Nhân giống in vitro dứa Cayen

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Mở đầu
Dứa là loại cây ăn quả có giá trị dinh dỡng cao đồng thời là mặt hàng
xuất khẩu có giá trị. Quả dứa khi chín có mùi vị thơm ngon, màu sắc hấp dẫn.
Trong trái dứa tơi có nhiều đờng, vitamin C, axit amin, axit hữu cơ, muối
khoáng và các chất thơm. Dứa tơi và các sản phẩm chế biến từ dứa rất đợc a
chuộng trên cả thị trờng trong nớc và thị trờng quốc tế. Vì vậy, trong các sản
phẩm rau quả chế biến, xuất khẩu, dứa luôn chiếm vị trí hàng đầu (chiếm 50%
tổng sản lợng). Mặt khác, dứa còn đợc sử dụng để phủ xanh đất trống trên
những vùng đất dốc vốn khó sử dụng cho những cây nông nghiệp khác nhng lại
rất thích hợp cho dứa.
Hiện nay, nhu cầu của thị trờng về việc xuất khẩu các sản phẩm chế biến
từ dứa ngày càng tăng. Trong khi đó, giống dứa ở nớc ta hiện nay chủ yếu là
giống dứa Queen có năng suất thấp, quả nhỏ (0,5 - 0,7 kg), vỏ dầy, mắt sâu
nên việc chế biến lát cắt từ giống dứa này gặp nhiều khó khăn, cha phù hợp với
việc chế biến dứa hộp xuất khẩu. Do đó, vấn đề đặt ra hiện nay là phải làm cách
nào đó để tăng năng suất và phẩm chất dứa nhằm mục đích đáp ứng kịp thời
nhu cầu của thị trờng.
Theo kế hoạch của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn thì trong
những năm trớc mắt cần phải mở rộng diện tích trồng dứa, đồng thời cần thay
dần giống dứa Queen truyền thống bằng giống dứa Cayen có năng suất cao, quả
to, chất lợng phù hợp với việc chế biến dứa xuất khẩu. Chính vì vậy, nhu cầu về
giống dứa Cayen hiện nay là rất lớn. Tuy nhiên, giống dứa Cayen lại có hệ số
nhân tự nhiên rất thấp. Một số biện pháp nhân giống dứa Cayen bằng hom, nhân
nách lá, thân cắt khoanh đã đợc ứng dụng nhng vẫn không đáp ứng đợc nhu cầu
cây giống cho việc mở rộng sản xuất.
Trớc yêu cầu của thực tiễn sản xuất, một giải pháp khả thi đã đợc thực
hiện nhằm đáp ứng nhu cầu cây giống cho các khu vực trồng và sản xuất dứa,
đó là: sử dụng phơng pháp nhân giống in vitro dứa Cayen. Phơng pháp này có u
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
1

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
điểm là trong thời gian ngắn có thể tạo đợc nguồn cây giống sạch bệnh, đồng
đều về phẩm chất và giữ đợc các đặc tính quý của nguyên liệu ban đầu với hệ số
nhân giống cao gấp nhiều lần so với sử dụng phơng pháp nhân giống vô tính
truyền thống.
Tuy nhiên, trong quá trình nhân giống và cả trong thực tế sản xuất, do
ảnh hởng của nhiều yếu tố, giống dứa Cayen đã xuất hiện nhiều biến dị làm
giảm năng suất và chất lợng của giống. Để khắc phục tình trạng trên cần tiến
hành nghiên cứu hoàn thiện phơng pháp nhân giống in vitro dứa Cayen để bảo
tồn giống, đồng thời cung cấp giống dứa Cayen giữ nguyên đặc tính di truyền u
việt của giống gốc tránh hiện tợng lai tạp giống. Xuất phát từ ý nghĩa khoa học
và thực tiễn đã nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài Nhân giống in vitro dứa
Cayen nhằm mục đích tạo ra giống dứa Cayen có năng suất cao và ổn định, để
phục vụ yêu cầu thâm canh cho các khu vực trồng dứa.
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
2
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
CHƯƠNG 1. tổng quan tài liệu
1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại cây dứa
Cây dứa (Pineapple, Ananas) là loại cây ăn quả rất tiêu biểu thuộc vào giới
thực vật Plantae, ngành hạt kín Magnoliophyta, lớp Liliopsida, bộ Tầm Gửi
Bromeliales, họ Tầm Gửi Bromeliaceae, chi Ananas, loài Ananas comosus L. [27].
Dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ nằm trong tứ giác bao gồm vùng phía Nam Braxin và
vùng phía Bắc Achentia, Paraguay, giữa vĩ tuyến Nam 15
0
và 30
0
và kinh tuyến 40
0
và

60
0
Tây. Dứa đợc du nhập vào châu Âu và châu á từ thế kỷ 16 [3].
Trên thế giới có rất nhiều loại dứa khác nhau. Tuỳ thuộc vào các đặc
điểm hình thái nh hình dạng, kích thớc, đặc điểm lá, trọng lợng quả và một số
chỉ số về hàm lợng đờng, hàm lợng chất khô mà ngời ta chia các loại dứa thành
4 nhóm sau [10]:
Nhóm Cayen (Smooth Cayen)
Nhóm này đang rất đợc a chuộng trong công nghiệp sản xuất dứa hộp
trên thế giới [12].
Đặc điểm của giống dứa Cayen là cây cao to, lá không có gai, quả hình
trụ, mắt quả dẹt, kích cỡ đồng đều. Khi chín thịt quả vàng tơi, mùi vị thơm ngon,
hàm lợng đờng và độ chua cao. Giống này cho năng suất cao, trọng lợng quả
trung bình đạt 2 kg, nếu chăm sóc tốt thì trọng lợng quả có thể lên tới 5 - 7 kg
[24]. Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn thành phố Hồ Chí Minh,
năng suất của dứa Cayen bình quân đạt 40 - 45 tấn/ha, tăng gấp ba lần so với
giống dứa Queen. Điều này mở ra triển vọng lớn cho việc phát triển trồng dứa
Cayen phục vụ nhu cầu chế biến dứa xuất khẩu [31].
Nhóm Hoàng Hậu (Queen Pineaple)
Đây là nhóm thích hợp cho xuất khẩu quả tơi hơn là cho chế biến và
sản xuất dứa hộp. Đặc điểm của nhóm này là sinh trởng kém hơn nhóm
Cayen, lá ngắn, có nhiều gai. Quả nhỏ, hình tháp, trọng lợng quả trung bình
đạt 0,5 - 0,7 kg, hàm lợng chất khô và độ chua thấp, thịt quả ăn rất thơm
ngon và giòn. Ngoài ra, giống dứa Queen còn có khả năng chống chịu với
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
3
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
các điều kiện môi trờng tốt nên ít bị sâu bệnh. Các giống dứa ở Việt Nam chủ
yếu thuộc vào nhóm này.
Nhóm Tây Ban Nha đỏ (Red Spanish)

So với nhóm Cayen và nhóm Queen thì nhóm này có năng suất thấp, lá
dài, quả nhỏ và hình táo nên nhóm này không đợc trồng phổ biến.
Nhóm Tây Phi (Abacaxi)
Đặc điểm của nhóm này là quả nhỏ, có hình tháp, lá có gai, màu sắc quả và
thịt quả nhạt, không phù hợp cho cả xuất khẩu quả tơi và chế biến dứa hộp. Do
vậy, giống dứa này chủ yếu là phục vụ cho nhu cầu của địa phơng.
1.2. Giá trị kinh tế và sử dụng của dứa
Dứa là loại cây ăn quả có giá trị dinh dỡng, giá trị kinh tế và giá trị xuất
khẩu cao. Vì vậy, hiện nay ngành trồng dứa đang phát triển rất mạnh mẽ.
Trong quả dứa chín có hàm lợng đờng từ 10 - 12%, nếu chăm sóc tốt có
thể đạt 15 - 18%. Trong đó có 60 - 70% là đờng Saccarose và 30 - 40% là đờng
Glucose và Fructose. Lợng axít chiếm khoảng 0,6% (trong đó có trên 80% là
axít Citric), chất tro chiếm 0,4 - 0,6% trọng lợng tơi của trái dứa.
Dứa còn chứa vitamin C với hàm lợng 24 - 28 mg/100g trái. Ngoài ra,
trong quả dứa còn chứa Bromelin là loại enzym có tác dụng phân giải protein.
Quả dứa có thể dùng để ăn tơi, chế biến dứa hộp, nớc giải khát, làm mứt
kẹo. Các phụ phẩm từ dứa còn là nguồn nguyên liệu để sản xuất phân bón, làm
giấy hoặc sản xuất thức ăn gia súc [3].
Theo những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy: dứa là loại quả ăn rất
mát và đợc coi là một trong những cây ăn quả nhiệt đới hàng đầu, rất đợc a
chuộng. Dứa đã trở thành món tráng miệng khá phổ biến của những ngời dân ở
Hawai, Philippines, Brazil, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam [27].
1.3. Tình hình sản xuất dứa ở Việt Nam
Trong số các loại cây ăn quả ở Việt Nam thì dứa là loại cây ăn quả lâu đời
và có nhiều lợi thế hơn so với các cây ăn quả khác nh: cam, quýt, chuối [3]. Vì
vậy, việc trồng dứa ở nớc ta đã đợc quan tâm từ những năm 1936 - 1937 và cho
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
4
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
đến nay, ngành trồng dứa vẫn giữ vị trí rất quan trọng trong ngành trồng trọt ở

nớc ta. Dứa là loại cây dễ trồng, không kén đất do đó ở Việt Nam dứa đợc trồng
phổ biến ở cả 3 miền Bắc - Trung - Nam [1].
ở các tỉnh miền Bắc: Do nhiệt độ trung bình trong năm từ 12
0
C - 23
0
C,
độ ẩm không khí 83% nên tơng đối thích hợp cho sinh trởng của cây dứa. Sản l-
ợng dứa của khu vực này đạt khoảng 42.000 - 47.000 tấn/năm. Trong mấy năm
gần đây, diện tích và sản lợng dứa ở miền Bắc tăng cao và trở thành nguồn cung
cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa hộp.
ở các tỉnh miền Trung: Mặc dù có khí hậu nhiệt đới nhng ở miền Trung
do ảnh hởng của gió Lào nên nhiệt độ trung bình cao khoảng 39
0
C, độ ẩm
không khí thấp 40 - 45% nên sự sinh trởng của dứa là kém.
ở các tỉnh miền Nam: Do có khí hậu nhiệt đới điển hình nên ở khu vực
này đã hình thành đợc các khu trồng dứa trọng điểm nổi tiếng ở nớc ta nh:
Hậu Giang, Kiên Giang, Long An, Minh Hải, thành phố Hồ Chí Minh. Sản l-
ợng dứa của vùng này cung cấp hầu hết cho các nhà máy chế biến dứa ở miền
Nam [10]. Có thể nói đây là vùng có diện tích và sản lợng dứa lớn nhất so với
cả nớc.
Theo tài liệu của FAO (2001) sản lợng dứa của nớc ta hiện nay đạt khoảng
415.000 tấn/năm. Còn ở một số nớc khác thuộc khu vực Đông Nam á nh Thái Lan
đạt 1.979 triệu tấn, Philippines đạt 1.618 triệu tấn, Brazil đạt 143 triệu tấn. Tổng sản
lợng dứa của cả thế giới trong năm 2001 là 14.220 triệu tấn [27].
1.4. Các phơng pháp nhân giống dứa
1.4.1. các phơng pháp nhân giống vô tính truyền thống
Nhân giống bằng các loại chồi
Chồi là cơ quan quan trọng đợc dùng trong nhân giống dứa theo phơng

pháp nhân giống vô tính truyền thống. Trong sản xuất hiện nay, giống dứa
phục vụ cho sản xuất chủ yếu là các loại chồi. Tuỳ theo vị trí của chồi trên cây
ngời ta phân biệt thành 5 loại chồi sau: chồi thân, chồi cuống, chồi nách, chồi
ngầm và chồi ngọn [17].
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
5
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Nhân giống bằng thân
Dứa Cayen có rất ít chồi do đó để phát triển nhanh giống dứa này ngời ta
kết hợp việc sử dụng các loại chồi và nhân giống bằng thân dứa đã thu quả [24].
Dùng thân dứa có nhiều mầm ngủ, bóc sạch lá và cắt thành từng khoanh
dày 2,5 - 3 cm. Sau đó xử lý các khoanh bằng thuốc diệt nấm và giâm vào đất
có độ ẩm 15 - 16%. Sau một thời gian mỗi một khoanh có thể thu đợc 1 - 3 chồi
nên từ một thân dứa có thể thu đợc 9 - 10 chồi [9].
Nhân bằng cách chẻ nhỏ các chồi
Có thể tăng hệ số nhân giống bằng cách dùng chồi chẻ đôi hoặc chẻ t để
giâm. Các phần chẻ sẽ cho 1 - 2 chồi. Sau khi các chồi có từ 7 - 8 lá lại tiếp tục
chẻ để tăng hệ số nhân giống [19].
1.4.2. Nhân giống bằng nuôi cấy in vitro
Hiện nay, ngành trồng dứa ở Việt Nam đang có kế hoạch tăng nhanh
về quy mô sản xuất và mở rộng diện tích. Do đó, việc sử dụng các phơng
pháp nhân giống vô tính truyền thống cha đáp ứng đợc nhu cầu về giống
dứa cho sản xuất.
Giải pháp cho vấn đề trên là ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống.
Biện pháp nhân giống vô tính giống dứa bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đợc đề xuất
vào năm 1977 đã mở ra một triển vọng mới cho ngành sản xuất dứa [27]. Quy
trình nhân giống in vitro cây dứa bao gồm 5 giai đoạn nh sau:
1. Tạo chồi
2. Tạo cây, nhân và duy trì chồi nuôi in vitro
3. Nuôi cây

4. Vờn ơm
5. Đồng ruộng
ở Việt Nam, trớc yêu cầu của thực tiễn sản xuất về số lợng và chất lợng
cây giống thì vấn đề nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang đợc hết sức
quan tâm và chú ý. Đã có nhiều công trình nghiên cứu thành công phơng pháp
nhân giống dứa Cayen nh: Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển đề nghị quy trình
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
6
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
nhân nhanh giống dứa Cayen dới dạng thể chồi [17]. Đặng Xuyến Nh, Hoàng Thị
Kim Hoa và các cs đa ra quy trình nhân nhanh giống dứa Cayen Phú Hộ và Đồng
Giao [8]. Trơng Thị Hảo đa ra quy trình nhân nhanh giống dứa Cayen bằng kỹ
thuật nuôi cấy phát sinh phôi giả (PLB protocorm like body) trong điều kiện
tự nhiên [28]. Đào Kim Thoa đã nghiên cứu thành công một số biện pháp kỹ
thuật làm tăng hệ số nhân giống vô tính cây dứa Cayen [29], Lê Văn Thợng cũng
đã nghiên cứu một số biện pháp tăng nhanh năng suất trồng dứa trên đất đồi và
đất phèn [11].
Tuy nhiên, vấn đề sản xuất cây giống in vitro hiện nay còn gặp nhiều khó
khăn nhất là việc hoàn thiện, rút ngắn và đơn giản hoá quy trình chăm sóc dứa
in vitro ở giai đoạn vờn ơm [7].
1.5. Các điều kiện ảnh hởng đến sinh trởng của cây dứa
1.5.1. ảnh hởng của điều kiện ngoại cảnh lên sinh trởng và tỷ lệ sống
sót của cây
Nói chung, trong đời sống của thực vật ảnh hởng của điều kiện ngoại
cảnh nh: ánh sáng, độ ẩm có ý nghĩa quyết định đến sinh trởng và phát triển
của cây. Nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình thực hiện các chức
năng sinh lý của cây nh: hô hấp, quang hợp, dinh dỡng khoáng hoặc trao đổi n-
ớc, tổng hợp sắc tố [14], [16].
Đối với cây dứa nuôi cấy mô do có đặc điểm là sinh trởng trong môi tr-
ờng giàu dinh dỡng, ánh sáng, nhiệt độ ổn định, độ ẩm không khí cao nên khi đ-

a cây ra vờn ơm thì các điều kiện ngoại cảnh có ảnh hởng rất lớn đến sinh trởng
và tỷ lệ sống sót của cây [5]. Khi nghiên cứu giải phẫu lá cây Brasisica phát
triển từ hạt và cây nuôi cấy mô, Wetzstein đã đi đến kết luận là: có sự khác biệt
giữa chúng về sinh lý học, về các hợp chất hoá học và về khả năng quang hợp
[25]. Ngoài ra, cấu tạo của lá cây nuôi trong ống nghiệm còn có đặc điểm là:
mô giậu giảm, thịt lá tăng, lớp sáp trên lá mỏng nên khi đa cây ra ngoài môi tr-
ờng có độ ẩm thấp cây dễ bị mất nớc và héo [23].
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
7
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Các tác giả trên cũng lu ý khi đa cây ra ngoài ống nghiệm cần trồng
trong nhà kính (có cờng độ ánh sáng thấp). Trớc lúc đa cây ra đồng ruộng nên
tạo độ ẩm 80 - 100% để cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, tạo thêm
nhiều rễ mới.
Qua nghiên cứu cũng cho thấy: ở cây dơng xỉ nhân bằng kỹ thuật nuôi
cấy in vitro do nuôi cấy trong điều kiện độ ẩm cao nên lợng sáp trên lá giảm
thấp (2,8 àg/mg trọng lợng tơi). Khi đặt cây trong điều kiện độ ẩm thấp 60 -
70% hàm lợng sáp trên bề mặt lá tăng nhanh và đã làm tăng tỷ lệ sống sót của
cây từ 72 - 96% [21].
Từ những kết quả thu đợc cho thấy: đối với cây nuôi cấy mô trớc khi đa
ra trồng ở điều kiện tự nhiên cần có quá trình thích nghi dần với điều kiện tự
nhiên nh chế độ ánh sáng, độ ẩm
1.5.2. ảnh hởng của chất điều hoà sinh trởng
Trong quá trình sinh trởng và phát triển của thực vật ngoài các chất hữu
cơ (protein, gluxit, lipid, axit nucleic) để cấu trúc lên tế bào, mô, cơ quan và
cung cấp cho hoạt động sống của cây thì cây còn cần rất nhiều chất có hoạt tính
sinh học nh: vitamin, enzym và các hoocmon, trong đó các hoocmon có vai trò
rất quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trởng phát triển và các
hoạt động sinh lý của thực vật [22].
Các chất điều hoà sinh trởng phát triển của thực vật gồm các

Phytohoocmon và các chất điều hoà sinh trởng đợc tổng hợp nhân tạo. Đây là
những chất có bản chất hoá học rất khác nhau nhng chúng đều có tác dụng điều
tiết các quá trình sinh trởng phát triển của cây từ lúc tế bào trứng đợc thụ tinh
phát triển thành phôi cho đến khi cây ra hoa kết quả, hình thành cơ quan sinh
sản, dự trữ và kết thúc chu kỳ sống của mình [14].
Hiện nay, trong nền nông nghiệp thâm canh cao thì các chất điều hoà
sinh trởng ngày càng có vai trò tích cực hơn trong việc điều chỉnh quá trình sinh
trởng và phát triển của cây một cách hợp lý nhất làm tăng năng suất và phẩm
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
8
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
chất thu hoạch [12]. Trong nuôi cấy mô tế bào, các chất điều hoà sinh tr-
ởng nh: Auxin, Cytokinin là thành phần không thể thiếu đợc để chủ động
điều khiển sự phát sinh hình thái thực vật in vitro.
Auxin
Went (1928) và Thimann (1937) đã phát hiện ra Auxin. Đại diện của
Auxin là: Indole acetic acid (IAA) [14]. Auxin có tác dụng sinh lý rất
nhiều mặt lên các quá trình sinh trởng của tế bào, hoạt động của tầng phát
sinh, sự hình thành rễ, hiện tợng u thế ngọn, tính hớng của thực vật, sự
sinh trởng của quả và tạo quả không hạt Trong đó, tác dụng sinh lý đặc
trng nhất của Auxin là kích thích sự ra rễ [20].
Vai trò của Auxin cho sự phân hoá rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy
mô. Trong môi trờng chỉ có Auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất hiện rễ mà
thôi [25]. Vì vậy, trong kỹ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng Auxin
để kích thích sự ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc.
C ytokinin
Cytokinin đợc phát hiện vào năm 1953 (sau Auxin) bởi Miller, Skoog
và các cs. Hiệu quả sinh lý đặc trng nhất của Cytokinin đối với thực vật là
kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy, ngời ta xem chúng nh là
các chất hoạt hoá sự phân chia tế bào, tác động lên sự phân hoá cơ quan

đặc biệt là sự phân hoá chồi [15]. Ngời ta đã chứng minh đợc sự cân bằng
tỷ lệ giữa Auxin và Cytokinin có ý nghĩa quyết định trong quá trình phát
sinh hình thái của mô cấy in vitro cũng nh trên cây nguyên vẹn. Nếu tỉ lệ
Auxin lớn hơn tỉ lệ Cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn nếu tỉ lệ
Cytokinin lớn hơn tỉ lệ Auxin thì kích thích sự xuất hiện và phát triển của
chồi [18].
Để tăng hệ số nhân giống, ngời ta tăng nồng độ Cytokinin trong môi
trờng nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro [26].
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
9
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Gibberellin
Bên cạnh Auxin và Cytokinin thì Gibberellin là một nhóm chất điều hoà
sinh trởng đợc sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp do nó có tác dụng tích cực
lên sự sinh trởng phát triển của cây [7]. Gibberellin đợc phát hiện bởi nhà
nghiên cứu ngời Nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa.
Gibberellin đợc sử dụng rộng rãi nhất là Gibberelic acid (GA
3
) [6].
Tác dụng sinh lý rõ rệt nhất của Gibberellin là làm tăng sinh trởng ở cây
nguyên vẹn [18]. Gibberellin kích thích mạnh mẽ sự sinh trởng của tế bào thực
vật theo chiều dọc làm kéo dài thân, lóng cũng nh chiều cao cây. Do đó, trong
các chất kích thích sinh trởng thực vật thì Gibberellin là chất quan trọng đợc sử
dụng để kích thích sinh trởng kéo dài thân, lóng của cây.
Ngoài các chất điều hoà sinh trởng kể trên, bột ra rễ ABT - một loại chất
kích thích sinh trởng mới đang đợc sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác
nhau. Hiện nay có khoảng 10 loại ABT, trong đó mỗi loại có u thế sử dụng với
các loại cây trồng riêng biệt. Các tổng kết mới đây cho thấy các ABT6 - 10 khi
xử lý đã tăng thu hoạch từ 6 - 20%, cao hơn 4 - 8% so với xử lý ABT4. Có thể
nói: ABT6 đợc sử dụng rộng rãi cho nhiều loại cây trồng và đem lại hiệu quả cao

nhất. Hiện nay, ở Việt Nam chất kích thích ABT đã và đang đợc sử dụng để kích
thích sự ra rễ của nhiều loại cây trồng, thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt
giống, kích thích sinh trởng và tăng năng suất cây trồng [13].
1.6. Phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.6.1. Lịch sử phát triển của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, Harberland là ngời đầu tiên đã quan niệm rằng bất kỳ một tế
bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển
thành một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã cho rằng: Bằng cách nuôi cấy tế bào đã
phân lập, ngời ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dỡng. Ông
cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây một lá mầm nh:
Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công. Hơn mời năm sau,
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
10
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Kotte và Robbin (1924) đã nuôi cấy đỉnh sinh trởng rễ của một loại cây hoà
thảo. Họ đã thu đợc một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ nhng chỉ duy trì đợc hệ rễ này
trong một thời gian ngắn.
Từ năm 1934 đợc xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực
vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua (Lycopersicon
esculentum) trong môi trờng dịch thể có chứa muối khoáng, đờng Saccaroza và
dịch chiết nấm men. Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay thế dịch chiết nấm
men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6). Cùng thời gian đó, nhà khoa học Pháp
- Gautheret đã nuôi cấy thành công mô tợng tầng của một số cây thân gỗ [17]. Sau
khi Went và Thimann tìm ra và tinh chế đợc chất điều hoà sinh trởng đầu tiên là
IAA, Gautheret thấy rằng việc bổ sung các vitamin nhóm B và IAA vào môi trờng
đã nâng cao khả năng sinh trởng của mô tợng tầng cây Salix capraea và Populus
nigra.
Vào năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì đợc sinh
trởng của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trong một thời gian dài. Trong năm đó,
White đã nuôi cấy thành công con lai cây thuốc lá (Nicotiana glauca và N.

langdoffi). Năm 1941, Van Overbeek và cs đã phát hiện thấy nớc dừa có ảnh hởng
tích cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Datura) [23]. Cũng trong
thời gian này nhiều chất điều hoà sinh trởng nhân tạo thuộc nhóm auxin nh: NAA;
2,4-D đã đợc tổng hợp. Nhiều tác giả đã xác nhận cùng với nớc dừa, 2,4-D và
NAA đã giúp tạo ra mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tợng thực vật
mà trớc đó khó khăn nuôi cấy.
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm DNA chiết từ tinh dịch cá bẹ
(Lerringperm) vào môi trờng nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy
chế phẩm này có tác dụng kích thích sinh trởng mô nuôi cấy rõ rệt. Một năm
sau, Skoog và cs đã xác nhận chất gây ra hiện tợng trên là 6-furfuryl amino
purine và đặt tên là Kinetin. Sau đó ngời ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có
tác dụng kích thích phân bào tơng tự nh Kinetin và cùng với Kinetin gọi chung
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
11
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
là nhóm Cytokinin. Cytokinin đợc tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là
Zeatin có trong mầm ngô. Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân chia
tế bào của các mô đã biệt hoá cao nh tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt đã phơi
khô.
Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hởng của
tỷ lệ (Kinetin/auxin) trong môi trờng nuôi cấy đối với sự phát sinh hình thái
của mô sẹo cây thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ này thì mô sẹo có khuynh hớng
tạo chồi. Hiện tợng này cũng đã đợc xác nhận trên nhiều đối tợng khác nhau và
từ đó đóng góp rất lớn vào sự sinh trởng và phát triển của các cơ quan, mô, tế
bào trong nuôi cấy. Thành công của hai nhà khoa học này đã dẫn tới nhiều phát
hiện quan trọng khác nhau mở đầu cho gian đoạn thứ ba về nuôi cấy mô tế bào
thực vật: kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy túi phấn, hạt phấn, nuôi cấy tạo
phôi xoma nhân tạo
Trong thời gian 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã
đợc chú ý rất nhiều. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách tế bào đơn ở dạng

thể huyền phù bằng cách nuôi cấy mô sẹo trong môi trờng lỏng, có lắc. Năm
1956, Nickell cũng nuôi cấy huyền phù tế bào đơn của loài đậu (Phaseolus
vulgaris) liên tục trong thời gian dài. Năm 1960, Bergman đã dùng phơng
pháp lọc đơn giản để thu đợc huyền phù các tế bào độc lập. Ngời ta có thể
cấy các tế bào này vào môi trờng thạch, chúng tiếp tục phân chia và tạo ra
mô sẹo.
Ngời ta đã bắt đầu chú ý đến kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
kể từ khi Guha và Maheswari (1964) phát hiện đợc những cấu trúc giống
phôi khi nuôi cấy bao phấn cây cà độc dợc (Datura inoxia). Năm 1966, họ
đã tạo đợc cây đơn bội đầu tiên thông qua nuôi cấy bao phấn. Năm 1967,
nhóm Bourgin và Nitch tạo ra cây thuốc lá đơn bội từ bao phấn. Cho đến nay
phơng pháp này đã trở nên có hiệu quả cao trong việc tạo ra các cây đơn bội
nh: lúa, lúa mạch, lúa mì, ngô
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
12
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Một hớng khác của nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đợc ứng dụng rộng rãi
cho nhân giống và phục hồi giống. Bắt đầu từ những năm 1960 khi Morel nhận
thấy protocorm của cây địa lan khi nuôi cấy đã hình thành nên các protocorm
khác. Nếu trong môi trờng thích hợp thì các protocorm đó có thể phát triển
thành cây con.
ở nớc ta, cho tới nay cũng có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào
thực vật và đã hoàn thiện đợc một số quy trình nhân giống bằng phơng pháp
nuôi cấy mô và tế bào thực vật nh: Viện Di truyền Nông nghiệp đã hoàn thành
quy trình nhân giống Mía, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cũng đã đa
vào đợc trong sản xuất quy trình nhân giống Bạch Đàn
Hiện nay, ngời ta đã và đang đẩy mạnh khai thác tiềm năng nuôi cấy mô
tế bào thực vật dựa trên quan điểm sinh học hiện đại: Mỗi tế bào riêng rẽ đã đ-
ợc phân hoá đều chứa toàn bộ thông tin di truyền (DNA) cần thiết của cả cơ thể
thực vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào đều có thể phát triển

thành một cá thể hoàn chỉnh, đó là tính toàn năng của tế bào.
1.6.2. Thành tựu của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào
Trải qua một thời gian cha phải là dài nhng những thành tựu mà công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đạt đợc là rất lớn, với hàng loạt cây trồng
nh: cây ăn quả, cây lơng thực, cây công nghiệp, cây thuốc quý hiếm có giá trị
cao, cây hoa.
ở nớc ta, các hớng nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật đợc phát triển mạnh từ những năm 80 và đã đạt đợc những kết quả
khích lệ.
Ví dụ: ở cây ăn quả đã xây dựng đợc quy trình nhân giống các cây ăn quả
có múi. ở cây lơng thực đã nhân đợc giống khoai tây, lúa, ngô. Đối với cây
công nghiệp, chúng ta đã ứng dụng thành công phơng pháp nuôi cấy in vitro ở
một số cây nh: Bạch đàn, Keo. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro cũng đợc sử dụng
rộng rãi để nhân nhanh một số cây dợc liệu nh: Trinh nữ hoàng cung, Thanh
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
13
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
hao, Thông đỏ nhằm thu nhận đợc nguồn nguyên liệu ổn định. Một số cây hoa
cũng đợc nhân giống bằng nuôi cấy in vitro nh: Phong lan và nhiều loại hoa
khác nh: Hồng, Cúc, Cẩm chớng, Lyly, Đồng tiền.
Hiện nay, thành tựu của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong sản
xuất mà nhất là sản xuất nông nghiệp ngày càng đợc thể hiện rõ. Nó đã trở
thành một công cụ không thể thiếu của công nghệ sinh học hiện đại, nhất là
trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp thực vật, công nghệ tạo
giống và nhân nhanh giống hiện đại.
1.6.3. Phơng pháp nhân giống in vitro
Phơng pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục đợc những trở
ngại của các phơng pháp nhân giống vô tính truyền thống đồng thời còn đem lại
những lợi ích thiết thực nh sau:
Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn đợc các tính trạng đã

chọn lọc.
Tạo đợc dòng thuần chủng của cây tạp giao. Điều đó rất có ý nghĩa đối
với cây thuốc và những cây trồng để chiết lấy hoạt chất.
Tạo đợc cây có genotype mới (đa bội, đơn bội).
Lu giữ tập đoàn gen.
Phục tráng giống thông qua kỹ thuật cấy đỉnh sinh trởng và cải tạo giống
thông qua kỹ thuật gen.
Có thể sản xuất giống cây quanh năm.
Nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất
định hoặc nẩy mầm kém.
Hệ số nhân cực kỳ cao.
Nói tóm lại, nhân giống in vitro một mặt tạo ra cây con sạch bệnh với hệ số
nhân cao, mặt khác đảm bảo đợc tính ổn định di truyền của cây trồng [19].
Tuy nhiên, phơng pháp này đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
14
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân bằng các ph-
ơng pháp khác.
Hiện nay, nhân giống in vitro đã đợc áp dụng cho nhiều loại cây. Murashige
(1974) đã chia quy trình nhân giống in vitro thành 4 giai đoạn nh sau [7]:
Giai đoạn 1: Nuôi cấy khởi đầu (tái sinh chồi, cụm chồi)
Đa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy phải đảm bảo: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ
lệ sống cao, tốc độ sinh trởng nhanh. Kết quả bớc này phụ thuộc rất nhiều vào
cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh trởng, chồi nách, sau đó là hoa,
đoạn thân, mảnh lá, rễ
Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện in vitro
Giai đoạn này kích thích tạo cơ quan phụ hoặc có cấu trúc khác mà từ đó
phát sinh cây hoàn chỉnh. Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định
phơng thức nhân nhanh nhất bằng môi trờng dinh dỡng và điều kiện khí hậu tối

thích.
Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn quan trọng, bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện cây thích
nghi với điều kiện thay đổi của môi trờng ngoại cảnh nh: sự thay đổi nhiệt độ,
độ ẩm, sự mất nớc, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dỡng sang trạng thái tự
dỡng hoàn toàn.
Giai đoạn 4: Huấn luyện cây con, chuyển cây ra trồng ở điều kiện tự nhiên
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi của cây với điều kiện tự nhiên là 2 - 3
tuần. Trong thời gian này, cây cần đợc chăm sóc và bảo vệ tốt trớc những yếu tố
bất lợi nh: Mất nớc nhanh làm cây bị héo, nhiễm vi khuẩn và nấm, bệnh thối nõn,
bệnh cháy lá do nắng.
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
15
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Sơ đồ quy trình nhân giống thực vật in vitro



Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
16
Cụm chồi
Vờn ơm
Bao phấn,
túi noãn
Hoa
Đỉnh sinh trưởng
Phôi
Nhân nhanh
chồi
Mô sẹo

Vật liệu vô trùng
RễThânLá
Mầm chồi
Chồi
Tế bào phôi
Khử trùng
Tái sinh
chồi
Tạo mô sẹo
Cây hoàn chỉnh
Tạo rễ
Đưa cây ra đất
Cụm chồi
Vườn ươm
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng nghiên cứu
Thí nghiệm đợc tiến hành trên cây dứa Cayen (Ananas comosus L.).
Nguồn nguyên liệu dứa đợc lấy từ các địa phơng khác nhau:
1. Xã La Hiên - huyện Võ Nhai - tỉnh Thái Nguyên.
2. Xã Cao Thợng - huyện Tân Yên - tỉnh Bắc Giang.
Trong đó, nguồn nguyên liệu chính để đa mẫu là các chồi ngọn hoặc chồi nách
chứa các mắt ngủ của cây (hình 2.1)
Hình 2.1. ảnh dứa Cayen ngoài tự nhiên
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm đợc tiến hành trong khoảng thời gian từ tháng 9 - 2007
đến tháng 5 - 2008 tại Phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Khoa học Tự nhiên và
Xã hội - Đại học Thái Nguyên.
2.2.2. Phơng pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm đợc tiến hành trên môi trờng nền MS (Murashige -
Skoog, 1962 ) có bổ sung đờng 2,5%; thạch 0,8 - 0,9 %; M-inositol 100 mg/l và
các chất kích thích sinh trởng ở các thang nồng độ khác nhau.
Thí nghiệm 1. Nghiên cứu hiệu quả khử trùng
Mẫu dùng cho nuôi cấy là phần ngọn dứa hoặc chồi nách có chứa các
mắt ngủ của cây.
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
17
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Ngọn dứa bóc vỏ, rửa sạch dới vòi nớc chảy, rửa tiếp bằng nớc xà phòng
loãng, rửa sạch xà phòng, sau đó để dới vòi nớc chảy mạnh khoảng 5 - 10 phút. Hoá
chất dùng cho việc khử trùng mẫu là cồn 70
0
, javen 50%, thuỷ ngân clorua 0,1%.
Thời gian khử trùng thay đổi tuỳ từng loại hoá chất. Cồn 70
0
khử trùng trong 30
giây, javen 50% trong 5 phút, thuỷ ngân clorua 0,1% trong 10 - 20 phút. Các thao
tác đợc tiến hành trong buồng cấy vô trùng.
Thí nghiệm 2 . ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng
nhân chồi
Các mẫu sau khi khử trùng tách lấy các mầm ngủ và đỉnh sinh trởng cấy lên
các môi trờng cảm ứng tạo chồi ban đầu. Sau đó, lấy những chồi tạo thành cấy lên
môi trờng nhân chồi. Môi trờng nhân chồi sử dụng môi trờng nền MS bổ sung đờng
2,5%; thạch 0,8% và các chất điều hòa sinh trởng là NAA với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5
mg/l và BAP với nồng độ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Cụ thể nh sau:
Kí hiệu môi trờng NAA (mg/l) BAP (mg/l)
MT1 0,5 1,0
MT2 0,5 1,5
MT3 0,5 2,0

MT4 1,0 1,0
MT5 1,0 1,5
MT6 1,0 2,0
MT7 1,5 1,0
MT8 1,5 1,5
MT9 1,5 2,0
Thí nghiệm 3 . ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả
năng tạo protocorm
Những chồi dứa Cayen mới tạo thành ở thí nghiệm nhân chồi sẽ đợc cấy
chuyển sang môi trờng tạo protocorm. Môi trờng tạo protocorm là môi trờng dịch
thể (môi trờng nền MS; 2,5% đờng và các chất điều hòa sinh trởng là NAA với
nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 mg/l; BAP với nồng độ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l).
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
18
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
Kí hiệu môi trờng NAA (mg/l) BAP (mg/l)
ML1 0,5 1,0
ML2 0,5 1,5
ML3 0,5 2,0
ML4 1,0 1,0
ML5 1,0 1,5
ML6 1,0 2,0
ML7 1,5 1,0
ML8 1,5 1,5
ML9 1,5 2,0
Thí nghiệm 4 . ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng
nhân chồi từ protocorm ở môi trờng rắn
Sau khi protocorm tạo thành, để thu đợc những chồi dứa to, khoẻ với số l-
ợng lớn thì cần chuyển những protocorm sang môi trờng nhân chồi. Các môi trờng
nhân chồi đợc sử dụng là những môi trờng: MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6,

MT7, MT8 và MT9.
Thí nghiệm 5 . ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng
nhân chồi từ protocorm ở môi trờng dịch thể
Để so sánh hiệu quả nhân chồi từ protocorm của các môi trờng dịch thể
so với các môi trờng rắn chúng tôi sử dụng các môi trờng sau:
ML5: MS + 2,5% đờng + 1,0 mg/l NAA +1,5 mg/l BAP
ML6: MS + 2,5% đờng + 1,0 mg/l NAA +2,0 mg/l BAP
ML7: MS + 2,5% đờng + 1,5 mg/l NAA +1,0 mg/l BAP
Thí nghiệm 6 . ảnh hởng của mật độ nuôi cấy đến sự phát sinh biến dị và hệ
số nhân chồi
Để nghiên cứu ảnh hởng của mật độ nuôi cấy đến sự phát sinh chồi biến dị và
hệ số nhân chồi, chúng tôi cấy các chồi dứa vào môi trờng MT6 với số lợng chồi cấy
ban đầu: 5, 10, 15, 20 chồi/bình.
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn
19