tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất n hydroxypropenamid mới hướng ức chế histone deacetylase

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

HOÀNG PHƯƠNG THẢO
MÃ SINH VIÊN: 1401559

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID
MỚI HƯỚNG ỨC CHẾ HISTONE
DEACETYLASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

HOÀNG PHƯƠNG THẢO
MÃ SINH VIÊN: 1401559

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID
MỚI HƯỚNG ỨC CHẾ HISTONE
DEACETYLASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Phan Thị Phương Dung
NCS. Đỗ Thị Mai Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày phần nội dung đề tài khóa luận của mình, tôi xin gửi lời
cảm ơn chân thành đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ, động
viên và giúp đỡ tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình.
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những người thầy, người
cô đáng kính của tôi: GS.TS. Nguyễn Hải Nam, PGS.TS. Phan Thị Phương
Dung, NCS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà
Nội. Thầy cô đã không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành
khóa luận mà đã luôn có những chỉ dẫn chính xác, kịp thời và động viên tôi những
lúc khó khăn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ
thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại
học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa
Dược - Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm
nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, đặc biệt là NCS. Dương Tiến Anh, anh Nguyễn
Văn Sự, em Bùi Xuân Trường, em Nguyễn Tuấn Linh đã chia sẻ buồn vui, giúp
đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2018

Sinh viên
Hoàng Phương Thảo


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. HISTON DEACETYLASE .................................................................................2
1.1.1. Khái niệm và phân loại histon deacetylase ...................................................2
1.1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa ...3
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi) .............................................................5
1.2.1. Phân loại HDACi ..........................................................................................5
1.2.2. Cấu trúc các chất HDACi .............................................................................5
1.2.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC .............................6
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC HƯỚNG
ỨC CHẾ HDAC ..........................................................................................................7
1.3.1. Trên thế giới..................................................................................................8
1.3.1. Trong nước ...................................................................................................9
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID
HYDROXAMIC .......................................................................................................10
1.4.1. Một số phương pháp tạo liên kết amid .......................................................11
1.4.2. Một số phương pháp tổng hợp acid hydroxamic ........................................13
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................................16

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ .....................................................................16
2.1.1. Hóa chất ......................................................................................................16


2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .........................................................................................16
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..............................................................................17
2.2.1. Tổng hợp hóa học .......................................................................................17
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được .............................17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................17
2.3.1. Tổng hợp hóa học .......................................................................................17
2.3.2. Thử tác dụng sinh học.................................................................................18
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................20
3.1. HÓA HỌC ..........................................................................................................20
3.1.1. Tổng hợp hóa học .......................................................................................20
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết .................................................................................31
3.1.3. Xác định cấu trúc ........................................................................................32
3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC .........................................................................36
3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC .......................................................................36
3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro ...............................................37
3.3. BÀN LUẬN .......................................................................................................38
3.3.1. Tổng hợp hóa học .......................................................................................38
3.3.2. Khẳng định cấu trúc ....................................................................................40
3.3.3. Thử hoạt tính sinh học ................................................................................44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13

C-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance)

ADN

: Acid desoxyribonucleic

Asp

: Acid aspartic

D

: Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)

DCM

: Dicloromethan

dd

: Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (Doublet of doublet)

DMAP

: Dimethylaminopyridin

DMF

: Dimethylformamid

DMSO

: Dimethylsulfoxid

DMSO-d6

: Dimethylsulfoxid deuteri hóa

FBS

: Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA

: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
(U.S. Food and Drug Administration)

H (%)

: Hiệu suất

HAT

: Histon acetyltransferase

HCT116

: Dòng tế bào ung thư ruột kết người

HDAC

: Histon deacetylase

HDACi

: Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors)

His

: Histidin

IC50

: Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

IR

: Hồng ngoại (Infrared)

J

: Hằng số ghép cặp trong phổ NMR.

KRIBB

: Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc
(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)

M

: Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)


MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NAD+

: Nicotinamid adenin dinucleotid

NCI –H23

: Dòng tế bào ung thư phổi thể không nhỏ người

NST

: Nhiễm sắc thể

PC-3

: Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người

Rf

: Hệ số lưu giữ trong TLC

S

: Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)

SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG

: Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)

SW620

: Dòng tế bào ung thư đại tràng người

T

: Vạch ba trong phổ NMR (Triplet)

THF

: Tetrahydrofuran

TLC

: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TMS

: Tetramethylsilan

Tºnc

: Nhiệt độ nóng chảy

TSA

: Trichostatin A

THF

: Tetrahydrofuran

UV

: Tử ngoại (Ultraviolet)

ZBG

: Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)

δ (ppm)

: Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

Ν

: Dao động hóa trị trong phổ IR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (Tºnc) của các dẫn chất IVa-e ...............31
Bảng 3.2. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IVa-e ...................................32
Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) của các dẫn chất IVa-e ............33
Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất IVa-e .........................33
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất IVa-e ........................35
Bảng 3.6. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-e ..................36
Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất IVa-e .......37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Vai trò của HDAC và HAT trong điều hòa quá trình phiên mã.................2
Hình 1.2. Phân loại các HDAC ..................................................................................3
Hình 1.3. Cơ chế deacetyl hóa theo Finnin ................................................................4
Hình 1.4. Phân loại các chất ức chế HDAC ...............................................................5
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc HDACi ...........................................................................6
Hình 1.6. Kết quả nghiên cứu của M.W. Martin ........................................................8

Hình 1.7. Cấu trúc chất 5a,b trong nghiên cứu của Dae-Kee Kim ............................9
Hình 1.8. Hợp chất 6c trong nghiên cứu của J.Chen ..................................................9
Hình 1.9. Cấu trúc chung các chất 7a-c trong nghiên cứu của Đoàn Thanh Hiếu ...10
Hình 1.10. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Trần Thị Lan Hương ....10
Hình 3.1. Phổ khối lượng MS của dẫn chất IVe ......................................................41
Hình 3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của IVb .......................................43
Hình 3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của dẫn chất IVe ........................44
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất IVa-e trên các
dòng tế bào SW620, PC-3 và NCI-H23. ...................................................................46


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Phản ứng tạo liên kết amid trực tiếp ........................................................11
Sơ đồ 1.2. Phản ứng tạo liên kết amid thông qua acid hoạt hóa ...............................11
Sơ đồ 1.3 a, Phản ứng tạo acyl clorid; b, Phản ứng tổng hợp amid..........................12
Sơ đồ 1.4 Vai trò xúc tác của pyridin .......................................................................12
Sơ đồ 1.5 Tổng hợp thông qua tạo acyl azid ............................................................12
Sơ đồ 1.6. Tổng hợp amid thông qua tạo ester ........................................................13
Sơ đồ 1.7. Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic trong nghiên cứu của tác giả Trần
Thị Lan Hương .........................................................................................................14
Sơ đồ 1.8. a, Tổng hợp từ ester; b, Tổng hợp từ acid carboxylic .............................14
Sơ đồ 3.1. Các bước tổng hợp hóa học chung ..........................................................20
Sơ đồ 3.2. Tổng hợp dẫn chất IIa .............................................................................20
Sơ đồ 3.3. Tổng hợp dẫn chất IIIa ...........................................................................21
Sơ đồ 3.4. Tổng hợp dẫn chất IVa ............................................................................22
Sơ đồ 3.5. Tổng hợp dẫn chất IVb ...........................................................................24
Sơ đồ 3.6. Tổng hợp dẫn chất IVc ............................................................................26
Sơ đồ 3.7. Tổng hợp dẫn chất IVd ...........................................................................27
Sơ đồ 3.8. Tổng hợp dẫn chất IVe ............................................................................29
Sơ đồ 3.9. Cơ chế phản ứng tạo thành IIa-e .............................................................38

Sơ đồ 3.10. Vai trò xúc tác của DMAP ....................................................................38
Sơ đồ 3.11. Cơ chế phản ứng tổng hợp các dẫn chất IIIa-e .....................................39
Sơ đồ 3.12. Cơ chế tạo thành chất IVa-e ..................................................................39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã chỉ
ra rằng, ung thư không chỉ là kết quả của các thay đổi di truyền trên cấu trúc gen mà
còn bởi các thay đổi biểu hiện gen không liên quan tới thay đổi trình tự mã hóa
ADN [7], [24]. Một số thay đổi biểu hiện gen này liên quan tới cách tế bào đọc mã
gen thông qua quá trình methyl hóa ADN và các quá trình biến đổi histon như
deacetyl/acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa... Khám phá này mở ra hướng
nghiên cứu thuốc chống ung thư mới tập trung vào một số chất ức chế enzym kiểm
soát biểu hiện gen, đặc biệt là ADN methyltransferase và histone deacetylase, kết
quả cho thấy có nhiều chất được tạo ra với khả năng chống ung thư đầy hứa hẹn [7].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự huy động quá mức các HDAC có khả
năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của
các tế bào ung thư [7], [26]. Hiện nay, trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp
và công bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt trong đó
điển hình là SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC (HDACi) đầu tiên
được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T. Sau đó
là belinostat (Beleodaq®) năm 2014 và gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng
được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư vào năm 2015 [13].
Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết
kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic
hướng ức chế HDAC cho hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm
tốt. Trong đó có một số dẫn chất là N-hydroxypropenamid cho tác dụng ức chế
HDAC mạnh và tiềm năng trên độc tính tế bào [13].
Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử
hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất N-hydroxypropenamid

mới hướng ức chế histon deacetylase” với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp (E)-N-(3-((4-(3-(hydroxyamino)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzyl)oxy)
phenyl)benzamid và 4 dẫn chất.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được.
1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE
1.1.1. Khái niệm và phân loại histon deacetylase
1.1.1.1. Khái niệm histon deacetylase
Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ
nhóm acetyl từ ε-N-acetyl lysin của nhiều protein khác nhau, trong đó acid amin này
có nhiều trong đầu N của protein histon. HDAC cùng với histon acetyltransferase
(HAT) quyết định dạng tồn tại acetyl hóa hoặc deacetyl hóa của histon [23].
Nucleosom là đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể (NST), gồm một đoạn ADN
chứa 146 cặp nucleotid quấn quanh lõi protein octamer hình đĩa của các histon (1
tetramer H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B). Các cặp histon có cấu trúc 2 phần quan
trọng: đầu C nằm bên trong lõi, đầu N nằm bên ngoài nucleosom với acid amin kết
thúc là lysin [6].

Hình 1.1. Vai trò của HDAC và HAT trong điều hòa quá trình phiên mã
2


HDAC deacetyl hóa lysin, làm đầu N tích điện dương lớn gây tương tác mạnh
với ADN tích điện âm, dẫn tới đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã.
Ngược lại HAT acetyl lysin, trung hòa điện tích dương nhóm ε-NH2 của lysin ở đầu
N của histon, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã diễn ra [12] (xem hình 1.1).
1.1.1.2. Phân loại histon deacetylase

Hiện nay,các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở người và
chúng được chia thành 4 nhóm [23], [11] (xem hình 1.2). Nhóm I, II và IV là những
enzym phụ thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy
nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các
acid hydroxamic. Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất
như vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ [11], [10].

Hình 1.2. Phân loại các HDAC
1.1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa
Các HDAC nhóm I, II, IV có trung tâm hoạt động gồm hai phần chính:
+ Ion Zn2+: là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là
thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí.
Trong phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và 1
3


liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của acetyl lysin ở đầu N của
histon từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Thường các chất ức chế HDAC liên kết
càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [25].
Như acid hydroxamic, ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+
qua 2 nguyên tử oxy của nó.
+ Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất, tham gia liên kết
Van der Waals với cơ chất và được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là
các acid amin có nhân thơm như: Phenylalamin, Tyrosin, Prolin, Histidin. Nó có
cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất. Miệng túi
có một vài vòng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC.
Đáy túi có một vài phân tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản
ứng deacetyl hóa và tạo liên kết hydro khi không có -OH của Tyrosin [9].
Cơ chế deacetyl hóa của HDAC được Finnin và cộng sự đưa ra vào năm 1999
dựa trên kết quả nguyên cứu HDLP (histon deacetylase like protein) có cấu trúc

vùng acid amin tương đồng 30% với HDAC1 [9].

Hình 1.3. Cơ chế deacetyl hóa theo Finnin
Đầu tiên, nguyên tử oxy của nhóm carbonyl của phần N-acetyl lysin trên đầu
N của histon liên kết phối trí với Zn2+, làm nhóm carbonyl phân cực về phía oxy và
4


carbon trở nên ái điện tử hơn. Một phần nước sẽ tạo liên kết phối trí với Zn2+. Nhờ
hệ thống chuyển tiếp Asp173-His132 và Asp166-His131, nguyên tử oxy của nước
trở nên ái nhân hơn. Sau khi được hoạt hóa, oxy của nước tấn công và nguyên tử C
của nhóm carbonyl tạo ra oxyanion tứ diện trung gian (oxy của nhóm carbonyl),
được ổn định bởi Tyr297 và Zn2+. Cuối cùng liên kết C-N bị bẻ gãy, 1 proton được
chuyển từ His132 cho nguyên tử N tạo thành acetat và lysin [9].
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi)
1.2.1. Phân loại HDACi
Dựa vào cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC được chia thành 6 nhóm:
các acid hydroxamic, các aminobenzamid, các epoxyceton các peptid vòng, các acid
carboxylic mạch ngắn, và các phân tử lai [22] (xem hình 1.4). Mỗi nhóm chất ức
chế HDAC đều có những ưu nhược điểm riêng, trong đó nhóm acid hydroxamic bị
nhanh thải trừ, tác dụng ức chế không chọn lọc HDAC nhóm I, II, IV nhưng có ưu
điểm là ức chế ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản, dễ tổng hợp [14].

Hình 1.4. Phân loại các chất ức chế HDAC
1.2.2. Cấu trúc các chất HDACi
Các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần chính [8]:
5


- Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group - SRG) do hay còn gọi là

nhóm khóa hoạt động (Capping group - CAP): tham gia vào quá trình nhận diện với
bề mặt amino acid của enzym, thường là các vòng thơm hoặc peptid vòng.
- Vùng cầu nối (Linker): có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym
giúp cho cơ chất cố định trong kênh, thường là các nhóm sơ nước, gồm các
hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no.
- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): tham gia tạo tương
tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC, có thể là acid hydroxamic,
các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton...[11].

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc HDACi
1.2.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC
1.2.3.1. Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt
Từ việc xác định được vai trò như đã nêu trên của nhóm nhận diện bề mặt,
nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc thay đổi nhóm nhận diện bề mặt giúp làm thay
đổi hoạt tính và tính chọn lọc của HDACi [28], [16].
Năm 2010, nghiên cứu của T. Sundarapandian và cộng sự đã chỉ ra các dẫn
chất có nhóm nhận diện bề mặt thân dầu cho hoạt tính tốt hơn các dẫn chất không
chứa nhóm này [27]. Trong nghiên cứu được công bố năm 2006, tác giả Juvale và
cộng sự đã chỉ ra rằng việc thêm các nhóm thế giàu điện tử trên vòng phenyl của
6


nhóm CAP có thể làm tăng hoạt tính, cùng với đó sự có mặt của các nguyên tử
hydro linh động và các trung tâm mang điện tích âm có khả năng tạo liên kết hydro
với các acid amin trên kênh enzym cũng giúp làm tăng hoạt tính [16].
Nghiên cứu của nhóm tác giả Di Micco S. đã giải thích sự ức chế chọn lọc của
các hợp chất cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn (azumamid E và apicidi) trên
HDAC nhóm I. Nghiên cứu chỉ ra rằng, do cấu trúc miệng túi của kênh enzym khác
nhau giữa các HDAC nên việc thay đổi cấu trúc vùng CAP phù hợp với cấu trúc
miệng túi sẽ làm tăng tính chọn lọc của HDACi. Các HDAC nhóm I dễ dàng cho

nhóm nhận diện bề mặt cồng kềnh của các cyclopeptid vào tương tác tạo liên kết
bền vững giữa các chất ức chế HDAC với kênh enzym. Còn với các HDAC nhóm
II, do bề mặt enzym lại chứa các phân tử cồng kềnh, khó tạo liên kết với các hợp
chất vòng lớn [5].
1.2.3.2. Ảnh hưởng của vùng cầu nối
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vùng cầu nối của các chất ức chế HDAC nhóm 1
có chiều dài 4-6 carbon cho hiệu quả tốt vì nó tương ứng với chiều dài kênh enzym
là khoảng 11 Å của nhóm này [20], [5]. Năm 2011, Choi và cộng sự đã tiến hành
nghiên cứu bằng cách thêm các nhóm thế ở các vị trí khác nhau trên vùng linker của
SAHA, kết quả chỉ ra rằng việc gắn thêm các nhóm thế vào vùng linker gần với
nhóm acid hydroxamic gây bất lợi cho hoạt tính. Ngược lại việc thêm các nhóm thế
trong vùng cầu nối gần với nhóm CAP cho hoạt tính tốt hơn [4].
1.2.3.2. Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn kẽm
Nghiên của của Zhang và cộng sự năm 2018 cho thấy nhóm ZBG đóng vai trò
quyết định trong việc gắn với trung tâm hoạt động của HDAC qua đó xác định hiệu
lực của các HDACi. Nhóm acid hydroxamic được sử dụng rộng rãi làm ZBG do nó
có khả năng tạo phức chelat bền vững với kẽm, và bên cạnh đó một số dẫn chất
benzamid cũng được sử dụng để ức chế các HDAC nhóm I. Nghiên cứu cũng chỉ ra
rằng việc áp dụng acid carboxylic và thiol bị giới hạn do cho hiệu lực thấp [29].
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC HƯỚNG
ỨC CHẾ HDAC
7


1.3.1. Trên thế giới
Trong nghiên cứu mới được công bố tháng 5 năm 2018, tác giả M.W. Martin
và cộng sự [18] đã khám phá ra dẫn chất N-hydroxy-2-arylisoindolin-4-carboxamid
cho tác dụng ứng chế chọn lọc HDAC11. Nghiên cứu ban đầu, Martin đã tổng hợp
được hợp chất cho tác dụng ức chế tốt trên cả HDAC11 và HDAC6 (chất số 1). Sau
đó bằng việc thay đổi vị trí của nhóm acid hydroxamic tác giả thấy rằng khi nhóm

chức ở vị trí số 6 tác dụng ức chế HDAC6 gần như không đổi so với chất số 1 tuy
nhiên tác dụng ức chế HDAC11 không còn đáng kể. Còn khi nhóm chức ở vị trí số
8 thì hiệu lực trên HDAC6 giảm 20 lần trong khi đó hiệu lực trên HDAC11 chỉ
giảm 2 lần. Và khi nhóm chức ở vị trí số 5 thì tác dụng ức chế HDAC6 không còn
đáng kể nhưng tác dụng ức chế HDAC11 tốt nhất [18] (xem hình 1.6).

Chất số
1
2
3
4

HDAC11
IC50 (μM)
2,1
1,2
>10
4,6

Vị trí nhóm acid hydroxamic
7
5
6
8

HDAC6
IC50 (μM)
0,004
>10
0,002

0,082

Hình 1.6. Kết quả nghiên cứu của M.W. Martin
Năm 2003, Tác giả Dae-Kee Kim và cộng sự [17] đã thiết kế và tổng hợp một
số dẫn chất N-hydroxypropenamid hướng ức chế HDAC. Trong số các dẫn chất
tổng hợp được, chất 5b thể hiện khả năng ức chế sự tăng trưởng của ba dòng tế bào
ung thư thử nghiệm là ung thư phổi (A549), ung thư vú (SK-BR-3) và ung thư dạ
dày (MKN45) vượt trội, với giá trị IC50 thấp hơn 2-4 lần oxamflatin- một trong số
những acid hydroxamic tổng hợp có tác dụng ức chế HDAC mạnh nhất. Thử
nghiệm ức chế HDAC trên dịch chiết tế bào ung thư biểu mô dạ dày người cho thấy
hợp chất 5a, 5b cho tác dụng tốt với giá trị IC50 thấp hơn oxamflatin. Trong đó chất
5a cho tác dụng tốt nhất với giá trị IC50 thấp hơn 1,4 lần oxamflatin [17].
8


Hình 1.7. Cấu trúc chất 5a,b trong nghiên cứu của Dae-Kee Kim
Bên cạnh hướng nghiên cứu thay đổi cấu trúc để tăng tương tác giữa chất ức
chế với HDAC đơn thuần, xu hướng tìm ra những chất có đích tác dụng đồng thời
lên HDAC và một số enzym khác nhằm tăng cơ chế tác động lên tế bào ung thư
đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung tìm hiểu trong thời gian gần
đây. Như trong nghiên cứu năm 2018, tác giả J. Chen và cộng sự [3] đã công bố
việc thiết kế tổng hợp dãy dẫn chất acid acridin hydroxamic với tác dụng ức chế
đồng thời HDAC và topoisomerase. Các dẫn chất này đều cho tác dụng ức chế tốt
cả hai đích và đều ức chế topoisomerase ở nồng độ 50 μM. Hợp chất 6c cho tác
dụng ức chế HDAC tốt nhất và mạnh hơn gấp nhiều lần so với SAHA [3] (xem hình
1.8).

Hình 1.8. Hợp chất 6c trong nghiên cứu của J.Chen
1.3.1. Trong nước
Năm 2017, tác giả Đoàn Thanh Hiếu và các cộng sự [13] đã thiết kế, tổng hợp

và thử hoạt tính của dãy chất N-hydroxybenzamid/N-hydroxypropenamid mang
khung quinazolin (xem hình 1.9). Hướng thiết kế công thức nghiên cứu của các tác
giả dựa trên cấu trúc của nexturastat A và panobinostat là hai chất đã chứng minh
cho hiệu quả tốt. Tác giả đã giữ lại cấu trúc phần linker và ZBG nhưng thay phần
CAP bằng vòng quinazolin với hy vọng vòng này sẽ tạo nhiều liên kết hydro với
các acid amin ở miệng túi enzym nhằm làm tăng tương tác của các chất này. Kết
9


quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy, các acid hydroxamic này đều gây độc
tế bào trên ba dòng tế bào ung thư người thử nghiệm là tế bào ung thư ruột kết
(SW620), tuyến tiền liệt (PC-3) và phổi (NCI-H23). Ngoài ra kết quả nghiên cứu
còn cho thấy các dẫn chất N-hydroxypropenamid cho hiệu lực cao hơn trên cả tác
dụng ức chế HDAC và độc tế bào. Một số dẫn chất như 7a-c cho gây độc tế bào gấp
4 lần SAHA [13].

Hình 1.9. Cấu trúc chung các chất 7a-c trong nghiên cứu của Đoàn Thanh Hiếu
Một nghiên cứu khác được công bố vào 2017 của tác giả Trần Thị Lan Hương
và cộng sự [15] cũng cho thấy dãy chất N-hydroxybenzamid mang khung 2oxoindolin (xem hình 1.10) thể hiện độc tính tế bào gấp 4 tới 6 lần SAHA. Các chất
này còn cho tác dụng ức chế HDAC2 với giá trị IC50 trung bình 1 μM. Kết quả
nghiên cứu docking chỉ ra các chất này tạo liên kết chặt chẽ với trung tâm hoạt động
của HDAC2 với ái lực cao hơn của SAHA [15]

Hình 1.10. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Trần Thị Lan Hương
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID
HYDROXAMIC
Các chất được tổng hợp trong nội dung khóa luận đều là dẫn chất của acid
hydroxamic có chứa liên kết amid. Bước đầu tiên trong gian đoạn tổng hợp là tiến
hành phản ứng tạo liên kết amid và bước cuối cùng là tạo acid hydroxamic. Dưới
đây là một số phương pháp tạo liên kết amid và tổng hợp acid hydroxamic hay được

sử dụng.
10


1.4.1. Một số phương pháp tạo liên kết amid
Liên kết amid được tạo thành khi cho một acid phản ứng với một amin. Phản
ứng trước tiên tạo dạng muối bền, sau đó liên kết amid được tạo thành khi thắng
được nhiệt động học phản ứng (sơ đồ 1.1).

Sơ đồ 1.1. Phản ứng tạo liên kết amid trực tiếp
Phản ứng trực tiếp này thường diễn ra ở nhiệt độ cao 160-180oC. Nhiệt độ này
thường không thích hợp cho phản ứng tổng hợp các chất có mặt một số nhóm chức
khác và tổng hợp peptid. Đồng thời, phản ứng trực tiếp này còn gặp phải một số
nhược điểm như hiệu suất thấp, sự racemic hóa, khó tinh chế…[19].
Vì vậy hoạt hóa nhóm chức acid bằng cách gắn nhóm dễ tách loại vào carbon
acyl của acid trước khi nhóm amin tấn công để tạo liên kết amid là cần thiết.

Sơ đồ 1.2. Phản ứng tạo liên kết amid thông qua acid hoạt hóa
Có nhiều cách để hoạt hóa acid carboxylic như tạo acyl halid, acyl azid,
acylimidazol, anhydrid, ester… bằng cách sử dụng các tác nhân hóa học khác nhau.
Cho đến nay, nhiều loại tác nhân hoạt hóa đã được biết đến và được sử dụng, thông
thường với mục đích nâng cao hiệu suất, giảm tạo thành các sản phẩm phụ, tăng
tính chọn lọc cũng như dễ tinh chế sản phẩm. Sau đây là một số phương pháp tạo
liên kết amid thông qua acid hoạt hóa [19].
1.4.1.1. Acyl halid
Các acyl halid là acyl clorid, acyl fluorid và acyl bromid, trong đó hay sử dụng
nhất là acyl clorid. Đây là một trong những phương pháp đầu tiên để hoạt hóa acid
và có nhiều acyl clorid khác nhau được bán trên thị trường. Các tác nhân hay được
sử dụng để tạo acyl là thionyl clorid (SOCl2), oxalyl clorid ((COCl)2), phospho
triclorid (PCl3), phospho oxyclorid (POCl3), phospho pentaclorid (PCl5). Sau đó liên

kết amid được tạo thành bằng cách cho acyl clorid phản ứng với amin (sơ đồ 1.3).

11


Sơ đồ 1.3 a, Phản ứng tạo acyl clorid; b, Phản ứng tổng hợp amid
Trong phản ứng này, có sự có mặt của một base là cần thiết để phản ứng với
HCl tạo thành, tránh chuyển nhóm amin của nguyên liệu thành muối HCl không
hoạt động [19]. Các base hay dùng là amin bậc 3 như triethylamin (NEt3), Nmethylmorpholin, pyridin (sơ đồ 1.4).

Sơ đồ 1.4 Vai trò xúc tác của pyridin
1.4.1.2. Acyl azid
Phương pháp tổng hợp amid theo con đường tạo acyl azid là phương pháp đầu
tiên tạo liên kết peptid bởi Curtius từ năm 1902 [19]. Acyl azid có thể được tạo
thành từ dẫn chất methyl ester qua hai bước phản ứng. Nhóm methoxy được thay
thế bởi hydrazin để tạo acyl hyrazid, sau đó tác dụng với acid nitrơ để thu được acyl
azid (sơ đồ 1.5).

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp thông qua tạo acyl azid
12


1.4.1.3. Ester
Một phương pháp hoạt hóa acid carboxylic tạo tác nhân acyl hoạt động trung
bình là tạo ester. Đây cũng là phương pháp tạo acid hoạt hóa khá phổ biến. Việc lựa
chọn alcol để tạo ester tùy thuộc vào mục đích của người sử dụng. Ví dụ, trong tổng
hợp peptid, alcol hay được sử dụng nhất là benzotriazol hydroxid (HOBt), pnitrophenol (PNP), pentafluorophenol (PFP) [19]. Bên cạnh đó còn có một số alcol
khác được sử dụng với các ưu điểm riêng như N-hydroxysuccinimid tan trong nước
dễ dàng loại bỏ ở giai đoạn tinh chế, hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) hiệu quả
hơn HOBt trong một số trường hợp base amin yếu ( xem sơ đồ 1.6).

Sơ đồ 1.6. Tổng hợp amid thông qua tạo ester
1.4.2. Một số phương pháp tổng hợp acid hydroxamic
Acid hydroxamic là sản phẩm thu được của phản ứng giữa các dẫn chất của
acid carboxylic như ester, clorid acid, anhydrid… với hydroxylamin. Trong đó
phương pháp tổng hợp acid hydroxamic đi từ nguyên liệu ester và acid carboxylic
cho tác dụng với hydroxylamin là phổ biến hơn cả.
1.4.2.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester
Đây là phương pháp được nhiều nhóm nghiên cứu áp dụng để tổng hợp các
acid hydroxamic, ví dụ như Martin và cộng sự (năm 2018) [18] hay Trần Thị Lan
Hương và cộng sự (năm 2017) [15]. Các nhóm nghiên cứu trên đều tổng hợp acid
hydroxamic từ methyl ester phản ứng với hydroxylamin trong dung môi
MeOH/THF ở môi trường kiềm NaOH. Phản ứng xảy ra ở điều kiện từ 0-5°C với
hiệu suất khá cao (xem sơ đồ 1.7).

13


Sơ đồ 1.7. Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic trong nghiên cứu của tác giả Trần
Thị Lan Hương
Trong một số trường hợp, tùy thuộc vào bản chất của ester tham gia mà điều
kiện phản ứng và dung môi phản ứng có thể thay đổi. Ví dụ, trong nghiên cứu tổng
hợp các acid acridin hydroxamic với tác dụng ức chế đồng thời HDAC và
topoisomerase của J. Chen và cộng sự năm 2018 [3], dung môi phản ứng lại là hỗn
hợp CH3OH : CH2Cl2 (1:1) và tiến hành ở nhiệt độ phòng.
1.4.1.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic
Ngoài phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester, người ta có thể đi từ
acid carboxylic nếu phản ứng trực tiếp giữa methyl ester và hydroxylamin khó xảy
ra. Khi đó, trong một số trường hợp cần sử dụng tác nhân hoạt hóa acid carboxylic
và sử dụng hydroxylamin có nhóm bảo vệ nhóm -OH [1].

Như trong nghiên cứu của Price và cộng sự năm 2007 [21], tác giả đã đưa ra
hai phương pháp tổng hợp acid hydroxamic (xem sơ đồ 1.8). Trong phương pháp
tổng hợp từ acid carboxylic, Price đã sử dụng tác nhân NaOH để chuyển nhóm
methyl ester thành acid carboxylic, sau đó hoạt hóa nó bằng HATU
(hexafluorophosphat azabenzotriazol tetramethyl uranium) rồi tiến hành phản ứng
với H2NOTHP (hydroxylamin tetrahydropyran) trong dung môi DMF, ở môi trường
kiềm N,N-diisopropylethylamin ((i-Pr)2NEt). Tiếp theo nhóm bảo vệ OH được tách
ra bởi acid p-TSA (p-toluensulfonic acid) trong MeOH để tạo acid hydroxamic.

Sơ đồ 1.8. a, Tổng hợp từ ester; b, Tổng hợp từ acid carboxylic

14


Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic trải qua nhiều giai
đoạn, hiệu suất thường thấp hơn so với cách tổng hợp từ ester. Nhưng do phản ứng
tổng hợp từ ester của Price cũng cho hiệu suất thấp (39-62%) nên có thể tiến hành
theo cả hai phương pháp.
Như vậy, trong hai phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ 2 nguồn ester
và acid carboxylic, phương pháp đi từ ester có điều kiện phản ứng đơn giản hơn và
cho hiệu suất cao hơn. Tuy nhiên, tùy thuộc vào nguyên liệu ban đầu và sản phẩm,
các nhà hóa học có thể chọn phương pháp và các tác nhân hoạt hóa phù hợp.

15