Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất n hydroxypropenamid mang khung 3 spiro1,3dioxolan 2 oxoindolin

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



HOÀNG KHẮC QUANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-
HYDROXYPROPENAMID MANG
KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2-
OXOINDOLIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


HÀ NỘI-2015









BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



HOÀNG KHẮC QUANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-
HYDROXYPROPENAMID MANG
KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2-
OXOINDOLIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
GS.TS. Nguyễn Hải Nam
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI-2015








Lời cảm ơn
Nh s  nhia th gng n lc trong thi gian

qua ca bL
c gi li cc i thi c
GS.TS. Nguyễn Hải Nam TS. Đào Thị Kim Oanh, gi
 i h i. Thy   ch to nhng
u kin thun li nht ng ch dn
 kp thi nhng  .
 xin gi li cn DS. Đỗ Thị Mai Dung  
c nghim ti b i h
Ni.
i li ci cc anh ch k
thua b i hi, Vin Khoa h
 Vic - i hc Quc gia Chungbuk - c trong
sut thu ki lu
Cui li ctanh ch
c nghim ti b  trong sut
thi gian  qua.
i, 10 05 15
i vit


Hoàng Khắc Quang








MỤC LỤC

DANH MH VIT TT
Trang
DANH MNG

DANH M

DANH M

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
2
1.1. HISTON DEACETYLASE
2

3
i HDAC
3
1.2. CHT C CH U TR 
4
1.2.1. 
1.2.2. Ct c ch histon deacetylase
4
5
1.2.3.  ng ct c ch HDAC
5
1.2.4. t c ch histon deacetylase
7
       ng c  t c ch histon
deacetylase

8
ng chn lc ct c ch histon deacetylase
10
1.3. MT S  GIC V
 T C CH     GN


11
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
16
2.1. U
16

16
2.1.2
16
2.2. THIT B, DNG C
16
2.3. U
17




2.3.1. Tng hc
17
2.3.2. Th ng sinh hc
17

 ging thuc ct tng hc
19
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
20
C
20
3.1.1. Tng hc
20
3.1.2. Ki tinh khit
29
nh c
32
3.2. TH HOC
36
3.2.1. Th ng c ch HDAC
36
3.2.2. Th ho in vitro
36
 ging thuc
36
3.3. N
37
3.3.1. Tng hc
37

38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
44
U THAM KHO

PH LC
















DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
:
Acid deoxyribonucleic
AsPC-1
:
T y
DCM
:
Dicloromethan
DMF
:
Dimethylformamid

DMSO
:
Dimethylsulfoxid
EtOH
:
Ethanol
HAT
:
Histon acetyltranferase
HDAC
:
Histon deacetylase
HDACi
:
Cht c ch histon deacetylase
IC
50
:
N c ch 50% s n ca t 
IR
:
 hng ngoi
MCF-7
:
T 
MeOH
:
Methanol
MS
:

Ph khng
NCI-H460
:
T i
NMR
:
 cng t h
PC3
:
T n lit tuyn
SAHA
:
Acid suberoylanilid hydroxamic
SW620
:
T i 
TLC
:
p mng
TSA
:
Trichostatin A

DANH MỤC CÁC BẢNG



STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1: 
3
2
Bảng 1.2: t c ch  nghi

8
3
Bảng 1.3: ng c ch chn lc ct c ch
HDAC
11
4
Bảng 3.1: Ch s u sut tng hp c
hydroxamic t ester

29
5
Bảng 3.2 R
f
 y (t
o

nc
) ct
IVa-d

30
6
Bảng 3.3: Kt qu  IR ct IVa-d
30
7
Bảng 3.4: Kt qu  MS ct IVa-d
32
8
Bảng 3.5: Kt qu 
1
H-NMR ct IVa-d
33
9
Bảng 3.6: Kt qu 
13
C-NMR

ct IVa-d
35
10
Bảng 3.7: Kt qu th ho 
dn cht IVa-d
40
11
Bảng 3.8: Kt qu th ho 
 IVa-d

42














DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
STT
Tên hình vẽ
Trang
1
Hình 1.1: Cu to nucleosom
2
2
Hình 1.2:  hong ca HDAC
3
3
Hình 1.3: Ct c ch HDAC
5
4
Hình 1.4:  ng ca cht c ch HDAC

6
5
Hình 1.5: c mt s cht c ch HDAC
7
6
Hình 1.6: Cng ca
HDAC

9
7
Hình 1.7: Ct s dn cht N-hydroxy-3-phenyl-2-
propenamid
12
8
Hình 1.8: Panobinostat (LBH589)
13
9
Hình 1.9: Belinostat (PXP101)
13
10
Hình 1.10: c cu to ca HD-75
14
11
Hình 1.11: c cu to ca HD-55
14
12
Hình 3.1: Kt qu th ng c ch HDAC cn
cht IVa-d
38
13

Hình 3.2: Bi  
cht IVa-d so v 
PC-3, AsPC-1
41














DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
STT
Tên Sơ đồ
Trang
1
Sơ đồ 3.1: ng hp
20
2
Sơ đồ 3.2: ng hp cht IIa
21
3
Sơ đồ 3.3: ng hp cht IIIa

22
4
Sơ đồ 3.4: ng hp cht IVa
23
5
Sơ đồ 3.5: ng hp cht IVb
24
6
Sơ đồ 3.6: ng hp cht IVc
26
7
Sơ đồ 3.7: ng hp cht IVd
27
1



ĐẶT VẤN ĐỀ
t thp k t nhiu tc
i thu  u
tr u qu cu tr o
v         hay x tr.  t c ch histon
i din cho mu tr 
Trong s c g-LAQ824 hot dn
xut ca acid 4-amino  c ch mnh histon
deacetylase (HDAC) v   IC
50
         y
LAQ824 c ch s ng c 
rut kt t   

tuyn tin li i A549 v IC
50

LAQ824 t t  
---468  i. Tip tng n
ti thit k  tng hc thay th 
nhn din b mt ca LAQ824 b     -spiro[1,3]dioxolan-2-
oxoindolin mang li nhu kh u in vitro.y
cc hi “Tổng hợp và thử độc tính tế bào của một số dẫn chất
N-hydroxypropenamid mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin”  tng
hp 4 acid hydroxamic mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin vi 2 mc

1. Tng hp N-hydroxy-3-{4-[(2'-oxospiro[1,3-dioxolane-2,3'-indol]-1'(2'H)-
yl)methyl]phenyl}prop-2-enamid n cht.
2. Th hot  in vitro ng c ch HDAC ca
t tng hc.

2



CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE
  n trin bnh uc bi 
ngh sinh h i,   i di truyn hu hin kiu gen.
Tt c b gen cm sc th (NST), mt phc hi
 protein - n v cn c

Hình 1.1. Cu to nucleosom
Mi nucleosom bao gm mt octamer a 4 cp histon (2

cp ca H2A vi H2B   p ca H3 v  c qun quanh bi 146 cp
nucleotid [3]. u amin ca histon mang nhinh
vu phosphat a ADN tu
c cao cu hiu amin ca histon
nh, NSt c
ch c lc biu
hin. M a histon ph thu u
amin ca histon. S  u amin ca
histon. Trong t  
histon deacetylase (HDAC)  histon acetyltransferase (HAT). Hai enzym 
3



c nhau. S ng trong hong cm bo m
n ca nhim sc th ding.
1.1.1. Định nghĩa histon deacetylase
           i b 
acetyl t -N acetyl lysine amino acid ca histon      
ADN qun cht ch      i lp vi histon acetyltransferase -
 n -amino ca lysin 
u N ca histon [5].
Histons
ngưng tụ các nhiễm sắc thể
ngăn cản phiên mã

Acetyl-histons
kéo giãn các nhiễm sắc thể
kích thích phiên mã
Hình 1.2.  hong ca HDAC

1.1.2. Phân loại HDAC
 
c [6]:

Enzym
I
HDAC 1, HDAC 2, HDAC 3, HDAC 8
IIa
HDAC 4, HDAC 5, HDAC 7, HDAC9
IIb
HDAC 6, HDAC 10
III
Sirtuin (SIRT) 1,2,3,4,5,6,7, Chng ca SIRT2
trong nm men Saccharomyces cerevisiae
IV
HDAC 11
Bảng 1.1: 
 nhkinh  ng
enzym ph thuc Zn
2+
a mi mt ion Zn
2+
 a
 Nh b c ch bp cht to chelat vi Zn
2+

 c gng
 ph thu
+
 mt cofactor thit yu [6], o

phc chelat vi Zn
2+
.
4



1.2. CHẤT ỨC CHẾ HDAC TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ
1.2.1. Histon deacetylase và ung thƣ
  xt bin trong ADN, dn t 
 ch ki n c
th.
n
ct biu hic li, HDAC loi b 
acetyl t m sc th  trc ch 
y, s m sc th 
quan tru hin gen. Vic mng hong
gi dn nhng bng biu hin gn
,10].
 ch ra rn
nhin cc trong t 
  bi cht t  k c s di chuyn, s
 to mch.
 khu c [7]:
- Gim c ch  
- c ch bi 
-  s cht t 
 y s tin trin cn [7]:
- y s ch (angiogenesis).
- n (invasion).

- Gi
- n (migration).
y  i hong ca 
kic ch hong ca HDAC.  cht c ch
y ha h
cht c ch  c chp thuu tr    
5



romodepsin (Istodax) do Cc Quc phc phm Hoa K (FDA)
ct li ca hu ht c ch c
hi t lon ng ph.
y ct c ch c nhi
giu nhng c ch chn lc tng lo
ng du tr .
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế histon deacetylase
t c ch 
3 ph
- n vi ion Zn
2+
-aminoanilin ca
u  thi ng c ch enzym.
- u n
to nhit Van der Waals vn kh c ch
enzym.
- n din b m
hoc 1 s  mt enzym, quyc hiu
lc ca cht c ch HDAC [16].
Ar

N
H
N
H
OH
O O
n
B
AC

Hình 1.3. Ct c ch HDAC
y, c 3 phn ca cht c ch  hin
hoc ch  c   tng ht cht c
ch HDAC mi.
1.2.3. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC
6



 ng ct c ch HDAC ph thuu ki
 ca cht c ch, n i gian ti

t c ch ng ch y
[9]:
- y s bi .
- c ch  .
- y s cht t .
-   ng min dc ch
to mn c ch s n ca khi u.

Hình 1.4.  ng ca cht c ch HDAC
Sau khi ti ng li  pha G1
  n cht t 
mt s t l m ki 
m thi dng li, ch u kin tr i
tip tc. Nhng t   ng tr  m ki   p t 
tri    ng t           i
t t 
   cht c ch m ki
7



 trong 1 s t c tip hop gen hot
m ki [9].
1.2.4. Phân loại các chất ức chế histon deacetylase
t c ch c th nghi s du
tr   ]:
- amat: TSA, SAHA, CBHA,
- 
- ch ngn: 
- nzamid: N-acetyldinalin, MS-275,
- n cht ceton: Trifluoromethyl ceton, alpha-cetonami

Hình 1.5: c mt s cht c ch HDAC
Mm ng hn ch nh
chuyc ch n l
u l mc. 
 ng c ch    
acid c ch mc ch

8



m Hing 21 cht c ch HDAC c th
nghi u tr c th bng 1.2) [11].
Bảng 1.2. t c ch  nghi
Nhóm
Chất
Nồng độ
Thử nghiệm
Loại ung thƣ
Acid béo
mạch ngắn
Phenylbutyrat
mM
Pha II

U lympho
Valproic acid (VPA)
mM
Pha II, III

U bung trng, c t
cung, tuy
lympho
AN-9 (tin thuc)
mM
Pha I, II
U lympho, bch cu

Acid
hydroxamic

Vorinostat ( SAHA)


t
PHA II, III
CTCL
NSCLC
LBH589
nM
Pha I, II
CTCL, u lympho
Hodgkin
PDX101
nM
Pha I, II
ng trng,
CTCL
CRA-024781
/nM
Pha I, II

ITF-2357
nM
Pha I, II
U lympho Hodgkin
JNJ-26481585
nM

Pha I, II
CTCL, AML
SB939
nM
Pha I, II
n tin lit
CHR-2845
nM
Pha I

4SC-201
nM
Pha II

U lympho Hodgkin, ung

AR-42
M
Pha I
U lympho, CLL
Benzamid
Chidamide
nM
Pha II


4SC-202

Pha I
AML, u lympho

Cyclic
tetrapeptid
Depsipeptid
nM
Pt
Pha II, III

CTCL, CLL, AML,

Ghi chú: NSCLC: carcinom tế bào phổi không nhỏ; CTCL: u lympho da tế bào T; CLL: ung thư
bạch cầu mãn.
1.2.5. Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế histon deacetylase
9



t c ch HDACc du -
alkyl-hydroxamic. Cm 3 ph- B - C: Phn din
b mt, phn cu nn kt vi ion Zn
2+
.

Hình 1.6. Cng ca HDAC
u qu ng ct c ch HDAC d t
ca 3 yu t ]:
- Nhóm kết thúc gắn kết với Zn
2+
(zinc-binding group-ZBG): acid hydroxamic,
 thiol, benzamid, mercaptoceton,  thi ng
c ch HDAC.

- Cầu nối sơ nước (hydrophobic linker): ng -alkyl, hoc
mch amid-   id-  n   enzym.
Cu nn kh c ch, quynh s p v ca
t vi chit amid quan tri
then ch ch t 5-6  [11].
- Nhóm khóa hoạt động (capping group):    c peptid
ng n mt enzym. c hi
hiu lc c ch HDAC.  c ca cht
b ng ln bhong
hc ca hot cht.
10



n nay phn l u tp
n vi ion Zn
2+
, c gu thay th 
 u ni khc phc ch 
chn l u d n

1.2.6. Tác dụng, tác dụng chọn lọc của các chất ức chế histon deacetylase
Mt trong nhng hn ch ct c ch   
n lc vng ph. u
v n lc ct c ch enzym histon deacetylase (HDIsi vi tng
loi HDAC  n ty, tin
lit tuyn c rt quan tra ch u tr bng
liIs (c  lit hp) trong mi loi bnh c th 
u ra thuc mc
ngu v ng ca thuc trong mi lo th c

ng.    t s  t c ch  c
 bin hin nay ng chn lc c
nhau. (Bng 1.3). [4,12].












11



Bảng 1.3. ng c ch chn lc ct c ch HDAC



Tên chất
(nhóm)

Loại enzym HDAC và nhóm tương ứng
Nhóm
I
II A

II B
IV
HDAC-
1
2
3
8
4
5
7
9
6
10
11
Acid
hydroxamic
Vorinostat (SAHA)
+
+
+
+
nd
nd
-
-
-
nd
nd
Trichostatin A (TSA)
+

nd
+
nd
+
nd
nd
nd
+
+
nd
Panobinostat
(LBH589)
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
Belinostat (PXD-
101)
+
+
+

+

nd
+
+
+
nd
nd
Dacinostat (LAQ824)
+
+
+

+
nd
+
+
+
+
nd
Givinostat (ITF2357)
+
+
+
+
nd
nd
nd
nd
+
+
nd

FR276457
+
+
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
+
nd
Benzamide
Mocetinostat
(MGCD003)
+
+
+
nd
+
+
nd
+
nd
+
+
Entinostat (MS-
275)
+



+
+
+
-
nd
-
+
nd
Acid
carboxylic
Butyrate
+

+
-
-
nd
+
+
-
nd
nd
Valproic Acid
+
+
+
+
nd
nd

-
-
-
nd
nd
Peptid vòng
Apicidin
+
+
+
+
-
+
-
-
+
+
nd
Ghi chú: + ức chế mạnh; c ch yu; - : không có tác dụng; nd: chưa có dữ liệu
ng chng rng mt cht c ch HDAC nht
 ng c ch chn lt s ,
n c ch m-275 c ch chn lc
i IC
50
ng
c ch vi HDAC8. Hai hp cht mc tng hIs
ng chn l
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƢỚC VỀ CÁC
CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE CÔNG BỐ GẦN ĐÂY
12

* Hướng tổng hợp các dẫn chất N-hydroxy-3-phenyl-2-propenamid-cơ sở xây dựng
công thức cho đề tài.
N
O
NHOH
R
2
R
1
H
N
N
H
NH
O
OH
LBH589 - IC50 = 5 nM
N
H
S
N
H
OH
O
O O
PXD101 - IC50 = 27 nM
NHOH

O
N
OH
N
LAQ824 - IC50 = 32 nM
N-hydroxy-3-phenyl-2-propenamid

Hình 1.7: Ct s dn cht N-hydroxy-3-phenyl-2-propenamid
* Panobinostat (LBH589):
t cht c ch u th nghi
ng bu ca
y S)c thc hinh 
 i mc liu u       c la
13



chn ng t qu cho thy 3 trong 5 bc s
ci thii gim 100% triu ch th
n bnh  cho rp tt,
u tr m triu ch
hiu qu nhg  mc liu thp trong thu tr.[17]
H
N
N
H
NH
O
OH

Hình 1.8: Panobinostat (LBH589)
* Belinostat (PXD101):
a Mt c ch HDAC b
mt hp ph     ng ca SAHA bng hp phn sulfonyl
phenyl (H) to ra cht c ch HDAC mi v IC
50
t
ng hp kh
N
H
S
N
H
OH
O
O O

Hình 1.9: Belinostat (PXD101)
Nhn thy c 3 hot cht LBH58    c
n cu ni chn cht ca
N-hydroxy-3-phenyl-2-u cho hot tt, th hin qua nng
 c ch 50% IC
50
thng t 
i. C 3 chn th nghi
[27].
             a khung 3-
spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin  u ni ging vi cu ni ca 3 hot cht
LBH.
14

* Tác nhân ức chế histon deacetylase photoreactive [18]
Tii hc Illinois ti Chicago
u ct k c k mnh
m n lc ch HDAC8.
t c ch c t
[19] t hp vi m k
photoreactive ca cht c ch b a
t c ch  t c ch HDAC photoreactive ca Ti 
c ch n s  t s 
o v cht t 
n kinh. HD-75 (a chc ch
 n tin lit, trt c ch HD-55 (
1.11c chn lng t c ch chn l
 tc ch (IC
50
) th so vi suberoylanilide
axit hydroxamic (SAHA) (HD-55 = 17 nM, SAHA = 440 nM).
N
O
H
N
H
N
OH
N
3
O

O

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của HD-75
N
3
N
3
N
N
N
H
H
N
OH
O
O

Hình 1.11: Công thức cấu tạo của HD-55
* Các chất ức chế HDAC do nhóm nghiên cứu bộ môn Hóa Dược,trường Đại học
Dược Hà Nội thiết kế và nghiên cứu.
Tip nn thuc m
u ti b c i hc
15



H   t k     n cht hydroxamic acid mang khung 5-
phenyl-1,3,4-thiadiazol, thiazolidin-2,4-dion, 3-spiro[1,3] dioxolan-2-oxoindolin
mi.
S

N
N
N
H
O
NHOH
O
R
6

khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol
S
N
N
R
O
O
O
O
OH

khung thiazolidin-2,4-dion
c hiu dn ch
nh u ni nht
 th c m
 c hin tng hp 4 hot cht c ch HDAC d   -
spiro[1,3]dioxolan-2-t khung mang nhiu trin v
  t vn
c hin, kt qu chi tit s n tip theo
c

16




CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI
DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
 dng tc nghi
tng hc nhp t c Sigma-c s dng trc
ti 
2.1.1. Hóa chất chính
- 
+ Isatin
+ 5-Fluoroisatin
+ 5-Methylisatin
+ 5-Bromoisatin
- Methyl-3-[4(bromomethyl)phenyl]prop-2-
enoat
- Ethylen glycol
- Hydroxylamin hydroclorid
- St (III) clorid
- Acid p-toluensulfonic
2.1.2. Dung môi và hóa chất khác

DMF
Aceton
MeOH

n-Hexan
HCl
EtOH
NaOH
Dicloromethan
c ct

2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
- 
- My t gia nhit
- S
- M
- T lnh, t st, phu thy tinh, giy l
 thunh chy sp mng (TLC).
- Bn mng silicagel Merck 70-230 mesh.
- M y nhin Melting point apparatus S mp3