạn chế của phương pháp truyền thống trước đây, đặc biệt là xác định khoảng
cách di truyền. Chỉ thị RAPD và SSR hiện đang được áp dụng rất có hiệu quả ngay ở
Việt Nam trong chọn tạo các giống lúa mới kháng rày nâu, đạo ôn (Nguyễn Thị Lang
và CS, 2002). Tuy nhiên ở nước ta, việc cải tạo các giống cây lạc/vừng bằng ứng
dụng các chỉ thị phân tử mới bắt đầu được nghiên cứu.
Nhằm bước đầu cung cấp các thông tin di truyền, góp phần lưu giữ, duy trì
nguồn gen đa dạng của tập đoàn giống lạc và vừng ở phía Nam, đồng thời làm cơ sở
khoa học cho việc lựa chọn bố mẹ sử dụng trong các tổ hợp lai phù hợp theo mục
đích của người tạo giống, công trình nghiên cứu này là sử dụng hai loại chỉ thị
RAPD và SSR để “ Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu
(lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo
được”.
5
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu về cây lạc
Chơng 2. ( ngắn gọn và gộp những cáci gì giữa
vừng và lạc)
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại, và phân bố
2.1.1.1. Nguồn gốc

Cây lạc có nguồn gốc Nam Mỹ. Năm 1977, E.G.Squier tìm thấy những
quả lạc đợc chôn trong các ngôi mộ của những ngời Inca cổ xa dọc bờ biển
phía tây của Nam Mỹ. Lạc đợc đựng trong các vại cùng một số thực phẩm
khác. Niên đại của các ngôi mộ cổ này có từ năm 1500 1200 tr ớc công
nguyên [12], [38].
Theo Gregory (1979, 1980) và một số tác giả, lạc có nguồn gốc ở Nam
Mỹ: phân bố từ đông bắc Braxin đến tây nam Achentina và vùng đất dốc dãy
Andes của Braxin và Peru [12], [45].
2.1.1.2. Phân loại
Lạc là cây họ đậu (Fabaceae), chi Arachis loài Arachis hypogaea.L. Đ-
ợc chia làm 2 loài phụ chính khác nhau về dạng phân cành: loài phụ
hypogaea có dạng phân cành xen kẽ và loài phụ fastigiata với dạng phân
cành liên tục
6
+ Loài phụ hypogaea đợc chia thành 2 giống thực vật học: giống
hypogaea (virginia) và giống hirsute
+ Loài phụ fastigiata đợc chia thành các giống nh: giống fastigiata
(valencia), giống vulgaris (spanish), giống peruviana và giống acequafurian
Trên thực tế, ngoài hai loài phụ đợc nhắc đến còn có loài phụ thứ 3
dạng bò cũng đợc công nhận [18], [23].
2.1.1.3. Sự phân bố của lạc
Có lẽ cây lạc đầu tiên đợc đa từ Nam Mỹ tới châu Âu vào năm 1574
theo báo cáo của Nicolas Monardes.
Krapovickas (1986) cho rằng lạc đợc đa từ bờ biển phía tây Peru tới
Mehico và sau đó ngang qua Thái Bình Dơng theo các thơng thuyền Tây Ban
Nha tới Philippine và các vùng khác thuộc châu á - Thái Bình Dơng
Tóm lại, từ vùng nguyên sản ở Nam Mỹ, bằng nhiều con đờng lạc đã
đợc đa đi khắp thế giới và nó nhanh chóng thích ứng với các vùng nhiệt đới, á
nhiệt đới và các vùng có khí hậu ẩm. Đặc biệt lạc đã tìm đợc mảnh đất phát
triển thuận lợi ở châu Phi và vùng nhiệt đới châu á. Lạc đợc trồng rộng rãi ở

châu Phi rồi từ đây, theo các thuyền buôn nô lệ, lạc lại đợc đa trở lại châu Mỹ
và cả châu Âu. Chính sự giao lu chéo rộng rãi này đã hình thành nên nhiều
vùng gen thứ cấp và làm phong phú thêm hệ gen của lạc [12].
Hiện nay, lạc đợc trồng ở hơn 100 nớc trên thế giới, với tổng diện tích
trên 21 triệu ha. Châu á chiếm 63.4% diện tích, sản lợng chiếm 71.7%; châu
Mỹ chiếm 31.3% diện tích, sản lợng chiếm 18.6% và Bắc Trung Mỹ chiếm
3.7% về diện tích, sản lợng 7.5% (hình 1).
Diện tích Sản lợng
7
Những
nớc sản xuất
lạc quan trọng
ở châu á là
Trung Quốc, ấn Độ , Thái Lan, Việt Nam và Indonesia. Trong đó, ấn Độ có
diện tích trồng lớn nhất trên 8 triệu ha.
ở Việt Nam, tổng diện tích trồng lạc khoảng 270000 ha (số liệu năm
2000) và phân bố trên tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp của Việt Nam
[10].
2.1.2. Di truyền học cây lạc
Kawakami (1930) đã xác định số lợng nhiễm sắc thể của lạc A.
hypogaea là 2n=4x=40. Husted (1931, 1933) đã xác định đợc 40 nhiễm sắc
thể soma của 6 giống lạc thơng phẩm và 16 dòng của những giống lạc trồng
trọt. Xác nhận số đơn bội của lạc n=2x=20 ở một số dạng Valencia đứng và
hai dạng thân bò. Patel và Narayana (1937) cũng thông báo n=2x=20 nhiễm
sắc thể đơn bội và 40 nhiễm sắc thể soma ở hai giống lạc đứng small japan
và Gudiyaham Bunch . Nh vậy, số nhiễm sắc thể đặc trng cho các giống
khác nhau của loài A. hypogaea là 2n=4x=40 [37], [18].
2.1.3. Tình hình sản xuất lạc
2.1.3.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới
Lạc là cây lấy dầu và cung cấp thực phẩm quan trọng. Nó là cây cung

cấp dầu chính thứ 3 của thế giới bên cạnh cây đậu tơng và cây bông (FAO
Food Outlok, 1990) [24].
Hiện nay, diện tích đất trồng lạc trên thế giới là 21 triệu ha, đợc trồng
trên 100 nớc và sản lợng đạt 29,14 triệu tấn.
Trong khi năng suất lạc trung bình trên thế giới mới đạt xấp xỉ 1,3
tấn/ha thì ở Trung Quốc thử nghiệm trên diện hẹp đã thu đợc năng suất
khoảng 12 tấn/ha, cao hơn 9 lần so với năng suất bình quân của thế giới.
Điều đó chứng tỏ tiềm năng năng suất lạc còn rất lớn để khai thác.
a. Diện tích, sản lợng
trồng lạc của các nớc
trên thế giới
8
ấn Độ là nớc đứng đầu thế giới về diện tích trồng lạc (6-7 triệu ha) nhng
năng suất còn thấp (0,8-1,2 tấn/ha). Nói chung, năng suất lạc ở ấn Độ không
đồng đều, có vùng chỉ đạt 0,5 tấn/ha, có vùng lại đạt tới 3 tấn/ha [42].
Trung Quốc là nớc đứng thứ 2 về diện tích trồng lạc. Diện tích trồng lạc
ở Trung Quốc có xu hớng tăng (năm 1993 tổng diện tích là 3379,0 nghìn ha,
đến năm 2002 tổng diện tích là 4920,7 nghìn ha). Năng suất lạc ở Trung
Quốc khá đồng đều ở các vùng [42]. Nhiều năm nay, sản phẩm lạc Trung
Quốc là một trong các mặt hàng nông sản xuất khẩu nổi tiếng trên thị trờng
quốc tế. Trung Quốc cũng là một nớc gặt hái nhiều thành tựu nhất trong phát
triển sản xuất lạc, đặc biệt trong thập kỷ 90 vừa qua. Vào những năm 1960,
năng suất lạc Trung Quốc mới chỉ đạt 1,14 tấn/ha; năm 1970 là 1,21 tấn/ha;
năm1980 là 1,78 tấn/ha; đến năm 1990 là 2,5 tấn/ha. Năm 1994 năng suất
lạc trung bình của Trung Quốc đã đạt 2,69 tấn/ha và năm 2000 đa năng suất
lạc toàn quốc lên 3,0 tấn/ha. Để đạt đợc những thành tựu nh vậy, Trung Quốc
đã thực hiện chiến lợc đẩy mạnh nghiên cứu và chuyển giao tiến bộ kỹ thuật,
trong đó kỹ thuật che phủ nilon làm tăng năng suất từ 20-50% [42].
Mỹ là nớc có diện tích trồng lạc không lớn (0,59 triệu ha), nhng năng
suất đạt cao nhất thế giới (3,1 tấn/ha), sản lợng đạt 1,8 triệu tấn (số liệu năm

2003) [38]. Điều đó chứng tỏ Mỹ là nớc đứng đầu về áp dụng các tiến bộ khoa
học kỹ thuật.
2.1.3.2. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam
ở nớc ta, lạc đợc trồng rộng rãi trên nhiều loại đất và địa hình khác
nhau. Diện tích trồng lạc có xu hớng tăng mạnh những năm trớc đây và nay
có xu hớng ổn định diện tích 245- 247 triệu ha (bảng 1)
Bảng 1: Diễn biến sản xuất lạc ở nớc ta
Năm
Diện tích
(1000ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lợng
(tấn)
1939 4,6 7,4 3,4
1955 17,7 8,3 14,5
1965 85,9 9,42 80,9
1973 81,5 9,66 78,7
1985 231,0 9,5 202,4
1993 217,1 11,9 259,3
1994 248,2 11,9 294,4
9
1995 259,9 12,9 334,6
1998 269,4 14,3 386,0
1999 247,6 12,8 318,1
2001 244,6 14,8 363,1
2002 246,7 16,2 400,4
Từ năm 1990 đến nay, công tác nghiên cứu và chuyển giao tiến bộ kỹ
thuật trồng lạc ở nớc ta đã đợc quan tâm hơn trớc. Các đề tài nghiên cứu cấp
Nhà nớc, cấp Ngành, các dự án trong nớc và Quốc tế về nghiên cứu, chuyển

giao tiến bộ kỹ thuật trên cây lạc đã đợc triển khai, thu hút sự tham gia của
một đội ngũ đông đảo các cán bộ ngiên cứu và khuyến nông trong cả nớc. Bộ
Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn xác định phát triển cây lấy dầu trong đó
cây lạc là một trong những vấn đề trọng điểm trong chơng trình phát triển
nông nghiệp và nông thôn nớc ta. Hợp tác quốc tế trong lĩnh vực nghiên cứu
và phát triển cây lạc đã đợc tăng cờng. Thông qua chơng trình hợp tác với
ICRISAT, mạng lới đậu đỗ và Cây cốc châu á (CLAN), Việt Nam đã học hỏi
và tiếp cận đợc nhiều thành tựu mới [10].
Triển vọng phát triển cây lạc ở Việt Nam:
ở nớc ta, lạc đợc coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị
rất đa dạng. Trớc hết, với giá trị dinh dỡng cao nên lạc là cây thực phẩm quan
trọng của nhân dân ta. Trong dầu lạc chứa hàm lợng axít béo cha no cao
(80% trong thành phần axít béo của dầu lạc), đây chính là loại dầu thực phẩm
tốt. Ngoài giá trị dinh dỡng, lạc còn là cây cải tạo đất rất tốt.
Lạc là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới nên phù hợp với điều kiện nhiệt
đới của nớc ta. Bên cạnh đó, yêu cầu về đất đai đối với cây lạc không khắt
khe lắm.
Đất đai nông nghiệp của ta bị rửa trôi và phong hoá nhanh, hàm lợng
mùn và dinh dỡng thấp (nhất là đất bạc màu, đất phù sa cổ, đất dốc tụ ). Vì
vậy, trồng lạc là một trong những biện pháp cải tạo đất, tạo nền nông nghiệp
bền vững. Lạc là cây trồng cải tạo đất quan trọng trong hệ thống canh tác đa
canh ở nớc ta [10], [12].
10
Vài năm trở lại đây, tình trạng hạn hán kéo dài, Đảng và Nhà nớc có
chủ trơng chuyển đổi cây trồng sang cây trồng cạn, trong đó lạc là một trong
những cây trồng chủ đạo.
2.1.4. Một số phơng pháp chọn tạo giống cây lạc và vừng
2.1.4.1. Xây dựng tập đoàn giống và cảI tiến quần thể
Bớc đầu tiên trong công tác chọn tạo giống là xây dựng tập đoàn giống
nhằm thu nhập nguồn gen làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo sau

này. Tập đoàn giống gồm các giống có nguồn gốc khác nhau: các giống có
thể thu thập từ các địa phơng hay nhập nội
Từ tập đoàn giống, ta tiến hành các thí nghiệm so sánh, khảo nghiệm
để xác định giống tốt cho sản xuất, một số giống khác lại đợc dùng làm
nguyên liệu cho lai tạo hoặc xử lý đột biến. Từ năm 1991 1995, bằng ph ơng
pháp chọn lọc cá thể, dòng lạc VD1 đợc chọn tạo từ giống địa phơng Lỳ. Qua
đánh giá giống VD1 cho năng suất cao hơn giống đối chứng địa phơng Lỳ
19%, hàm lợng dầu cao hơn 3%... Hiện tại, VD1 đã đợc Bộ Nông nghiệp &
PTNT cho phép khu vực hóa phía Nam.
Hiện nay, thông qua các bớc đánh giá, tuyển chọn từ các giống nhập
nội chúng ta đã tuyển chọn đợc nhiều giống lạc cho năng suất cao, thích hợp
với các điều kiện sinh thái khác nhau. Các giống hiện đợc trồng phổ biến rộng
rãi ở phía Bắc là L14, L18 Đều là những giống có nguồn gốc nhập nội từ
Trung Quốc đợc Trung tâm NC & TN Đậu đỗ Viện KHNN Việt Nam chọn
tạo [10] [12].
Ngày nay, ngoài việc đánh giá tập đoàn giống bằng các chỉ thị hình
thái, ngời ta còn đánh giá tập đoàn giống bằng các phơng pháp chị thị phân tử
(RAPD, SSR, RFLP, AFLP ). Nhờ các chỉ thị này mà chúng ta biết đ ợc
khoảng cách di truyền giữa các giống, tạo việc lựa chọn bố mẹ cặp lai phù
hợp.
2.1.4.2. Chọn tạo giống lạc bằng phơng pháp lai hữu tính
Lai giống là phơng pháp cơ bản để tạo ra biến dị tổ hợp phục vụ cho
chọn lọc. Nhờ lai giống mà có thể phối hợp đợc các đặc tính và tính trạng có
lợi của các dạng bố mẹ và con lai. Tuy nhiên, bố mẹ truyền cho con cái bộ
gen của chúng và kết quả của quá trình tái tổ hợp mà nhiều kiểu gen mới đợc
11
tạo ra, sau khi tơng tác với môi trờng đã tạo ra các kiểu hình mới rất có ích
cho chọn giống. Đó là cây kiểu thâm canh, kiểu cây lý tởng ở lúa, hàm lợng
dầu siêu cao ở hớng dơng...
Một hiệu ứng đặc biệt nhận đợc trong lai giống là hiệu ứng u thế lai biểu

hiện ở đời F1. Nhờ hiệu ứng này mà phơng pháp tạo giống u thế lai đã ra đời
và nhiều giống cây trồng năng suất siêu cao đã đợc tạo ra nh ngô, lúa, mía,
hành...
Lai hữu tính kết hợp với chọn lọc đúng kỹ thuật là phơng pháp chọn tạo
giống lạc nhanh và có hiệu quả cao. Bớc đầu tiên và có tính quyết định trong
công tác lai tạo là chọn bố mẹ cặp lai. Tiêu chuẩn chọn bố mẹ tùy theo mục
đích lai: có thể lai để cải tiến một đặc điểm nào đó (vỏ quả, tính chống
chịu ); hoặc sử dụng trong nghiên cứu di truyền ta chọn bố mẹ cặp lai có
nhiều tính trạng tơng phản, có quan hệ di truyền xa [12].
Từ phơng pháp lại hữu tính, Trung tâm NC & TN Đậu đỗ đã chọn tạo đ-
ợc giống L12, L03 là những giống triển vọng, phù hợp với vùng nớc trời.
2.1.4.3. Xử lý đột biến
Đột biến là sự thay đổi đột ngột về vật chất di truyền của tế bào. Đột
biến có thể xảy ra ở gen (mất hay thay đổi cấu trúc) hoặc ở nhiểm sắc thể.
Đột biến là quá trình hoàn toàn ngẫu nhiên và đa số chúng gây hại cho cơ thể
sinh vật. Tuy nhiên, trong chọn tạo giống, đột biến nhân tạo có tần số biến dị
có lợi là rất thấp nhng u điểm là thời gian tạo giống nhanh chóng vì phần lớn
các biến dị đều di truyền.
- Phơng pháp xử lý
Đối với cây lạc, xử lý đột biến bằng tác nhân vật lý hay hóa học đều có
tác dụng gây đột biến. Các tác nhân hóa học nh: H
2
O
2
, nồng độ 1-10% và
NMU (Nitro methyl ure) nồng độ 0,01 0,025%. Tác nhân vật lý: th ờng
dùng tia gamma Co
60
liều lợng 5kr 25 kr.
Xử lí hóa chất thờng là dùng phơng pháp ngâm hạt, thời gian ngâm

5-30 phút. Xử lý phóng xạ bằng phơng pháp xử lý hạt khô.
- Chọn lọc sau xử lý
12
Chọn lọc cá thể từ M1-M4, chọn các dòng ổn định để tiến hành chọn
lọc quần thể. Quần thể đột biến ổn định từ M8 và sau đó có thể tiến hành
nhân giống [13].
Giống lạc V79 là giống lạc quốc gia đợc Viện KHNN Việt Nam chọn tạo
bằng phơng pháp xử lý đột biến tia gamma Co
60
liều lợng 5kr [10].
2.2. Giới thiệu về cây vừng
2.2.1. Nguồn gốc, Phân loại và phân bố
Cây vừng (Sesamum indicum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày và là
cây lấy dầu quan trọng. Cây vừng thuộc họ vừng (Pedaliaceae) gồm 16 chi
với 60 loài. Có khoảng 37 loài thuộc chi Sesamum nhng chỉ Sesamum
indicum là loài duy nhất đợc con ngời sử dụng trong trồng trọt. Về di truyền
học, vừng là cây lỡng bội 2n = 2x = 26 [46].
Vừng là cây lấy dầu cổ xa nhất, có nguồn gốc từ Nam Phi. Tại đây còn
rất nhiều vừng hoang dại cho hạt, nhng có vị đắng. ở Babylon và Assyria
vừng đã đợc đánh giá là cây lấy dầu có giá trị cao cách đây 4000 năm [39].
Theo nhiều con đờng khác nhau, vừng đã lan tỏa ra khắp Châu Phi, Trung
Mỹ, Nam Mỹ, miền Trung á, ấn Độ, Trung Quốc, các nớc Đông Nam á trong
đó có Việt Nam. Vừng có mặt ở các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và một phần
ôn đới vào lúc thời tiết cha bắt đầu lạnh giá. Vừng chỉ có thể nảy mầm khi
nhiệt độ đất trên 20
0
C và phát triển ở nhiệt độ dới 30
0
C. Sản phẩm chính của
vừng là hạt, hạt vừng chứa bình quân 50% dầu thực vật, 25% protein, 5% chất

khoáng [14], [46], [40].
Theo tạp chí Dầu thực vật thế giới thì có khoảng 30 n ớc trên thế giới
có gieo trồng vừng quy mô tối thiểu trên 10 nghìn ha. Ai Cập là nớc có năng
suất bình quân cao nhất (11,5 tạ/ha) nhng sản lợng không nhiều (khoảng 20
nghìn tấn). ấn Độ, Trung Quốc là những nớc sản lợng lớn nhất thế giới, tiếp
theo là Mianmar, Sudan, Mehico, Nigeria, Venezuela, Thổ Nhỉ Kỳ, Uganda
and Ethiopia. Sản lợng dao động do nền kinh tế địa phơng và điều kiện thời
tiết. Sản lợng vừng trên toàn thế giới 2-5 triệu tấn đợc trồng ở 5-16,3 triệu ha.
Theo tổ chức FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations)
(2002), thì sản lợng vừng đợc xếp vị trí thứ 6 trong số hạt cây lấy dầu ăn đợc
13
(2.893,114 triệu tấn), và xếp vị trí 12 đối với sản lợng dầu thực vật trên toàn
thế giới (754.159 triệu tấn) [39].
ở Việt Nam, việc gieo trồng vừng đã có từ lâu. Trong sách Vân đài loại
ngữ , nhà bác học Lê Quý Đôn đã từng tổng kết: phép làm ruộng tốt thì nên
trồng đỗ xanh trớc, sau đó đến các loại đậu nhỏ và vừng.. . Sản l ợng vừng
hiện nay của nớc ta khoảng 30 nghìn tấn/năm, năng suất bình quân 4,8 tạ/ha.
2.2.2. Tình hình sản xuất vừng
Trên thế giới, diện tích trồng vừng khá hẹp (5-16,3 triệu ha), năng suất
bình quân khoảng 3,5 tạ/ha, sản lợng 2,2 triệu tấn. Lợng vừng sản xuất đợc
chủ yếu dùng trong tiêu thụ nội địa.
Trung Quốc và ấn độ là hai nớc có sản lợng vừng lớn nhất (trên 500
tấn). Nhóm các nớc có sản lợng đứng thứ hai (trên100 nghìn tấn) là: Myanma,
Sudan, Uganda. Nhóm các nớc có sản lợng vừng dới 100 nghìn tấn:
Guatemala, Mehico, Thái Lan, Thổ Nhĩ Kì...[46] trong đó có Việt Nam (bảng
2).
Bảng 2: Sản lợng vừng một số nớc trên thế giới
TT Nớc sản lợng (tấn)
1
ấn Độ

800,000
2 Trung Quốc 650,000
3 Myanmar 380,000
4 Sudan 325,000
5 Uganda 110,000
6 Nigeria 75,000
7 Pakistan 68,000
8 Bangladesh 50,000
9 Cộng hòa Trung Phi 42,800
10 Liên minh Cộng hòa Tanzania 41,000
11 Thái Lan 40,000
12 Ethiopia 39,000
13 Ai Cập 37,000
14 Guatemala 35,049
15 Iran (Islamic Republic of) 33,000
16 Việt Nam 30,000
17 Paraguay 30,000
18 Burkina Faso 29,000
14
19 Somalia 28,400
20 Mehico 22,593

Hiện nay, các nghiên cứu về cây vừng ở nớc ta còn rất hạn chế, năng
suất vừng còn thấp. Các giống vừng hiện trồng chủ yếu là các giống nhập nội
nh V6, V36... Tại trung tâm NC & TN đậu đỗ, năm 2001 đã chọn tạo đợc
giống vừng đen VĐ10 có nguồn gốc từ Minh Lộc Hậu Lộc Thanh Hóa.
Qua một số nghiên cứu khảo nghiệm ở một số địa phơng thì VĐ10 cho năng
suất cao hơn cả V6 và V36 [17].
2.3. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc
phân tích đa hình kiểu gen

Trong những năm qua, với sự ra đời của sinh học phân tử và công nghệ
gen, một ngành khoa học mới đã xuất hiện: Phân loại học phân tử (molecular
taxonomy), chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN. Các kỹ thuật điểm
chỉ ADN phân tích và so sánh trình tự nucleotide của các đoạn ADN đã giúp
cho việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại,
đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của
nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật [59].
Các kỹ thuật đợc sử dụng trong phân loại phân tử bao gồm: kỹ thuật
isozym (đồng enzym), các kỹ thuật phân tích đoạn ADN nh phơng pháp đa
hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length
Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở của phản ứng PCR nh ADN
tiểu vệ tinh (Simple Sequence Repeats - SSR), đa hình các đoạn ADN nhân
bản ngẫu nhiên (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều
dài các đoạn ADN nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism -
AFLP), kỹ thuật điểm chỉ ADN đa locus, lai ADN, phân tích trình tự ADN...

2.3.1. Phơng pháp phân tích RAPD (Random Aplified Polymorphic
DNA)
2.3.1.1. Nguyên lý

-
15
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phối hợp phản ứng sử dụng polymerase của
phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với các mồi ADN không đặc thù để nhân các
đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên có thể đa
hình bởi các đoạn nhân có thể có trong mẫu ADN của cá thể này nhng lại
không có trong mẫu ADN của cá thể khác [70].
Năm 1990, William và cộng sự đã phát triển kỹ thuật RAPD dựa trên cơ sở
của phơng pháp PCR.Mồi th ờng gồm khoảng 10 nucleotide đ ợc sắp xếp
theo một trình tự ngẫu nhiên nào đó, vì vậy xác suất bắt cặp một đoạn

nucleotide trong genome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/4
10
1/1010 =
1/1.000.000. Có nghĩa cứ khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10
gốc bổ trợ cho 10 gốc của mồi RAPD với trình tự xác định nào đó. Do kỹ thuật
này chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả hai đầu của đoạn ADN cần
nhân bản, ngoài ra 2 đoạn mồi này phải đ ợc kết cặp trên hai sợi đơn khác
nhau của chuỗi ADN và phải đi theo chiều hớng vào nhau, nên xác suất trên
phải nhỏ đi nhiều. Trên thực tế xác suất bắt cặp của các mồi còn nhỏ hơn
nhiều lần nữa, bởi trong điều kiện PCR thông th ờng chỉ tổng hợp đ ợc một
đoạn ADN không dài quá năm nghìn nucleotide. Đối với ADN thực vật, các
mồi RAPD th ờng cho sản phẩm PCR từ một vài băng đến vài chục băng có
chiều dài từ 100-5000 nucleotide [3],[16].
Với đặc điểm là ngắn, nên khả năng đoạn mồi tìm ra đợc điểm gắn trên
DNA khuôn không quá khó khăn. Tuỳ vào từng loại thực vật hay vi sinh vật
mà các đoạn mồi ngẫu nhiên đợc thiết kế. Theo lý thuyết, số lợng của các
đoạn DNA đợc nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí của các đoạn mồi, kích
thớc và mức độ phức tạp của cấu trúc DNA geneome. Kết quả là sau khi điện
di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện đợc tính đa hình dựa trên các phân đoạn
DNA đợc nhân bản. Sự đa hình của sản phẩm RAPD là do kết quả thay đổi
các điểm gắn của mồi (ví dụ: đột biến điểm) hoặc do thay đổi nhiễm sắc thể
trong các vùng đợc nhân bản (ví dụ: thêm đoạn, mất đoạn hay đảo đoạn) sẽ
gây ra sự thay đổi về kích thớc hay ngăn cản sự nhân bản DNA. Sản phẩm
khuyếch đại đợc phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc
polyacrylamide và có thể quan sát đợc sau khi gel đợc nhuộm bằng hoá chất
đặc trng. Tính đa hình đợc nhận ra do sự có mặt hoặc vắng mặt của một sản
phẩm nhân bản.
16
2.3.1.2.
2.3.1.3. u nhợc điểm của phơng pháp RAPD

Kỹ thuật RAPD cho phép đánh giá toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lại
tính đa hình cao, trong lập bản đồ thì chỉ thị RAPD chủ yếu là chỉ thị trội. Ph-
ơng pháp tiến hành đơn giản, ít tốn kém. u điểm nữa của kỹ thuật này là
nhanh, rẻ và cho phép tiến hành với số lợng mẫu lớn. Kỹ thuật RADP không
yêu cầu mẫu dò ADN, không cần biết thông tin về trình tự đoạn ADN cần
nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉ cần một lợng nhỏ ADN khuôn và
có thể thực hiện tự động [33]. Với một bộ mồi ta có thể sử dụng đợc với các
loài khác nhau trong khi các mẫu dò RFLP chỉ có thể dùng đợc cho các loài
có quan hệ gần gũi. Tính đa dạng thu đợc từ các chỉ thị RAPD đợc đánh giá
cao hơn so với kỹ thuật RFLP trong trờng hợp thực hiện trên cùng một vật liệu
và cho phép phát hiện đợc tính đa dạng ngay cả trong các đoạn chứa các trật
tự nucleotide lặp lại [21], [33].
Bên cạnh đó, RAPD còn là một kỹ thuật lấy dấu ADN có độ nhạy cao,
có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, lập bản đồ di truyền, lập bản đồ gen
liên kết và phân tích con lai F1. Bằng phơng pháp này có thể xác định đợc
ngay các gen liên kết của quần thể F1 mà không cần chờ các tính trạng của
thế hệ F1 biểu hiện khi trồng và thu hoạch. Tuy nhiên, RAPD cũng có những
nhợc điểm do mồi không đặc hiệu nên có rất nhiều băng khó phân tích, dẫn
đến khi phân tích kết quả rất dễ sai lầm do cách đánh giá chủ quan của từng
ngời. Nhng vì nó dễ tiến hành nên phơng pháp này hiện nay đợc ứng dụng
khá phổ biến ở những nớc có điều kiện nh nớc ta. Hiện nay, phơng pháp
RAPD đợc ứng dụng trong nớc ta trong nhiều lĩnh vực: nh đánh giá tính đa
hình ở lúa, đậu tơng, lạc, chè, cà phê, bông, vải định vị gen kháng rầy nâu
ở lúa [4], [7],[9].
2.3.1.4. ứng dụng
Kỹ thuật RAPD có khả năng phát hiện đợc những thay đổi nhỏ trong hệ
gen của các cá thể thân thuộc hơn hẳn so với kỹ thuật Isozym, kỹ thuật RFLP
(Foolad et al, 1993) khi nghiên cứu về các dòng khoai tây đợc nuôi cấy thấy
rằng: 63% trong tổng số 313 mồi phát hiện thấy đoạn ADN đa hình nhờ ph-
ơng pháp RAPD trong khi RFLP là 16% và Isozym là 0%. Do sự phát hiện

17
tính đa hình dễ dàng nên kỹ thuật này đợc sử dụng cho việc nghiên cứu tính
thuần của giống.
Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật RAPD là một ph-
ơng pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài,
nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD cũng đợc sử
dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa hình di truyền
trong các kiểu gen lúa nớc và lúa nơng, sự đa hình di truyền giữa lúa Indica và
Japonica, xác định sự đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo,
tế bào huyền phù và tế bào trần.
Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân
thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc
phân loại. Chúng cũng đợc sử dụng nh những chỉ thị phân tử để xác định
những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây
trồng, nh tính trạng chất lợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virut ở cà chua
[6], [20].
Hiện nay, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nhận biết, phân loại và
phân tích đa hình di truyền của các loài khác nhau nh phân tích sự đa dạng
ADN giữa các giống mía [35], xác định và phân loại các kiểu di truyền của các
giống đậu Hà Lan [60], phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài
Orobanche [58], phân tích các biến đổi di truyền trong loài cỏ ba lá trắng ở
Bắc Mỹ [34].
Hai nhà khoa học Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự
10 nucleotide để nghiên cứu sự khác biệt của 28 giống cần tây và đợc chia
làm ba nhóm. Kết quả thu đợc càng đợc khẳng định khi sử dụng 6 chỉ thị
protein để phân loại các giống cần tây trên [70]. Tơng tự, nhiều tác giả đã sử
dụng RAPD để lập cây chủng loại phát sinh của ngô, lúa gạo, lúa mì... [9],
[61].
Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất hiệu quả trong việc tìm ra các
chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Sun và cộng sự

(2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình ADN của 35
giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB (Fusarium head blight) và phát hiện ra 3
chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng bệnh FHB [65].
18
Orozco và cộng sự (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối
quan hệ di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc lai tạo từ các loài bố,
mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục
đích tạo con lai có đặc điểm quý. Bùi Mạnh Hùng cùng cộng sự (2000) cũng
cho biết khi sử dụng kỹ thuật RAPD đã phân biệt đợc hai giống đậu Vetch và
Lentil cùng giống nhau về hình thái (trọng lợng 1000 hạt, màu sắc, kích th-
ớc...). Điều này có một ý nghĩa lớn trong việc xác định độ thuần di truyền cũng
nh mức độ lẫn tạp cơ giới của các loại giống cây trồng [1], [52].
Lansium domesticum Corr. (Bòn bon) là loài cây ăn quả đợc trồng phổ
biến ở Malaysia. Các giống đợc trồng tại đây là giống Dokung, Duku,
Langsat , chúng khác nhau ở một số đặc điểm hình thái học, sinh học hay
vùng phân bố. Ngoài ra, cũng có những giống khác nhau do chúng là dạng
con lai hoặc do sự đặt tên khác nhau của ngời dân địa phơng. Sự phức tạp
này đã gây ra hiện tợng mất tên hoặc sai tên của một số loài. Để giải quyết
vấn đề này, Song và cộng sự (2000) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích
mối quan hệ di truyền giữa chúng. Công trình này đã làm sáng tỏ mối quan hệ
di truyền và cung cấp những kiến thức sâu hơn để tìm ra các loài L.
domesticum khác nhau [62].
2.3.2. Phơng pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats)
2.3.2.1. Nguyên lý
SSR hay còn gọi là microsatellites, nó thờng là những đoạn ADN ngắn
có trình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide nh CACACACA, và chúng có
khuynh hớng chiếm các vùng ADN không mang mã (vùng dị nhiễm sắc nh:
tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể), một vài đơn vị SSR (nh CA) có
thể đợc lặp lại bốn lần, một số đơn vị khác lại đợc lặp lại từ hai đến ba mơi
lần.

Phơng thức lặp lại cũng rất đa dạng và có thể chia làm 3 loại:
- Lặp lại hoàn toàn , các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau.
- Lặp lại không hoàn toàn, xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là 1 hoặc 1 số
nucleotide.
- Lặp lại phức tạp, có sự xen kẽ vào các đơn vị lặp lại nhiều nucleotide
khác nhau.
19
Vùng microsatellites thờng là những vùng siêu biến, nó không chỉ khác
nhau giữa các loài mà còn giữa các cá thể có quan hệ gần gũi. Đó chính là cơ
sở tạo ra tính đa hình của phơng pháp SSR. Tính đa hình SSR thờng biểu lộ
tính đồng trội.
Cách thông thờng nhất để dò microsatellites là thiết kế các mồi PCR nó
nằm duy nhất trong một locus trên genome, do vậy một cặp mồi PCR có thể
đặc trng cho từng cá thể trong loài, việc tạo ra các sản phẩm PCR có kích th-
ớc khác nhau đó cũng chính là các microsatellites có kích thớc khác nhau [2],
[8].
2.3.2.2. Phơng pháp
Phơng pháp SSR dựa trên nguyên tắc PCR với mồi đặc hiệu khoảng
20 nucleotide, với nhiệt độ bắt mồi 55
0
C - 65
o
C, cho sản phẩm đặc hiệu có
kích thớc 100-400 bp, Sản phẩm đợc điện di trên gel polyacrylamide 6% -8%.
2.3.2.3. u nhợc điểm
Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị
khác. Trong phân tích SSR không dùng phóng xạ hoặc bất kỳ một bớc nghiên
cứu phức tạp nào khác mà cho kết quả nhanh, tin cậy hơn RAPD RFLP Chỉ
thị SSR là các locus đặc trng, đa alen và cung cấp nhiều thông tin nên chúng
hết sức có ích cho việc phát hiện sự thay đổi trình tự nucleotide đặc trng cho

một loài. Vì thế SSR đợc xem nh là Finger printing [66].
Hạn chế của kỹ thuật SSR là phơng pháp này đòi hỏi phải thiết kế mồi
đặc trng cho mỗi loài nên chi phí rất cao. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu
cần tách dòng và đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa
SSR [20], [36].
Số lợng các mồi cha đợc phát triển ở nhiều loài cây và lý do này khiến
cho hiệu quả của SSR trong lập bản đồ di truyền bị hạn chế. Tuy nhiên, dựa
vào ngân hàng gen đã có hiện nay có thể khai thác để sàng lọc tính đa hình
trong nghiên cứu của một số loại cây trồng, chẳng hạn các chỉ thị SSR thiết
kế trên đối tợng cây lúa có thể dùng cho nghiên cứu ở ngô, mía, mì mạch
Tuy nhiên cho đến nay việc sử dụng các mồi đã đợc thiết kế cho các đối tợng
cây trồng khác hầu nh không chỉ ra tính đa hình nào đối với cây lạc.
20
2.3.2.4. ứng dụng
Giá trị SSR là sinh ra tính đa hình từ rất nhiều vùng tơng ứng, bao phủ
rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR.
Những chuỗi đa hình đơn giản này đã đợc ứng dụng trong việc lập bản đồ cả
ở hai đối tợng động vật và thực vật, ở ngời microsetellite đợc gọi là thế hệ thứ
hai của các chỉ thị phân tử, ở thực vật tần số và số lợng microsetellite đã đợc
xác định trên các cây nhiệt đới nh: bắp cải, đậu tơng, lúa mì và 34 giống cây
trồng khác. Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật sự lặp lại
(AT)n nhiều hơn ở động vật. Trong khi ở những loài động vật thì lại giàu
microsetellite (GT)n. Những nghiên cứu trên lúa (Wu and tanksley, 1993),
Ngô (Senio and Heun, 1993) và Arabidopsis (Bell and Ecker, 1994) cũng cho
kết quả tơng tự. Tuy nhiên, chỉ thị này cũng có nhợc điểm cơ bản nh quá trình
thiết kế mồi rất tốn kém. SSR thờng đợc dùng để lập bản đồ những vùng khó
tính (vùng dị nhiễm sắc)
Có khá nhiều nghiên cứu đa dạng phân tử ở lạc từ thập kỉ năm 70 nhng
đến nay cũng chỉ có vài công trình là chỉ ra mức độ đa hình (nhng tính đa hình
rất thấp) ở lạc khi sử dụng chỉ thị RFLP, AFLP, RAPD. Vì thế một vài năm trở

lại đây việc thiết kế các mồi SSR chuyên dụng cho lạc đã đợc một số Viện
nghiên cứu trên thế giới thực hiện. Hiện nay, có khoảng vài trăm chỉ thị SSR
đã đợc công bố là có tính đa hình cao ở lạc nuôi trồng. Kết quả chỉ ra rằng
trình tự lặp lại GA/CA đợc phân tán thờng xuyên trong lạc [36]. Theo nghiên
cứu của He G. và cs (2003) trong số 56 cặp mồi đợc thiết lập trên cơ sở của
cây lạc thì chỉ có 19 cặp mồi chỉ ra tính đa hình khi phân tích với 15 giống lạc.
Trung bình có 4,25 alen trên một locus và đặc biệt có trên 14 alen đã đợc tìm
thấy trong một locus. Điều này chỉ ra rằng chỉ thị SSR cho độ đa hình cao hơn
các chỉ thị khác ở lạc.
ở Việt Nam, kỹ thuật SSR đã đợc ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tính
thuần của lúa, đánh giá quỹ gen của cây lúa, lập bản đồ phân tử các đặc
điểm rễ ở lúa cạn, xác định chỉ thị phân tử bệnh rỉ sắt ở lạc...
21
Chơng 3. Nguyên liệu và phơng pháp
3.1. Nguyên liệu nghiên cứu
3.1.1. Nguyên liệu thực vật
Vật liệu thực vật đợc sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:
o 32 giống lạc và 14 giống vừng đang đợc trồng rộng rãi khắp cả nớc, đ-
ợc cung cấp bởi viện Viện Cây có dầu Miền Nam. Danh sách các giống
lạc và vừng nghiên cứu đợc trình bày ở phụ lục 1 và 2.
o Viết cụ thẻ số lợng Một số dòng lạc, vừng đột biến đợc trình bày ở phụ
lục 3 và 4.
3.1.2. Thiết bị và hóa chất
Công trình nghiên cứu đợc thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào thực
vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học.
Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là của các hãng sản xuất
chuyên dụng cung cấp nh: Máy ly tâm (Beckman), máy PCR System 9700
(Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode Array
Spectrophotometer của hãng Hewlett - Packard, máy chụp ảnh gel - Doc
(Pharmacia), máy ổn nhiệt, máy soi UV, lò vi sóng, các hóa chất tách chiết

ADN, hóa chất PCR, mồi...
3.2. Phơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Tách chiết ADN từ lá
Tạo cây con
22
Các hạt lạc/vừng đợc gieo vào các cốc đựng cát và đợc đặt trong khay.
Hàng ngày tới nớc vào khay để nớc thấm từ dới lên trên, điều này tạo cho cây
luôn có độ ẩm và đủ ôxy cho hô hấp. Cây con trồng đợc 1-2 tuần thì thu lấy
lá.
Thu và bảo quản lá
Thu mẫu lá khi còn non, cho vào ống eppendorf 2 ml, nhanh chóng cho
vào nitơ lỏng. Chúng đợc dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -
84
0
C cho đến khi sử dụng.
Hoá chất sử dụng:
Đệm tách (Extraction buffer)
TT Nồng độ gốc Nồng độ làm việc
1 Tris 1M (pH 8,0) 100 mM
2 EDTA 0,5M (pH 8,0) 20 mM
3 NaCl 5M 2 M
4 CTAB 4% (w/v)
5 - mercaptoethanol 0,2% (v/v)
Đệm TE: 10 mM Tris, pH 8,0
1 mM EDTA, pH 8,0
Các hoá chất khác: - Isopropanol.
- Ethanol 80%.
- Chloroform : isoamyl (24:1).
- Nitơ lỏng.
Quy trình tách chiết:

B
1
: Cân 200 mg mẫu lá non cho vào ống eppendorf 2 ml.
B
2
: Cho nitơ lỏng vào ống eppendorf có chứa mẫu lá. Nghiền bằng đũa
thủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn.
B
3
: Bổ sung 800 l đệm tách ADN, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợp đồng
nhất, ủ trong 60 phút ở 65
0
C.
B
4
: Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
B
5
: Bổ sung 800 l hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (24:1), đảo đều.
B
6
: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút để phân tách thành 2 pha,
hút cẩn thận dịch nổi cho vào ống eppendorf mới.
B
7
: Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1), đảo nhẹ.
23
B
8
: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi (hoặc vớt

kết tủa ADN).
B
9
: Rửa ADN hai lần bằng ethanol 80%.
B
10
: Làm khô ADN bằng máy Speed - Vac hay ở nhiệt độ phòng.
B
11
: Hoà tan ADN trong 300 l TE 1X.
B
12
: Bổ sung 1 l RNase (10 mg/ml), ủ ở 37
0
C trong 30 phút.
B
13
: Thêm 10 l Sodium acetate 3M đảo nhẹ.
B
14
: Bổ sung 2,5 thể tích ethanol tuyệt đối, đảo nhẹ để ở - 20
0
C ít nhất 1
giờ.
B
15
: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4
0
C, loại bỏ dịch nổi.
B

16
: Rửa ADN hai lần bằng ethanol 80%.
B
17
: Hoà tan ADN trong 300 àl TE 1X, giữ ở -20
0
C đến khi sử dụng.
3.2.2. Xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN
3.2.2.1. Phơng pháp đo quang phổ
Việc xác định hàm lợng và độ tinh sạch của ADN có thể đợc thực hiện
bằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bớc sóng 230, 260, 280 nm trên máy
đo quang phổ. Khi đó ADN có đỉnh hấp thụ cực đại ở bớc sóng 260 nm. Từ
giá trị OD260 ta sẽ tính đợc hàm lợng của ADN thu đợc (chẳng hạn số đo trên
máy là 1,0 thì hàm lợng ADN sẽ vào khoảng 50 mg/1 ml mẫu). Độ tinh sạch
của ADN có thể đợc xác định bằng tỷ số OD260/OD280 và OD260/ OD230.
Các tỷ số này lần lợt chỉ ra sự có mặt của các tạp chất là protein, các hợp
chất polyphenol và carbonhydrate. Một mẫu ADN đợc coi là tinh sạch nếu tỷ
số OD260/OD280 và OD260/OD230 đạt 1,8 - 2.
Các bớc đo đợc tiến hành nh sau:
- Chỉnh cân bằng máy (Blank): dùng nớc cất 2 lần khử ion, vô trùng để
làm chuẩn.
- Kiểm tra máy: đo một mẫu ADN có nồng độ chuẩn đã biết trớc (ADN
của thực khuẩn thể ).
- Đo mẫu ở bớc sóng = 260 nm và = 280 nm.
Mẫu đợc pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995àl nớc cất + 5àl
ADN mẫu, lắc đều cho vào cuvet, đặt vào máy đo.
- Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvet bằng nớc cất.
- In kết quả đo đợc.
24
Từ đó, ta tính đợc hàm lợng và độ sạch của ADN theo công thức:

* Hàm lợng ADN: E = 50 x HSPL x OD260
* Độ sạch của ADN: OD260/OD280 và OD260/ OD230
Trong đó E : Hàm lợng ADN (ng/àl),
50 : Hằng số,
HSPL: Hệ số pha loãng,
OD230: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 230 nm,
OD260: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 260 nm,
OD280: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 280 nm.
3.2.2.2. Phơng pháp điện di trên gen agarose
Ngoài phơng pháp kiểm tra và xác định hàm lợng ADN trên máy quang
phổ kế, ta có thể xác định chất lợng ADN mẫu tách đợc bằng phơng pháp
điện di trên gel agarose 0,8%. Để xác định hàm lợng ADN, khi điện di mẫu
ADN ta cho thêm một giếng đối chứng là ADN lam đa với nồng độ xác định tr-
ớc.
- Hóa chất:
+ Agarose
+ Dung dịch TAE 1X (Tris bazơ 48,8 g/l : axit axetic 10,2 ml/l :
EDTA 0,5M 20 ml/l pH 8,0)
+ Ethidium Bromide (EtBr) 0.5 g/ml
+ Đệm tra mẫu (Buffers Dye 10X)
- Chuẩn bị gel: Cân 0,8 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE
1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến 50
0
- 60
0
C,
đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lợc. Sau 30 - 60 phút, khi
gel agarose đã đông cứng, gỡ khay gel cài vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X
ngập bản gel agarose khoảng 2 mm, tháo lợc ra khỏi bản gel.
- Tra mẫu: Trộn mẫu theo tỷ lệ (1 l ADN/1 l đệm tra mẫu 10X: 7 l

H
2
O) và tra vào giếng.
- Điện di: Hiệu điện thế dùng để điện di từ 80 - 100 V. ADN chuyển từ
cực âm sang cực dơng. Quan sát sự di chuyển bằng mầu của bromophenol
để biết lúc nào ngừng điện di.
- Nhuộm ADN: Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide. Bản gel đợc lấy ra
khỏi khay điện di và đa vào dung dịch EtBr 0,5g/ml trong thời gian khoảng
15 phút trên máy lắc nhẹ.
25