tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất 6–benzylamino –2–(naphthalen–1–yl) quinazolin–4–on

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM ANH

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT 6–BENZYLAMINO
–2–(NAPHTHALEN–1–YL)
QUINAZOLIN–4–ON

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KIM ANH
Mã sinh viên: 1401027

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT 6–BENZYLAMINO
–2–(NAPHTHALEN–1–YL)
QUINAZOLIN–4–ON
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Văn Thị Mỹ Huệ
2. DS. Nguyễn Thị Lai

Nơi thực hiện:
1. Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc –
Viện hóa sinh biển – Viện hàn lâm khoa học
và Công nghệ Việt Nam
2. Bộ môn Hóa Hữu cơ – Đại học Dƣợc Hà Nội

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu đầy khó khăn và vất vả để hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo,
bạn bè và người thân. Nhân dịp này, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:
PGS. TS. Văn Thị Mỹ Huệ, người thầy tận tâm đã giao cho em đề tài
này, truyền cho em nhiều kiến thức khoa học quý giá và luôn quan tâm, động
viên em trong quá trình hoàn thành đề tài.
DS. Nguyễn Thị Lai đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong quá trình làm thực
nghiệm để em có thể hoàn thành tốt mục tiêu đề tài.
TS. Lê Nguyễn Thành, ThS. Trần Hữu Giáp, NCS. Vũ Thị Kim Oanh
và toàn thể các cán bộ tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc – Viện Hóa
sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ kinh
nghiệm, giúp đỡ và tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình làm thực nghiệm.
Cuối cùng, em cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích
lệ tinh thần và giúp đỡ em trong khoảng thời gian hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp cũng như suốt quãng thời gian học tập dưới mái trường Đại học Dược
Hà Nội.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Kim Anh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2
1.1. Hoạt tính kháng ung thƣ của dẫn chất 4(3H)–quinazolinon ....................... 2
1.2. Phƣơng pháp tổng hợp dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on .... 8
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 12
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................ 12
2.1.1. Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi .................................................. 12
2.1.2. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 13
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 14
2.3.1. Phương pháp tổng hợp dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–
yl)quinazolin–4–on ....................................................................................... 14
2.3.2. Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc ....................................... 14
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư ..................... 14
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... 17
3.1. Tổng hợp hóa học...................................................................................... 17
3.1.1. Tổng hợp chất trung gian 5–benzyllamino–2–nitrobenzamid (2) ...... 17
3.1.2. Tổng hợp chất trung gian 2–amino–5–benzylaminobenzamid (3) ..... 18
3.1.3. Tổng hợp các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)
quinazolin–4–on (5a–c) ................................................................................ 18
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc .......................................... 21
3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được............................ 21

3.2.2. Khẳng định cấu trúc............................................................................ 22
3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ ....................................................... 25
3.4. Bàn luận .................................................................................................... 26
3.4.1. Về tổng hợp hóa học ........................................................................... 26
3.4.2. Về khẳng định cấu trúc ....................................................................... 30
3.4.3. Về hoạt tính kháng tế bào ung thư ...................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APCI

Atmospheric – pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học ở
điều kiện áp suất khí quyển)

ATCC

The American Type Culture Collection (Tổ chức tài nguyên và
tiêu chuẩn vật liệu sinh học Mỹ)

Ar

Aryl

CDCl3

Cloroform–d

13

Carbon–13 nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hƣởng từ hạt

C–NMR

nhân 13C)
CTPT

Công thức phân tử

Đ.v.C

Đơn vị carbon

DMAC

N,N–Dimethyl acetamid

DMSO

Dimethyl sulfoxid

EC50

50% Effective concentration (Nồng độ có tác dụng với 50% cá
thể)

ED50

The concentration of compound which affords 50% reduction in
cell number after a 3–day incubation (Nồng độ chất tạo ra sự
giảm 50% số lƣợng tế bào sau 3 ngày ủ)

EtOAc

Ethylacetat

1

Proton nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hƣởng từ hạt

H–NMR

nhân proton)
IC50

Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%)

IR

Infrared Spectrometry (Phổ hồng ngoại)

J

Hằng số tƣơng tác spin–spin

JNK

c–Jun N–terminal kinase

KLPT

Khối lƣợng phân tử

Me

Methyl

MS

Mass spectrometry (Phổ khối lƣợng)

MTT

3–(4,5–dimethyl–2–thiazolyl)–2,5–diphenyltetrazoli bromid

na

Non active (không có hoạt tính)


SKLM

Sắc ký lớp mỏng

n–HE

n–Hexan

Tonc

Nhiệt độ nóng chảy

Than ht

Than hoạt tính


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB của một số dẫn

3

chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on và 2–phenylquinazolin–4–
on (Ia–d, IIa–b)
Bảng 1.2.

Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thƣ của một

4

số dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon (IIIa–f)
Bảng 1.3.

Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thƣ của một

5

số dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (IVa–e)
Bảng 1.4.

Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thƣ của hai

7

dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on và một
dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–2–yl)quinazolin–4–on (Va–c)
Bảng 1.5.

Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 6–(n–

8

butylamino)–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (VIa–b)
Bảng 2.1.

Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu

12

Bảng 3.1.

Kết quả tổng hợp các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–

20

yl)quinazolin–4–on (5a–c)
Bảng 3.2.

Giá trị Rf và Tonc của các hợp chất 5a–c

21

Bảng 3.3.

Số liệu phổ IR của các dẫn chất 5a–c

22

Bảng 3.4.

Số liệu phổ MS của các dẫn chất 5a–c

23

Bảng 3.5.

Số liệu phổ 1H–NMR của các dẫn chất 5a–c

24

Bảng 3.6.

Số liệu phổ 13C–NMR của các dẫn chất 5a–c

25

Bảng 3.7.

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất 5a–c

26

Bảng 3.8.

So sánh hiệu suất phản ứng tổng hợp giữa một số dẫn chất 6–

29

benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4(3H)–on và 6–(n–butyl
amino)–2–phenylquinazolin–4(3H)–on tƣơng ứng
Bảng 3.9.

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất 5a–c

35

Bảng 3.10.

So sánh hoạt tính kháng ung thƣ trên hai dòng tế bào KB và Hep–G2

36

của các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on
và chất 6–alkylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on khác

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1.

Phản ứng amid hóa giữa anthranilonitril và naphthoyl clorid của Xia

9

Sơ đồ 1.2.

Phản ứng ngƣng tụ giữa imidat và acid 2–aminobenzoic của Connolly

9

và Guiry
Sơ đồ 1.3.

Phản ứng giữa nitril và lithiated 2–aminobenzamid của Couture

10

Sơ đồ 1.4.

Phản ứng ngƣng tụ trực tiếp từ aldehyd với anthranilamid và dẫn chất

10

của Abdel–Jalil

Sơ đồ 1.5.

Phản ứng ngƣng tụ trực tiếp từ aldehyd với anthranilamid và dẫn chất

10

của Hour
Sơ đồ 1.6.

Phản ứng ngƣng tụ trực tiếp từ aldehyd với anthranilamid và dẫn chất

11

của Kim N.Y. và Cheon C.H.
Sơ đồ 3.1.

Quy trình tổng hợp các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)

17

quinazolin–4–on
Sơ đồ 3.2.

Cơ chế phản ứng tổng hợp chất trung gian 5–benzylamino–2–nitro

27

benzamid (2)
Sơ đồ 3.3.

Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất trung gian 2–amino–5–benzylamino

27

benzamid (3)
Sơ đồ 3.4.

Sơ đồ phản ứng tổng hợp 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)

28

quinazolin–4–on (5a–c)
Sơ đồ 3.5.

Cơ chế phản ứng tổng hợp 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)

28

quinazolin–4–on (5a–c)

HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1.

Cấu trúc hóa học của quinazolin và 4(3H)–quinazolinon

2

Hình 1.2.

Cấu trúc hóa học của hai thuốc Noltrexed, Raltitrexed

2


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới năm 2018, ung thƣ là nguyên nhân
gây tử vong đứng hàng thứ hai trên toàn cầu và ƣớc tính chiếm 9,6 triệu ca tử
vong [27]. Tại Việt Nam, có 164671 ca mắc ung thƣ mới và 114871 ngƣời chết
do ung thƣ trong năm 2018 [28].
Một trong các biện pháp điều trị ung thƣ phổ biến là hóa trị liệu. Một số
thuốc điều trị ung thƣ đã đƣợc sử dụng trong lâm sàng, tuy nhiên số lƣợng
không nhiều và giá cả đắt đỏ. Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển các hợp chất
có hoạt tính chống ung thƣ tiềm năng là một nhu cầu cấp thiết của Việt Nam và
thế giới.
Raltitrexed và Nolatrexed là hai thuốc ung thƣ có cấu trúc 4(3H)–
quinazolinon đã đƣợc cấp phép lƣu hành trên thế giới [24]. Nhiều nhà khoa học
trên thế giới và Việt Nam cũng đã nghiên cứu về tổng hợp và thử hoạt tính
kháng ung thƣ của các dẫn chất 4(3H)–quinazolinon và thu đƣợc nhiều hợp chất
có hoạt tính tốt. Trong nhóm chất nói trên, các dẫn chất 2–arylquinazolin–
4(3H)–on đƣợc quan tâm hàng đầu nhờ tác dụng chống ung thƣ của chúng [6,
17, 26]. Nhiều nghiên cứu cho thấy các dẫn chất 2–arylquinazolin–4(3H)–on có
chứa nhóm thế naphthalen–1–yl ở vị trí số 2 và nhóm thế amino ở vị trí số 6 thể
hiện nhiều tiềm năng trong tác dụng chống ung thƣ [1, 2, 11, 15, 26].
Với định hƣớng sử dụng nhóm thế ở vị trí số 2 là các dẫn chất
naphthalen–1–yl và nhóm thế ở vị trí số 6 là benzylamino để tìm hiểu mối liên
quan giữa cấu trúc và hoạt tính kháng ung thƣ của dãy chất 2–arylquinazolin–
4(3H)–on, đồng thời tìm kiếm những hợp chất có khả năng gây độc tế bào, khóa
luận: “Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất
6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on” đƣợc tiến hành với

hai mục tiêu:
1. Tổng hợp đƣợc một số dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–
yl)quinazolin–4–on.
2. Thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp đƣợc trên một số
dòng tế bào ung thƣ.
1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Hoạt tính kháng ung thƣ của dẫn chất 4(3H)–quinazolinon
Quinazolinon là vòng quinazolin có gắn thêm nhóm carbonyl [9]. Trong
số các cấu trúc quinazolinon, 4(3H)–quinazolinon là phổ biến nhất, là sản phẩm
trung gian hoặc sản phẩm tự nhiên trong nhiều con đƣờng sinh tổng hợp đã đƣợc
đề xuất. Điều này một phần là do cấu trúc có nguồn gốc từ các anthranilat (acid
anthranilic hoặc các este khác nhau, anhydrid isatoic, anthranilamid và
anthranilonitril) trong khi 2(1H)–quinazolinon chủ yếu là sản phẩm của
anthranilonitril hoặc benzamid với các nitril [16].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của quinazolin và 4(3H)–quinazolinon
4(3H)–quinazolinon là một nhóm lớn các hợp chất hóa học thể hiện hoạt
tính sinh học đa dạng trên động vật cũng nhƣ trên ngƣời. Các nghiên cứu trƣớc
đây đã chỉ ra rằng các dẫn chất 4(3H)–quinazolinon có nhiều tác dụng nhƣ:
chống HIV, chống ung thƣ, kháng khuẩn, chống trầm cảm, chống nấm…[10, 18,
19, 25]. Tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 4(3H)–quinazolinon đƣợc đặc biệt
quan tâm nghiên cứu và đã thu đƣợc nhiều hợp chất có tác dụng tốt. Một số
thuốc là dẫn chất 4(3H)–quinazolinon đã đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng nhƣ:
Nolatrexed và Raltitrexed sử dụng trong điều trị ung thƣ,… [24].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hai thuốc Noltrexed, Raltitrexed

2


Trong các dẫn chất 4(3H)–quinazolinon, 2–arylquinazolin–4–on là một
nhóm hợp chất hóa học quan trọng, đƣợc quan tâm hàng đầu vì khả năng chống
ung thƣ của chúng [6, 17, 26]. Trong số các 2–arylquinazolin–4–on, các dẫn
chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on thể hiện tác dụng chống ung thƣ tiềm
năng. Điều này đƣợc thể hiện trong các nghiên cứu sau đây.
Năm 2001, Yi Xia và các cộng sự đã tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh
học của các dẫn chất 2–phenylquinazolin–4–on và 2–(naphthalen–1–
yl)quinazolin–4–on. Dựa trên kết quả thử độc tính tế bào trên dòng tế bào ung
thƣ biểu mô KB, có thể thấy hoạt tính gây độc tế bào của dẫn chất 2–
(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on

mạnh

hơn

một

số

dẫn

chất

2–

phenylquinazolin–4–on có cùng các nhóm thế còn lại trên nhân 4(3H)–
quinazolinon. Nhƣ vậy, nhóm thế naphthlen–1–yl ở vị trí số 2 trên nhân 4(3H)–

quinazolinon có vai trò quan trọng trong tác dụng chống ung thƣ [26]. Kết quả
so sánh hoạt tính gây độc tế bào giữa các dẫn chất 2–(naphthalen–1–
yl)quinazolin–4–on và 2–phenylquinazolin–4–on đƣợc thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB của một số
dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on và 2–phenylquinazolin–4–on
(Ia–d, IIa–b)
STT

Ia

Công thức cấu tạo

ED50
(µg/mL)

STT

12,50

3

Công thức cấu tạo

ED50
(µg/mL)

Ib

>20

Ic

>20

Id

>20


7,30

IIa

>20

IIb

Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành, Văn Thị Mỹ Huệ và
Nguyễn Thị Huyền đã tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ
của một số dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon. Kết quả thử hoạt tính của năm dẫn
chất 2–aryl–4–quinazolinon (IIIa–f) cho thấy, trong các dẫn chất có cùng nhân
6–methyl–quianzolin–4–on hoặc 7–methyl–quianzolin–4–on, dẫn chất có nhóm
thế 2–(naphthalen–1–yl) có tác dụng kháng tế bào ung thƣ mạnh hơn một số dẫn
chất có nhóm thế ở vị trí số 2 là dẫn chất của phenyl. Trong đó, cả ba dẫn chất
2–(naphthalen–1–yl)–quinazolin–4–on (IIIa, IIId, IIIf) tổng hợp đƣợc đều cho
hoạt tính gây độc tế bào rất tốt [2]. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một
số dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon (IIIa–f) đƣợc tổng hợp ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thƣ
của một số dẫn chất 2–aryl–4–quinazolinon (IIIa–f)
IC50 (µg/mL)

R6/R7

R6 = –CH3

STT

Công thức cấu tạo

KB

Hep–
G2

LU

MCF7

IIIa

3,92

5,8

11,69

16,64

IIIb

4,48

5,81

62

74

IIIc

29,17

24,8

104

29,25

4


IIId

14,85

20,75

30

30,62

IIIe

70,4

32

104

>128

IIIf

0,051

0,096

0,125

0,5

Ellipticin

0,31

0,35

0,45

0,53

R7 = –CH3

R6 =
–N(CH3)2

Kết quả nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành và cộng sự còn cho thấy giữa các dẫn
chất 2–(naphthalen–1–yl)–quinazolin–4–on (IIIa, IIId, IIIf) tổng hợp đƣợc, dẫn
chất có nhóm thế ở vị trí số 6 cho hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn so với
nhóm thế ở vị trí số 7, đặc biệt là nhóm thế dimethylamino ở vị trí số 6 cho hoạt
tính mạnh nhất, có IC50 (µg/mL) thấp hơn chất đối chứng dƣơng ellipticin [2].
Năm 2013, Mann Jen Hour và các cộng sự đã tổng hợp, thử hoạt tính gây
độc tế bào và xác định cơ chế chống khối u của một số dẫn chất 2–
arylquinazolinon với các nhóm thế khác nhau ở vị trí số 6. Nghiên cứu đã tổng
hợp đƣợc năm dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on đều có hoạt tính
gây độc tế bào tốt, cho giá trị IC50 (µM) từ 0,03 – 8,74 µM trên năm dòng tế bào
ung thƣ [11]. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào đƣợc tổng hợp trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thƣ
của một số dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (IVa–e)
STT

IVa

Công thức cấu tạo

IC50 (µM)
M21

CH27

H460

Hep3B

HSC–3

0,09

0,09

0,07

1,94

0,15

5


IVb

0,63

0,43

4,37

8,74

0,20

IVc

0,03

0,05

0,08

1,35

0,04

IVd

0,44

0,38

0,38

7,46

1,65

IVe

0,9

0,78

0,44

1,11

0,63

Ngoài ra, nghiên cứu của Mann Jen Hour còn đƣa đến một kết luận quan trọng
về cơ chế gây độc tế bào của 5 dẫn chất này (IVa–e) là nhắm đến mục tiêu kép,
gắn kết với tubulin và JNK, chống ung thƣ và gây chết tế bào ung thƣ thông qua
việc can thiệp vào chức năng điều khiển của tubulin và JNK [11].
Từ ba nghiên cứu trên, có thể thấy đƣợc nhóm thế ở vị trí số 2 trong nhân
4(3H)–quinazolinon có ý nghĩa quan trọng trong tác dụng gây độc tế bào, đặc
biệt là nhóm thế naphthalen–1–yl. Đồng thời, có thể nhận ra các dẫn chất 6–
amino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on từ những nghiên cứu trên đều có
hoạt tính kháng ung thƣ tốt. Trong số các 2–arylquinazolin–4–on, các dẫn chất
có nhóm thế amino ở vị trí số 6 cũng đã đƣợc báo cáo là có tác dụng chống ung
thƣ rất mạnh [15]. Một số nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính gây độc tế bào
của các dẫn chất 6–amino–2–arylquinazolin–4–on khác đã đƣợc tiến hành thu
đƣợc các dẫn chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt [1, 15]. Điều này cũng đƣợc
thể hiện trong hai nghiên cứu sau đây.
Năm 2016, Lê Nguyễn Thành và các cộng sự đã tiến hành tổng hợp và
thử hoạt tính chống ung thƣ của các dẫn chất 2–aryl–6–diethylamino

6


quinazolinon. Hai dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–
on (Va–b) tổng hợp đƣợc đều có hoạt tính gây độc tế bào tốt, mạnh hơn chất
chứng dƣơng ellipticin trên ba dòng tế bào ung thƣ KB, Hep–G2 và MCF–7,
riêng với dòng tế bào ung thƣ LU–1, trong khi chất Vb có hoạt tính mạnh hơn

chất đối chứng ellipticin thì chất Va cho hoạt tính yếu hơn. Trong khi đó, chất
Vc có nhóm thế ở vị trí số 2 là naphthalen–2–yl lại cho hoạt tính kháng dòng tế
bào KB yếu hơn chất Va, Vb và ellipticin, không có tác dụng trên ba dòng tế
bào còn lại. Nhƣ vậy, nhóm thế 2–(naphthalen–1–yl) có tác động tốt hơn nhóm
thế 2–(naphthalen–2–yl) đến khả năng gây độc tế bào của nhân 4(3H)–
quinazolinon [15]. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hai dẫn chất 6–
diethylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (Va–b) và một dẫn chất 6–
diethylamino–2–(naphthalen–2–yl)quinazolin–4–on (Vc) đƣợc tổng hợp ở bảng
1.4.
Bảng 1.4. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thƣ
của hai dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on và
một dẫn chất 6–diethylamino–2–(naphthalen–2–yl)quinazolin–4–on (Va–c)
STT

IC50 (µM)

Công thức cấu tạo

KB

Hep–G2

LU–1

MCF–7

Va

0,05

0,06

3,48

0,25

Vb

0,24

0,31

1,34

0,29

Vc

66,5

na

na

na

1,26

1,42

1,827

2,151

Ellipticin

7


Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành, Ngô Xuân Hoàng và
Trần Minh Huệ đã tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của
một số dẫn chất 6–butylamino–2–arylquinazolin–4–on. Trong số năm dẫn chất
thu đƣợc, có hai dẫn chất có nhóm thế naphthalen–1–yl ở vị trí số 2. Hai dẫn
chất này đều có hoạt tính rất tốt trên hai dòng tế bào ung thƣ KB và Hep–G2,
mạnh hơn từ 2 – 17,25 lần so với chất chứng dƣơng ellipticin [1]. Kết quả thử
hoạt tính đƣợc trình bày trong bảng 1.5.
Bảng 1.5. Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 6–(n–
butylamino)–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on (VIa–b)
STT

Công thức cấu tạo

IC50(µM)
KB

Hep–G2

VIa

0,91

0,99

VIb

0,11

0,12

Ellipticin đo cùng VIb

1,665

2,07

Từ kết quả của những nghiên cứu trên, có thể thấy đƣợc tiềm năng chống
ung thƣ của các dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)–6–aminoquinazolinon. Trong
khóa luận này, các dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)–6–aminoquinazolinon với
nhóm thế ở vị trí số 6 là benzylamino tiếp tục đƣợc tiến hành tổng hợp và thử
hoạt tính chống ung thƣ.
1.2. Phƣơng pháp tổng hợp dẫn chất 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on
1.2.1. Phản ứng amid hóa giữa anthranilonitril và naphthoyl clorid
Nhƣ thể hiện trong sơ đồ 1.1, 2–(naphthalen–1–yl)–quinazolin–4–on đƣợc
tổng hợp theo phƣơng pháp amid hóa anthranilonitril với naphthoyl clorid đã tạo
ra các chất trung gian diaryl amid tƣơng ứng. Đóng vòng oxy hóa các diaryl
amid trong điều kiện cơ bản sẽ tạo ra đƣợc các quinazolinon [26].

8

Sơ đồ 1.1. Phản ứng amid hóa giữa anthranilonitril và naphthoyl clorid của
Xia
1.2.2. Phản ứng ngưng tụ giữa imidat và acid 2–aminobenzoic
Phản ứng giữa imidat và acid 2–aminobenzoic đã đƣợc báo cáo vào đầu
những năm 1960 bởi Ried và các cộng sự [20–22].
Connolly và Guiry đã phát triển phƣơng pháp này để tổng hợp một dãy
các 2–aryl– và 2–alkyl–quinazolinon. Trƣớc khi ngƣng tụ với acid 2–amino
benzoic, muối imidat đƣợc chuyển về dạng imidat tƣơng ứng bằng phản ứng với
một đƣơng lƣợng base. Phản ứng tạo ra các quinazolinon mong muốn với hiệu
suất tốt [7].

Sơ đồ 1.2. Phản ứng ngƣng tụ giữa imidat và acid 2–aminobenzoic của
Connolly và Guiry
1.2.3. Phản ứng giữa nitril và lithiated 2–aminobenzamid
Couture và cộng sự đã phát triển một quy trình để tổng hợp 2–aryl– và 2–
alkyl–quinazolinon bằng phản ứng giữa lithium 2–(diethylaminocarbonyl)anilid
với aryl nitril phù hợp. Mặc dù hiệu suất đạt đƣợc thấp trong một số trƣờng hợp,
đây vẫn là một phƣơng pháp ƣu việt nhờ sự đơn giản và phổ biến của quy trình.
Đây là một trong những phƣơng pháp thuận tiện để tổng hợp 2–aryl– và 2–
alkyl–quinazolinon [8].

9


Sơ đồ 1.3. Phản ứng giữa nitril và lithiated 2–aminobenzamid của Couture
1.2.4. Phản ứng ngưng tụ trực tiếp từ aldehyd với anthranilamid và dẫn chất
Abdel–Jalil và cộng sự đã báo cáo về phản ứng ngƣng tụ của aryl và alkyl
aldehyd với anthranilamid trong ethanol hồi lƣu với sự có mặt của CuCl2, tạo ra
một chất trung gian base Schiff trƣớc khi chuyển thành 2–aryl– và 2–alkyl–
quinazolinon với hiệu suất rất tốt. Ƣu điểm của phƣơng pháp là tiến hành ở nhiệt

độ thấp, giúp giảm phân hủy sản phẩm [3].

Sơ đồ 1.4. Phản ứng ngƣng tụ trực tiếp từ aldehyd với anthranilamid và
dẫn chất của Abdel–Jalil
Phƣơng pháp này cũng đƣợc Mann Jen Hour và các cộng sự sử dụng
trong các nghiên cứu tổng hợp 2–arylquinazolinon nhƣng với điều kiện phản
ứng khác. Phản ứng đƣợc tiến hành trong dung môi DMAC với sự có mặt của
NaHSO3 ở 150oC trong 3 giờ. Phản ứng thu đƣợc các 2–arylquinazolinon mong
muốn với hiệu suất khá tốt, phụ thuộc vào nhóm thế trên nhân thơm [12].

Sơ đồ 1.5. Phản ứng ngƣng tụ trực tiếp từ aldehyd với anthranilamid và
dẫn chất của Hour
Năm 2014, Kim N.Y. và Cheon C.H. cũng đã tổng hợp các dẫn chất
quinazolinon bằng phản ứng ngƣng tụ anthranilamid và các aldehyd trong điều
kiện oxy hóa chân không, dung môi dimethyl sulfoxid (DMSO), hỗn hợp phản

10


ứng đƣợc đun ở 100oC trong 12–36 giờ. Hiệu suất của phản ứng là 38 – 98%
[13].

Sơ đồ 1.6. Phản ứng ngƣng tụ trực tiếp từ aldehyd với anthranilamid và
dẫn chất của Kim N.Y. và Cheon C.H.
Trong đề tài này, 2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–4–on đƣợc tổng hợp từ
anthranilamid và aldehyd theo phƣơng pháp của Mann Jen Hour do phƣơng
pháp này có nhiều ƣu điểm nhƣ sau:
- Nguyên liệu dễ kiếm, sẵn có.
- Thời gian phản ứng ngắn.
- Điều kiện phản ứng tƣơng đối dễ thực hiện.

- Hiệu suất phản ứng khá cao.

11


CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi
Hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm có xuất xứ từ các công ty
hóa chất nhƣ Aldrich, Merck, Đức Giang (Việt Nam), Quảng Châu (Trung
Quốc)... Các hóa chất này đƣợc sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm và
đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu
TT
1

Nguyên liệu
5–Cloro–2–
nitrobenzamid

Xuất sứ

TT

Nguyên liệu

Aldrich

11

Methanol

Xuất sứ
Trung
Quốc

2

Dimethyl sulfoxid

Aldrich

12

Ethanol

3

1–Naphthaldehyd

Aldrich

13

n–Hexan

Aldrich

14

Aceton

Aldrich

15

Ethylacetat

16

Benzylamin

17

Than hoạt tính

18

Nƣớc cất

Việt Nam

19

Natri bisulfit

Aldrich

4

5

2–Hydroxy–1–
naphthaldehyd
2–Methoxy–1–
naphthaldehyd
Sắt (III) clorid

Trung

hexahydrat

Quốc

7

N,N–dimethylacetamid

Merck

8

Kali carbonat

9

Hydrazin hydrat 80%

10

Natri sulfat

6

Trung
Quốc
Trung
Quốc
Việt Nam

12

Việt Nam
Trung
Quốc
Trung
Quốc
Trung
Quốc
Merck
Trung
Quốc


2.1.2. Thiết bị thí nghiệm
– Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 100mL, 50mL, 25mL, sinh hàn, phễu, cốc
thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, lọ penicillin,
giấy lọc, cột chạy sắc ký,....
– Bơm hút chân không KNF (Đức).

– Máy cất quay EYELA (Nhật Bản).
– Tủ sấy Heraeus (Đức).
– Sắc ký lớp mỏng (SKLM) đƣợc tiến hành trên bản mỏng sắc ký tráng
silica gel 60 F254 Merck (Đức).
– Máy khuấy từ gia nhiệt IKA–RTC (Pháp).
– Cân phân tích Ohaus (Trung Quốc).
– Buồng soi UV 2 bƣớc sóng Spectroline (Mỹ).
– Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H–NMR,

13

C–NMR) Bruker

Avance 500 MHz, tại phòng thí nghiệm Hóa dƣợc, khoa Hóa học – Trƣờng Đại
học Khoa học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội).
– Máy đo phổ khối lƣợng LC–MS–Trap–Agilent 1260, tại Trung tâm tiên
tiến – Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam).
– Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity–IS–Shimadzu, tại bộ môn Hóa lý
– Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội).
– Máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA 120, tại bộ môn Hoá Hữu cơ –
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tổng hợp các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin
–4–on
– Tổng hợp chất trung gian 5–benzylamino–2–nitrobenzamid.
– Tổng hợp chất trung gian 2–amino–5–benzylaminobenzamid.
– Tổng hợp các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)quinazolin–
4–on.
2.2.2. Tinh chế và xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được
2.2.3. Thử hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất tổng hợp được

13


Tiến hành thử hoạt tính kháng ung thƣ của các dẫn chất tổng hợp đƣợc
trên 2 dòng tế bào: ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ gan (Hep–G2).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tổng hợp dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–yl)
quinazolin–4–on
– Sử dụng các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ cổ điển và hiện đại để tổng
hợp các dẫn chất dự kiến.
– Theo dõi tiến trình phản ứng và sơ bộ đánh giá độ tinh khiết các chất
bằng sắc ký lớp mỏng.
2.3.2. Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc
– Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, kết tinh để tinh chế
các hợp chất tổng hợp đƣợc.
– Sử dụng các phƣơng pháp phổ hiện đại để khẳng định cấu trúc hóa học
của các hợp chất tổng hợp đƣợc gồm: phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H–NMR và
13

C–NMR), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS).

2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư
Thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các dẫn chất tổng hợp đƣợc theo
phƣơng pháp MTT là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện
các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện
in vitro [4], [23].
2.3.3.1. Nguyên tắc
Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời đƣợc tiến hành theo

phƣơng pháp in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào ung thƣ đƣợc
nuôi cấy trong đĩa 96 giếng.
Hợp chất MTT có tên khoa học là 3–(4,5–dimethyl–2–thiazolyl)–2,5–
diphenyl tetrazoli bromid, có màu vàng đƣợc thêm vào mỗi giếng và tế bào đƣợc
ủ ở 37oC, 5% CO2. Màu vàng biến đổi thành formazan tím trong ty thể của tế
bào sống. Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzym reductase trong ty thể hoạt
14


động, và nhƣ vậy sự thay đổi liên quan trực tiếp đến số lƣợng tế bào sống sót.
Dung dịch có màu này có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 540 – 600 nm
nên có thể đƣợc định lƣợng bằng máy quang phổ kế. Viện nghiên cứu ung thƣ
quốc gia Mỹ (NCI) hiện nay đang áp dụng phƣơng pháp này.
2.3.3.2. Các dòng tế bào thử nghiệm
Các dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời đƣợc cung cấp bởi ATCC gồm:
– KB (Human epidemic carcinoma) – tế bào ung thƣ biểu mô.
– Hep–G2 (Hepatocellular carcinoma) – tế bào ung thƣ gan.
2.3.3.3. Chất chuẩn dương tính
Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào là ellipticin pha trong DMSO.
2.3.3.4. Tiến hành
 Chuẩn bị tế bào:
– Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng phù hợp có bổ
sung huyết thanh bê tƣơi 10%, dung dịch kháng sinh 1% (penicillin 50,000
units/L và streptomycin 50 mg/L) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện
tiêu chuẩn (5% CO2, 37oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào từng
dòng tế bào mà thời gian cấy chuyển khác nhau. Tế bào đƣợc nuôi cấy cho phát
triển tới mức khoảng 70% (pha log), thay môi trƣờng sạch, tế bào này đƣợc
dùng làm thí nghiệm.
– Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao
cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/mL. Tiếp theo pha loãng thuốc nghiên cứu

thành các thang nồng độ khác nhau. Nồng độ của thuốc thử đƣợc dùng theo tiêu
chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thƣ có nguồn gốc dƣợc liệu của tác giả Teicher
1997. Ellipticin đƣợc sử dụng làm chứng dƣơng và dung dịch DMSO 0,1% đƣợc
sử dụng làm chứng âm.
 Quy trình xác định hoạt tính kháng tế bào ung thƣ:
– Pha 200 μL dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3x104 tế bào/mL vào
mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trƣờng DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium) cho các dòng tế bào KB, Hep–G2.

15


– Mẫu thử đƣợc pha loãng đến nồng độ thích hợp. Ủ ở 37oC, 5% CO2
trong 3 ngày.
– Giếng điều khiển (đối chứng dƣơng) chỉ gồm 200 μL dung dịch tế bào
3x104 tế bào/mL.
– Sau 3 ngày nuôi cấy, ủ tiếp với MTT 0,2 mg/mL ở 37oC trong 4 giờ.
– Loại bỏ môi trƣờng, thêm 100 μL DMSO lắc đều để formazan có thể
hòa tan hoàn toàn.
– Đọc kết quả mật độ quang ở bƣớc sóng 540 nm trên máy
Spectrophotometter Genios TECAN. Mật độ quang phản ánh số lƣợng tế bào
còn sống sót.
 Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử
tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đƣợc của chứng OD (ngày 0),
DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo
công thức:

IC50 = 100 % – CS%

16


CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tổng hợp hóa học
Quy trình tổng hợp các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–1–
yl)quinazolin–4–on đƣợc tiến hành theo sơ đồ sau:
NH2-NH2.H2O
FeCl3.6H2O, than hoạt tính
EtOH, hồi lƣu

Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp các dẫn chất 6–benzylamino–2–(naphthalen–
1–yl)quinazolin–4–on
Quá trình tiến hành cụ thể qua 3 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Tổng hợp chất trung gian 5–benzylamino–2–nitrobenzamid
(2).
 Giai đoạn 2: Tổng hợp chất trung gian 2–amino–5–benzylaminobenzamid
(3).
 Giai đoạn 3: Tổng hợp các dẫn chất của 6–benzylamino–2–(naphthalen–
1–yl)quinazolin–4–on (5a–c).
3.1.1. Tổng hợp chất trung gian 5–benzylamino–2–nitrobenzamid (2)

Tiến hành: Hòa tan hỗn hợp gồm 1500 mg (7,5 mmol) 5–cloro–2–
nitrobenzamid (1) và 5600 mg (52,5 mmol) benzylamin vào 5 mL DMSO, đun
hồi lƣu ở 110oC. Phản ứng đƣợc theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (hệ dung môi n–
17