Nghiên cứu thu nhận và ứng dụng chế phẩm glucoamilaza của aspergillus niger trong lên men etanol từ bột sắn sống luận án PTS sinh học01 05 12

MỤC LỤC

Phần I . Mỏ BAU.................................................................. 1

Phân II.TổNG QUAN TAI

l iệ u

........................................................ 4

I . GA v à quá t r ì n h th ủ y phân b ộ t s ố n g ........................................................ 4
1 . 1 . Dại cuơng

quá t r ì n h t h ủ y phân t i n h b ộ t

v à GA.......................4

1 . 2 . Mối l i ê n quan g iũ a khả nảng bám và thủy phân b ộ t sống
cùa GA.............................................................................................................. 9

1 .3 .Phàn úng thuần nghich và chất úc chế GA thủy phân
b ộ t s ố n g ...........................................................................................................11
1 . 3 . 1 . GA x ú c t ắ c
1 . 3 . 2 . Chất ú c c h ế

ch o phản úng n g ư ộ c .......................................................11
GA t h ù y phân

b ộ t s ố n g ................................... 11

I I . s à n x u ấ t GA t ù v i s in h v ậ t ....................................................................... 14

2 . 1 . Chùng g i ố n g v i s i n h v ậ t ................■......................................................... 14
2 . 2 . D i ề u k i ệ n v à t h à n h phần môi t r ư ò n g s à n x u ấ t GA.................. 15
2 . 3 . Lên men s ả n x u ấ t GA................................................................................... '.17
2 - 3 . 1 . P h ư ô n g ph áp

l ê n men x ố p ....................................................................18

2.3.2.Phưông phấp

lên men dịch

t h ể ......................................18

I I I . s ử dụng ch ế phẩm GA t r o n g l ê n men e t a n o l

tù t ỉn h b ô t . .19

3.1.Ph\lông pháp Amylo.............................................................................20
3 .2 .P h \iô n g pháp M ycom alt................................................................................. 20
3 . 3 . Lên

men e t a n o l t r ự c t i ế p t ù b ộ t s ố n g ....................................... 20


- 2 -

Phần 1 1 1 . NGUYÊN LlỆU VÀ PHƯONG PHAP.................................. 27

I.V i sinh

v ậ t ............................................................................................. 27

I I .H ó a c h ấ t v à t h i ế t b i ................................................................................... 27
2 . 1 . Hóa c h ấ t .................................................................................................................... 27

2 . 2 . T h iế t b ị .......................................................................................................... 28
III.

Cấc phUòng pháp phân t í c h .................................................................. 28

3 . 1 . Đ i n g l ư ợ n g đư òn g khủ t h e o phương ph áp m i c r o - B e r t r a n d . 28
3 . 2 . Xác đ i n h hàm l ư ợ n g t i n h b ộ t t r o n g mẫu.......................................... 29

3 .3 .Xác định hiệu suất lên men e ta n o l..........................................29
3 . 4 . Xác đ i n h p r o t e i n t h e o phương pháp L o w ry ..................................... 29

IV .C á c môi tr u ồ n g dùng t r o n g n g h iê n c ú u ...............................................30

4 .1 . Môỉ trưòng Hansen.............................................................................30
4 . 2 . Môi trư ò n g M a r t i n . . . . .........................................................: .................30

4 . 3 . Môi tru ò n g C zapek......................................................................................31
4 . 4 . Môi t r ư ò n g cám t r ấ u s ả n x u ấ t e n z i m ................................................. 31
4 . 5 . Môi t r ư ò n g l ê n men e t a n o l ......................................................................... 31

V .C á c phưdng pháp x á c đ in h h o ạ t độ e n z im .............................................3 1

5 . 1 . Xác đ ịn h

h o ạ t

5 . 2 . Xác đ ị n h

h o ạ t đ ộ GA t h ủ y ph ân b ộ t s ố n g ........................................ 31

V I.C á c t h í nghiệm c v t h ể .................................................................................... 32
6

. 1 . Phân l ậ p , t u y ể n c h ọ n v à t ố i ưu h ó a môi t r ư ò n g c h o

sân x u ấ t GA.....................................................................................................32

6 .1 .1 . Phân lập chủng nẩm sỢi có hoạt tin h GA thùy phân
bột sống. . ...................................................................................... 32


- 3 -

6

. 1 . 2 . T uyể n c h o n c á c c h ủ n g c ó h o ạ t t i n h c a o .................................... 33

6

. 1 . 3 . Tối

ưu hoá môi

trưòng cho sàn xuất c h ế phẩm GA........33

6 . 2 . Bảo quản c h e phẩm GA ................................................................................... 38
6

. 3 . Phương ph áp n g h i ê n cứu GA.........................................................................38

6 . 3 . 1 . T i n h s ạ c h GA..................................................................................................... 38
6

. 3 . 2 . N g h i ê n c ú u mọt s ố ctặc t í n h c ủ a GA...............................................40

6.4.PhucJng pháp n g h iên cúu c h ấ t úc chế GA thủy phân
b ộ t s ố n g .............................................................................................................. 42
6 . 4 . 1 . Xác đ ị n h h o ạ t độ kìm hãm c ủ a c h ấ t ú c c h ế .............................42

6 . 4 . 2 . Tinh sa ch tù n g phân c h ấ t úc c h ế ................................................42
6 . 4 . 3 . Một

số đặc t ín h cùa c h ấ t úc chế l i ê n quan (Jen

phàn úng thủy phân b ộ t sống của GA................................. .. . 43
6 . 5 . Tuyển chon cá c chừng nấm men lê n men e t a n o l ỏ
n h i ệ t ctộ c a o ...........................................................................................................45

6.5.1.
6

Sổ tu y ể n cấ c chủng nấm men lê n men ỏ 42 c ..................4 5

. 5 . 2 . So s á n h kh ả n ă n g l ê n men c ủ a c á c c h ù n g
t r o n g b ì n h S m i t h ...........................................................................................46

6.5.3.

So sánh h iệ u

s u ấ t lê n men cùa cá c ch ủ n g.............. 46

6

. 6 . Lên

men e t a n o l t r ự c t i ế p t ừ b ộ t s ấ n s ố n g ................................ 47

6

. 6 . 1 . T h í n g h i ệ m l ê n men t r ự c t i ế p t ù b ộ t s ấ n s ố n g ...................47

6 . 6 . 2 . Lựa chọn cá c
tr ự c t i ế p t ù
6

. 6 . 3 . Dộng h ọ c q u á

th ôn g số t h íc h hộp

cho lê n men

b ộ t sẩn s ố n g .............................................................48
trìn h

l ê n men ả q u i mô t h ử n g h i ệ m .............. 48

V I I - T ín h k ế t q u à ........................................................................................................ 49


_

Phần IV :KET QũẢ

I.Ph ần lậ p v à tuyển

v à thao

chpn cá c

4

-

LUẠN.................................................50

chủng nấm

S0 Ỉ sỉn h

trư ổ n g t r ê n m ô i trư ồ n g ch ú a b ộ t s ố n g .................................................50
1 . 1 . Phần l ậ p ..................................................................................................................50

1 . 2 . Tuyển ch ọ n .......................................................................................................50
II.

Tố ỉ Tiu hóa d iê u k iệ n v à

th àn h

phần

môỉ triiò n g

sả n x u ấ t ch ế phẩm GA......................................................................................59
2 . 1 . T ố i ưu đ iể u k iệ n môi tr ư ò n g ................................................................59
2 . 1 . 1 . Ảnh hường củ a n h iệt đ ộ ....................................................................... 60
2 .1.2 .

Ảnh hưỏng củ a t ỷ l ệ cám t r ấ u ................................................. 6 1

2 . 1 . 3 . Anh hường cù a độ ấm môi tr ư ò n g ....................................................62
2 . 1 . 4 . Ảnh hưởng cù a pH ban d ầ u .................................................................... 63
2 . 1 . 5 . Anh hưởng củ a t h ò i g ia n lê n men................................................... 64
2 . 2 . T ố i ưu hóa th àn h phấn môi trư ờ ng ................................................. 65
2 . 2 . 1 . Lựa chọn c á c y ế u t ố th àn h phần môi t r ư ò n g .........................65

2 . 2 . 2 . Lập clưòng cong t ố i ưu
th àn h

cho tù n g yếu tố

phần môi tr ư ò n g ....................................................................... 66

2 . 2 . 3 . Qui hoạch

hóa thự c nghiệm th e o 2

nhân t ố . . . . ................68

2.2.4.BưỐc leo đốc t ố i điểm t ố i ÜU theo Box-Wilson.................. 70
I I I . L ụ a chọn ctỉểu k iậ n bâo quản ch ế phẩm G A .............................. 72
IV .N g h iê n cúu t i n h s ạ c h v à đ ặ c t í n h c ủ a GA....................................... 74
4 . 1 . T á ch t ù n g ph ần p h ầ n GA.................................................................................74

4 . 1 . 1 . Lựa chọn dung d ịc h c h i ế t r ú t ......................................................... 74
4 . 1 . 2 . Thấm dò đ iể u k iệ n k ế t tủ a e n z im ..................................................75


-

5

-

4 .1.3 .s ấ c

ký qua c ô t lo c g e l Sep h ad ex G -2 0 0 ................................. 76

4 .1 .4 .sẳ c

ký qua c ộ t CM S e p h a d e x C - 5 0 ................................................... 77

4 . 2 . N g h i ế n c ú u một s ố đ ặ c t í n h c ủ a GA-I v à G A - I I ........................ 81

4 .2 .1 .Anh hưỏng của n h iệt độ ctến hoạt ctộ GA-I và G A -II...82
4 . 2 . 2 . Anh

hường cũ a pH đến h o ạ t độ GA-I v à G A - I I ..................... 84

4 . 2 . 3 . Anh

hương c ù a c á c io n kim lo ạ .i v à cá c c h ấ t khác

đến

h o ạ t cíộ GA-I v à G A - I I .................................................................. 85

4 . 2 . 4 . N g h i ê n c ứu khà nà n g t h ủ y ph ần b ô t s ố n g c ủ a GA-I

v à G A - I I .......................................................................................................... 86
V .N g h iê n cú u t ỉ n h s ạ c h v ầ áặic t í n h củ a c h ấ t ú c c h ế ................. 88
5 . 1 . Tách tù n g phần c h ấ t úc chế ( G I ) ......................................................... 89
5 . 2 . Đặc t ín h củ a G I .............................................................................................. 9 1
V I.T u y ể n chon c á c chùng nấm men lê n men e t a n o l ả 42 c . . . .

97

6 . 1 . Số t u y ể n ............................................................................................................ 97
6

. 2 . So s á n h k h à nă n g l ê n men t r o n g b ì n h S m i t h .............................9 8 .

6 . 3 . So

sánh h iê u s u ấ t lê n men củ a cá c chùng ố 42

c ............ 10 0

V I I .L ê n men e t a n o l t r ự c t i ế p t ù b ộ t sắ n Bống.................................10 5
7 . 1 . Anh hưởng củ a lượng enzim ctến h iệ u s u ấ t lê n men............. 10 5
7 . 2 . Anh hường củ a lượng nấm men đến h iệ u s u ấ t lê n m e n . . . 10 8
7 . 3 . Ánh hứỏng cù a số lư ộng b ộ t s ẩ n sốn g cỉến

h iệ u s u ấ t lê n men.....................................................................................109
7 .4 .

N ghiến cửu ctọng học quá t r ì n h

k Ể t luận

lê n men e t a n o l ............. 1 1 3

Phần

V :

........................................................................... 1 1 7

Phần

VI: TAI LlỆU tham khao ............................................120


- 6 -

CẤC CHỮ VIET TAT

đuọc dùng trong luận ấn

1.cộng t á c viên

=c tv .

2 .G lu c o a m ila z a

= GA

3 . Chế

phẩm GA nhân ctưộc sa u k h i qua c ộ t Sephadex G -200 = GA-G

4 . C hất úc chế

GA th ủ y phân

5 . Hoạt ctộ cù a

chẩt

b ộ t sống

= GI

úc chế

6 . T rung tâm n g h iê n cúu

v i s in h v ậ t

= GIA
hoc úng dụng

= TTNCVSVt

7 .T e tr a m e th y le th y le n e d ia m in e

= TEMED

8 .E t h y le n d in itr o tr ia c e tic a c id e

= EDTA


Phân I .
T ro n g số c á c sàn
chiếm v a i t r ò

M Ở

Đ A U

phẩm lê n

quan t r o n g đ ác

men nhò

b iệ t

con n gư ò i c h ỉ b i ế t v a i t r ò củ a

v i Binh v â t e t a n o l

ctối v ố i đ ò i

nó t r o n g

sỐ ng.Neu x a xưa

sàn

phẩm lê n men

tr u y ề n th ố n g c á c l ó ạ i đổ uống chúa rượu t h ì clển n ay thự c t ế <áã
khẳng đ in h v a i t r ò t o lố n cù a e t a n o l tr o n g n h iề u l i n h vức như
th ứ c phẩm,điiửc

phẩm ,y t ế ,c ô n g

n g h ỉê p ẽtỉểu

chể c á c

hữu cố mối .Hơn th ế nữa nó còn ctưoc c o ỉ l à nguồn

có t r i ể n vọn g cho tương l a i . C h ỉ

v â t liê u

nâng lilộ n g

r i ê n g tr o n g công

n g h iệ p thực

phẩm ,nhu cầu e t a n o l t r ê n th ế g i ó i ctã đ ạ t 9 t ỳ l í t [ 1 3 9 ] .
Thực t ế n ày đã th ú c cfẩy c á c nhà n g h iên cúu tìm kiếm nguồn
cơ c h ấ t mói cho

sả n

xuất

e ta n o l.

x e n lu lo z a đã cíạt cíuộc những

V iệ c

sà n

x u ấ t e t a n o l tù

k ể t quả n h ấ t cỉịnh

nhung r ỉ đưòng

v à nguyên l i ệ u chúa b ộ t v ẫ n l à nguồn cơ c h ấ t chủ yếu .R Ỉ
th u ận l ộ i cho

quá t r ì n h

e t a n o l.N g o à i c á c

lê n

l o ạ i ctưòng

men đơn

g iả n

lê n m e n ,r ỉ

c h ấ t có g ỉ á t r i d in h dưỡng cao khác do

đưòng

tr ự c t i ế p th àn h

đưòng còn chúa n h iề u

đó đang t r ổ th àn h nguon

cơ c h ấ t hấp dẫn hơn cho sà n x u ấ t c á c sàn phấm lê n men khác quý

v à có g i á t r ị như

các

a x it

m e t io n in ) , v ỉ t a m i n ( B i 2 ,
p e n n ỉx ilin b a x y t r a x ln ) ,
cơ( a x e t ồ n , b u t a n o l) .T r ù

B e,

a m in ía x it

B z),

g lu t a m íc , l ỉ z i n ,

kháng

a x í t hũu cơ( x ì t r ỉ c ) ,
một số

ló n như B r a z in v à M ê h ic o , nguyên

nưóc có

s in h íte tr a x y lin ,
dung môi hữu

tr ữ lượng

l i ệ u chúa b ộ t v ẫ n

r ỉ đưòng
l à có c h ấ t

chù y ếu cho sả n x u ấ t e t a n o l .
ỏ c á c nưốc k in h

tế

nông n g h iệ p có

nguyên l i ệ u t i n h b ộ t v à nhân lự c cho

tiề m năng t o

lố n v ể

sà n x u ấ t e t a n o l . Tuy v ậ y


tlrức t ế sà n x u ấ t đang gập

một t r ỏ n g ạ i

phẩm cao do c á c c h ỉ p h i v ề nhần cô n g ,
cha v i ệ c hổ hóa ,

d ịc h hóà

phẩm ,khà năng sả n x u ấ t ỏ clây

enzira cần

b ộ t . cùng v ó i

l ý sản x u ấ t v à
được mỏ

t i ê u th ụ

sàn

rộ n g nếu

như

t i ế p nhận c á c t i ế n bô

nhắm hạ
cúu

n h iê n l i ê u ,

c h ỉ có th ể

c á c nưóc n ày có cfủ khả năng

phần lố n c ấ c n g h iê n

thành sân

v ầ ctuòng hóa t in h

nhũng cố gan g tr o n g tổ chúc quản

cfổi mói công 'nghê

ló n v ể g i á

g i á th àn h
đểu

tậ p

thành sản x u ấ t enzim d ịc h hoá ,

kỹ th u ậ t ,

sản phẩm.Theo huống này

tru n g

v à o khá nãng h& g i ả

ctưòng h o á ,

tă n g h iê u quà t á c

dụng cù a nó v à h iê u s u ẩ t lê n men e t a n o l

cù a c á c chủng v i s in h

v ậ t sừ dụng.CÓ những n g h iê n cúu áp dụng

kỹ th u ậ t d i tr u y ề n để

tạ o r a c ấ c chủng
enzim clưòng hóa

v i s in h
v ù a lê n

v â t nhân

tạ o vùa

có khả nãng s in h

men e t a n o lc 1 5 , 1 6 ] .

Đ iểu đó v ù a t i ế t

kiêm đtlộc nguồn enzim v ù a đơn g ià n hóa

quá t r ì n h sàn x u a t.T u y

v ậ y , khâu hổ hóa t in h b ộ t chiếm 40% c h i

p h í nhân cống v à n ãeg

lương cho c à quả t r ì n h sả n x u ấ t v ẫ n đang

tổ n t ạ ỉ ỏ hầu h ế t

các

cổ sở sà n x u ấ t .
ứng dụng khả năng

th ủ y phân tr ự c t i ế p

qua hổ hóa c ù a g lu c o a m ila z a l à
e ta n o l n ó i riê n g

vầ các

công nghệ

c h u n g .V iệ c l o a i bô hoàn to à n
g i á th àn h sà n x u ấ t v à mỏ

một

tiế n

lê n men

cíen n ay t r ê n th ế g i ố ỉ .m ộ t số

sàn x u ấ t v à

nưốc đã áp dụng

sàn x u ấ t

tù t in h

t ù t ỉn h b ộ t . Ke tù

bò n ày t r o n g sàn x u ấ t lố n như Nhật B àn ,
số nưóc khác áan g th u đuộc k ế t

tr o n g

khâu hồ hóa t ỉn h b ô t

r a t r i ể n von g

tr a n h mối t r o n g lê n men e t a n o l

bộ

t in h b ọ t không

bột nói

dẫn ctến ha

BÚc canh
th â p k ý 80

th àn h côn g t i ế n

P h i l ỉ p i n [ 1 2 , 1 1 5 ] , một

quà úng dụng ở múc

t r iể n khai


~

3

-

! như Thái Lan,Indonesia, N igerỉa[2 2 ,3 4 ,1 3 1 ].
c? nưốc t a

,k ể từ k h i

mất t h i trư ò n g L iê n xô

nưốc Dông Ẩ u ,s à n x u ấ t e t a n o l

gần như ngùng

p h i quá lố n cho nhộp khẩu enzỉm

cũ cần p h ả ỉ hổ hóa t in h
đưoc úng dụng t a i

cơ

sỏ

sàn

x u ấ t khẩu hàng trăm ngàn tấ n ngũ cố c

c á c cơ sỏ sá n x u ấ t

th àn h

bộ nào
sàn x u a t

dẫn ctến hàng nễưn p h ả i

không qua chế b iế n tr o n g

khoáng 30 t r i ệ u

kéo th e o

chi

quỉ tr ìn h

có môt t i ế n

x u ấ t .G i á

e t a n o l t r o n g nưốc lố n hon g i á x u ấ t khẩu

k h i đó tiề m năng sàn x u ấ t

t r ê do nhũng

v à h&n chế củ a c á c

b ô t.H ầ u như chưa

các

cũ v à c á c

môt số

l í t e t a n o ic 1 3 9 ] c ù a

lượng đáng

kể nhân công

tr o n g nưóc không đưộc sủ dụng.
X uất p h á t t ù th ự c t ế t r ê n v à c á c k ế t quả n g h iên cứu gần
đ ầy chúng t ô i t i ế n
dung khả n ăn g

hành <ẩể

th ủ y

phân b ộ t

À sperg ỉllu s n lg er tro n g lên
s ố n g " .K ê t quả

đã đưa

t à i "N g h iên

r a một

t ỉ ế p tù b ô t sấ n số n g đ ạ t

số n g

côn g

sà n x u ấ t th e o

lư ộ n g,đ ơ n g iả n hóa q u i t r ì n h
ra

cô h ô i

x u ấ t e t a n o l tr o n g nưốc.

trự c t i ế p
lê n men

h iệ u s u ấ t 87-90%

bưóc đ ố i móỉ

công nghệ

x u ấ t khẩu k h ô i

x u ấ t v à úng

g lu c o a m y la za. -tù

quỉ tr ìn h

bé n ầy cũng l à mong muốn

sàn phẩm t a o

củ a

men e ta n o l

Đóng góp nhò

nghê

cúu sả n

tìl bột Ban
e t a n o l tr ự c

80 v ó i l ý

củ a chúng t ô i

th u y ế t.
nhắm tù n g

hưống t ỉ ể t kiậm năng
dẫn đến hạ g i á th àn h
phvc

v à mỏ

rộ n g sàn


-

Phần I I :

I

T ố N G

4 -

Q U A N

T A I

L ĩ Ệ U

. Glucoamllaza và quá trình thùy phần bột Bồng.

1 . 1 . D ạ i cilông v ề quấ t r ì n h th ủ y phân
T in h b ô t ctưộc tổ n g hộp

t in h b ộ t v à GA

nhò quá t r ì n h

quang hop củ a

thực

v ấ t .Đó l à nguồn cung cấ p cacb on v à năng lũ ộ n g chù yếu cho con
n gư òi v à động v ậ t .
T ỉn h b ộ t

bao gổm

t r ú c tù c á c phân
g lu c o z a

tứ

c á c mạch

a m ilo z a v à a m ilo p e c t ỉn cấu

g l u c o z a .T rong

mạch

được gấn v ố i nhau bầng l i ê n k ế t

tr o n g mạch a m ilo p e c t in c á c phân
v ó i nhau ờ v i t r í

« (1-4 )

và

a m ilo z a c á c phần tủ

ÍX

( 1 - 4 ) g l u c o z ỉ t , còn

tủ g lu c o z a l a i chlOc

tạ.o

liê n kết

thành

các

mạch phân nhánh (h ìn h 1 ) .
ClijOH

Â~~\
__ ,,__ K o H
— 0— \ ị

CHjOI !

—' 0
0- JJ \\00H"

■■

1 0HÇH,

.¡ //IL —
_ o 0i -.

ÒH

ỵl ■
i/ o

l/

Ị/

■

A

■ỵ

N

0._ J \ 0 "
I— OH
I.

'

/1
I OHL

B

Hình 1- C ấ u t r ú c mạch a m ilo z a (A ) v à a m ỉlo p e c t ỉn ( B ) T in h b ô t l ầ nguõn

nguyên l i ê u ban

n h iề u quá t r ì n h công nghệ sàn x u ấ t v à chế
phẩm v à c á c dung môi hữu cO .Phẳn lố n c á c
t in h b ọ t

đầu quan tr ọ n g

cho

b iế n th\ic phẩm, diiộc
quá t r ì n h chế

b iế n

éềxx b ẩ t đầu bắng v ỉ ê c th u ỷ phân c á c l i ê n k ế t g iữ a c á c

phần từ g lu c o z a .s â n phẩm th u ỳ phân có th ể

ctiiộc dùng t r ự c t i ế p


-

5

-

chlối dạng d ỉc h chlòng đậm đ ặc h ay ctũộc
tin h k h iế t.M ăt

khác sản

phẩm sau

nguyên l i ê u ban đầu cho c á c

t in h chế để th u g lu c o z a

thuỷ phân

có thể dùng làm

quá t r ì n h công nghệ t i ế p

th e o ctể

sàn x u ấ t ra hàng l o ạ t cá c sàn phẩm nh u:mì c h ín h ( n a t r i g lu ta m a t),
b ia ,r ư O u ,c á c dung môi hữu c ứ < a x e to n , b u ta n o l) hoăc c á c a x í t hũu
cơ như a x e t i c , l a c t ỉ c .
Nguòi p h á t h iê n r a

khả năng

bột l à Kirchoff .ô n g đã tạ o
như đưòng k h ỉ xủ
P erso r [ 1 1 ,4 8 ]
a m ila za

lý tin h

sàn x u ấ t

r a chlộc một dung d ịc h
bọt v ố i

a x ít

lầ n ctắu t i ê n tá c h ctưộc ố

bấng

ca ch thêm

g lu c o z a tù t in h

e t a n o l vầo

[ 4 8 ] . Sau

có v ị n g ọ t
dó Payen v à

dạng k ế t t ù a chế phẩm

d ic h c h i ế t

của mầm cíại

mạch.ThUc r a v i ê c dùng enzim để th u ỳ phần t in h b ô t c h i thứ c sư
b ẩ t áầu kế t ù k h ỉ enzim n ày
nhò quá t r ì n h lê n men v i
v à o nãm 1 9 1 4
tù nấm S 0 i

ctư^c sà n x u ấ t ỏ q u i mô công

s in h v ậ t v ố i

sán g chế cù a

n g h iệ p

Takam ine

ứ Nhât BẲn.đ^ cfây chế phẩm amilaza chlộc sản X ỉiất

A sperg ỉllu s

nigerC A.oryzae)

t r ê n môi

trư ồ n g cám

m ì. Tên thướng phẩm củ a chế phẩm này l à T a k a - d i a s t a z a [ 1 1 0 ] .
V ố i ưu th ế hơn hẳn a x í t v ề t ín h ctăc h iê u c a o ,h iê u s u ấ t
th u ỷ phân c a o ,t ố c cfộ phản úng nhanh cũng như khà năng de dàng

điều khiển quá trìn h phản úng , enzim áã thay
bộ quá t r ì n h th u ỳ phấn

t in h b ộ t .

Cùng v ố i sự p h á t t r i ể n củ a s in h
tr o n g l ĩ n h vự c hoá học v à v ậ t
học nói chung và

đ ạ t ctưộc n h iề u

lin h
k ế t quả

tr ú c phân tủ và cơ chế

thể hầu như toàn

vuc
to

tấ c

học,nh ữ n g t i ế n bộ khấc

l ý học đã g iú p cho
nghiên

cửu

am ila za

lố n . Khoa học ctã

ngành enzim
nói r iê n g

làm sá n g

dung của a m i l a z a tr o n g quá

tò cấu

t r ìn h


- 6 -

th u ỳ phân t i n h b ộ t.C h o ctến

n ay n g ũ ò ỉ t a

l o ạ i enzim l i ê n quan tr ự c

t i ế p ctến quá

đã p h á t h iệ n

ctươc 6

t r ì n h th u ỷ phân

t in h

b ộ t.
Quá t r ì n h
t i n h b ộ t ổ n h iệ t

th u ỳ phần

ctộ

8 0 - 10 0

t in h b ộ t

b ẩ t đẵu

v ó i v i ệ c xừ l ý

k h iế n cho t in h b ộ t đ ạ t t ố i múc hồ

c

hoá hoàn t o à n [ 4 8 , 8 9 ] . Sau đó l à v ỉ ê c duy t r ì đ iể u k iệ n phàn úng
ctể cho c á c enzim

được bổ

sung vào

th e o mục đ íc h th u nhận sản phẩm

r iê n g r ẽ

h a y k ế t hop tu ỳ

úng v ố i v a i t r ò cù a

các lo ạ i

enzim kh ấc nhau.

a-amilaza h ay a(1-4)glucohidrolaza(EC. 3 .2 .1 .1 ) l a enzim
hưống n ộ i,p h â n c ấ t c á c l i ê n k ế t « ( 1 - 4 )

g l u c o z i t có tr o n g mach

a m ilo z a v à a m ilo p e c t in C 1 1 , 3 0 , 8 8 ] .V iệ c

xù l ý

t in h b ô t

v ố i a - a m ila z a lầm giảm nhanh khà năng b a t mầu cù a
ì ố t v à
cùa

d ic h

hổ

th u ỷ phân th àn h c á c sản phẩm

hoấ

t in h b ô t v ố i

t i n h b ôt.M ạch a m ilo z a chlöc

có phần t ủ lương nhỏ

m a lto z a v à m a l t o t r i o z a . v ố i a m ilo p e c t in k h ỉ

a-amilaza , n g o a i m a lto z a v a

hồ hoá

bỉ

chù yếu l à

th u ỷ

m a lt o t r io z a sả n phẩm cồn

phân b ờ i
chíla c à

c á c d e x t r ỉ n g i ố i h ạ n [ 4 1 , 1 1 8 , 12 9 ]c ù n g v ó i 5-10 % g lu c o z a [ 4 8 ] .

ß-amilaza h ay ß (1-4)
l à enzim .hưống

ngoạỉ

xú c

glucomaltohydrolaza (EC.3 .2 .1 .2 )

tá c

th u ỷ

phân

các

liê n

kết

« ( 1 - 4 ) g l u c o z i t p h la tr o n g b ẩ t đầu t ù đấu không khử t r ê n mạch
a m ilo z a v à a m ilo p e c tin .E n z im khống có

khà năng th u ỷ

l i ê n k ế t
sa u

và

kết

quả

chúa c à m a lto z a v ó i mạch a m ilo z a còn

phân c á c

th u ỳ p h ân , sà n phẩm

v ó i mạch a m ilo p e c t in sàn

phẩm chúa c à m a lto z a v à B - d e x t r ỉ n g i ó i h a n [ 2 1 , 8 8 ] .

glucoamilaza(GA)

h ay

amyloglucozidaza, Ịfamilaza


- 7 -

(EC. 3 .2 .1 .3 ) là enzim hưòng
kêttt ( 1 - 4 ) ,« ( 1 - 6 ) và c x( l - 3)

ngoại xúc tác thuỷ

phần các liê n

g l u c o z i t b ấ t ¿tầu tù

đầu không khủ

t r ê n mạch a m ilo z a v ầ a m ilo p e c t in

vầ

tạ o

th àn h

sản phấm chù

yếu c u ố i cùng l à g lu c o z a [ 4 8 , 7 0 , 8 5 ,9 6 ] .

N goài ba

lo a i

h iệ u s u ấ t v à t ố c độ quá

enzim khác như

chù yếu

a m lla za

n o i t r ê n , l i ê n quan cten

t r ì n h th u ỳ phân

t ỉn h b ộ t còn

p u llu la n a z a fg lu co lzo m era za ,tra n

P u llu la n a za

xúc t á c

qua t r in h

có cá c

g lu co zila za .

th u ỳ phân cá c

k ế t (X( 1 - 6 ) ể l u c o z ỉ t tr o n g mạch a m ilo p e c t ỉn ,m a l t r io z a ,

liên
B d e x t r in

v a c x d e x trin g i ố i han [ 4 8 ,9 6 ] .

Glucoizomeraza không tham
nói trê n

,n ó c h ỉ

xú c

tá c

g i a vào quá t r ìn h

v iệ c

chuyển

hoá

thu ỳ phân

g lu c o z a

th àn h

f r u c t o z a t ạ o v ị n g ọ t cho sàn p h ẩ m [ l l,4 8 ] .

hay

T ra n g lu co zila za .

quá t r i n h t ạ o nên c á c l i ê n
từ g lu c o z a , k ế t

quà

làm

g lu c o z il tra n sfe ra za

xuc t a c cho

k ế t « ( 1 - 6 ) g l u c o z i t g iữ a
giảm

h iệ u

su ất

h a i phân

th u ỳ phân cù a c á c

amilaza [ 4 8 ,8 8 ] .
Khả năng c ẩ t cá c l i ê n k ế t
c á c phân tủ g lu c o z a

tr o n g c à

« ( 1 - 4 ) , « ( 1 - 6 ) và « ( 1 - 3 ) g iữ a

mach a m ilo z a

th u dhlộc sản phẩm th u ỳ phân t r i ê t cfể l à ưu
GA so v ó i c ấ c

v à a m ilo p e c t in đế
th ể t u y ệ t đ ố i

amilaza khác [ 2 6 ,7 0 , 8 5 , 1 0 8 ] . Chinh v i vậ.y ma enzim

n ày cíã v à đang th u h ú t sự quan tẳm cù a c á c nhầ n g h iê n
x u ấ t v à úng dung.GA nắm tr o n g số những enzim

t r ê n th ế g i ó i

cù a

(p ro tea za

,

a-am l

l a s a ) . sả n

cúu sàn

có sàn lượng cao

phẩm GA nầm 1990 đ a t

t ố i 320 t ấ n [ 2 ] .G A chiức sà n x u ấ t chủ y ếu nhò nấm s ợ i như :

Rhizopus delemar,

A .niger [4 8 , 7 1 , 9 6 ] v à nấm men Endomycopsỉs


-

8

-

,1
fib u Ji^ e r a C 2 1 ,8 8 ,1 2 5 ] .
n h iề u v i s in h v ậ t

N goài r a

khấc

nó còn

đưoc p h á t

Mucorl1 3 5 ] ,

nhu:

h iê n t r ê n

Cephalosporium,

N e u r o s p o r a [85,96].
GA t in h k h i ế t to n t ạ i chủ yếu ả h a i dạng

GA I v à

GA I I [ 1 1 , 2 1 , 8 5 , 8 9 , 9 6 ] .C ác GA bền ở môi trư ò n g a x í t hơn so v ố i
ờ môi trư ò n g k iề m t1 1 , 7 0 , 9 6 ] .Phàn

úng th u ỷ

phân cùa

GA t h íc h

hộp ồ pH 4 , 5 đến 5 , 0 v à ỏ n h iệ t ctộ 4 0 -5 0 C .Enzim bển
độ 40

A.

ỏ n h iệ t

C[ 1 1 , 2 1 , 9 6 ] . Điểm dtẳng đ iê n dao động tù 3 , 5 v ố i GA cùa

awamori đến

8 ,4

vài

GA

Mucor ra u A 'ia r?u s[9 6 ]. Trọng

cù a

lư ong phần t ủ c ù a c á c GA th a y ctối tù 5 0 .0 0 0 đến 10 0 - 0 0 0 [ 8 8 ] .
Các enzim tương

đ ố i g iố n g

nhau v ề

này không c h ỉ đúng v ố i cùng

th àn h phân a x í t am in .ctiểu

một l o à i mà

còn ctúng v ố i

cả các

l o à i khấc n h au [ 8 5 ] .
Thành phần h y d ra tc a c b o n chiếm

rauxianus và Penỉcilium
oryzaeiBB ] -Như

oxalum

v ậ y ,t ắ t cà

tù 3% v ố i GA

đến

GA l à

20%

vòi

cù a
GA

Mucor
tU

A.

g ly c o p r o t e in chíia c á c th an h

phần hydratcác bon chủ yểu l à m an o za, glucoza, g a l a c t o z a [ 8 4 ,8 5 ,
8 8 ] . Các th àn h phẵn p r o t e in v à h y d ra tc a c b o n
liề n k ể t g lu c o z it
amin như t r ê o n in

g iữ a c á c

và s ê rin [8 5 ].

bên h o ạ t t í n h GA mà còn l i ê n
khấ rõ r ê t . K h i

phân từ

l o ạ i bò

h y d ra tc a c b o n v à c á c a x i t

H y d ra tcác b o n không

quan đến h o ạ t đô enzim

th àn h phần

h y d r a tc a c b o n

tr o n g tr u n g tấm

hoạt

cĩộng

bị
củ a

những làm
một c á ch

h y d ra tc a c b o n b à i c á c c h ấ t

ô x y h ó a ,S h ir e nhận th ấ y rắ n g h o ạ t áo cù a
th u ận v ố i lư ộng

gẩn v ố l nhau bang

enzim giảm th e o t ỳ l ê

ô x y h ó a [7 0 , 8 3 ] .T heo
enzim

có

it

H iro m i,

n h ấ t h a i nhóm

c a c b o x y l , t r o n g k h i đó v a i t r ò cửa c ấ c io n kim l o ạ i v à c á c nhổm


- 9 -

s u l f i h y d r y l l a i không quan t r o n g v ố i h o ạ t độ cù a GA. K hi xủ l ý
v ố ỉ C N -,F - ,
1- 2 - M ố ỉ

EDTA t h ì hoạ.t ctộ enzim không b i ú c c h ế [ 8 5 ,8 8 ,9 6 ] .

X iê n quan

g iữ a kh à

năng th u ỳ

năng bám

vầo

b ộ t số n g

v à khả

phân b p t số n g c ủ a GA.

Mặc dù GA l à môt t r o n g những enzim ẽhiộc

n g h iê n cúu sầu

rộng nhất vế mẶt lý thuyết cũng như úng dụng thực t ế , nhưng
v ỉ ê c úng

dung khà năng th u ỷ

đuộc quan tâm

n h ỉể u

phần

bột

t r o n g những

sốn g

nămgần

những n g h iê n c ử ư

mói c h ì

đây.N hũng th àn h

tr o n g n g h iê n cúu úng dụng khả năng này l à
tr o n g

củ a nó

tựu

môt t i ế n bô cíáng kế

am ilazatllb'i.

về

T rong v i ê c p h ấ t h iệ n

khả năng th u ỷ

GA p h ả ỉ kể đến đóng góp cù a Y am asaki

phần b ọ t sốn g

cù a

[ 1 3 6 ] . Nhung nhũng n g h iê n

cứu th e o hưóng n ày c h ỉ được chú ý sa u k h i Y am asaki v à Ueda báo
cáo v ể th àn h công t r o n g úng

dụng khả nãng th u ỳ

phân b ộ t số n g

củ a GA để lê n men e t a n o l tr ự c t i ế p tù b ộ t gạo v à b ộ t n g ồ [ 1 3 7 ] .
GA t i n h s ạ c h thưòng tồ n t ạ i ờ h a i dạng GA I v à GA I I .
H ai dạng iz o z im đã ctược t in h chế tù
phân t ủ 74900 v à 5430 0 v ố i

th àn h phần h y d ra tc a c b o n

l à 13% v à 18 % .GAI th u ỳ phân t i n h
II

A.nlger v à có tr ọ n g lilộ n g
tương úng

b ộ t v ó i tố c đô nhanh

htín GA"

[ 8 8 ] . D iều đổ có n g h ĩa l à hầng số Km v ố i t in h b ộ t hổ hoá củ a

GA I I cao hơn BO v ố i cù a GA I .T u y mhỉên

c á c t á c g i à chưa quan

tầm đến khà nãng th u ỳ phân b ọ t sốn g cù a c á c iz o z im n à y .
Khi n g h iê n

cúu GA

củ a c á c

Y am asak i nhận th ấ y chúng thưòng

chủng nấm

tồ n t ạ i ả c á c

nhau vể khà năng thuỳ phân bôt sống.GA I

mốc khác nhau ,
iz o z im v à khác

có hoat ắò thuỳ phân

b ô t sốn g mạnh gấp ba lầ n so v ố i GA I I [ 1 3 4 , 1 3 5 ] .

Các n g h iê n cúu


-

khác cù a U e d a [12 4 ] v à H a y a sh ỉd a

10

-

v ố ỉ GA II.D ổ n g t h ồ ỉ c á c t á c g i ả [ 4 4 ,

116 ,

12 1,

g iũ a khà nãng

củ a GA I v à khả nãng bám củ a nó v à o b ộ t
bám v à th u ỷ phân m©,nh mẽ b ô t

awamori cũng

sốn g cao hôn n h iê u 80

cho th ấ y GA I có khả năng th u ỷ phân b ộ t

th ấ y cố môt mốỉ tướng quan

A.

[ 4 5 ,4 6 ] t r ê n

1 2 4 ] cũng nhận

th u ỷ phân b ộ t

sốn g

sống.G A I có khà năng

sốn g còn GA I I

lạ i

không có khả

năng bám cũng như khà năng th u ỷ phấn b ộ t sốn g hoăc bám v à th u ỷ
phân b ô t số n g ỏ

múc clô

cíilOc A la m [17 ] báo

cáo

th ẩp c 1 1 6 , 1 2 4 ] . K et
khi

n g h iê n

cúu

quá tilđ n g tư cũng

GA

B .s u b t i l i s 3018. TÌẨ th-Uc nghiệm ¿ t a c g i ả nhận
phân tủ enzim có
g iú p cho enzim
t r ì n h th u ỳ phân

RhizowvcoríGO'i
46]

hai v ỉ
bám v ào
như l à

t r í chúc
b ộ t sốn g

năng khác
còn v ị

tru n g tầm

Amylomycesí 10 9 ] ,

tù

vi

khuẩn

đ ịn h ra n g t r ê n
nhau,m ột v i t r í

t r í k i a xú c t á c quá

h o ạ t ctong. N ghiên

cứu t r ê n

Rhlzopusi 1 2 1 ] , A. awamoriíAA,

E. fibuligera[117Jc\y.B. môt số t á c g i ả khac cũng đồng ý v ò i

nhân đ ỉn h n à y . Tuy v â y cho

ctển lú c đó chưa có

n g h iê n cứu nào

chúng minh đưoc

t r ê n . Đe

tò v ấ n để n à y ,

g iả t h iế t

H a y a sh ỉd a v à c t v . [ 4 4 , 4 5 , 4 6 , 5 2 , 5 5 ]
trư ò n g d ịc h th ể n u ô i
sạ c h tổrí t ạ i ờ

làm sá n g

n g h iê n

cứu

GA

tr o n g

môi

A.awamori v à nhận th a y ra n g : enzim t ỉn h

ba dang

GA I,G A

I ' và

GA I I v ố i t r ọ n g lưong

phân tủ tương úng l à 9 0 .0 0 0 ,8 3 .0 0 0 v à 5 7 .0 0 0 . GA I có khả nảng
bám v à th u ỳ phân b ộ t sốn g m©.nh mẽ t r o n g k h i đó GA I

l ộ i không

có c ả h a i khả năng n à y .T á c g i à đã t i ế n hành th u ỳ phân g i ó i hạn
GA I v ố i

proteaza a x ỉ t h o ạc s u b t ỉ l i s ỉ n , lu e clb th a y ra n g GA I

b i cất và g iả i

phóng r a

một g l y c o p e p t ỉ t ( G P I )

phân tủ l à 7000 v à GA I '. G A

có t r o n g lưộng

I ' không có khả năng

bám v à th u ỳ


-

phằn b ô t eồng nhưng

v ẫ n còn

11

-

h o ạ t t ín h

"thuý phân

b ộ t sa u hồ

hoá.Céic t á c g i ả khấc cũng dta.t chlöc k ể t quả tương tiA k h i n g h iên
cứu GA t ù

A .niger

cũng chúng minh
tổ n g hop

K-2711 8 ] .

đuoc ra n g

proteaza

về

mầt

d ỉ tr u y ề n học H a y a sh id a

A.fícum mất khả nầng

b iế n chủng

c h i tồ n t a ỉ một dạng

GA I tr o n g

n u ô i c ấ y . T rong k h ỉ đó v ố i chủng chưa b i đ ô t

môi trư ò n g

b iể n

GA vẫn tổ n

t a i ờ c à h a ỉ dang GA I v à GA I I [4 9 3 .

1 .3 .Phản úng thuận nghịch và chất úc chế 6A thuỷ phân bôt sống
1 .3 .1 . 6A xúc tấ c cho phản -ủng ngưoc.
Khỉ th u ỳ phân
th àn h g lu c o z a .S ö

j t in h b ộ t
như

vậy

vì

th u ỳ phẳn

hoàn to à n

v ỉê c

tạ o nên c á c l i ê n k ế t

« ( 1 - 6 ) g l u c o z i t g iữ a h a i phần từ g lu c o z a

không c h ỉ do v a i t r ò

củ a

dĩ

không chlộc

g lu co zíltra n a fera za ,b ò ỉ v ì k h ỉ th u ỳ phân vồ ỉ GA t in h k h iế t

sả n phẩm v ẫ n không

đạt tố i

cho phép nhân đ ỉn h rắ n g GA

múc độ th u ỳ
có th ể

đã

phân t r i ệ t

đ ể .D iề u đó

tham g i a v ào phàn úng

th e o c h iề u ngưoc l ạ ỉ ctể t ạ o

nên c á c l i ê n

phân t ủ g lu c o z a tr o n g đ iề u

k iệ n n h ấ t c fịn h [4 8 ]. N ghiên

W a ta n a b e [13 0 ] ctã

làm

rỗ

g ià

th ỉế t

k ế t g lu c o z it

t r ê n .K h i

g i à nhận đưoc

m a lto z a ,0 ,5 % iz o m a lt r io z a .T h ü c

tế

sà n

củ a

g iữ dung d ic h

sả n phẩm chúa
xuất

ta i

H an b arfo ed cũng không nhân

đưoc sà n phẩm

d ic h t ỉ n h b ô t( 30% -

v ố i chế phẩmG A [48].D o

40% )

cứu

Rhizopus endomyces ò

g lu c o z a 40% v ố i GA t in h sạ c h th u nhận t ù
55 C,pH 5 , 0 sa u 96 g i ò , t á c

tù các

2,2%

hãng Novo,

th u ỷ phân t r i ệ t

để

dtó phưông

pháp cổ đ ịn h GA ctã ctưọc sù dụng ctể t á c h enzim r a k h ổ i sàn phẩm
nhầm khấc p hvc nhưoc ctiểm t r ê n .

1 .3 .2 .Chất úc chế GA thuỳ phấn bột sống.


-

C hất ú c ch ế đ ã c h iậ u

12

-

c á c phản úng enzim ctang

th u h ú t

su quan tâm của nhiểu nhà nghiên cứu,nếu enzỉm là chất xúc tác
Bỉnh hoc có v a ỉ trò quan
chất úc

chế đặc

hiệu

trong trong moi hoeit đông sống
l&ỉ

trong v iệ c điều hoà cắc

chiếm

một

vi

tr i

th ì

quan trong kh

phàn úng enzim.Nhiêu hiên

tuơng bậnh

lý liê n quan đến chúc năng sinh học của một Bố enzim và khi đó
v iệ c sù dụng cấc chất úc

chế đặc hiệu

d iề u t r i có h iệ u quá.Như v ầ y

trỏ thành phưỏng

v i ậ c n g h iê n cứu c h ấ t

nghiên cúu tín h đẶc

có ý nghĩa khoa hoc trong

l a i vừa có ý nghĩa trong điều t r i các bênh

pháp

úc chế v ù a

hiệu của enzỉm

liê n quan đến chúc

năng cúa enzim[80].Tuy nhỉên , những nghiên cúu về chất úc

chế

phần lốn tập trung ỏ đối tưộng thực vật . Cấc chất úc chế

có

nguồn gốc tù v i sinh v èt

chỉ th\Ac sư thu

tù khi Umerawa tá ch duoc

ch ất úc chế pro teaza

(Trypsln)

khuẩn ClostrldiumC 119].

Nghiên cílu chất ùc

chế am:tlaza chịpc

b ấ t ctầu châm hơn k h i Murau
tù s .

hút ctưoc su chú ý kể

[ 7 5 ] t á c h đưoc

đ la s ta d ic v s 2476 v a U e d a [12 0 ] t á c h

tìl v i

c h ấ t úc chế

S P I-1

chlOc c h ấ t ílc chế t ĩl

S .sp 280 .Tiếp theo Fukuhara đã nhận ctưoc chất íic chế GA thuộc
loộ-ỉ

a m ylosterolt [ 3 9 ] t ìl S .d ỉa sta tỉc u s .
N ghiên cúu c h ấ t úc chế đ ạc h iệ u

cho phản úng th u ỳ

phân

b ộ t số n g v ố i GA b ấ t đầu kể t ù p h á t h iê n cù a Saha v à Ueda [ 1 2 6 ,

1 2 7 ].Khi sử dụng chế phấm GA cfể lên
bột sống , Saha và Ueda nhân

men etanol trực

thấy hoat độ của enzim

¿Ịáng kể k h i t ă n g nổng ctộ enzim ,như ng h iê n

thấy trong trưòng

hộp sủ

thương phẩm GA

A .nlger chíla ch ắt

tù

dụng enzỉm

tiế p tù
bỉ úc chế

tượng n ày l ạ i không

tỉn h sạoh [1 2 6 ].Cho rấng
nào đó

có hoat tin h ÍẲC


-

13

-

t
c h ế , t ấ c g i ả đ ã t i ế n hành c ả c

bưốc t in h B&ch chế phẩm

t r a o đ ổ i lo n D EA E-Sephadex-A 25 r ổ i lọ c
ctưởc mồt c h ấ t có

bản

chất

qua g e l G -10 0

glycoprotein

là

qua c ô t
v à nhân

chíla

25%

h y d r a t c a r b o n , t r ọ n g lư ong phân t ủ 1 2 000 .C h ấ t úc chế bám hoàn
to à n v à o b ộ t số n g v à úc

ch ế mạnh me

số n g v ố ỉ G A .V iệ c tă n g nồng kim hãm củ a c h ấ t

úc

nhèn ctưoc chủng A .nỉger

cố hoạt tín h úc

phân b ộ t

cớ c h ấ t cũng làm giảm

khà năng

c h ế [ 9 1] .T iế p

n g h iê n cúu đến v i ệ c l\Aa chọn

ctó

các

tá c

g i ả ũfã hưống

c ấ c chủng có h o ạ t t in h úc chế v à

K19. Bang c á c bưbc tỉnhSẠ cỊi tưóng tự ,h ọ

glycoprotein

đã t á c h ctưoc một

quố t r ì n h th u ỷ

chế.Chất

úc

s e r i n j 't r e o n i n . g l y x i r ^ a x i t

có tr ọ n g ruộng phân

chế

tử 1 0 .5 0 0

giàu các a x lt amin như :

a s p a c t ỉ c .Thành

phần

giàu glucoza,xyloza,m anoza và galactoza.C hat

h y d ra tc a c b o n

úc chế bám hoàn

to à n v à o

b ô t m l;ú c chế t ố ỉ 4 1,5 % múc độ

th u ỳ phân b ộ t sốn g

GA nhưng

l ạ i không g â y úc chế phán úng

th u ỳ phấn t ỉn h

hổ hoá v ố i G A [9 3 ].

Towmprayoon cho

rầ n g phần

t r ò quan t r ọ n g <íốỉ v ố i ho&t t í n h kim

cù a

b ộ t sau

p r o t e ỉn có v a i

hãm cù a c h ấ t úc c h ế .V iệ c

xủ l ý v ố ỉ

proteaza đa làm mất khả nầng bám v a khả nầng klm hãm

phàn úng

th u ỷ phấn b ộ t sổ n g

cũn g nhận t h ấ y c h ấ t ú c chế

J

v á i GA củ a c h ấ t úc c h ế .
khác nhau v ề khà

T ác g i à

năng bấm

vào các

lo ạ i bột sống và proteaza chi lam mất hoạt tin h kìm ham khi xử
lý chất úc chế

rỉêng r e.Proteaza

không làm mất hoạt tìn h íic

ch ế sa u k h i c h ấ t ú c chế đ ã bám v à o b ộ t s ổ n g [ 9 8 , 1 0 0 , 1 0 5 ] .
H iện n ay
t á c dụng c ù a nó

Ban[ 4 2 , 4 3 , 1 0 1 , 1 0 7 ] .

v i ệ c n g h iê n cúu
vẫn

đang ctưộc

c h ấ t úc

tỉế n

chế n ày
hành

v à cơ chế
tạ i

Nhật


-

14

-

I I . SÀn xuất GA tà v i Binh vẬt.
Đăc điểm chung giũa lên men sàn xuất
lê n men v i s in h v â t khác

l à h iệ u s u ấ t

GA và các quá trìn h

c ủ a c ả quá

t r ì n h phv

thuôc vào ba yếu tố quan trọng : chùng giống v i sinh v â t,

ctiều

k iệ n v à th àn h phần môi tr u ồ n g lê n m en,công nghệ lê n m e n [ ll ,2 0 ,
2 1,7 1,9 4 ,9 7 ] .
2 . 1 . Chủng g iố n g v i s in h v â t .

Nhầm ctat ctưoc
vi

hiệu quả

kinh tế trong sản

s in h v ậ t đùng để sản x u ấ t

GA cắn được tu y ể n chọn

sổ c h ỉ t ỉ ê u quan tr ọ n g n h u : t ố c đồ p h á t
tổ n g hớp enzỉm c a o úng

xu ất,các chủng

v ó i moi đơn

th eo một

t r i ể n nhanh ,h iê u s u ấ t

v ị cớ c h ấ t ,k h ả

năng s in h

trư ờ ng v à tổ n g hộp enzỉm c a o t r ê n môi trư ò n g đơn g ỉà n , r è t i ê n
có s ẵ n .T ổ n g hộp i t h a y không có g l u c o z i l t r a n s f e r a z a ,k h ô n g s in h
c á c (ẩôc t ố .N g o à i r a c á c c h ỉ t i ê u khác cũng cần đưộc đề cẬp đến

như chịu chlOc các tẩỉểu kiện bất l ộ i :n h iệt đô cao,

pH thấp,có

mật c á c chất chống n h i ễ m [ 2 1 ,9 4 ,9 6 ] .
Những n g h iê n cúu v ê

GA cho th ấ y

,h ầ u h ế t c á c

nhóm v i

s in h v ậ t ctều có khả năng tổ n g hộp GA như: v i khuẩn [ 2 3 , 5 0 , 5 9 ] ,
nấm m e n [ 1 1 5 , 1 1 7 , 1 2 5 3 ,

nấm mốc[ 4 6 , 6 4 , 1 2 1 , 1 2 2 ,

[ 4 0 ] , nấm b âc c a o [ 1 0 2 , 1 0 4 ] -Tuy n h iê n ,
th u ộ c c á c c h ỉ

A sp erg lllu s

và

1 3 3 ] , x ạ khuẩn

t r o n g thUc t ế ctai d iệ n

Rhizopus

như:

A.niger,

A awamori, Rhizopus delemav,Rhizopus oryzae ctưoc chú ý n h iề u
hớn

c ả [2 1 ,7 1 ,9 6 ,8 8 ].

V iê c tu y ể n chọn c á c chủng có h o ạ t

đô GA c a o dùng tr o n g

sản xuất được bắt ctầu vố ỉ các

chùng phầnlâp tù tu

có sẵn trong các

v i sinh vật [94] . Shoichitaka clã

bộ

sưu

tập

nhỉên hay


-

15

-

phân lâ p v à tu y ể n chon đưoc 5 chủng nấm s ô i
tù 76 chủng đang được bảo

cố h o ạ t độ GA cao

Cortlclum ro f e i l điiỢc

quàn.

co i là

chùng có h o ạ t độ GA cao v à khả năng th u ỳ phần b ộ t sống hôn hẳn
va

JRhizopus

deỉemarí 1 0 3 ] . 0 T h á i L a n ,B r u m ir a t a r a [ 2 2 ]c ũ n g tu y ể n

chọn ctưoc 2

2 ch ế phẩm GA ẽtưộc

chủng

sả n

A.nlger

x u ấ t tù

A .niger MUCK v à A. níger KMB-1 tòi

38 chung co san th 'ich

hop cho quá t r i n h lê n men xốp v à d ic h th ể .T h e o hưống phân l ậ p ,
T a n i v à c t v . [ 1 0 6 ] đ ã phân
sấn n h ỉlm mốc v à

lậ.p clüOc 18 0

chọn cíưoc

chủng

chủng nấm s ô ỉ

A.sp

N-2 cò

tù b ô t

h o ạ t ctộ tương

cfilöng 1 1 4 đôn v ỉ/g a m k h ỉ lê n men xốp v à 14 đơn v ị / ml k h i lê n
men d ic h th ể .T u y n h iê n thực t ế sàn x u ấ t không th o à mãn v ố i c á c
chủng phân lậ p v à tu y ể n chọn

t ù tự n h iê n , v i ệ c nâng

s u ấ t v à c ả ỉ b iế n c á c ctăc t í n h sẵ n cố
nhò k ỹ t h u ậ t d i t r u y ề n l à b iệ n
thtfc t ế n ó ỉ t r ê n . K hi sủ

xạ

cũng th àn h

chọn được chùng đ ộ t b iế n

có

chủng l a i

dùng

phuớng

A. n lger có ưu

k iệ n

Môi trư ò n g
l o ạ ỉ enzim ctưoc

vầ

tử

công k h i

g ây

h o ạ t đô GA cao gấp 1 5
pháp

la i

th ế hớn han

s in h tổ n g hop GA v à tô c cíô s in h
2 2 D iề u

bấng t ỉ a

chùng đ ộ t b iế n có h o ạ t

5 lẫ n chủng g ố c .L i n [ 8 5 ]

chủng g ố c . K hi

củ a cố c chủng n g h iên cúu

pháp hữu h iê u ctáp úng

dung búc

K u nỉshim a [ 6 3 ] đ ã t ạ o được

cao h iê u

B a l l [8 8 ]
chùng gốc v ề

nhu cầu
ngoại

•,

độ cao gấp
đ ô t b iế n v ầ
lầ n so v ố i
đ ã ta o đưộc
h iệ u x u ấ t

triiớ n g .

th àn h phần môitrư ò n g lê n men sả n x u ấ t GA.

có tầm

quan t r ọ n g

đ ặc b ỉ ê t

dfến h iê u s u ấ t v à

tố n g h ộ p .C á c th àn h phần chù yếu cù a môi trư ò n g

như h y d r a t c a c b o n , n ỉ t d , p h o t pho cố v a i t r ò
s u ấ t s in h e n z i m C ll ] -T in h b ộ t ,

d e x tr in ,

q u y ế t đ in h đến h iê u
m a lto z a v à g lu c o z a tỏ


-

16

-

ra th ích hop cho v iê c ainh GA ỏ A. awamorlíQQ'], còn saccaroza,
la c t o z a , fr u c t o z a và g a la c to z a

l a i kém h ỉê u quả

hớn. Các phụ

phấm nông n g h iệp khấc nhu c á m ,trấ u cũng l à nguồn CÖ c h ấ t t h íc h

hop cho sàn xuất GA ỏ AspergilluslQñ] .
Hydratcacbon

không chỉ

cho s ỉn h trũ ỏ n g v à s in h enzim

mẽ trong những

áỉều kiên

h o ạ t độ GA tă n g k h i môi

hoà s in h tổ n g

Xiên kết a (1 -4 )g lu c o z it có vai

g â y cảm

cảm úng kích

cỏ c h ấ t cao phần tử

tr ọ n g lưong phân t ủ th ấ p

t h e o [ 8 8 ] - M a lt o t e t r o z a l à c h ấ t câm

t r i n h tổ n g
úng

liệ u

phần h y d ra tc a c b o n chúa

trò như một chất

úng quá

Alam ,

c á c nguổn nguyên

t h ic h v i ệ c tổ n g hộp G A .V Ỉẹc th u ỳ phần c á c
b ả i GA th àn h c á c sả n phấm có

sàn

tống hợp mạnh

nhất đinh[21,71,85,96].T h eo
trư òn g có mặt

còn l à

hộp GA.GA l à

cùa tế bầo,chx đưoc

ch ú a t ỉ n h b ộ t [ 7 1 ] . Nhìn chung c á c th àn h

đ i v à o t ế bào v à

cacbon và nãng lUOng

cù a chủng n g h ỉên cứu mà

c h ấ t càm úng t r o n g v ỉ ê c đ iề u

phẩm trao ctổi chất bậc hai

là nguồn

mạnh

có th ể

höp enzim t i ế p
đ ố i v ó ỉ tổ n g hộp

enzim ở B. lich en i forml s [ 20].
Các nguồn

n it ơ v à

lưong n i t ô

khác nhau

đến h iê u s u ấ t s in h tổ n g hop GA. Q a a le [8 8 ]
nìtơ hữu CÖ làm tăng h iệu su ất tổng hộp

v ố i các nguổn n itơ

vô cơ

nhân th ấ y c á c nguồn
enzim ỏ A. awamori so

như n itơ r a tn a tr i.

cũng «áưoc Hang nhận t h ấ y k h ỉ sử dụng

có ành hưởng

Ket quả tương tư

đâu tuơng làm nguồn n itơ

cho sàn xuất GA tù T. thermophỉlalbA'] . Ngược l ạ i

vòi

A.sp N-2

T a n i l ạ i nhận th ấ y amon su n p h at làm tă n g h iệ u s u ấ t tố n g hộp GA
gấp ba lầ n so v ố l nguổn n it ơ

hữu cơ l à p e p to n [10 6 3 . V iệ c sủ

dung p h ố i hộp t h íc h hộp t ỳ l ệ amon su n p h at v à n i t r a t n a t r ỉ cho


w HC- "
17

k e t qua t o t hon

k h ỉ dùng

r iê n g r ẽ

tù n g l o ạ i

muối tr o n g sản

t xuât GA tù Aspergi 1Just 11 ] . Sunphat amon còn ảnh
trin h t i ế t enzim từ tế
th ấ y k h ỉ sả n x u ấ t

bào vào môi

ampdaza t il

v à n ỉt ơ được c o ỉ l ầ th ôn g

A. oryzaeí 8 8 ] .T y l ẹ

đã nhân

g íừ a cacbon

môi trư ò n g sản

tương đối lốn trên các

khác nhau thậm c h í n gay c à v ố i c á c
V ố i c á c chùng

trưòng nhu Ingle

số quan tr ọ n g tr o n g

xuất GA .Tỷ lê này thay đổ ỉ

hưỏng đến quá

ctối tưộng

chùng tr o n g cùng một l o à i .

A.niger, t ỷ l ê t r ê n th a y đ ổ ỉ til 20 v ồ i n g h iên cílu

của Minoda đến 1,2 trong nghỉên cúu của B lack[96].

Phốtpho chiếm v ị

t r í quan tr ọ n g

tr o n g c á c quá

tr ìn h

t r a o đ ố i c h ấ t c ù a t ế bào cũng như tổ n g

hộp enzim -Yamada nhận

th ấ y liiộ n g phốtpho

tù 0,05% đến 0 ,1% l à

th ich hộp cho quá
thành phân môi

tro n g

môi

trìn h

truòng

sinh
chủ

yếu

trư ồ n g

GA ỏ A. awamoríLQB]. Ngoài cac
nói

trên

trư ò n g k h ác nhu n h ỉậ t ctô,pH

cũng cẩn đưộc

cho lên men sản xuất GA.Giá

t r ị pH t ố i

cho p h á t t r i ể n

là 4 ,0 trong

GA l à 7 ,0 [ 8 8 ] „ G i á t r ị pH

phát tr iể n

hộp cho tố n g hộp GA

k h ỉ ctó pH t h íc h hop

củ a môi trư ò n g

dạng iz o z im kh ác n hau . W atanabe

hộp

A. fo e lid e s ,pH t ố i t h ĩc h

đến h iệ u s u ấ t tổ n g hộp GA mà còn ảnh hưỏng

tù 2 0 đến 2 , 5 t h ì

duy t r ì t h ic h

ưu cho sụ

không thưòng xu yên đổng n h ất v ố i pH t h íc h
đ ố i v ố i một chủ n g. Chẳng han v ố i chùng

, các thông số môi

cho sản x u ấ t

không c h ỉ ảnh

hưỏng

đến t ỳ l ệ g iữ a c á c

nhận th ấ y ,k h ỉ pH

mối trư ò n g

A.awamori tổ n g hộp chủ y ếu c á c GA c h ịu a x i t

trong khi đó ưu thế cho

tổng hợp GA không chịu a x ít

t r ị pH môi tru ò n g l à 6 ,0 đến 6 , 5 [ 1 1 ] .

2 3. Lên men sân xuất GA

khi giá


-

18

-

ề

San xuât enzlm v ỉ sinh
r iê n g chu y êu th e o

v&t nóỉ chung

h a i phương

pháp lê n men xốp

d ịc h th ê .T u ỳ th u ộ c v ào chủng v ỉ s in h v ậ t
cơ c h â t v à đ iề u
hộp

k iệ n th\Ac

và sản xuất

t ế mà

GA nối

v à lê n men

dùng tr o n g sản x u ấ t ,

chọn mợt

phương pháp t h íc h

.

2.3.1.Phiiông pháp lên men xốp(solỉđ State fermentation).
Phương pháp lê n men xốp ctưộc Takam ine dtể x u ấ t ,mỏ

công nghiệp sân xuất

enzim

nhò

đâu cho

v i sinh vật [48,110]. Phương

phấp này tỏ ra thuận l o i ỏ một số măt

chủ yếu như : de dàng thu

nhận sà n phẩm .s ả n

dùng tr ự c

phẩm có

th ể ctưoc

t i ế p cho sàn

x u ấ t h a y làm khô ỏ n h iệ t độ t h íc h hợp sa u đó bảo quàn

dẵn ; hiêu suất sinh enzim trên môt ctón v ỉ
v ố i phương pháp lê n men d ỉc h t h ể ;c ó th ể
nguổn cơ c h ấ t sẵ n

có , rẻ tiề n

chẳng

để dùng

cđ chất cao hdn 30

sàn x u ấ t enzim tù c á c
h&n

c á c phụ phẩm nông

n g h iệ p như c á m ,t r ấ u . Tuy n h iê n phuơng pháp này cũng bộc lộ một
Bố nhưoc điểm như tốn công và diện t i c h nhà xưỏng,d! nhiễm các
v i s in h v ậ t l a tr o n g sàn x u ấ t
th ô n g số môi trư ò n g

t ố i ư u,khó

đột

lố n v ố i cáo chủng

, khó ctỉều k h iể n v à duy
khăn k h ỉ

t r ì các

t r i ể n k h a i sàn x u ấ t

b iế n hay c á c chủng l a i mẫn cảm v ố i những

thay đổi cùa môi trưòng.các thông số riêng cân chú ý trong lên
men xốp là đô thống khỉ và ctộ ẩm mổi trưòng,chúng có liê n quan
c h ậ t chẽ đển h iệ u s u ấ t v à t h ò i g ia n cù a quá t r ì n h lê n men.

2 3 2 Phuơng pháp

lên

men

dịch

thể

(liq u id

State

f e r m e n t a t io n ) .
Lên men d ịc h
( fe r m e n t o r ) <íưộc

th ể ctuộc
Wemver đũa

t i ế n hành
r a lẩ n

tr o n g t h i ế t
đầu t i ê n

b ị lê n men

năm 1 8 9 1 [9 7 ]

.


-

Phướng pháp này có ưu th ê
cần ỉ t d iê n t í c h

19

-

hơn phương pháp lê n men

v à không

g ỉa n cho

t h i é t b i th u ầ n l ộ i cho đ iê u c h in h c á c
ưu tr o n g sà n x u ấ t ,

các

sàn x u ấ t

xốp ổ ch o :

, lê n men tr o n g

'thong số môi ■brưòng "tối

buốc t i ế n hành đươc

th e o d õ ỉ v à kiểm

so át chẶt chẽ v ỉệ c nhiễm c á c v i Bỉnh v ậ t l ạ , nhò


lê n men có t ín h an to à n c a o . Phương pháp n ày th uận l ộ i cho sàn
x u ấ t lố n v à áp dụng c á c t i ế n bô v à kỹ th u â t v à chủng mốỉ tr o n g
n g h iê n cứu v à s à n x u ấ t .T u y n h iên có th ể nhận th ấ y mọt số nhưđiểm củ a phương pháp n ày nhu tố n kém đầu

t u t h i ế t b i ban đ ầu ,

không t h í c h úng v ố i một số chủng sả n x u ấ t e n z ỉm ,h ỉậ u s u ấ t s in h
enzim t r ê n một đơn v i cơ

c h ấ t th ấ p .T ro n g sản x u ấ t

Bố như độ n h ố t môi trư ò n g ,

t ố c cfô th ông k h í v à

,

c á c thông

t ố c đô khuấy

cần chiOc chú t r ọ n g .

I
I I I . s ả dung GA trong lên men etanol tò tinh bôt.
Công nghê lê n men e t a n o l
hoá t ỉ n h b ộ t ỏ
t in h b ộ t đ ạ t t ố i
đưòng hoá t i ế p

n h i ê t độ
múc
th e o

cao tủ

<ẩộ

hổ

80 đến

hoả

b ấ t đâu vối" bưóc hồ

10 0 C [8 9 ] g iú p cho

hoàn to à n . Khâu d ic h hoấ v à

yếu

nhò

a-am£laza

A .niger

h ay

Rhlzopus

chủ

B. s u b t l l i s v à GA c ủ a

tù t in h b ộ t

Biiốc ch u yển hoá t i ế p th e o .

cù a

v i khuẩn

cteiejn ctr[4 8 ,8 9 ].

tù đưòng mói

g i ả i phóng

th àn h e t a n o l được th tlc h iậ n nhồ c á c v i s in h v ậ t chủ yếu như nấm
men

s

c e r e v is ia e ,v i

khuẩn

Zymomonass h ay

Công nghệ lê n men tù t in h b ộ t

đưoc t i ế n hành th e o

pháp chù y ếu l à Amylo v à M ycom alt.
3 . 1 . Phướng phấp A m ylo.

nám s o i

Rhizopus.
h a i phương