Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (coffea robusta) để lên men tạo ethanol tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã ngành: 62.54.01.01

L PHẠM T ĐỖ VIẾT PHƯƠNG ẤN QUỐC

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI
(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

Cần Thơ, 2020


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS. TS. Lê Nguyễn Đoan Duy P
Người hướng dẫn phụ: TS. Phạm Văn TấnGS.TS. Nguyễn Văn
Mười

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ
sở
Họp tại:
Vào lúc:

Phản biện 1: S. Đái Thị Xuân Trang
Phản biện 2: GS.TS. Đống Thị Anh Đào

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
Thư viện Quốc gia Việt Nam.


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Đỗ Viết Phương, Phạm Văn Tấn và Lê Nguyễn Đoan Duy. 2017.
Determination of caffeine in coffee pulp (Coffea robusta) using UVVisible spectrophotometer. Vietnam Journal of Chemistry, 55: 86-91
(ISSN 0866-7144).
2. Do Viet Phuong, Pham Van Tan and Le Nguyen Doan Duy. 2017.
Optimizing decaffeination conditions from coffee pulp in Vietnam
(Coffea robusta) using hot water extraction. Proceedings of the 15th
ASEAN Conference on Food Science and Technology, 112-118 (ISBN
978-604-67-1007-3).
3. Đỗ Viết Phương, Lê Hương Thủy, Đàm Sao Mai, Đặng Thị Sáu,
Lê Nguyễn Đoan Duy và Phạm Văn Tấn. 2018. Thu nhận enzyme
cellulase từ Trichoderma asperellum QT5 phân lập được từ quả cà phê
tại huyện Krôngbuk, tỉnh Đăklăk, Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn, 3+4: 150-159 (ISSN 1859-4581).
4. Đỗ Viết Phương, Lê Nguyễn Đoan Duy và Phạm Văn Tấn. 2019.
Khảo sát quá trình tiền xử lý, thủy phân và lên men vỏ quả cà phê để
tạo thành cồn sinh học. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,
5: 115-123 (ISSN 1895-4581).
5. Do Viet Phuong, Le Pham Tan Quoc, Pham Van Tan and Le
Nguyen Doan Duy. 2019. Production of bioethanol from Robusta
coffee pulp (Coffea robusta L.) in Vietnam. Foods and Raw materials,
7(1): 10-17 (ISSN 2310-9599).


Chương 1. MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của luận án
Trong vài thập niên trở lại đây, đứng trước nhu cầu năng lượng ngày
càng gia tăng và vấn đề ô nhiễm môi trường do sử dụng nhiên liệu hóa
thạch đã thúc đẩy các nước phải quan tâm nhiều hơn trong việc theo đuổi
và thay thế bằng các nguồn năng lượng tái tạo và đặc biệt là sản xuất
ethanol sinh học. Một trong những nguồn nguyên liệu dồi dào nhất đến
thời điểm hiện tại để sản xuất ethanol sinh học đó là sinh khối
lignocellulose. Các nhà khoa học ước tính rằng sản xuất ethanol từ sinh
khối lignocellulose có thể tăng gấp 16 lần sản lượng hiện tại (Kwon et al.,
2013). Nghiên cứu gần đây chỉ ra tiềm năng tuyệt vời của phế thải vỏ cà
phê trong việc sản xuất ethanol sinh học (Saha and Cotta, 2008). Nếu đốt
ethanol thay vì xăng sẽ giảm hơn 80% lượng khí thải carbon ra môi trường
(Mussatto et al., 2011).
Tuy nhiên rào cản lớn nhất trong việc sản xuất ethanol từ nguồn
nguyên liệu này đó chính là trong nguyên liệu có chứa nhiều
hemicellulose và lignin. Các chất này liên kết chặt chẽ với cellulose và
tạo rào chắn bảo vệ sự tấn công của các loại hóa chất cũng như các loại
enzyme tới phân tử cellulose (Ragauskas et al., 2006; Hahn-Hägerdal et
al., 2006). Đứng trước khó khăn đó các nhà khoa học đã nghiên cứu tìm
ra nhiều phương pháp tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose trước khi tiến
hành đường hóa và lên men.
Mặt khác, lignin được biết đến như là một trong những thành phần
chính cấu thành nên thành tế bào thực vật và tảo. Lignin hiện diện nhiều
nhất trong tất cả các loại thân cây gỗ, chính vì thế nó còn được gọi là
“chất gỗ” (Martone et al., 2009). Trong vỏ quả cà phê lignin chiếm
khoảng 20,07% và khi so sánh hàm lượng lignin trong vỏ quả cà phê với
một số nguồn sinh khối lignocellulose tương tự như: Lignin trong rơm rạ
chiếm 4,65% ; lignin trong lõi bắp chiếm 15%; trong bã mía là 20% hoặc
trong cỏ là 12÷18% (Sun and Cheng, 2002; Mosier et al., 2005; Goyal et
al., 2008; Sassner et al., 2008; Zhang et al., 2009). Có thể nhận thấy rằng,

hàm lượng lignin trong vỏ cà phê cao hơn một số nguồn sinh khối
lignocellulose tương tự và điều này sẽ là một cản trở lớn cho quá trình
tiền xử lý vỏ quả cà phê trước khi thủy phân và lên men tạo ethanol. Do
đó, cần thiết phải có những khảo sát về các phương pháp tiền xử lý để loại
bỏ thành phần lignin này đồng thời phải giữ lại lượng cellulose có trong
nguyên liệu trước khi tiến hành quá trình thủy phân và lên men tạo ethanol
sinh học.

1


Trên thực tế, việc sản xuất cà phê ở Việt Nam lại tập trung chủ yếu
ở các tỉnh Tây Nguyên cho nên sẽ giảm thiểu được chi phí thu gom
nguyên liệu. Ngoài ra, có thể nhận thấy được tiềm năng về trữ lượng vỏ
cà phê ở Việt Nam rất lớn, cùng với vấn đề mang tính thời sự đó là bài
toán giải quyết ô nhiễm trường, tìm và thay thế nguồn năng lượng hóa
thạch đang dần cạn kiệt. Chính vì vậy, vỏ quả cà phê được chọn lựa làm
nguyên liệu cho nghiên cứu: “Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi
sinh vật phân giải vỏ quả cà phê để lên men tạo ethanol”.
1.2 Mục tiêu đề tài
Sử dụng các tác nhân acid loãng, kiềm loãng, vi sóng hay nấm mục
trắng để tiền xử lý vỏ quả cà phê vối nhằm loại bỏ nhiều nhất
hemicellulose và lignin ra khỏi nguyên liệu. Đồng thời là quá trình thu
nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và ứng dụng vào thủy phân vỏ quả cà
phê. Dịch thủy phân được đem đi lên men để so sánh hiệu quả thủy phân
giữa enzyme thu nhận được với enzyme thương mại.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát quá trình khử caffeine, polyphenol và quá trình tiền xử lý
vỏ quả cà phê đồng thời tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine,
khử polyphenol.

Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ nấm mốc và tinh sạch
sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ và muối vô cơ .
So sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được và enzyme
thương mại. Đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy
phân và tối ưu hóa điều kiện thủy phân nhằm thu được hàm lượng đường
khử là cao nhất.
Kiểm tra thành phần dịch thủy phân và đưa ra phương pháp khử độc
dịch thủy phân.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và các phương
pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol.
1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
Nghiên cứu và đưa ra các giải pháp hữu ích nhằm giải quyết vấn đề
phụ phẩm trong công nghiệp chế biến là khuynh hướng nghiên cứu đang
được quan tâm ở trong và ngoài nước. Việc sử dụng vỏ quả cà phê vối là
lựa chọn có ý nghĩa thực tiễn khi Việt Nam là nước xuất khẩu cà phê nhân
lớn thứ 2 thế giới (đặc biệt, xuất khẩu cà phê Robusta lớn nhất thế giới).
Kết quả nghiên cứu từ luận án đã cung cấp số liệu về thành phần hóa
học của vỏ quả cà phê vối, cho thấy tính khả thi của việc sử dụng nguồn
2


phụ phẩm này như nguồn sinh khối lignocellulose tiềm năng để sản xuất
ethanol sinh học.
Nghiên cứu đã chú trọng sử dụng các giải pháp hạn chế sử dụng hóa
chất độc hại nồng độ cao bằng việc kết hợp các phương thức tiền xử lý.
1.5 Điểm mới của luận án
Đề xuất được giải pháp tiền xử lý có sự hỗ trợ của vi sóng để giảm đáng
kể lượng hóa chất sử dụng (chỉ sử dụng kiềm loãng, acid loãng), giúp giảm
ảnh hưởng đến môi trường và tăng hiệu suất; sự cần thiết của việc điều chỉnh
thứ tự của các bước tiền xử lý theo thành phần nguyên liệu.

Đánh giá được sự hình thành và tác động của một số chất hóa học
nguy hại cho quá trình lên men và đề xuất được giải pháp loại trừ.
Thu nhận được enzyme cellulase từ dòng nấm mốc Trichoderma
asperellum (QT5) được phân lập từ bề mặt vỏ quả cà phê hỏng, ứng dụng
có hiệu quả trong thủy phân vỏ quả cà phê vối.
Thông tin từ kết quả nghiên cứu là tư liệu khoa học cho việc nghiên
cứu về ethanol sinh học từ các nguồn phụ phẩm có hàm lượng lignin cao,
sử dụng trong giảng dạy về quản lý và tận dụng phụ phẩm trong sản xuất
thực phẩm.
1.6 Kết cấu của luận án
Luận án bao gồm 142 trang với 5 chương: Chương 1- Giới thiệu
(trang 1-4); Chương 2- Tổng quan tài liệu (trang 5-51); Chương 3Phương pháp nghiên cứu (trang 52-79 với 28 thí nghiệm); Chương 4- Kết
quả và thảo luận (trang 78-141); Chương 5- Kết luận và đề xuất (trang
142). Trong nội dung chính có 33 bảng và 65 hình. Bài viết sử dụng 262
tài liệu tham khảo, bao gồm 236 tài liệu tiếng Anh và 26 tài liệu tiếng
Việt.

Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vỏ quả cà phê
Vỏ cà phê là phụ phẩm đầu tiên thu được trong quá trình chế biến cà
phê nhân ướt. Vỏ quả chiếm khoảng 43,2% trọng lượng tươi hoặc 28,7%
trọng lượng chất khô của toàn bộ quả cà phê. Thành phần chất xơ (bao
gồm cellulose, hemicellulose và lignin) trong vỏ cà phê chiếm đến 51%
(so với khối lượng vỏ khô), những thành phần khác như protein, pectin,
tinh bột, đường khử, ... chiếm 49%. Vỏ cà phê được xem như là nguồn
thức ăn rất tốt cho động vật vì nguồn dinh dưỡng khá cao. Tuy nhiên trong
vỏ cà phê có chứa một số thành phần phi dinh dưỡng không tốt cho
chuyển hóa thức ăn đối với động vật như: tannin hay caffeine.
3

Bên cạnh đó, vỏ quả cà phê cũng chứa một lượng chất xơ khá lớn:
25,88% cellulose; 3,6% hemicellulose và 20,07% lignin. Do đó, vỏ quả
cà phê cũng được xem như là một nguồn sinh khối lignocellulose dùng
trong sản xuất bioethanol (thế hệ sản xuất ethanol thứ 2).
2.2 Giới thiệu về quá trình tiền xử lý
Tiền xử lý được xem là bước đầu tiên và quan trọng nhất của quy
trình sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose bởi vì thông qua quá
trình tiền xử lý mà các polymer carbohydrate trong sinh khối
lignocellulose bị chuyển đổi thành dạng đường đơn giản hơn trước khi
thực hiện quá trình lên men. Việc chuyển đổi này thường được thực hiện
bởi enzyme thủy phân. Tuy nhiên do tính chất không đồng nhất và rất
phức tạp của sinh khối lignocellulose (ví dụ như: độ kết tinh cellulose,
mức độ trùng hợp, độ ẩm, diện tích bề mặt, mức độ liên kết của lignin và
hemicellulose) nên sinh khối này bắt buộc phải tiền xử lý trước để có thể
điều chỉnh được hoạt động thủy phân của enzyme.
Điều quan trọng của quá trình tiền xử lý là phải làm giảm nhiều nhất
có thể lượng lignin và hemicellulose có trong nguyên liệu mà vẫn giữ lại
càng nhiều thành phần cellulose và làm giảm độ kết tinh của cellulose.
Để đánh giá hiệu quả của quá trình tiền xử lý cần thiết phải dựa vào lượng
đường khử được giải phóng sau quá trình thủy phân cũng như cần xem
xét đến quá trình trung hòa dịch tiền xử lý. Bên cạnh đó cần phải quan
tâm đến tính kinh tế của toàn bộ quá trình khi xem xét chọn phương pháp
tiền xử lý nào.
2.3 Giới thiệu về quá trình thủy phân vỏ quả cà phê
Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê sau tiền xử lý chính là quá trình
phân giải sinh học của cellulose và hemicellulose có trong vỏ quả cà phê
dưới tác dụng của enzyme. Thường thì cellulose sẽ thủy phân tạo thành
glucose, nó giống như quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose.
Nhưng khác nhau ở chỗ, glucose trong cellulose được nối với các liên kết

beta trong cấu trúc tinh thể khó phân hủy hơn nhiều so với liên kết alpha
trong tinh bột vô định hình (Holtzapple, 1993).
Để thủy phân hoàn toàn cellulose thành glucose phải nhờ sự phối
hợp xúc tác của một phức hệ cellulase. Cần có ba kiểu enzyme tham gia
vào phức hệ này: endo-β-1,4-glucanases, exo-β-1,4-glucanases và βglucosidases.
Hemicellulose có thể bị thủy phân bởi các enzyme như
endoxylanases, exoglycanases, xylanases, endomannanases, β4


xylosidase, …Bên cạnh đó, tác nhân acid loãng và kiềm loãng cũng có
thể thủy phân được hemicellulose.
2.4 Các nghiên cứu về quá trình tiền xử lý và sản xuất ethanol
Trong những thập niên gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về quá trình
tiền xử lý và sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose như: rơm rạ, lúa
mì, bã mía, thân cây bắp, lõi bắp, cỏ hay là gỗ mềm. Chỉ có một vài nghiên
cứu về sản xuất ethanol sinh học từ vỏ quả cà phê. Mới đây nhất, theo
nghiên cứu của (Shenoy et al., 2011) đã nghiên cứu về quá trình sản xuất
ethanol từ vỏ quả cà phê bằng phương pháp thủy phân bởi acid H2SO4 2%
trong thời gian 30 phút ở 90oC. Hàm lượng đường tổng số thu được sau
quá trình thủy phân là 1,62 g/100 mL dịch thủy phân, đường khử là 0,7
g/100 mL dịch thủy phân. Sau đó đem đi lên men và thu được lượng
ethanol là 0,46 g/g đường.
Một nghiên cứu khác cũng được thực hiện trên đối tượng là vỏ trấu
cà phê. Vỏ trấu cà phê được thủy phân bằng acid H2SO4 1÷5%, tỷ lệ
nguyên liệu:acid là 1:10 và thời gian thủy phân là 5 giờ. Hỗn hợp dịch
thủy phân sau đó được tiến hành lên men với nấm men thương mại S.
cereviciae ở nhiệt độ 30oC, pH = 5, trong thời gian 24 giờ thì thu được
nồng độ ethanol cao nhất là 7,9 g/L (Sahu, 2014).
Đa số các công trình nghiên cứu trước đây đều tập trung dùng acid
H2SO4 ở nồng độ trung bình đến cao để tiền xử lý kết hợp với thủy phân

sinh khối lignocellulose nhằm mục đích thu đường khử cho nên ưu điểm
chính là thời gian xử lý được rút ngắn rất nhiều so với việc dùng enzyme
để thủy phân. Ngoài ra tính kinh tế là yếu tố luôn được quan tâm khi tiến
hành sản xuất thương mại và các nghiên cứu trước đáp ứng được điều này
bởi vì nếu dùng enzyme để thủy phân sẽ tốn kém rất nhiều lần so với dùng
acid. Tuy nhiên, nhược điểm lớn khi dùng acid để thủy phân là gây ô
nhiễm môi trường ở mức nghiêm trọng, thiết bị yêu cầu phải chịu được
acid và nhiệt độ cao. Cho nên các nghiên cứu sau này hầu như không còn
sử dụng acid để thủy phân mà phải sử dụng đến enzyme.
Theo nghiên cứu thuộc đề tài “Nghiên cứu công nghệ xử lý một số
loại phụ phẩm nông nghiệp (PPNN) bằng nước áp suất cao để thu dung
dịch đường có khả năng lên men tạo thành ethanol” (Nguyễn Hoàng
Dũng, 2008), PPNN được sử dụng là rơm, rạ, trấu. Để tạo thành ethanol,
rơm, rạ, trấu được xử lý bằng thiết bị phản ứng thủy nhiệt ở quy mô phòng
thí nghiệm. Sau đó được tiếp tục nghiên cứu ở quy mô pilot trên thiết bị
cấp hơi nước áp suất cao.
5


Năm 2005, nhóm nghiên cứu do TS. Phan Đình Tuấn, trường Đại
học Bách Khoa TP.HCM phụ trách đã thực hiện nghiên cứu công nghệ
xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như rơm, rạ, trấu… nhằm
sản xuất bioethanol, tiến tới xây dựng mô hình “thị trấn biomass” tại
xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, TP.HCM. Sau gần 5 năm thực hiện, các nhà
khoa học đã nghiên cứu, sản xuất thành công xăng sinh học từ rơm rạ và
các chất thải có nguồn gốc cellulose (Hồng Hoa, 2014).
Tuy nhiên, một trong những khó khăn của dự án là giá thành xăng
sinh học sản xuất từ rơm rạ khá cao, do chi phí phân hủy cellulose trong
rơm rạ lớn. Quá trình này tiêu tốn nhiều năng lượng, hiệu suất và nồng độ
đường tạo ra thấp, dẫn đến hiệu suất quá trình lên men cũng như nồng độ

ethanol tạo ra thấp hơn nhiều so với quá trình sản xuất ethanol từ tinh bột.
Nếu phân hủy cellulose bằng hóa chất, giá thành sẽ thấp hơn, nhưng trong
dung dịch đường tạo ra cũng sẽ chứa một lượng hóa chất, không thuận lợi
cho việc lên men ethanol. Do đó, dự án này hướng đến mục tiêu không
dùng hóa chất để phân hủy cellulose. Chi phí tinh chế ethanol sau khi lên
men cũng là một vấn đề khó khăn, gây tốn kém về mặt năng lượng, dù đã
thành công trong việc sản xuất xăng sinh học từ rơm rạ, nhưng để thương
mại hóa sản phẩm, các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nỗ lực nghiên cứu
nhằm hạ giá thành sản phẩm.
Cũng có nhiều nghiên cứu về quá trình tiền xử lý bằng kiềm loãng
trên các đối tượng như rơm, bã mía, gỗ, … Tương ứng với mỗi loại
nguyên liệu thì phải có khảo sát riêng biệt để tìm ra phương pháp tiền xử
lý tối ưu cho loại nguyên liệu đó. Hầu hết các loại sinh khối nông nghiệp
thông thường đã có các chế độ tiền xử lý tối ưu. Tuy nhiên trên đối tượng
vỏ quả cà phê thì chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu. Nhược điểm lớn
khi sử dụng kiềm để tiền xử lý là gặp phải khó khăn trong việc thu hồi
lượng kiềm trong dịch sau thủy phân. Ngoài ra việc sử dụng hóa chất đòi
hỏi dụng cụ thiết bị chịu được nhiệt độ và khả năng chịu ăn mòn cao.
Phương pháp không được khuyến thích sử dụng ở quy mô công nghiệp vì
khả năng gây ô nhiễm môi trường tương đối nghiêm trọng.

Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
3.1.1 Nguyên liệu
Vỏ quả cà phê vối tươi được thu nhận tại xã Pơng Drang, huyện Krông
Buk, tỉnh Đăk Lăk. Thời gian thu nhận từ tháng 11 đến tháng 1 dương lịch.
Quả cà phê chín có màu đỏ tươi, không bị dập, không bị mốc. Quả cà phê
6

tươi sau khi thu hái tiến hành cho vào thùng xốp có ướp thêm đá và vận
chuyển về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá 12 giờ.
3.1.2 Enzyme và nấm men
Các enzyme thương mại sử dụng: Viscozyme® Cassava C:
(Bagsvaerd, Đan Mạch), Celluclast® 1.5L (Novozyme, Đan Mạch),
Glucosidase (Novozyme, Đan Mạch). Nấm men: Sacharomyces
cerevisiae.
3.1.3 Phương pháp nghiên cứu chính
Phương pháp tiền xử lý
Cân 50 g nguyên liệu vỏ cà phê đã sấy khô cho vào 1 bình cầu 1 L, sau
đó cho thêm 500 mL dung dịch H2SO4 2% (w/w). Nguyên liệu sẽ được tiền xử
lý trong nồi hấp tiệt trùng ở 140oC trong 45 phút. Lấy ra để nguội rồi dùng vải
để lọc thu lấy phần bã rắn. Rửa bã này nhiều lần với nước cho đến khi pH trung
tính. Tiếp tục cho vào bình cầu 500 mL dung dịch NaOH nồng độ 0,2 g
NaOH/g nguyên liệu. Quá trình tiền xử lý kiềm thực hiện ở 120oC trong 20
phút, sau đó chuyển vào lò vi sóng thực hiện quá trình tiền xử lý vi sóng ở mức
công suất 327 W, thời gian 20 phút. Cuối cùng, lọc, rửa trung tính và sấy khô
như ban đầu (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019).
Phương pháp thủy phân bằng enzyme cellulase
Cân 15 g nguyên liệu đã qua tiền xử lý cho vào erlen 250 mL. Tiếp tục cho
vào 150 mL dung dịch đệm citrate 0,05 mol/L, pH 4,8. Một thể tích enzyme
cellulase cho vào với nồng độ 25 FPU/g và 30 CBU/g. Quá trình này được thực
hiện trên máy lắc có gia nhiệt ở 50oC, 150 vòng/phút trong thời gian 72 giờ. Kết
thúc quá trình thủy phân, dịch được ly tâm 2500 vòng trong 10 phút. Thu lấy
dịch ly tâm và bỏ phần cặn. Dịch ly tâm sẽ đem xác định các chỉ tiêu đường khử,
đường glucose (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019).
Phương pháp lên men tạo ethanol
Cho 250 mL dịch thủy phân vào bình lên men 500 mL. Bổ sung thêm vào
1 số thành phần môi trường: (NH4)2SO4 (1 g/L), K2HPO4 (0,1 g/L),
MgSO4.7H2O (0,2 g/L). Hỗn hợp sẽ được hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút

sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng. Bổ sung vào dịch lên men lượng tế bào
nấm men S. cereviciae ban đầu là 3x108 cfu/mL. Quá trình lên men được thực
hiện ở điều kiện pH 5, nhiệt độ 30oC và lắc 120 vòng/phút. Tại các thời điểm lên
men khác nhau lấy ra 1 lượng dịch lên men xác định các chỉ tiêu: ethanol, đường
khử, đường glucose (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019).

7


3.1.4 Phương pháp phân tích và đo đạc
Bảng 3.1: Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc
STT
1
2
3
4

Chỉ tiêu
Độ ẩm
Tro tổng số
Lipid tổng
Caffeine

Phương pháp
AOAC 934.06
AOAC 942.05
AOAC 948.16
Đo quang ở 265 nm (AmosTautua and Diepreye, 2014)
Phản ứng với thuốc thử FolinCiocalteu (Ayesha et al., 2010)
Phương pháp Bradford (Bradford,

1976)
Phương pháp calcicum pectate
(Carré and Haynes, 1922)
Phương pháp Phenol sulphuric
acid (Dubois et al., 1956)
Phương pháp Dinitrosalicylic
Acid (Miller, 1959)
Phương pháp Glucose Oxidase
(Sadasivam and Manickam, 1996)
Phương pháp crude fiber (Van
Soest and Wine, 1967)
Phương pháp Dichromate
oxidation (Sayyad et al., 2015)
TCVN 1554 : 1974

5 Polyphenol tổng
6 Protein tổng số
7 Pectin
8 Đường tổng
9 Đường khử
10 Đường glucose
11 Cellulose, hemicellulose,
lignin
12 Ethanol
13 Độ thấm nước

3.1.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một hoặc hai nhân tố, lặp lại
ba lần. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được sử dụng cho thí nghiệm
kế tiếp. Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD

để kết luận sự khác biệt giữa trung bình các nghiệm thức với phần mềm hỗ
trợ Statgraphics Centurion 15.2 và phần mềm Modde 5.0 dùng tính toán
mô hình bề mặt đáp ứng.
3.1.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm

8


Vỏ quả cà phê (khô)
Xay, nghiền, rây

Phân tích thành phần hóa học

Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê

Khảo sát một số phương pháp khử caffeine
và polyphenol (TN 1)
Tối ưu hóa quá trình khử caffeine và
polyphenol (TN 2)
Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng acid (TN
3)

Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng kiềm
(TN 4)
Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng vi sinh
vật (TN 5)

Khảo sát quá trình tiền xử lý kết hợp
acid-kiềm-vi sóng (TN 6)

Chọn được các thông số cơ bản của quá trình tiền xử lý
Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc
Phân lập một số dòng nấm mốc (TN 7)
Định tính khả năng sinh tổng hợp cellulase (TN
8)
Khảo sát các điều kiện môi trường nuôi cấy đến
khả năng sinh enzyme celulase của nấm mốc
(TN 9-15)

Khảo sát nồng độ các tác nhân (NH4)2SO4,
NaCl, Ethanol và Acetone đến quá trình thu
nhận enzyme cellulase (TN 16-19)

Chọn được điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme cellulase có hoạt tính cao
Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Khảo sát chủng loại enzyme đến hàm lượng
đường khử thu được sau quá trình thủy phân
(TN 20)

Khảo sát nồng độ enzyme thủy phân (TN
21)
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời
gian thủy phân (TN 22)

Tối ưu hóa các thông số của quá trình thủy phân (TN 23)
Khử độc dịch thủy phân (TN 24)
Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Khảo sát mật độ nấm men (TN 25)
Khảo sát nhiệt độ lên men (TN 26)

Khảo sát thời gian lên men (TN 27)
Khảo sát phương pháp lên men (TN 28)

Chọn được các thông số cho quá trình lên men

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
9


3.2 Nội dung nghiên cứu và bố trí thí nghiệm cụ thể
3.2.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối
Mục tiêu: Xác định một số thành phần cơ bản của nguyên liệu vỏ quả
cà phê vối, làm cơ sở cho việc đánh giá khả năng sử dụng vỏ quả cà phê
làm nguồn sinh khối lignocellulose để sản xuất ethanol sinh học.
Chỉ tiêu đánh giá: Độ ẩm (%), protein tổng số (%), lipid (%), pectin
(%), đường khử (%), đường tổng số (%), tro (%), caffeine (%),
polyphenol (%), cellulose (%), helicellulose (%), lignin (%).
3.2.2 Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất
quá trình khử caffeine và polyphenol
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hiệu suất khử caffeine và polyphenol
trong nguyên liệu theo các phương pháp trích ly khác nhau.
Yếu tố khảo sát: Trích ly thông thường, trích ly bằng nước có hỗ trợ siêu
âm, trích ly bằng nước có hỗ trợ vi sóng.
Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất khử caffeine (%), hiệu suất khử polyphenol
(%).
Thí nghiệm 2: Tối ưu hóa quá trình khử caffeine và polyphenol
Yếu tố khảo sát: tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ trích ly và thời
gian trích ly.

Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất khử caffeine (%), hiệu suất khử polyphenol
(%).
Thí nghiệm 3: Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng acid
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose
và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 khi thay đổi nồng độ acid,
nhiệt độ và thời gian xử lý.
Yếu tố khảo sát: Nồng độ H2SO4, nhiệt độ tiền xử lý, thời gian tiền xử
lý
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.
Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng kiềm
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose
và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng NaOH khi thay đổi của tỷ lệ
kiềm, nhiệt độ và thời gian xử lý.
Yếu tố khảo sát: Tỷ lệ NaOH, nhiệt độ tiền xử lý, thời gian tiền xử lý
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.
Thí nghiệm 5: Tiền xử lý bằng chủng nấm mục trắng Phanerochaete
chrysosporium
10


Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose
và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng nấm mục trắng khi thay đổi thời
gian xử lý và độ ẩm nguyên liệu ban đầu.
Yếu tố khảo sát: Độ ẩm nguyên liệu, thời gian tiền xử lý
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.
Thí nghiệm 6: Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử
lý trên đối tượng vỏ quả cà phê
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose
và lignin trong vỏ quả cà phê khi có sự kết hợp của các tác nhân tiền xử
lý acid-kiềm-vi sóng.

Yếu tố khảo sát: tiền xử lý acid-kiềm, tiền xử lý kiềm-acid, tiền xử lý
acid-kiềm-vi sóng
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.
3.2.3 Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc
Thí nghiệm 7: Phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái
giống nhóm nấm Aspergillus sp và Trichoderma sp
Mục tiêu: Thu nhận các dòng nấm có đặc điểm hình thái giống nhóm
nấm Aspergillus và Trichoderma từ đất trồng cà phê, quả cà phê, cành
cây cà phê.
Yếu tố khảo sát: Đất trồng cà phê, quả cà phê bị mốc, cành cây cà phê
bị mục.
Chỉ tiêu đánh giá: Các dòng phân lập có đặc điểm bên ngoài giống với
nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus và Trichoderma.
Thí nghiệm 8: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase của các
dòng nấm mốc đã phân lập
Mục tiêu: Sơ bộ chọn các dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
cellulase từ các mẫu nấm đã phân lập được.
Yếu tố khảo sát: Các dòng nấm mốc đã nhận diện ở thí nghiệm 7.
Chỉ tiêu đánh giá: Các dòng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase
cao dựa trên đường kính vòng phân giải CMC.
Thí nghiệm 9-15: Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy
đến khả năng sinh enzyme celulase của nấm mốc phân lập được từ quả cà
phê
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hoạt lực enzyme cellulase khi thay
đổi các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm mốc.
Yếu tố khảo sát: Nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trường,
nồng độ dịch chiết khoai tây, cơ chất cảm ứng, nguồn khoáng bổ sung, nitơ
bổ sung.
11

Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính enzyme cellulase (CMCase).
Thí nghiệm 16-19: Ảnh hưởng của nồng độ tác nhân kết tủa
(NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone đến hoạt lực enzyme cellulase thu
được từ nấm mốc
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hoạt lực enzyme cellulase thu được
từ nấm mốc khi thay đổi nồng độ các tác nhân kết tủa enzyme.
Yếu tố khảo sát: Nồng độ (NH4)2SO4, nồng độ NaCl, tỷ lệ
ethanol/enzyme thô, tỷ lệ acetone/enzyme thô.
Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính, hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi.
3.2.4 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy
phân vỏ quả cà phê
Thí nghiệm 20: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường
khử thu được sau quá trình thủy phân
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng đường khử sau quá trình
thủy phân dưới sự thay đổi của loại enzyme cho vào quá trình thủy phân.
Yếu tố khảo sát: Enzyme thu nhận, Viscozyme, Celluclast 1.5L,
Glucosidase.
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử, đường glucose.
Thí nghiệm 21-22: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời
gian đến hàm lượng đường khử thu được sau quá trình thủy phân
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng đường khử sau quá trình
thủy phân dưới sự thay đổi của nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian
thủy phân.
Yếu tố khảo sát: Nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy
phân.
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử, đường glucose.
Thí nghiệm 23: Tối ưu hóa các thông số của quá trình thủy phân
Yếu tố khảo sát: Nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy
phân.

Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử.
3.2.5 Thí nghiệm 24: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến hiệu quả khử
độc dịch thủy phân
Mục tiêu: Chọn được thể tích Ca(OH)2 thích hợp để kết tủa gốc
sulphate trong dịch thủy phân nhiều nhất có thể trước khi lên men tạo
ethanol.
Yếu tố khảo sát: Thể tích Ca(OH)2
Chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng kết tủa.
12


3.2.6 Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men
Thí nghiệm 25-27: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men, nhiệt độ
và thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được
Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng ethanol và glucose dưới
sự thay đổi của mật độ tế bào nấm men ban đầu cho vào quá trình lên
men.
Yếu tố khảo sát: Mật độ tế bào nấm men, nhiệt độ lên men, thời gian lên
men
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng ethanol tạo thành.
Thí nghiệm 28: Ảnh hưởng của phương pháp lên men đến hàm
lượng ethanol thu được
Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng ethanol tạo thành khi thực
hiện quá trình lên men với các phương pháp khác nhau và ở những thời
điểm lên men khác nhau.
Yếu tố khảo sát: Lên men SHF, lên men SSF, lên men SHF kết hợp
SSF.
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng ethanol tạo thành.

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối
Kết quả cho thấy thành phần hóa học vỏ quả cà phê bao gồm: đường
tổng 9,18±0,23%, pectin 4,37±0,06%, protein tổng 9,52±0,23%, cellulose
25,88±0,91%, hemicellulose 3,6±0,18%, lignin 20,07±0,56%, chất béo
1,22±0,11%, caffeine 0,78±0,01%, polyphenol 8,69±0,12% và tro
6,29±0,09%.
4.2 Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý đến sự thay đổi hàm
lượng cellulose, hemicellulose và lignin
4.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly hiệu suất khử caffeine và
polyphenol có trong vỏ quả cà phê
Đối với phương pháp trích ly thông thường: hiệu suất khử caffeine
là 88,1%, khử polyphenol là 80,6%.
Đối với phương pháp trích ly bằng nước có hỗ trợ siêu âm: hiệu suất
khử caffeine là 91,4%, khử polyphenol là 85,5%.
Đối với phương pháp trích ly bằng nước có hỗ trợ vi sóng: hiệu suất
khử caffeine là 92,3%, khử polyphenol là 87,7%.
Phương pháp khử caffeine và polyphenol được lựa chọn đó là trích ly
bằng nước nóng thông thường vì tính kinh tế, hiệu quả và sự thuận tiện.
13


4.2.2 Tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine và polyphenol
Để tìm được giá trị tối ưu trong quá trình khử caffeine và polyphenol
bằng nước nóng, cũng như các tương tác ảnh hưởng của các nhân tố đến
hiệu suất khử caffeine và polyphenol, tiến hành tối ưu hóa theo phương
pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với mô hình CCF với các thông số thay đổi
như là: X1: tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, X2: nhiệt độ trích ly, X3: thời gian
trích ly và hàm mục tiêu nghiên cứu lần lượt là Y1 (%, hiệu suất khử
caffeine), Y2 (%, hiệu suất khử polyphenol).
Bảng 4.1: Thông số của quá trình trích ly

Các nhân tố tối ưu

Ký hiệu

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
Nhiệt độ trích ly (oC)
Thời gian trích ly (phút)

X1
X2
X3

Các mức độ thay đổi
-1
0
1
30/1
40/1
50/1
70
80
90
90
120
150

Phương trình hồi quy thu nhận được như sau:
Y1= 88,33–3,56X1+5,17X2–7,6X12–9,97X22–5,23X32+4X1X3+4,49X2X3 (1)
Y2= 80,65–1,28X1+1,59X2–4,24X12–3,19X22+0,52X1X2+0,77X1X3 (2)

Cả 2 phương trình hồi quy đều có p<0,05; hệ số tương quan R2 là
0,995 và 0,986 (>0,8) và hệ số đánh giá khả năng dự đoán của mô hình
Q2 là 0,968 và 0,914 (>0,5) chứng tỏ mô hình đạt độ tin cậy cao.
Bảng 4.2: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm
Nhân tố
Giá trị dự đoán tối ưu
Giá trị kiểm tra

X1
38,6/1

X2
82,9

X3
136,7

Y1
88,1
89,52±0,49

Y2
80,95
78,77±0,44

Kết quả tối ưu đạt được từ mô hình chọn lựa ban đầu là: Hiệu suất
khử caffeine đạt 89,52% và khử polyphenol đạt 78,77% ở điều kiện tỷ lệ
dung môi/nguyên liệu là 38,6/1, nhiệt độ trích ly 82,9oC và thời gian trích
ly là 136,7 phút.
4.2.3 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi

hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin
Khi tăng nồng độ acid, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý thì sự suy
giảm cellulose, hemicellulose và lignin tăng theo. Tuy nhiên acid loãng
thực sự có hiệu quả trong việc loại bỏ hemicellulose nhưng không có hiệu
quả cao đối với lignin.
Điều kiện tiền xử lý tối ưu bằng acid loãng H2SO4 đối với vỏ quả cà
phê là: Nồng độ acid 2% (w/w), tỷ lệ acid:nguyên liệu là 10:1, nhiệt độ
tiền xử lý 140oC và thời gian là 45 phút. Ở điều kiện tiền xử lý này thì
14


cellulose tổn thất 7,5%, hemicellulose bị loại bỏ 43,9% và lignin bị loại
bỏ 4,2%.
A–B

Hình 4.1: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (B) khi được
tiền xử lý bằng H2SO4 2% dưới kính hiển vi điện tử (SEM)
4.2.4 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi
hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin
Tiền xử lý bằng kiềm loãng thực sự có hiệu quả hơn so với acid khi
loại bỏ được 46,11% hemicellulose, 76,63% lignin ra khỏi nguyên liệu
nhưng vẫn giữ lại được 71,25% cellulose. Kết quả này tuy có tốt hơn so
với tiền xử lý bằng acid loãng nhưng chưa phải là tốt nhất.
Điều kiện tiền xử lý tối ưu bằng kiềm loãng NaOH đối với vỏ quả cà
phê là: Tỷ lệ kiềm 0,2 g/g NL, tỷ lệ nguyên liệu/dịch kiềm là 1:10, nhiệt
độ tiền xử lý 120oC và thời gian 20 phút.
A–C

Hình 4.2: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (C) khi được
tiền xử lý bằng NaOH 0,2 g/g NL dưới kính hiển vi điện tử (SEM)

4.2.5 Tiền xử lý vỏ quả cà phê bằng chủng nấm P. chrysosporium
Sau 50 ngày tiền xử lý: cellulose giảm tối đa 23,7%, hemicellulose
giảm 14,1% và lignin giảm 51,4%.
Phương pháp tiền xử lý bằng chủng nấm P. chrysosporium chưa thực
sự có hiệu quả trong việc loại bỏ hemicellulose và lignin. Tuy nhiên
phương pháp này thực hiện ở nhiệt độ phòng và không sử dụng đến hóa
chất cho nên chi phí thấp và không gây ô nhiễm môi trường.
15


A–D

Hình 4.3: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (D) khi được
tiền xử lý bằng nấm mục trắng dưới kính hiển vi điện tử (SEM)
4.2.6 Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý trên
đối tượng vỏ quả cà phê
100

Cellulose

Hemicellulose

90

% bị loại bỏ

78.5

76.6

80

54.8

60
43.9

40

47.1
28.7

30

34.2

7.5

50.2
34.4

29.6
20.7
12.8

20
10

79.2
71.4

77.4

68.7

70

50

Lignin

4.2

0
Acid

Kiem

Acid-Kiem

Kiem-Acid

VSV

Acid-Kiem-Vi
song

Phương pháp tiền xử lý

Hình 4.4: Sự thay đổi thành phần chất xơ theo các phương pháp tiền xử

lý khác nhau
Đã có sự cải thiện đáng kể về phần trăm loại bỏ thành phần chất xơ
có trong vỏ quả cà phê khi có sự kết hợp 2 hay 3 phương pháp tiền xử lý
với nhau. Nếu xét về tiêu chí loại bỏ cảng nhiều càng tốt hemicellulose
và lignin thì phương pháp tiền xử lý acid-kiềm-vi sóng được lựa chọn,
khi loại bỏ được 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin. Tuy nhiên nếu xét
trên phương diện ít tổn thất cellulose nhất thì phương pháp tiền xử lý bằng
acid được lựa chọn, khi tổn thất chỉ 7,5% cellulose.
Do đó để có cơ sở cho việc lựa chọn phương pháp tiền xử lý nào là
tốt nhất cần phải xem xét đến lượng đường khử tạo ra sau quá trình thủy
phân của các phương pháp này sẽ thay đổi như thế nào. Với hàm mục tiêu
16


đường khử tạo ra ở phương pháp tiền xử lý nào cao nhất thì phương pháp
đó sẽ được lựa chọn.
A–E

Hình 4.5: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (E) khi được
tiền xử lý bằng acid-kiềm-vi sóng dưới kính hiển vi điện tử (SEM)
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự
hình thành đường khử
Phương
pháp TXL

Acid

Kiềm

Vsv

Acidkiềm

Kiềmacid

Kiềmvi sóng

Đường khử
g/L

19,85

28,21

13,19

41,27

39,29

38,21

Acidkiềmvi sóng
43,26

Kết quả Bảng 4.3 cho thấy, đã có cơ sở cho việc lựa chọn phương
pháp tiền xử lý thích hợp đối với vỏ quả cà phê đó là có sự kết hợp acidkiềm-vi vóng.
Khác
44.09%

Hemi
1.05
%

Celulose
25.88%

Lignin
20.07%

Tro
5.20
%

Khác
12.09%

Celulose
77.49%
Lignin
4.17%

Tro Hemi
6.29% 3.67%

NL TXL acid-kiềm-vi
sóng

NL chưa TXL

Hình 4.6: Thành phần nguyên liệu trước và sau khi tiền xử lý
Nguyên liệu sau tiền xử lý còn lại chủ yếu là cellulose (77,49%, tính
theo hàm lượng cellulose ban đầu), tro và một số chất khác (Hình 4.6).
Vỏ cà phê sau tiền xử lý có đặc điểm cảm quan là mềm xốp, màu vàng
nâu nhạt, khả năng thấm nước tốt.
17


4.3 Thu nhận enzyme cellulose từ nấm mốc
4.3.1 Kết quả phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái
giống nhóm nấm Aspergillus và Trichoderma
Bảng 4.4: Số dòng nấm mốc được phân lập từ một số nguồn
TT

Nguồn phân lập

1
2
3

Đất trồng cà phê
Quả cà phê
Cành lá mục
Tổng số

Số dòng
nấm
Aspergillus
2
6

5
13

Ký hiệu mẫu

Số dòng nấm
Trichoderma

Ký hiệu
mẫu

DA1, DA2
QA1÷QA6
CA1÷CA5

2
5
4
11

DT1, DT2
QT1÷QT5
CT1÷CT4

Thông qua quan sát sơ bộ các đặc điểm về đại thể và vi thể có thể
khẳng định, trong 24 dòng khảo sát có 13 dòng có đặc điểm giống
Aspergillus và 11 dòng có đặc điểm giống Trichoderma.
4.3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm
mốc phân lập được.
Trong số 24 dòng nấm mốc phân lập được, nhóm nấm mốc phân lập

được từ quả và cành cây mục thể hiện hoạt tính cellulase cao hơn là từ
đất. Riêng 11 dòng phân lập được từ quả thì đã có 5 dòng cho hoạt tính
cao (QA1, QA3, QA5, QT4, QT5). Với 9 dòng phân lập được từ cành lá
thì có 3 dòng thể hiện hoạt tính cellulase cao (CA1, CT2, CT4). Còn lại 4
dòng phân lập được từ đất nhưng không có dòng nào thể hiện hoạt tính
cellulase cao (D < 12 mm).
Có năm dòng nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase được
tuyển chọn bao gồm: QA3 (phân lập từ quả), CA1 (phân lập từ cành lá),
QT5 (phân lập từ quả), CT2 (phân lập từ cành lá) và CT4 (phân lập từ
cành lá). Riêng dòng QT5 cho kết quả đường kính vòng phân giải và hoạt
tính CMCase cao nhất. Kết quả định danh, xác định chủng QT5 là
Trichoderma asperellum với tỷ lệ đồng hình 99%.
4.3.3 Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm T. asperellum QT5
Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy T. asperellum QT5 đến
hoạt lực CMCase
Hoạt tính của enzyme thu được tăng dần theo thời gian nuôi cấy và
đạt cực đại tại thời điểm 7 ngày. Sau đó hoạt tính bắt đầu giảm dần khi
thời gian nuôi cấy tăng từ 7 đến 9 ngày.
Đối với chủng nấm mốc T. asperellum khả năng sinh tổng hợp
cellulase tăng dần trong khoảng nhiệt độ từ 30÷35oC tương ứng hoạt lực
tăng từ 1,69 U/mL đến cực đại là 1,84 U/mL (ở 35oC). Có thể nhận thấy
chủng T. asperellum cũng là một chủng nấm ưa ấm.
18


Thời gian để nấm mốc phát triển tối ưu là 7 ngày và nhiệt độ nuôi cấy
tốt nhất là 35oC, tương ứng với hoạt tính CMCase đạt cực đại là 1,6 U/mL.
Ảnh hưởng của pH môi trường và nồng độ dịch chiết khoai tây đến
hoạt lực CMCase
Hoạt tính CMCase tăng dần khi pH môi trường tăng và hoạt lực đạt

cực đại ở pH 7 (2,37 U/mL), sau đó khả năng sinh tổng hợp cellulase giảm
nhanh chóng ở pH 9. Như vậy, chủng T. asperellum có khả năng sinh tổng
hợp cellulase mạnh nhất trong điều kiện pH trung tính.
Ngoài ra, khi tăng nồng độ dịch chiết khoai tây thì hoạt lực CMCase
tăng theo và hoạt lực đạt cao nhất khi nồng độ dịch chiết là 100% (v/v).
Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase
Cơ chất cảm ứng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh
tổng hợp cellulase của các chủng nấm. Chủng T. asperellum QT5 được
lên men trong môi trường chứa các nguồn cơ chất cảm ứng khác nhau ở
nồng độ 1% (w/v). Kết quả cho thấy cơ chất cám gạo cho khả năng cảm
ứng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đạt 9,76 U/mL.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ và khoáng chất đến hoạt lực CMCase
Một số nguồn khoáng: KCl, MgSO4 hay CaCO3 khi bổ sung vào môi
trường nuôi cấy thì có tác dụng làm tăng hoạt tính CMCase. Trong nghiên
cứu của Ali and Akhand (1992), thì các khoáng NaCl và KCl không có
tác dụng làm tăng hoạt tính Endo-glucanase. Tuy nhiên trong nghiên cứu
này KCl có tác dụng gia tăng hoạt tính CMCase hơn so với MgSO4, điều
này cho thấy ion K+ phân ly từ KCl cũng ảnh hưởng đến hoạt tính
cellulase sinh ra bởi nấm mốc T. asperellum.
Một số nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng, (NH4)2SO4 và
NH4NO3 là hai nguồn nitơ thích hợp nhất đối với chủng Trichoderma spp.
S1 (Ali and Akhand, 1992). Do đó, KCl và (NH4)2SO4 được lựa chọn để
bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm T. asperellum.
4.3.4 Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối
(NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone
Bảng 4.5: So sánh hiệu quả tinh sạch cellulase bằng các tác nhân kết tủa
khác nhau
Tác nhân kết tủa
Đối chứng
(NH4)2SO4

NaCl
Ethanol
Acetone

Tỷ lệ tác nhân
và enzyme

F65-75 (w/v)
25% (w/v)
3,5:1 (v/v)
2: 1 (v/v)

Protein
(mg/mL)

Hoạt tính
(U/mL)

0,96
0,316
0,471
0,438
0,507

13,6
13,9
16,42
21,72
13,8

19

Hoạt tính
riêng
(U/mg)
14,16
43,92
33,42
49,59
26,78

Hiệu suất
thu hồi (%)

70,51
78,36
89,43
43,54


Việc sử dụng dung môi ethanol tỏ ra hiệu quả đối với việc kết tủa sơ
bộ enzyme, thể hiện ở hoạt tính riêng gia tăng khác biệt khi so sánh với
các loại hóa chất kết tủa khác đã sử dụng và hiệu suất thu hồi tương đồng
với việc sử dụng NaCl (89,43% và 78,36%). Đồng thời, việc sử dụng
ethanol còn giúp giảm bớt công đoạn thẩm tích sau quá trình kết tủa với
muối. Dựa trên các kết quả khảo sát, ethanol được sử dụng làm dung môi
kết tủa cellulase với tỷ lệ ethanol:enzyme thô là 3,5:1.
4.4 Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose có trong vỏ quả cà phê
bởi hệ enzyme cellulase
4.4.1 Ảnh hưởng của chủng loại enzyme đến hiệu quả quá trình thủy

phân
Kết quả phân tích cho thấy, lượng đường khử và glucose tạo ra sau
quá trình thủy phân có sự khác nhau khi sử dụng các loại enzyme thủy
phân khác nhau. Cụ thể, cellulase thu nhận được tạo ra 12,15 g/L đường
khử và 8,35 g/L glucose; Viscozyme tạo ra 24,43 g/L đường khử và 17,46
g/L glucose; Celluclast 1.5L tạo ra 27,39 g/L đường khử và 18,65 g/L
glucose. Đường khử và glucose tạo ra khác nhau là do hoạt tính enzyme
endo và exo ban đầu của các enzyme khác nhau. Bên cạnh đó, khi thêm
vào quá trình thủy phân enzyme Glucosidase thì đường khử và glucose ở
các mẫu đều tăng đáng kể.
Để đánh giá hiệu quả quá trình thủy phân của các loại enzyme trên
cần xem xét đến hiệu quả kinh tế của quá trình thủy phân mà trước tiên là
xem xét chi phí thủy phân tính trên 1 gam ethanol tạo ra.
Bảng 4.6: Chi phí thủy phân của các loại enzyme khác nhau
Chủng loại enzyme

Thể tích
enzyme
(mL)

Chi phí
(đồng)

Ethanol (g/L)

Cellulase*

Chi
phí/1
mL

(đồng)
1.200

8,72

10.464

5,08±0,07f

Chi
phí/1g
ethanol
(đồng)
2.060e

Viscozyme

4.000

4,75

19.000

8,45±0,09e

2.249c

9,08±0,05d

2.506a

Celluclast 1.5L
Glucosidase
Cellulase*
+
Glucosidase
Viscozyme
+
Glucosidase
Celluclast 1.5L +
Glucosidase

35.000

0,65

22.750

6.800

0,83

5.644

8,72 + 0,83

16.108

10,06±0,13c

1.601f

4,75 + 0,83

24.644

11,67±0,15b

2.112d

0,65 + 0,83

28.394

12,02±0,12a

2.362b

Chi phí/1 mL enzyme và chi phí/1 g ethanol chỉ mang tính chất tham khảo
vì được tính toán sơ bộ ở điều kiện phòng thí nghiệm

20


Hàm lượng ethanol tính theo g/L dịch lên men do enzyme cellulase
thu nhận được tạo ra đều thấp hơn so với 2 loại enzyme thương mại thậm
chí là khi có sự kết hợp với Glucosidase. Tuy nhiên, khi xem xét chi phí
trên 1 gam ethanol tạo ra thì việc sử dụng enzyme cellulase thu nhận được
(Cellulase*) cho thấy hiệu quả tương đương hoặc hơn so với enzyme
thương mại. Do đó, enzyme cellulase* được chọn lựa kết hợp với

Glucosidase để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân
Trong điều kiện cơ chất nhất định, hiệu quả thủy phân của enzyme
cellulase chỉ tăng tuyến tính trong một giới hạn tỷ lệ enzyme nhất định
(5÷25 FPU/g và 5÷30 CBU/g).
Hầu như tất cả các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm thường sử dụng
với tỷ lệ từ 7 ÷ 33 FPU/g cơ chất và nó phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ
chất (Sun and Cheng, 2002). Qua đó, 25 FPU/g (đối với cellulase*) và 30
CBU/g (đối với glucosidase) là nồng độ được lựa chọn để thủy phân vỏ cà
phê trong toàn bộ các thí nghiệm về sau.
4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình thủy phân
Khi tăng nhiệt độ thủy phân, tốc độ phản ứng ban đầu tăng và tăng rõ
rệt trong khoảng nhiệt độ từ 35÷50oC. Thủy phân ở nhiệt độ 50oC cho hàm
lượng đường khử cao nhất đạt 26,1 g/L. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nhiệt
độ thủy phân lên 50÷60oC thì tốc độ phản ứng đầu giảm đồng nghĩa với
việc giảm hàm lượng đường khử tạo thành sau thủy phân và giảm một cách
rõ rệt ở nhiệt độ 60oC.
Dù enzyme có khả năng phản ứng ở nhiệt độ cao thì hiệu suất thủy
phân vẫn bị chi phối bởi thời gian phản ứng, vì nồng độ glucose và
cellobiose tích lũy tăng dần theo thời gian phản ứng. Đường khử tạo thành
trong phản ứng thủy phân enzyme tăng mạnh trong thời than đầu thủy phân
từ 1÷4 ngày, từ ngày 5 đến ngày thứ 7 đường khử tăng nhưng không đáng
kể và đạt cực đại 26,95 g/L ở ngày thứ 6.
Kết quả khảo sát cho thấy nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme
Cellulase* + Glucosidase là 50oC và thời gian thủy phân là 4 ngày.
4.4.4 Tối ưu hóa các thông số quá trình thủy phân bởi enzyme
cellulase thu nhận từ nấm mốc T. asperellum QT5 kết hợp với
glucosidase
Mô hình được thực hiện theo phương trình hồi quy như sau:
𝑛

𝑌 = 𝑎0 + ∑𝑛𝑖=1 𝑎𝑖 𝑥𝑖 + ∑𝑛𝑖=1 𝑎𝑖𝑖 𝑥𝑖2 + ∑𝑛−1
𝑖=1 ∑𝑗=2 𝑎𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗

21


Bảng 4.7: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu
Các nhân tố tối ưu

Các mức độ thay đổi
-1
0
1

Ký hiệu

Nồng độ enzyme (FPU/g)
X1
20
25
30
o
Nhiệt độ thủy phân ( C)
X2
45
50
55
Thời gian thủy phân (giờ)
X3
72

96
120
Phương trình hồi quy thu nhận được như sau:
Y= 27,18+0,79X2–2,64X12–2,1X22–1,13X32+0,78X2X3
Phương trình hồi quy có p<0,05; hệ số tương quan R2 là 0,979 (>0,8)
và hệ số đánh giá khả năng dự đoán của mô hình Q2 là 0,787 (>0,5) chứng
tỏ mô hình đạt độ tin cậy cao.
Bảng 4.8: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm
Nhân tố

X1

X2

X3

Y

Giá trị dự đoán tối ưu
24,77
51,19
92,3
27,35
Giá trị thực nghiệm
26,22±0,39
Kết quả tối ưu đạt được từ mô hình chọn lựa ban đầu là: Hàm lượng
đường khử đạt 27,35 g/L ở điều kiện nồng độ enzyme là 24,77 FPU/g,
nhiệt độ thủy phân 51,19oC và thời gian thủy phân là 92,3 giờ.
4.4.5 Nghiên cứu quá trình khử độc dịch thủy phân
Quá trình tiền xử lý bằng acid-kiềm-vi sóng đã tạo ra một số chất có

khả năng gây độc cho nấm men đó là HMF và Furfural với hàm lượng
2,11 g/L HMF và 3,37 g/L furfural. Phương pháp để loại bỏ một số chất
này là sử dụng phương pháp vôi hóa được phát triển bởi Millati (Millati
et al., 2002) kết hợp với lọc than hoạt tính.
Trọng lượng kết tủa (mg)

pH
0.5

10

0.4

pH

9
8

0.3

7

0.2

6
0.1

5
4

0
0

1

2

3
4
5
Thể tích Ca(OH)2 (mL)

Khối lượng kết tủa (g)

11

6

Hình 4.7: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa
22