Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư một số acid hydroxamic mang khung benzimidiazol và indolin

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI




NGUYỄN DUY



TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ MỘT SỐ
ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG
BENZIMIDAZOL/INDOLIN


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


HÀ NỘI 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


NGUYỄN DUY

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ MỘT SỐ
ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG
BENZIMIDAZOL/INDOLIN


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Phan Thị Phương Dung
2. DS. Đỗ Thị Mai Dung
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa Dược


HÀ NỘI 2014


Lời cảm ơn

Trƣớc khi bắt đầu viết nội dung của khóa luận này tôi xin đƣợc gửi lời
cảm ơn chân thành nhất đến những ngƣời trong suốt thời gian qua đã luôn ở
bên cạnh giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt
nghiệp này.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Phan Thị Phương Dung và DS. Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dƣợc -
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội là những ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình
chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Hóa Dƣợc - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trƣờng, các phòng
ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội -
những ngƣời đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt năm năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh
chị em đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian
qua.

Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Duy




Mục Lục

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Histon deacetylase (HDAC) 2
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 2
1.1.2. Mối liên quan giữa HDAC và ung thư 3
1.1.3. Phân loại các HDAC 5
1.1.4. Cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC kinh điển 6

1.1.5. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 7
1.2. Các chất ức chế HDAC 8
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC đang thử lâm sàng theo cấu trúc 8
1.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế
HDAC 11
1.3.1. Ảnh hưởng của cầu nối 11
1.3.2. Ảnh hưởng của nhóm khóa hoạt động 14
1.4. Các acid hydroxamic đã đƣợc thiết kế tổng hợp trong nƣớc 14
1.5. Thiết kế cấu trúc các chất dự kiến tổng hợp 15
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên liệu và thiết bị 17
2.1.1. Hóa chất 17
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ 17


2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.2.1. Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất dự kiến tổng hợp
được 18
2.2.2. Tổng hợp hóa học 18
2.2.3. Thử hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được 18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Sơ bộ đánh giá độ giống thuốc của các chất dự kiến tổng hợp 18
2.3.2. Tổng hợp hóa học 19
2.3.3. Thử tác dụng sinh học 20
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. Đánh giá tính giống thuốc của các chất dự kiến tổng hợp 22
3.2. Hóa học 23
3.2.1. Tổng hợp hóa học 23
3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết 31

3.2.3. Khẳng định cấu trúc 32
3.3. Thử tác dụng sinh học 36
3.4. Bàn luận 36
3.4.1. Tổng hợp hóa học 36
3.4.2. Tác dụng sinh học 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
I. Kết luận 40
II. Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC





DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13
C- NMR
:
: Cộng hƣởng từ hạt nhân
13
C
1
H- NMR
:
: Cộng hƣởng từ hạt nhân
1
H
AsPC-1:
:

: Tế bào ung thƣ tuyến tụy
CDI:
:
: Carbonyl diimidazol
DCM

: Dicloromethan
DMF
:
: Dimethyl formamid
DMSO
:
: Dimethyl sulfoxid
EtOH
:
: Ethanol
HAT
:
: Histon acetyltranferase
HDAC
:
: Enzym histon deacetylase
IC
50
:
: Nồng độ ức chế 50% sự tăng trƣởng của tế bào
IR
:
: Phổ hồng ngoại
MCF-7

: Tế bào ung thƣ vú
MeOH
:
: Methanol
MS
:
: Phổ khối lƣợng
MTT

: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromid
NCI-H460

: Tế bào ung thƣ phổi
PC3

: Tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt
SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic
SW620

: Tế bào ung thƣ đại tràng
TLC

: Sắc kí lớp mỏng
TMS

: Tetramethylsilan

T
o
nc
:

: Nhiệt độ nóng chảy
TSA

: Trichostatin A



DANH MỤC CÁC BẢNG
Stt
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1: Đặc điểm 11 HDAC “kinh điển”
5
2
Bảng 1.2: Phân loại một số chất ức chế HDAC đang được thử
nghiệm lâm sàng
9
3
Bảng 1.3: Hoạt tính của các chất tương tự TSA
11
4
Bảng 1.4: Hoạt tính của các dẫn chất sulfonamid hydroxamic
acid
12

5
Bảng 1.5: Tác dụng sinh học của một số chất ức chế HDAC
được thiết kế, tổng hợp tại Việt Nam
15
6
Bảng 3.1: Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất dự
kiến tổng hợp
22
7
Bảng 3.2: Một số đặc điểm lý hóa và hiệu suất tạo hydroxamic
từ ester của các chất I-IV
30
8
Bảng 3.3: Giá trị nhiệt độ nóng chảy (t
o
nc
) và R
f
với pha động
DCM/MeOH/AcOH = 90/10/1 của các chất I-IV
31
9
Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất I-IV
32
10
Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất I-IV
33
11
Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1

H
của 2 acid hydroxamic I và II
34
12
Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C của
acid hydroxamic II
35
13
Bảng 3.8: Kết quả thử tác dụng sinh học của các chất I, II,
III, IV và SAHA
37
14
Bảng 3.9: So sánh hoạt tính của các chất I, 9a và SAHA
38
15
Bảng 3.10: Giá trị logP ước tính của các chất II, III và IV
39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Stt
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1: Cấu trúc của nucleosom
2
2
Hình 1.2: Các enzym chức năng làm thay đổi cấu trúc nucleosom

3
3
Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế
bào ung thư
4
4
Hình 1.4: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC
7
5
Hình 1.5: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC tương
tự SAHA
8
6
Hình 1.6: Ảnh hưởng của cấu trúc cầu nối tới hoạt tính ức
chế HDAC
13
7
Hình 1.7: Chất ức chế có cầu nối là 1,4-cyclohexelen và 1,4-
phenylen
13
8
Hình 1.8: Acid hydroxamic có nhóm nhận diện bề mặt là
succinimid
14
9
Hình 1.9: Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được
nghiên cứu trong nước
15
10
Hình 1.10: Acid hydroxamic mang khung benzothiazol

16
11
Hình 1.11: Cấu trúc hóa học của các chất dự kiến tổng hợp
16

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Stt
Tên hình vẽ
Trang
1
Sơ đồ 1: Quy trình tổng hợp chất I
22
2
Sơ đồ 2: Quy trình tổng hợp chất II
24
3
Sơ đồ 3: Quy trình tổng hợp chất III
25
4
Sơ đồ 4: Quy trình tổng hợp chất IV
27
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm enzym xúc tác cho phản ứng
loại bỏ nhóm acetyl gắn trên phần đuôi lysin ở protein histon của nucleosom. Sự
loại bỏ các nhóm acetyl có vai trò trung hòa điện tích khỏi protein histon làm sợi
ADN quấn chặt vào lõi histon, ức chế quá trình phiên mã. Các nghiên cứu trong
khoảng thời gian những năm 90 của thế kỉ trƣớc cho thấy sự bất thƣờng hoạt
động của các HDAC có thể gây rối loạn quá trình phiên mã, từ đó làm phát sinh

và thúc đẩy phát triển ung thƣ. Từ đó, việc tìm kiếm hoạt chất ức chế HDAC trở
thành một hƣớng nghiên cứu trong tìm kiếm các chất điều trị ung thƣ.
Năm 1976, hoạt chất chống nấm TSA đƣợc phân lập từ Streptomyces
hygrocopicus bởi Tsuji và cộng sự 28. Nhƣng mãi tới năm 1990, tác dụng ức
chế HDAC của TSA mới đƣợc phát hiện bởi Yoshida và đồng nghiệp 33. Từ đó
dựa trên cấu trúc và tƣơng tác của nó với HDAC, một loạt các chất đƣợc thiết kế
và tổng hợp. Năm 2006 SAHA (Zolinza®) đã trở thành chất ức chế HDAC đầu
tiên đƣợc Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Mỹ (US-FDA) cấp phép điều trị
u limpho tế bào T dƣới da, đánh dấu sự thành công của hƣớng nghiên cứu [4].
Theo định hƣớng nghiên cứu đó, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc
- Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác dụng
sinh học của các acid hydroxamic mới với sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt và
cầu nối dựa trên cấu trúc của SAHA. Khóa luận: “Tổng hợp và thử tác dụng
sinh học một số acid hydroxamic mang khung benzimidazol/indolin hƣớng
ức chế histon deacetylase” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu:
1. Tổng hợp acid hydroxamic mang khung benzimidazol và các acid
hydroxamic mang khung indolin.
2. Thử độc tính trên dòng tế bào ung thƣ đại tràng SW620 của các chất
tổng hợp đƣợc.
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Histon deacetylase (HDAC)
Ở gen ngƣời, chuỗi ADN đƣợc gói gọn thành các nucleosom bằng cách
quấn quanh protein histon. Mỗi nucleosom gồm một đoạn ADN chứa 146 cặp
nucleotid kèm theo một octamer histon (hình 1.1). Giữa hai nucleosom liên
tiếp là một đoạn ADN cầu nối (linker ADN).

Hình 1.1: Cấu trúc của nucleosom
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase

Cấu trúc của nucleosom đƣợc giữ vững nhờ tƣơng tác tĩnh điện giữa
nhóm ε–amino lysin của lõi histon (nhóm amin này tích điện dƣơng ngay ở pH
sinh lý của cơ thể) với anion oxy của nhóm phosphat trong chuỗi xoắn kép
ADN, lúc này quá trình sao chép và phiên mã không xãy ra đƣợc.
Để quá trình sao chép và phiên mã xãy ra, nhóm ε–amino lysin bị làm
mất điện tích dƣơng bằng cách gắn thêm một nhóm acetyl, tƣơng tác tĩnh điện
3

không còn, chuỗi ADN tách ra khỏi lõi histon. Quá trình đó đƣợc xúc tác bởi
nhóm enzym histon acetyltransferase (HAT) (hình 1.2).

Ghi chú: Ac: gốc CH
3
COO¯

Hình 1.2: Các enzym chức năng làm thay đổi cấu trúc nucleosom
Histon deacetylase (HDAC) là nhóm enzym xúc tác cho phản ứng
ngƣợc lại, loại bỏ nhóm acetyl khỏi nhóm ε–amino lysin, phục hồi tƣơng tác
tĩnh điện, chuỗi ADN lại quấn chặt vào protein histon, quá trình sao chép,
phiên mã bị ức chế.
Sự cân bằng hoạt động của HAT và HDAC là cơ sở để đảm bảo sự tháo
xoắn, phiên mã diễn ra bình thƣờng.
1.1.2. Mối liên quan giữa HDAC và ung thư
Các nghiên cứu cho thấy mức độ acetyl hóa ảnh hƣởng trực tiếp tới
chức năng cơ bản của tế bào nhƣ quá trình phiên mã, tính di động, biệt hóa
(differentiation), chết theo chu kì của tế bào (apoptosis). Sai khác trong acetyl
hóa do sự gián đoạn hoạt động của các HAT hoặc hoạt động mạnh bất thƣờng
của các HDAC đã đƣợc chứng minh là liên quan tới sự hình thành và tiến
triển ung thƣ 11,27.
Những nghiên cứu quy mô lớn đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã quá

mức là cơ chế chính tạo ra các protein ung thƣ (oncoprotein). Sự biến đổi
4

trong cấu trúc nhiễm sắc thể tác động lên quá trình biệt hóa của các tế bào
bình thƣờng, kết quả dẫn tới hình thành các khối u. Vai trò chức năng của các
HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thƣ đƣợc minh họa trong hình
1.3 16,17,24.

Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư
Cụ thể ngƣời ta thấy sự gia tăng của HDAC1 trong bệnh ung thƣ dạ dày
[6], ung thƣ tuyến tiền liệt [14], ung thƣ đại tràng [31], ung thƣ vú [34] hay
ung thƣ da. Một ví dụ khác, sự gia tăng mạnh HDAC2 đƣợc tìm thấy trong
ung thƣ cổ tử cung [15] và ung thƣ dạ dày [25]. Một số nghiên cứu khác cũng
đã báo cáo về sự gia tăng không kiểm soát của HDAC3 và HDAC6 trong các
mẫu xét nghiệm ở ung thƣ đại tràng và ung thƣ vú [31,35].
Do sự liên quan giữa ung thƣ và hoạt động của các HDAC, thuốc ức
chế enzym này đƣợc kì vọng là sẽ đảo ngƣợc lại quá trình qua các cơ chế
24:
5

- Ức chế chu trình tế bào, hoạt hóa các chƣơng trình biệt hóa.
- Ức chế sự tạo mạch.
- Thúc đẩy sự chết theo chu trình của tế bào.
1.1.3. Phân loại các HDAC
Histon deacetylase (HDAC) là nhóm gồm có 18 enzym, đƣợc phân thành 4
nhóm dựa vào sự tƣơng đồng về cấu trúc với các enzym Rpd3, HdaI và Sir2 của
nấm men 9 (bảng 1.1):
Bảng 1.1: Đặc điểm 11 HDAC “kinh điển”
Nhóm
Loại

Kích thƣớc
(acid amin)
Vị trí gen
mã hóa
Vị trí hoạt động
I
1
482
1p34.1
Nhân
2
488
6q21
Nhân
3
428
5q31.3
Nhân
8
377
Xq13
Nhân/tế bào chất
II
IIa
4
1084
2q37.2
Nhân/tế bào chất
5
1122

17q21
Nhân/tế bào chất
7
912
12q13.1
Nhân/tế bào chất
9
1069
7p12.1
Nhân/tế bào chất
IIb
6
1215
Xp11.22
Tế bào chất
10
669
22q13.3
Tế bào chất
IV
11
347
3p25.2
Nhân/tế bào chất
- Nhóm I: HDAC1, -2, -5, -8, cấu trúc của chúng tƣơng đồng với enzym
Rdp3.
- Nhóm II: HDAC4, -5, -6, -7, -9, -10, cấu trúc của chúng tƣơng đồng
với enzym HdaI và đƣợc chia thành 2 phân nhóm. Phân nhóm IIa: HDAC4, -5,
-7, -9 và phân nhóm IIb: HDAC6, -10.
6

- Nhóm III: các protein Sirtuin điều hòa chuỗi thông tin gồm Sirt1, -2, -3,
-4, -5, -6, -7, cấu trúc của chúng tƣơng đồng với enzym Sir2.
- Nhóm IV: HDAC11, cấu trúc của nó tƣơng đồng với cả enzym Rdp3
và enzym HdaI.
Các HDAC nhóm I, II, IV đƣợc gọi là các HDAC “kinh điển” còn các
HDAC nhóm III đƣợc gọi là các sirtuin. Khác nhau cơ bản giữa các HDAC
“kinh điển” và các sirtuin là ở cơ chế xúc tác, trong khi các HDAC “kinh điển”
có coenzym là ion Zn
2+
thì các sirtuin lại có coenzym là NAD
+

(Nicotinamid

adenin

dinucleotid). Hiện nay các HDAC “kinh điển” đang là một
đích phân tử trong điều trị ung thƣ đƣợc giới nghiên cứu quan tâm, đặc biệt là
các HDAC nhóm II. Do có kích thƣớc lớn nên ngoài 320 acid amin tạo nên phần
túi enzym, phần còn lại đã tạo nên sự khác biệt giữa các HDAC nhóm này với
nhau ở phần miệng túi, tạo cơ sở cho việc thiết kế các chất ức chế HDAC chọn
lọc [9,13,32].
1.1.4. Cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC kinh điển
Cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC lần đầu tiên đƣợc giới
thiệu bởi Finin và đồng nghiệp [12]. Dù có kích thƣớc khác nhau nhƣng các
HDAC đều có chung 320 acid amin đầu N, là phần tạo nên túi enzym. Vì thế
trung tâm hoạt động của chúng tƣơng tự nhau, gồm có các phần cơ bản sau:
- Ngoài cùng là phần miệng túi enzym.
- Tiếp đến là túi enzym, là nơi chứa đựng và tham gia tạo liên kết Van

der Waals với cơ chất. Túi đƣợc cấu tạo bởi các acid amin thân dầu, đặc biệt là
các acid amin có nhân thơm nhƣ: Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin. Cấu
trúc túi khá linh động, có thể thay đổi kích thƣớc để phù hợp với cơ chất trong
phản ứng deacetyl. Ở HDAC nhóm I và II kênh này có chiều sâu khoảng 11Å,
ở gần cuối túi đƣờng kính của nó khoảng 7Å và đƣợc hạn chế bởi hai acid amin
Phenylalanin nằm song song với nhau (hình 1.4).
7

- Ở đáy túi là ion Zn
2+
, chính là coenzym của các HDAC. Đây là phần
tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi lysin bằng các liên kết phối trí.
Thông thƣờng các chất ức chế liên kết càng mạnh với ion Zn
2+
thì hoạt tính
sinh học càng mạnh.

Hình 1.4: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC
1.1.5. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Tƣơng ứng với ba phần cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym, cấu
trúc các chất ức chế HDAC cũng gồm 3 phần A-B-C (hình 1.5):
- Phần A là nhóm khóa hoạt động (capping group): thƣờng có cấu
trúc vòng thơm hoặc các peptid vòng.
- Phần B là vùng cầu nối: là cầu nối hydrocarbon thân dầu mạch thẳng
hay vòng, có thể no hoặc không no để tạo các liên kết Van der Waals với túi
enzym.
8

- Phần C là nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group): là các
nhóm có khả năng tƣơng tác với ion Zn

2+
tại trung tâm hoạt động của các
HDAC. Ngoài nhóm chức acid hydroxamic phần này còn có thể là các nhóm
chức khác nhƣ thiol, o-aminoanilin, mercaptoceton…

Hình 1.5: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC tương tự SAHA
Hầu hết các chất ức chế thuận nghịch HDAC, tuy nhiên có một số chất
có khả năng ức chế không hồi phục, đó là những chất có nhóm kết thúc là một
nhóm ái điện tử (thƣờng là một keto-epoxid) có khả năng tạo liên kết cộng
hóa trị với ion Zn
2+
, chẳng hạn tetrapeptid trapoxin [26].
Cấu trúc tinh thể của các HDAC tƣơng tác với chất ức chế cho thấy
nhóm kết thúc, cầu nối và một phần nhóm khóa hoạt động nằm trong túi
enzym làm lấp đầy khoảng trống trong lòng túi. Phần còn lại của nhóm khóa
hoạt động nằm ở bề mặt, tƣơng tác với phần miệng túi. Việc nghiên cứu thiết
kế cấu trúc của các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này.
1.2. Các chất ức chế HDAC
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC đang thử lâm sàng theo cấu trúc
Hiện nay, hai chất ức chế HDAC là acid suberoylanilid hydroxamic
9

(vorinostat, Zolinza) và romidepsin (depsipeptid, Istodax) đã đƣợc FDA cấp phép
lƣu hành trên thị trƣờng để điều trị u lympho tế bào T dƣới da (cutaneous T-cell
lymphoma). Gần đây, depsipeptid đã đƣợc FDA chấp thuận cho điều trị u limpho
tế bào T ngoại vi (peripheral T-cell lymphoma) [5,21]. Ngoài ra còn khoảng 15
chất ức chế HDAC khác đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác
nhau đƣợc chia thành 4 nhóm dựa theo cấu trúc (bảng 1.2) [10].
Bảng 1.2: Phân loại một số chất ức
chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng

Chất ức chế
HDAC
Công thức cấu tạo
Đích
tác
dụng
(nhóm
HDAC)
Nồng
độ
tác
dụng
Pha
lâm
sàng
Acid Hydroxamic
Trichostatin
A (TSA)
N
CH
3
CH
3
O
NH
OH
CH
3
CH
3

O

I, II, IV
nM
-
Vorinostat
(SAHA)
NH
NH
OH
O
O

I, II, IV
nM
Pha II,
III;
FDA
cấp
phép
(2006)
Givinostat
(ITF2357)
NCH
3
CH
3
O NH
O
O NH

OH

I,II
nM
Pha I,
II
Abexinostat
(PCI-24781)
O
N
CH
3
CH
3
NH
O
O
NH
OHO

I, II, IV
nM
Pha I,
II
10

Belinostat
(PXD101)
NH
S

O
O
NH
OH
O

I, II, IV
μM
Pha I,
II
Panobinostat
(LBH589)
N
H
CH
3
NH
NH
OH
O

I, II, IV
μM
Pha II,
III
Resminostat
(4SC-201)
N
NH
CH

2
OH
S
O
O
N CH
3
CH
3

I, II, IV
μM
Pha I,
II
Quisinostat
(JNJ-
26481585)
NH
OH
O
N
N N
NH
N
CH
3

I,II,IV
μM
Pha I

Peptid vòng
Depsipeptid
(Romidepsin)
NH S
O
CH
3
CH
3
NH
S
O
N
H
CH
3
NH
O
O
O
O

I
nM
Pha I,
II;
FDA
cấp
phép
(2009)

Benzamid
Entinostat
(MS-275)
NH
2
NH
NH O
O
N
O

I
μM
Pha II
11

Mocetinostat
(MGCD0103)
N N
N
O
NH
NH
2

I
μM
Pha I,
II
Acid béo

Acid Valproic
CH
3
OH
CH
3
O

I, II
mM
Pha I,
II, III
Butyrat
CH
3
O
-
O
Na
+

I, II
mM
Pha II
1.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế
HDAC
1.3.1. Ảnh hưởng của cầu nối
a. Ảnh hưởng của chiều dài cầu nối
- Năm 1999 Jung và đồng nghiệp [18] đã tổng hợp các chất ức chế
HDAC có cấu trúc amid ngƣợc tƣơng tự TSA với sự thay đổi chiều dài cầu

nối (bảng 1.3). Kết quả thử tác dụng cho thấy các hợp chất này ức chế cả
histon deacetylase ngô (HD-2) và HDAC của tế bào gan chuột. Nghiên cứu
này chỉ ra rằng các chất có chiều dài cầu nối từ năm tới sáu nhóm methylen có
tác dụng mạnh nhất (chất 1c và 1d).
Bảng 1.3: Hoạt tính của các chất tương tự TSA
R
O
N
NH
CH
3
OH
n
1 (a-e)

Hợp chất
R
N
HD-2 IC
50

(nM)
HDAC IC
50

(nM)
12

TSA
3

26
1a
Me
2
N
3
>40000
-
1b
Me
2
N
4
2000
>10000
1c
Me
2
N
5
100
244
1d
Me
2
N
6
100
46
1e

Me
2
N
7
300
145
- Trong một nghiên cứu khác, dựa trên cấu trúc của oxamflatin, Delorme
và đồng nghiệp 29 đã phát triển các chất ức chế HDAC trên cơ sở acid
hydroxamic sulfonamid (bảng 1.4).
Bảng 1.4: Hoạt tính của các dẫn chất sulfonamid hydroxamic acid
S
O
O
NH
NH
O
OH
Oxamflatin
S
O
O
NH
R NH
OH
O
2 (a-d)

Hợp chất
R
HDAC IC

50
(nM)
TSA
5
2a
-CH
2
-
1000
2b
-(CH
2
)
2
-
100
2c
-(CH
2
)
3
-
1000
2d
-CH=CH-
200
Các chất tổng hợp đƣợc đã cho tác dụng ức chế HDAC ngay ở nồng độ
nanomol. Đánh giá mối liên quan cấu trúc tác dụng tăng sinh khối u ở in vivo
của nghiên cứu cũng cho thấy, chiều dài cho tác dụng tốt nhất của cầu nối là
năm tới sáu nhóm methylen (chất 2b và 2d).

b. Ảnh hưởng của cấu trúc cầu nối
- Để hiểu đƣợc vai trò của nhóm thế methyl và liên kết olefin, dựa trên
13

cấu trúc của TSA các hợp chất 3a, 3b và 3c (hình 1.6) đƣợc Van OK 30 tổng
hợp và đánh giá khả năng ức chế HDAC. Việc bổ sung một nhóm methyl (3b)
và hai liên kết đôi cùng một nhóm methyl (3c) đã làm giảm hoạt tính tƣơng
ứng là 2,3 và 33 lần (so với 3a).
N
CH
3
CH
3
O
NH
NH
CH
3
O
OH
N
CH
3
CH
3
O
NH
NH
CH
3

O
OH
N
CH
3
CH
3
O
NH
NH
O
OH
N
CH
3
CH
3
O
CH
3
NH
O
OH
CH
3
Trichostatin A
HDAC IC
50
= 12 nM
3a

HDAC IC
50
= 152 nM
3b
HDAC IC
50
= 359 nM
3c
HDAC IC
50
= 12187 nM

Hình 1.6: Ảnh hưởng của cấu trúc cầu nối tới hoạt tính ức chế HDAC
- Với cầu nối là 1,4-cyclohexylen hoặc 1,4-phenylen và nhóm nhận
diện bề mặt là một nhóm thế 2 vòng thơm của 2 dẫn chất 4a và 4b, Uesato và
đồng nghiệp đã báo cáo kết quả thử hoạt tính HDAC 29. Họ nhận thấy rằng
chất chứa vòng phenylen (4a) có tác dụng ức chế mạnh hơn nhiều so với chất
chứa vòng cyclohexylen (4b) (hình 1.7).
NH
O
O
NH
OH
NH
O
CH
2
NH
OH
4a

HDAC IC
50
= 44 nM
4b
HDAC IC
50
= 2000 nM

Hình 1.7: Chất ức chế HDAC có cầu nối là
1,4-cyclohexelen và 1,4-phenylen (4a, 4b)
14

1.3.2. Ảnh hưởng của nhóm khóa hoạt động
- Curtin và đồng nghiệp 7 đã báo cáo các chất ức chế HDAC 5a, 5b
với nhóm nhận diện bề mặt là succinimid (hình1.8). Kết quả cho thấy, nhóm
nhận diện bề mặt là succinimid mạch thẳng (5a) có tác dụng yếu hơn
succinimid mạch vòng (5b) rất nhiều lần.
O
CH
3
CH
3
CH
3
O
O
CH
3
CH
3

N
H
N
O
H
NH
OH
O
O
5
5a
HDAC IC
50
= 2100 nM
O
N
N
O
H
NH
OH
O
O
O
CH
3
CH
3
5
5b

HDAC IC
50
= 38 nM

Hình 1.8: Acid hydroxamic có nhóm nhận diện bề mặt là succinimid
1.4. Các acid hydroxamic đã đƣợc thiết kế tổng hợp trong nƣớc
Ở trong nƣớc, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc-Trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác dụng sinh học của
một số acid hydroxamic mới hƣớng ức chế histon deacetylase dựa trên cấu
trúc của SAHA [3,8,22]. Hình 1.9 mô tả một số cấu trúc của các acid
hydroxamic đã đƣợc tổng hợp.
15

N
S
N
NH
NH
OH
O
O
6
R
N
S
R
NH
NH
OH
O

O
N
O
NH
OH
O
OH
R
N
S
R
NH
NH
OH
O
O
4
6
6 (a-c)
8
9
7 (a-b)

Hình 1.9: Cấu trúc chung của một số
dãy chất đã được nghiên cứu và công bố
Nghiên cứu đã mang lại kết quả khả quan, nhiều chất tổng hợp đƣợc có
tác dụng rất tốt khi thử khả năng ức chế HDAC, độc tính tế bào in vitro trên
một số dòng tế bào ung thƣ [3,8,22] (bảng 1.5).
Bảng 1.5: Tác dụng sinh học của một số chất ức chế
HDAC đã được thiết kế, tổng hợp tại Việt Nam

Hợp
chất
R
Độc tính tế bào IC
50
(μM)/dòng tế bào
SW620
MCF-7
PC3
AsPC-1
NCI-H460
SAHA
3,70
6,42
4,31
3,66
2,77
6a
2-Cl
0,34
1.23
0,42
0.63
0,11
6b
3-Cl
0,45
1,23
1,76
1.10

1,94
6c
4-OCH
3
1.46
2,46
1,63
0,80
1,97
7a
5-F
0,11
1,55
2.73
1,72
1,50
7b
5-Br
0,29
1,77
2,21
0,08
0,97
1.5. Thiết kế cấu trúc các chất dự kiến tổng hợp
9a (hình 1.10) là một trong số các chất đã đƣợc thiết kế, tổng hợp bởi
nhóm thực nghiệm tại bộ môn Hóa Dƣợc. Cấu trúc của 9a đƣợc thiết kế dựa
trên cấu trúc của SAHA, bằng cách giữ nguyên cấu trúc cầu nối và thay
khung benzen ở phần nhận diện bề mặt bằng khung benzothiazol.
16

S
N
NH
NH
O
O
OH
6
9a

IC
50
= 4,01 (µg/ml)
Hình 1.10: Acid hydroxamic mang khung benzothiazol
Kết quả thử hoạt tính của 9a thu đƣợc là khá tốt. Do đó 2 acid
hydroxamic I và II đƣợc thiết kế, tổng hợp để tiếp tục khảo sát hai khung
nhận diện mới là khung benzimidazol và khung indolin.
IV
N
NH
OH
O
III
N
NH
OH
O
II
N
NH

OH
O
O
N
H
N
NH
NH
O
O
OH
I

Hình 1.11: Cấu trúc hóa học của các chất dự kiến tổng hợp
Tiếp đến, để hiểu hơn về vai trò của nhóm C=O trong cầu nối của
SAHA acid hydroxamic III đƣợc thiết kế tổng hợp. Cấu trúc của chất III chỉ
khác cấu trúc của chất II ở chổ không có nhóm C=O trong cầu nối.
Chất IV vẫn mang khung nhận diện là indolin và sử dụng cầu nối
cinnamat của Panobinostat (hoạt chất đang đƣợc mở rộng thử nghiệm lâm
sàng bởi hãng dƣợc phẩm Novartis). Chất IV đƣợc thiết kế tổng hợp nhằm
khảo sát hoạt tính của cầu nối cinnamat này.




17


Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Hóa chất và nguyên liệu dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng
trong tổng hợp đƣợc nhập từ công ty Merck và Sigma-Aldrich. Hóa chất này
đƣợc sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm.
2.1.1.1. Hóa chất chính
 2-aminobenzimidazol
 Indolin
 Acid monomethyl suberic
 CDI
 Methyl-7-bromoheptanoat
 Hydroxylamin hydroclorid
 Methyl-3-(4-bomomethyl) cinamat
2.1.1.2. Các dung môi hóa chất khác
 DMF
 Aceton
 Acid acetic băng
 Dicloromethan
 Methanol
 K
2
CO
3

 Ethanol
 NaOH
 HCl
 Nƣớc cất
 KI
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

 Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh
hàn hồi lƣu, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, bình chạy sắc kí lớp mỏng.
 Máy khuấy từ gia nhiệt.
 Máy cất quay chân không Buchi R-210.
 Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu.