Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương

PHẦN I

MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài
Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những
kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu
mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng
hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các lồi
thực vật q hiếm [1].
Đặc trưng của rừng nhiệt đới là sự đa dạng về lồi, song thường là
các lồi hiếm do kích thước quần thể nhỏ, mật độ thấp, nhiều loài bị suy
giảm mạnh do tàn phá rừng. Hiểu biết của con người về mối tương tác và
sự phụ thuộc lẫn nhau giữa các lồi trong hệ sinh thái cịn ít. Do vậy những
nghiên cứu để bảo tồn đa dạng sinh học cần phải tiến hành đồng thời với
việc bảo tồn hiệu quả giữa các loài và hệ sinh thái. Bảo tồn nguồn gen thực
vật là việc cấp thiết và thường xuyên nhằm bảo vệ đa dạng sinh học ở nước
ta [12], [13].
Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam có rất nhiều cây thuốc q, trong
số đó cây Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv. ) là một trong những loài
thực vật trong danh mục cần được bảo tồn của Vườn Quốc gia Cúc Phương
[11], [14]. Ngồi cơng dụng chữa một số bệnh thơng thường như trị ghẻ,
sâu đốt, ngộ độc thức ăn hay bệnh vàng da thì cây Mắt trâu cịn phục vụ
cho cơng tác nghiên cứu tìm ra hoạt chất phịng và chống bệnh [9], [41],
[42]. Theo Ma và cộng sự thì trong dịch chiết vỏ thân cây Mắt trâu phân
tích được micromeline, 5 hợp chất alkaloids mới có khả năng kháng chủng
vi khuẩn H37Rv gây bệnh lao [32]. Bên cạnh đó, cây Mắt trâu cịn có giá
trị về mặt bảo tồn quần thể thực vật Vườn Quốc gia Cúc Phương.

1

Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu sâu về tác dụng chữa bệnh của
cây Mắt trâu. Vì vậy, cần có những nghiên cứu đầy đủ hơn về ứng dụng
cũng như nhân giống và bảo tồn loài cây này.
Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: Ứng dụng kỹ thuật
nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của
Vườn Quốc gia Cúc Phương.
Mục đích, nội dung nghiên cứu
Mục đích
Xây dựng qui trình hồn chỉnh để nhân nhanh và bảo tồn in vitro cây
Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv.) của Vườn Quốc gia Cúc Phương.
Nội dung
Khử trùng được mẫu sạch để nuôi cấy in vitro.
Xác định cơng thức mơi trường thích hợp tạo đa chồi in vitro.
Xác định công thức môi trường thích hợp tạo cây in vitro hồn chỉnh.
Xác định giá thể thích hợp cho cây in vitro ni trồng ngồi tự nhiên.

2


PHẦN II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Mắt trâu
Cây Mắt trâu có tên khoa học là Micromelum hissutum Oliv.
Thuộc bộ: Rutales (Cam)
Họ: Rutaceae (Cam)
Đặc điểm sinh học, sinh thái
Mắt trâu là cây gỗ nhỏ có thể cao đến 6m. Thân ít phân cành, cành
có nhiều lơng nhung, màu hung, lá màu xanh sẫm, kép lông chim lẻ, lá chét
từ 5 - 9, mọc so le, thuôn mũi mác hay mũi mác, dài 1,7 - 13cm, rộng 1 5cm, khơng cân ở góc và mũi nhọn sắc, đài dài, hơi có răng, có lơng nhung

ở mặt dưới. Hoa trắng, hay vàng xanh, thành cụm hoa phủ lông nhung,
ngắn hơn lá, cánh hoa có lơng cứng. Quả nạc dạng bầu dục, màu đỏ, cam
hay hung và có mùi thơm. Mùa hoa tháng 1 - 4, mùa quả chín tháng 4 - 5
[2], [6], [34].
Cây Mắt trâu phân bố ở một số khu vực như Ninh Bình, Nha Trang,
Hịa Bình, Thanh Hóa. Lồi cây này cũng được tìm thấy ở Ấn Độ,
Malayxia, Lào, Campuchia, Thái Lan [8], [39].
Lá cây Mắt trâu dùng trị bệnh ghẻ, nấu xông chữa bệnh vàng da
hay ngộ độc thức ăn. Sử dụng lá giã ra cùng với lá me sau đó thêm ít
muối dùng đắp vào da làm dịu đau khi bị sâu đốt. Theo nghiên cứu của
các tác giả Ma và Cộng sự (2005) trong dịch chiết của vỏ cây Mắt trâu
(Micromelum hissutum Oliv.) chứa chất có khả năng kháng chủng vi
khuẩn gây bệnh lao H37Rv. Các thí nghiệm đang trong giai đoạn thử
nghiệm trên chuột [32], [42].

3


Cây Mắt trâu nằm trong danh sách các loài thực vật cần được bảo tồn
của VQG Cúc Phương. Vì vậy, mà ngoài giá trị về làm thuốc hay dùng
trong nghiên cứu thì lồi cây này cịn đóng góp vốn gen của mình vào trong
quần thể thực vật VQG Cúc Phương, hiện đang được lưu giữ và bảo tồn
nguồn gen trong các phịng thí nghiệm [39], [41].
Trên thế giới, nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực
vật đã bảo tồn thành công nhiều cây thuốc như Centella aistica, Rehmannia
glutinosa [22], [38]. Năm 2009 Geetha và cộng sự đã thơng qua phương
pháp vi nhân giống hai lồi cây Holostemma adakodien và Ipomoea
mauritiana đồng thời cũng tuyên truyền cho người dân biết bảo tồn các cây
thuốc quí trước thảm họa bị tuyệt chủng [27].
2.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong nhân giống và bảo

tồn nguồn gen thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật
quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng
các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua
hơn 100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong
lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng [16].
2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các
loại nguyên liệu thực vật hồn tồn sạch được ni cấy trong môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng.
Bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
- Nuôi cấy cơ quan
- Nuôi cấy phôi

4


- Nuôi cấy mô sẹo
- Nuôi cấy tế bào trần
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là
tính tồn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902. Theo quan niệm
sinh học hiện đại thì tính tồn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã
phân hóa đều mang tồn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ
thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát
triển thành một cá thể hồn chỉnh.
Q trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là
kết quả của q trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó:
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế
bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.

Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt,
chúng khơng hồn tồn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường
hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phơi
sinh và phân chia mạnh mẽ. Q trình đó gọi là phản phân hóa tế bào
ngược lại với sự phân hóa tế bào.
Phân hóa tế bào
Tế bào phơi sinh

Tế bào phân chia

Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, cịn một số
gen khác lại bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã

5


được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình
sinh trưởng của cơ thể thực vật ln được hài hịa.
Như vậy, kỹ thật ni cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ
thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy
tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng). Đây là một điểm rất quan
trọng vì trên cơ sở đơn vị mơ, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kỹ
thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng [7],
[10], [16].
2.2.2. Các bước chính trong nhân giống vơ tính in vitro

Theo George (1993) q trình nhân giống vơ tính in vitro bao gồm
các bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ
(nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch vi
rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện
mơi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu quả
trước khi lấy mẫu ni cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng
sống và sinh trưởng của mẫu.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro. Các giai đoạn này
cần đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn
tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn
phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau
đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Bước 3: Nhân nhanh

6


Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng
nhanh số lượng thơng qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất
định và tạo phơi vơ tính.
Chúng ta cần phải xác định được mơi trường và điều kiện ngoại cảnh
thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo ngun tắc chung mơi trường có
nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ ni cấy thường là 25 27oC thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000
lux. Tuy nhiên, đối với mỗi loại đối tượng ni cấy địi hỏi có chế độ ánh
sáng ni cấy khác nhau.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh

sang môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi
chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang mơi trường khơng
chứa chất kích thích sinh trưởng.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau:
Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định
(số lá, số rễ, chiều cao cây).
Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp giá thể sạch tơi xốp, thoát
nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng
như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [5], [17].
2.2.3. Phương pháp nhân đa chồi
Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn được tách và nuôi cấy
trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới ảnh
hưởng của cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức
chế ưu thế ngọn để chồi bên phát triển. Các chồi này tiếp tục được chuyển
sang mơi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được

7


tạo ra. Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được
đưa ra vườn ươm khi đã có rễ hồn chỉnh [16].
Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi:
Nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau. Nồng độ cytokinin
thay đổi tùy theo giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi
người ta sử dụng auxin với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở
nồng độ cao. Không nên cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin q
cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.
Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt

bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động.
Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [18].
Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp
dụng rộng rãi ở nhiều loài thực vật, quá trình nhân chồi thường được thực
hiện theo các bước sau [10]:

Cây tự nhiên

Khử trùng mẫu

Nhân đa chồi

Cây trồng ngoài
Trồng cây trong
Tạo cây in vitro
Sơ đồ tổng quát nhânbầu
nhanh trong in vitro hồn chỉnh
tự nhiên
2.2.4. Vai trị của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro
Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trị quan trọng trong kỹ
thuật ni cấy mơ và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích
thích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được
chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai
chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong ni cấy mơ.
 Đặc tính của Auxin

8


Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường

xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần khác của mơi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng
của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái đặc biệt là
khi nó được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong
môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần
nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua
lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
Auxin có vai trị kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng
với cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone
của nhóm này có hoạt tính như: Tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính
hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn.
Tác động của các auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi
chính, rễ ... Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để
kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng rộng
rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA
(Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic Acid), 2,4 - D
(Dichlorphenoxy Acetic Acid) [18].
 Đặc tính của cytokinin
Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến
sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong ni
cấy mơ tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là
BAP (6 - Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 amin ), zeatin (6 - (4 - hydroxy - 3metyl - trans - 2 butanylamin) purin).
Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 0,2 mg/l. Ở nồng
độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi
bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.

9


Ngồi hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong ni cấy mơ và tế

bào thực vật người ta cịn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo
dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước chồi ni cấy…

GA3

là loại

gibberellin được sử dụng nhiều nhất.
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc
cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ
hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn [19].
2.2.5. Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương pháp nuôi
cấy mô và tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trong
những phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh, đặc biệt là đối với cây
trồng khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Dưới đây là một số
thành tựu đã đạt được.
• Trong nước
Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các lồi thực vật
nhiệt đới q hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan
tâm, bắt đầu từ các cây Thông (Taxus sps.) là một lồi có chứa các hoạt
chất chữa ung thư hiệu quả như Taxoid và các hợp chất và một số lồi thực
vật có giá trị làm thuốc [20].
Cây Màng tang (Litsea verticillata) là loại cây thân gỗ có chứa một
số hợp chất có khả năng kháng HIV (+)- demethoxyepiercelsin và
verticillatol [29], [40]. Tác giả Lê xuân Đắc và Cộng sự đã thành công
trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được
tìm thấy ở Vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế
bào thực vật [4].
Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) được biết là một vị

thuốc quí trong việc chữa một số bệnh ung thư. Tác giả Lưu Trường Sinh và

10


Cộng sự đã tạo ra cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro có
chất lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [15].
Các tác giả Nguyễn Thanh Danh và Cộng sự (2005) đã nghiên cứu
thành công nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae
Lecomte.), sử dụng phôi hạt của quả Vù hương xanh thu hái trước khi chín
30 ngày đã nhân giống được cây Vù hương bằng kỹ thuật ni cấy phơi hạt
xanh [3].
• Thế giới
Năm 2003, Bedir và Cộng sự đã vi nhân giống thành cơng giống
Hydrastis Canadensis, một lồi thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền
Bắc nước Mỹ [23].
Cũng cùng năm 2003 Part và Cộng sự đã thành công trong việc nhân
nhanh và bảo tồn cây thuốc Anemopaegma arvense trong ống nghiệm trên
mơi trường MS có chứa 4% đường sorbitol, kết quả sau 6 tháng mới phải
cấy chuyển một lần [36].
Năm 2008 Balaraju và Cộng sự đã nhân giống và tái sinh in vitro
thành công cây thuốc Vitex agnus castus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
và tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường MS có bổ sung
0,1mg/1ml IBA [21].
Gần đây những thành tựu trong việc hồn thiện qui trình ni cấy in
vitro cây thuốc đang có nguy cơ bị tuyệt chủng như Gynura procumbens,
Crotalaria verrucosa, Momordica tuberosa [24], [30], [33].
Năm 2009 bằng kỹ thuật vi nhân giống in vitro các nhà khoa học
trên thế giới đã thành công trong việc nhân nhanh nhiều cây thuốc quí hiếm
như Phyllanthus urinaria hay cây Givotia rottleriformis [31], [37].

Park và Cộng sự (2009) tái sinh thành công lồi Rehmannia
glutinosa q hiếm đang bị khai thác q mức [35].

11


Hiện nay những cơng trình nghiên cứu thành cơng trong lĩnh vực tái
sinh cây thuốc q bằng kỹ thuật ni cấy mô và tế bào thực vật vẫn đang
được tiến hành.
2.2.6. Phương pháp bảo tồn thực vật quí hiếm
Ngày nay nhiều nguồn gen thực vật bị đe dọa có nguy cơ tiệt chủng,
nhiều giống cây trồng bị thối hóa khơng giữ được đặc điểm nguyên sơ ban
đầu như chất lượng hay khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi, thì
việc sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để nhân nhanh và bảo tồn nguồn
gen là hết sức cần thiết. Bảo quản trong điều kiện in vitro được coi là giải
pháp cơng nghệ có triển vọng đối với cây trồng nhân giống vơ tính và cây
có hạt dễ mất khả năng nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp.
Bảo tồn in situ
Là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất bao hàm các quần thể tái sinh
nhân tạo bằng nguồn hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ cây mẹ mà khơng
áp dụng có định hướng. Điều này có ý nghĩa lớn đối với việc xây dựng
rừng giống cho các lồi cây có phân bố rải rác, như vậy quần tụ bảo tồn
được dùng làm nguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo [12].
Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình
thức bảo tồn in situ, song hai vấn đề được quan tâm là:
- Có qui hoạch cụ thể và xác định vùng cần bảo vệ cho mỗi loài sao cho
cá thể vẫn giữ nguyên được toàn bộ biến dị di truyền của loài.
- Kết hợp bảo tồn với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên,
tái sinh nhân tạo, xây dựng quần tụ bảo tồn mới, xây dựng giống và
phục vụ trồng rừng.

Bảo tồn ex situ

12


Bảo tồn ex situ được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu
nhân giống ra khỏi vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây
sống, rừng trồng với mục đích bảo tồn [12].
Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ là:
- Thu thập các mẫu gen tiêu biểu;
- Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài;
- Làm tăng số lượng mẫu thu thập được;
Khó khăn nhất trong bảo tồn ex situ là chi phí cao mà diện tích của
một quần tụ bảo tồn được đề xuất với 10 ha cho mỗi loài hoặc xuất xứ và
được lượng biến dị đủ lớn nghĩa là thu hạt từ càng nhiều kiểu gen càng tốt.

13


PHẦN III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu thực vật
Cây Mắt trâu được thu thập từ VQG Cúc Phương, do Trạm nghiên
cứu khoa học - VQG Cúc Phương cung cấp.
Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ nghiên cứu là các trang thiết bị như: box cấy vô trùng,
panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống

giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo PH, máy khuấy từ... (của các hãng
chuyên dụng như: Sanyo, Metler Toledo, Satorius...).
Hóa chất: Mơi trường MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối
đa lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog
(1962), đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP,
IAA, NAA, kinetin, IBA... (của các hãng chuyên dụng như: Sigma, Merck,
Invitrogen...).
Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 27°C và chế độ chiếu sáng
12h/12h với cường độ chiếu sáng là 2000 lux.
3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật và Trại thực nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thời gian: Từ tháng 4/2008 đến 4/2010.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm
khác nhau và có cơng thức đối chứng.
Số mẫu của mỗi cơng thức thí nghiệm lớn hơn hoặc bằng 30.

14


Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
3.2.2. Khử trùng mẫu
Khử trùng mẫu bao gồm các bước sau:
Cắt cành cây Mắt trâu thành đoạn dài 6 - 8 cm;
Rửa mẫu bằng nước xà phịng lỗng;
Rửa sạch nước xà phịng lỗng dưới vịi nước;
Rửa 2 lần bằng nước cất vơ trùng;
Rửa trong cồn 70 °C (Trong 15 giây);
Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;
Khử trùng trong dung dịch 1% NaClO, lắc trong 10 phút;

Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;
Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;
Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cắt tỉa thành những đoạn dài
khoảng 1,0 - 1,5 cm có từ 1 - 2 đốt thân và được cấy vào môi trường MS.
Sau khoảng 20 ngày, chồi non phát sinh in vitro các chồi non này được sử
dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo [4].
3.2.3. Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi
Mơi trường sử dụng trong các thí nghiệm là mơi trường MS + 30g/l
đường saccharose + 9g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng
với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH =
5,8.
Nhân đa chồi cây Mắt trâu
Thí nghiệm 1: Thăm dò nồng độ BAP và NAA đối với khả năng tạo chồi
Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ BAP và NAA thích hợp nhất cho
sự tạo chồi.
CT Mơi trường

Chất KTST
BAP (mg/l)

15

NAA (mg/l)


ĐC

0

0

MT1

0,5

0,5

MT2

1,0

0,5

MT3

1,5

0,5

MT4

2,0

0,5

MT5

2,5

0,5

MT6

3,0

0,5

Thí nghiệm 2: Thăm dị nồng độ BAP và IBA đối với khả năng tạo đa chồi
Khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và IBA đến khả năng phát
sinh chồi và tăng trưởng chồi Mắt trâu.

CT Môi trường

Chất KTST
BAP (mg/l)

IBA (mg/l)

ĐC

0

0

MT7

0,5

0,5

MT8

1,0

0,5

MT9

1,5

0,5

MT10

2,0

0,5

MT11

2,5

0,5

M12

3,0

0,5

Thí nghiệm 3: Thăm dị nồng độ BAP và kinetin đối với khả năng tạo chồi
Khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và kinetin đến khả năng tạo
chồi cây Mắt trâu.

16


CT Mơi trường

Chất KTST
BAP (mg/l)

kinetin (mg/l)

ĐC

0

0

MK1

0,5

0,5

MK2

1,0

0,5

MK3

1,5

0,5

MK4

2,0

0,5

MK5

2,5

0,5

MK6

3,0

0,5

Các thí nghiệm 1, 2 và 3 được bố trí ở điều kiện:
Nhiệt độ 25 - 27°C
Cường độ ánh sáng 2000 lux
Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l

agar, pH = 5,8.
Cành Mắt trâu được cắt toàn bộ lá chỉ giữ lại phần thân, thân được
cắt thành đoạn có chiều dài 2 - 3 cm gồm 1 - 3 chồi nách.
Nhân đa chồi bằng cách cấy thẳng đứng trên môi trường thạch, quan
sát khi đếm: Số chồi phát sinh/mẫu.
Công thức thích hợp sẽ được chọn để áp dụng cho các lần tạo đa chồi
tiếp theo.
3.2.4. Tạo cây Mắt trâu in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để
chuyển ra trồng ngoài tự nhiên. Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt
nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bên ngồi. Các chất kích thích

17


sinh trưởng có tác dụng tạo đa chồi được loại bỏ và thay vào đó là chất kích
thích sinh trưởng tạo rễ như IBA, NAA…
Thí nghiệm 4: Thăm dị nồng độ IBA đối với khả năng tạo rễ
Mục đích là khảo sát nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu

CT Mơi trường

Nồng độ IBA (mg/l)

ĐC

0

MTI1

0,3

MTI2

0,6

MTI3

0,9

MTI4

1,2

MTI5

1,5

Thí nghiệm 5: Thăm dò nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ
Mục đích thí nghiệm là khảo sát nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ
cây Mắt trâu nhằm chuẩn bị đưa cây con khỏe mạnh ra ngồi vườn ươm.
CT Mơi trường

Nồng độ NAA (mg/l)

ĐC

0

MTN1

0,3

MTN2

0,6

MTN3

0,9

MTN4

1,2

18


MTN5

1,5

Trong các thí nghiệm 4 và thí nghiệm 5 được bố trí ở điều kiện như sau:
Nhiệt độ 25 - 27°C
Cường độ ánh sáng là 2000 lux.
Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS + 30g/l đường saccharose + 9g/l
agar, pH = 5,8.
Các chồi có kích thước 2 - 3 cm được sử dụng cấy thẳng đứng trên
môi trường thạch.
Chỉ tiêu quan sát: Số rễ/mẫu

3.2.5. Trồng cây trong bầu
Đây là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân
giống in vitro. Giai đoạn này cây non cần sự thích nghi dần với điều kiện
bên ngoài ống nghiệm. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần
trong thời gian này cây non phải được bảo vệ và chăm sóc tốt trước những
yếu tố bất lợi.
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của các giá thể đến hiệu quả trồng cây Mắt
trâu
Mục đích thí nghiệm là tìm ra giá thể thích hợp trồng cây Mắt trâu trong bầu
Cơng thức

Thành phần giá thể

1

Đất trồng cây

2

Đất trồng cây : Trấu hun

3

Trấu hun

Tỷ lệ
1
1:1
1

Ghi chú: Đất trồng cây là hỗn hợp đất phù sa + 5% NPK + 15% mùn do
Trại thực nghiệm sinh học cung cấp.

19


3.2.6. Các chỉ tiêu nghiên cứu
Để đánh giá và tìm ra được mơi trường thích hợp nhất chúng tơi sử
dụng các chỉ tiêu sau:
Tổng số mẫu tạo chồi
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) =

x 100
Tổng số mẫu nuôi cấy
Tổng số chồi

Số chồi TB/mẫu

=
Tổng số mẫu tạo chồi
Tổng số chồi ra rễ

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

=

x 100
Tổng số chồi nuôi cấy
Tổng số rễ

Số rễ TB/chồi

=
Tổng số chồi ra rễ
Tổng số cây sống

Tỷ lệ cây sống (%)

=

x 100
Tổng số cây đem trồng

3.2.7. Phương pháp xử lí số liệu thí nghiệm
Các số liệu được xử lí thống kê sinh học. Kết quả được mơ phỏng
bằng các bảng và hình. Chúng tơi đã sử dụng những cơng thức
thống kê sau:
Trung bình số học:

X

=

∑X
n

− 2

Độ lệch chuẩn : δ = ∑ ( X − X )
n

20


Độ lệch trung bình: m =

δ
n
d

Tiêu chuẩn độ tin của hiệu: t d = m
d
X

: Giá trị trung bình cộng;

X: Giá trị của kết quả đo đếm được ở mỗi đối tượng mỗi lần nhắc lại;
n: Số lần nhắc lại của mỗi đợt thí nghiệm (30 ≤ n);
m: Sai số của trung bình số học;
δ : Độ lệch chuẩn;

d: Hiệu của

X

giữa đối chứng và thí nghiệm;

md : Sai số của hiệu các trung bình số học;
Khi tiêu chuẩn độ tin của hiệu td được so với tc - giá trị chuẩn của
tiêu chuẩn Studen với số bậc tự do là n1 + n2 − 2 ( n1 : Số lần nhắc lại của

cơng thức thí nghiệm; n2 : Số lần nhắc lại của công thức đối chứng). Sai
khác giữa các trị số trung bình chỉ có ý nghĩa khi td lớn hơn hoặc bằng giá
trị tương ứng với mức xác suất 0,95.

21


PHẦN IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tạo nguyên liệu vô trùng cây Mắt trâu
Cành Mắt trâu sau khi khử trùng xong mẫu được cắt tỉa thành những
đoạn gồm 1 - 2 đốt thân và được cấy vào môi trường MS. Kết quả sau 30
ngày nuôi cấy đã thu được các chồi vô trùng, các chồi non được sử dụng
làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 1: Chồi Mắt trâu vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy
4.2. Tạo đa chồi
Trong môi trường nghiên cứu in vitro khi bổ sung các chất kích thích
sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin sẽ kích thích sự sinh trưởng
phát triển và phân hóa của các cơ quan, từ đó tạo nên sức sống tốt cho các
mơ và tổ chức. Tuy nhiên, mỗi lồi thực vật lại thích hợp với một loại và
nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau. Vì vậy, nên sử dụng phối
hợp các chất kích thích sinh trưởng trong mơi trường nuôi cấy để cho hiệu
quả tối ưu nhất.

22


Việc tìm ra cơng thức mơi trường với nồng độ và tỷ lệ chất kích

thích sinh trưởng phù hợp với từng loài cây, từng giai đoạn phát triển là
bước rất quan trọng trong qui trình nhân giống in vitro.
4.2.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái
trong các hệ thống ni cấy. Khi tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì sẽ phát sinh
mơ sẹo hoặc hình thành rễ. Ngược lại sẽ dẫn tới phát sinh chồi và chồi
nách.
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm các công thức tạo đa chồi với các tổ
hợp của BAP và NAA ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thể hiện rõ ở bảng
1, hình 2a, hình 2b và hình 3 sau 2 tháng ni cấy.
Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi
BAP

NAA

Tỷ lệ mẫu tạo

Số chồi TB/ mẫu

(mg/l)

(mg/l)

chồi (%)

( X ± m)

ĐC

0

0

100

1,19 ± 0,10

-

MT1

0,5

0,5

100

2,61 ± 0,18

-

MT2

1,0

0,5

100

2,90 ± 0,21

+

MT3

1,5

0,5

100

2,93 ± 0,16

+

MT4

2,0

0,5

100

3,17 ± 0,15

-

MT5

2,5

0,5

100

2,69 ± 0,18

+

MT6

3,0

0,5

100

2,50 ± 0,21

-

CTMT

Ghi chú:+ Xuất hiện mô sẹo; - Không xuất hiện mô sẹo

23

Mô sẹo

Hình 2a: Tạo đa chồi cây Mắt trâu trên mơi trường MT4 ( Không
xuất hiện mô sẹo)
Theo kết quả nghiên cứu trên cây Bạch đàn (Eucalyptus) của Dibax
và Cộng sự (2005), nồng độ của BAP cao hơn nồng độ NAA sẽ cho hiệu
quả tạo chồi cao hơn [26]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu giữ
nguyên nồng độ của NAA là 0,5 mg/l, còn nồng độ của BAP tăng dần từ
0,5 mg/l đến 3 mg/l trong các công thức môi trường từ MT1 đến MT6.
Kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy: Các môi trường đều cho tỷ lệ
mẫu tạo chồi là 100%, ở môi trường MT2, MT3 tỷ lệ số chồi trung bình đạt
được lần lượt là 2,90; 2,93 chồi, xung quanh gốc có xuất hiện nhiều mô sẹo
dạng bở, lá của chồi xoăn nhiều. Ở môi trường MT6, MT1, MT5 hiệu quả
tạo chồi lần lượt là 2,50; 2,69; 2,61 chồi nhỏ và yếu.
Đối với môi trường MT4 có nồng độ BAP là 2,0 mg/l tỷ lệ tạo chồi
đạt 3,17 chồi. Sau 2 tháng nuôi cấy chồi con nhiều, to và khơng có mơ sẹo
ở gốc, riêng ở các môi trường MT2, MT3, MT5 xuất hiện mô sẹo với kích
thước khác nhau ở quanh gốc.

24


Hình 2b: Tạo đa chồi cây Mắt trâu trên mơi trường MT3 (Xuất hiện
mơ sẹo)
Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tơi lựa chọn mơi trường thích
hợp tạo đa chồi cây Mắt trâu là MT4 (2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA)
3,50

Số chồi TB/CTMT

3,00
2,50

2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
MT1

MT2

MT3

MT4

MT5

MT6

CTMT

Hình 3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi cây Mắt trâu
4.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi

25