xây dựng phương pháp định lượng natri hyaluronat trong dung dịch thuốc nhỏ mắt bằng quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG VINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH
THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG VINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH
THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI – 2019


MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...........................................................................
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................
DANH MỤC HÌNH .........................................................................................
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CHƯƠNG I .................................................................................................... 3
TỔNG QUAN ................................................................................................ 3
1.1.

TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................. 3

1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc tính hóa lý của natri hyaluronat .................. 3
1.1.2. Tác dụng của natri hyaluronat ............................................................ 4
1.1.3. Công thức bào chế của thuốc nhỏ mắt chứa SH .................................. 6
1.1.4. Công thức một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH trên thị trường .. 8
1.1.5. Tình hình nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng natri
hyaluronat……............................................................................................... 9
1.2.

TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DÙNG

TRONG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 12
1.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS ...................................... 12
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................. 15
CHƯƠNG II................................................................................................. 22
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 22
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ ..................................... 22
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 22
2.1.2. Dung môi, hóa chất........................................................................... 22
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................... 23
2.2.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 24

2.3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 24

2.3.1. Phương pháp HPLC.......................................................................... 24
2.3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV - VIS....................................... 25
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích.................................................... 27


2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................ 29
CHƯƠNG III ............................................................................................... 31
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ................................................................. 31
3.1.

KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH ................ 31

3.1.1. Sắc ký lọc gel (GFC) ........................................................................ 31
3.1.2. Sắc ký pha đảo (RP – HPLC) ........................................................... 33
3.1.3. Quang phổ hấp thụ UV – VIS ........................................................... 38
3.2.

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SH TRONG

THUỐC NHỎ MẮT ESKAR TEAR ............................................................ 42
3.2.1. Sắc ký lọc gel (GFC) ........................................................................ 42
3.2.2. Sắc ký pha đảo (RP – HPLC) ........................................................... 49
3.2.3. Quang phổ hấp thụ UV - VIS ........................................................... 55
3.3.

ÁP DỤNG CÁC QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG

SH TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT ..... 59
3.3.1. Xác định hàm lượng SH bằng GFC. ................................................. 59
3.3.2. Xác định hàm lượng SH bằng RP - HPLC ........................................ 61
CHƯƠNG IV ............................................................................................... 63
BÀN LUẬN ................................................................................................. 63
4.1.

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV - VIS .................... 63

4.2.

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ............................................................... 63

4.3.

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG

SH TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ............................................................. 66
4.4. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG .................................................................... 66
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 68
KẾT LUẬN .................................................................................................. 68
ĐỀ XUẤT .................................................................................................... 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 70
Tiếng Việt .................................................................................................... 70
Tiếng Anh .................................................................................................... 70
Trang Web ................................................................................................... 72


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ACN:

Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of official analytical chemists

cs:

Cộng sự

DAD:

Detector mảng diod (Diod Array Detector)

GFC

Sắc ký lọc gel (Gel filtration chromatography)

HA:

Acid hyaluronic

HPLC:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

ICH:

Tổ chức hòa hợp quốc tế (international conference on
harmonisation)

Mw:

Trọng lượng phân tử (Molecular weight)

NSAIDS:

Thuốc chống viêm không steroid (Non - steroid anti - inflammtory drugs)

NSX:

Nhà sản xuất

PA:

Tinh khiết dùng để phân tích (Purity analysis)

Quang phổ

Quang phổ hấp thụ hấp thụ UV – VIS

RP - HPLC

Sắc ký pha đảo (Reversed – phase high performance liquid
chromatography)

RSD:

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SEC:

Sắc ký rây phân tử (Size exclusion chromatography)

SH:

Natri hyaluronat (Sodium hyaluronate)

SKĐ:

Sắc ký đồ

STT:

Số thứ tự

TLTK:

Tài liệu tham khảo


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số chế phẩm dung dịch thuốc nhỏ mắt trên thị trường ............. 8
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch natri perclorat
tới thời gian lưu và hệ số As của pic SH ....................................................... 36
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian Carbazol phản ứng đến
độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ................................................................... 39
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung dịch Carbazol phản
ứng đến độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ..................................................... 40
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống GFC ...................... 44
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính bằng GFC ............................ 45
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng bằng GFC ............................................ 47
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ chính xác bằng GFC .................................... 48
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống RP - HPLC ............ 51
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính bằng RP - HPLC ................ 52
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng bằng RP - HPLC ............................... 53
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ chính xác bằng RP - HPLC ........................ 55
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống quang phổ UV - VIS.
..................................................................................................................... 56
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu bằng quang phổ UV – VIS. ......... 57
Bảng 3.15. Kết quả so sánh giá trị trung bình hàm lượng SH trong thuốc nhỏ
mắt Eskar tears bằng GFC và RP – HPLC ................................................... 58
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát hàm lượng SH bằng GFC ................................ 59

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát hàm lượng SH bằng RP - HPLC. ..................... 61
Bảng 4.18. So sánh phương pháp xây dựng với phương pháp công bố. ........ 64
Bảng 4.19. Kết quả khảo sát định lượng SH trong một số chế phẩm bằng GFC
và RP - HPLC. ............................................................................................. 66


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của acid hyaluronic .............................................. 3
Hình 2.2. Cơ chế phản ứng trong quy trình định lượng SH bằng phương pháp
quang phổ UV – VIS ..................................................................................... 26
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa pH pha động với hệ số kéo
đuôi As của pic SH ....................................................................................... 31
Hình 3.4. Phổ UV – VIS với detector DAD của pic SH tách bằng cột gel ..... 32
Hình 3.5. SKĐ của SH trong dung dịch mẫu chuẩn (a) và dung dịch mẫu thử
(b) tách bằng phương pháp GFC.................................................................. 33
Hình 3.6. SKĐ của natri hyaluronat khảo sát bằng cột C8 ........................... 34
Hình 3.7. SKĐ của natri hyaluronat khảo sát bằng cột Phenomenex Luna C18
(250 x 4,6 mm; 5 µm) ................................................................................... 35
Hình 3.8. SKĐ của natri hyaluronat khảo sát bằng cột Phenomenex Luna C18
(250 x 4,6 mm; 5 µm) với hệ pha động 1 và hệ pha động 2 .......................... 36
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ pha động với hệ số
As của pic SH ............................................................................................... 36
Hình 3.10. SKĐ của dung dịch mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b) sử dụng cột C18
..................................................................................................................... 38
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa thời gian phản ứng của
Carbazol đến độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ............................................. 39
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa thể tích Carbazol phản ứng
đến độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ............................................................ 40
Hình 3.13. SKĐ của dung dịch chuẩn (a), thử (b), thử thêm chuẩn (c) và

placebo (d) trong GFC ................................................................................. 44
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic SH bằng GFC. ................................................................................. 46
Hình 3.15. SKĐ của dung dịch chuẩn (a), thử (b), thử thêm chuẩn (c) và


placebo (d) trong RP - HPLC ....................................................................... 51
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic SH bằng RP - HPLC. ....................................................................... 53
Hình 3.17. Sắc ký đồ Sanlein (a), Hylene (b) và Samca (c) trong GFC......... 60
Hình 3.18. Sắc ký đồ Sanlein (a), Hylene (b) và Samca (c) trong RP - HPLC.
..................................................................................................................... 62


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng
natri hyaluronat trong dung dịch thuốc nhỏ mắt bằng quang phổ và sắc ký
lỏng hiệu năng cao”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết
mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ từ phía gia đình, thầy
cô, đồng nghiệp, bạn bè và nhà trường.
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
PGS .TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – người thầy đã tận tình dìu dắt chỉ
bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
ThS. Trần Thúy Hạnh – người đã tận tình chỉ bảo và đóng góp nhiều ý
kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các anh chị em khoa Dược lý, ban
lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện
cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà

Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Từ đáy lòng mình, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình thân
yêu của tôi, cảm ơn những người bạn thân thiết đã khích lệ, giúp đỡ tôi trong
quá trình nghiên cứu.
Với vốn kiến thức còn hạn chế của bản thân, chắc chắn luận văn còn
nhiều thiếu sót. Vì vậy, rất mong các thầy cô bỏ qua. Tôi hy vọng sẽ nhận
được những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô nhằm nâng cao kiến
thức của bản thân và phục vụ tốt cho quá trình công tác của tôi sau này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 03 năm 2019

Nguyễn Thị Hồng Vinh


ĐẶT VẤN ĐỀ
Natri hyaluronat (SH) là muối natri của acid hyaluronic, có bản chất là
một glycosaminoglycan bao gồm nhiều phân tử disaccharid của D – glucuronic acid và N – acetyl – D – Glucosamine liên kết với nhau [20],[24]. SH được
chiết xuất từ vi khuẩn và mào gà. Trong cơ thể, SH được hình thành bởi
nguyên bào sợi và được phân bố rộng rãi trong các mô liên kết, biểu mô và
thần kinh. Nồng độ SH trong cơ thể tăng cao trong trường hợp viêm hoạt dịch
và giảm sự dị hóa do suy thận [20].
Trong mỹ phẩm, SH giúp làm giảm nếp nhăn và tăng cường độ ẩm cho
da do có khả năng giữ nước. Trong y học, SH được dùng làm thuốc bôi ngoài
để làm tăng khả năng hấp thu qua da của các hoạt chất phối hợp [15], dùng
điều trị chứng đau trong thoái hóa khớp gối cho người dùng liệu pháp không
dùng thuốc và các trường hợp dùng thuốc giảm đau thông thường khác không
có hiệu quả [5]. Đặc biệt SH ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các bệnh
lý về mắt như phẫu thuật cấy ghép giác mạc, đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp
và bong võng mạc, điều trị triệu chứng khô mắt, làm dịu và bôi trơn bề mặt

mắt, tăng cường độ ẩm cho mắt…[15]. Hiện nay, đã có một số chế phẩm
thuốc nhỏ mắt chứa SH đã được đăng ký lưu hành tại Việt Nam như: Hylene,
Unihy, Salein …Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng các chế phẩm chứa SH,
đặc biệt là chế phẩm thuốc nhỏ mắt còn gặp nhiều khó khăn do ảnh hưởng bởi
sự có mặt của các protein, enzym [21]. Mặt khác do cấu trúc của SH là một
polymer có phân tử lượng lớn nên việc chia tách các phân tử trong dung dịch
gặp nhiều khó khăn hơn so với các hợp chất khác. Xuất phát từ những lý do
trên nhằm mục đích tìm ra phương pháp định lượng SH trong thuốc nhỏ mắt
có độ chính xác cao, ổn định và phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của
nhiều phòng thí nghiệm nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương
pháp định lượng natri hyaluronat trong dung dịch thuốc nhỏ mắt bằng
quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao “. Mục tiêu của đề tài bao gồm:

1


1. Xây dựng phương pháp định lượng natri hyaluronat trong thuốc nhỏ mắt
bằng quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2. Sử dụng các phương pháp đã xây dựng để định lượng natri hyaluronat
trong một số chế phẩm dung dịch thuốc nhỏ mắt đang lưu hành trên thị
trường.

2


CHƯƠNG I
TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc tính hóa lý của natri hyaluronat
Natri hyaluronat (hyaluronan) là muối natri của acid hyaluronic có

công thức phân tử là (C14H20NNaO11)n [22, 24]. HA thuộc nhóm
glycosaminoglycan, mạch thẳng không phân nhánh bao gồm nhiều phân tử
disaccharid lặp đi lặp lại với nhau. Các disaccharid được tạo thành bởi các
monosaccharid gồm D – glucuronic acid và N – acetyl – D – Glucosamine,
các monosaccharid này được liên kết với nhau thông qua liên kết glucosid ở
vị trí β - (1→4) của phân tử D – glucuronic acid và vị trí β - (1→3) của N –
acetyl – D – Glucosamine [18, 27]. Cả hai loại đường đều liên quan đến cấu
trúc không gian của glucose, trong cấu hình beta cho phép tất cả các nhóm
cồng kềnh bao gồm: nhóm hydroxyl, nhóm carboxylate, và cacbon anomer
nằm ở vị trí xích đạo thuận lợi về mặt kỹ thuật trong khi tất cả các nguyên tử
hydro đều chiếm giữ vị trí ít thuận lợi hơn. Do đó, cấu trúc của disaccharide
có năng lượng rất ổn định [18].

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của acid hyaluronic
Một chuỗi đại phân tử SH có trọng lượng phân tử khoảng 10 triệu Da
chứa 25.000 đơn vị disaccharid, được liên kết với nhau bằng liên kết kỵ
nước. Các chuỗi polysaccharid thẳng, không phân nhánh và có cấu trúc xoắn.

3


Các liên kết hydro nội phân tử có một vai trò lớn trong sự hình thành của
HA. Trong dung dịch, các phân tử nước xung quanh HA hình thành các liên
kết hydro khác. Trong điều kiện sinh lý, HA với anion carboxyl có khả năng
liên kết một lượng nước lớn vì vậy dung dịch HA 2% có thể liên kết 98%
nước bằng cách tạo thành gel. Chiều dài chuỗi polysaccharid và trọng lượng
phân tử của HA rất khác nhau trong các mô khác nhau. Trong các mô bình
thường, một phân tử HA (10 triệu Da) có độ dày 1nm và chiều dài 25 µm.
Trong tử cung, HA có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 6 đến 12 triệu
Da. Trọng lượng phân tử của HA là khoảng 7 triệu Da ở các khớp khỏe mạnh

và 4,8 triệu Da ở các khớp không khỏe mạnh [17]. Trọng lượng phân tử của
SH tinh khiết khoảng từ 500.000 đến 3.900.000 [24]. Dung dịch SH 0,5%
trong nước có pH khoảng 5,0 đến 8,5 [23]. Khi pH < 3, các nhóm carboxyl bị
proton hóa và HA tạo thành một loại gel không tan trong nước [17]. SH là
chất duy nhất thuộc nhóm glycosaminoglycan không có nhóm sulfat [20, 27].
HA là một phân tử rất không ổn định và nhạy cảm với nhiệt. Nếu dung dịch
HA được đun nóng lên đến 100ºC thì liên kết giữa các chuỗi sẽ bị hỏng do đó
Mw và độ nhớt của dung dịch giảm. HA bị thủy phân bởi enzyme
hyaluronidase [17, 18].
SH là bột hay hạt kết tinh màu trắng hoặc nhiều sợi. Tan ít trong nước, tan
nhiều hơn khi đun nóng, không tan trong ethanol và acetone. Nhiệt độ nóng
chảy trên 209oC [2, 3, 24].
1.1.2. Tác dụng của natri hyaluronat
Năm 1934, lần đẩu tiên Karl Meyer và John Palmer đã phân lập HA từ
thủy tinh thể của mắt bò. Năm 1942, Endre Balazs xin cấp bằng sáng chế để
sử dụng HA thay thế cho lòng trắng trứng trong các sản phẩm bánh. Đến cuối
những năm 1950, ứng dụng y tế đầu tiên của hyaluronan cho con người dùng
để thay thế thủy tinh thể trong phẫu thuật mắt [18]. Cuối những năm 1970 đầu
những năm 1980, SH được tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng

4


trong điều trị viêm xương khớp trên ngựa và người với thương phẩm là Hylartin và Hylartin Vertused. Năm 1980, biệt dược đầu tiên được bán ra ngoài thị
trường là Healon do công ty Endre Alexander Balazs phát triển và được sản
xuất bởi công ty Dược AB ở Thụy Điển. Năm 1986, SH ở dạng thuốc tiêm
dùng để điều trị viêm xương khớp đầu gối với biệt dược là Hyalart/Hyalgan
của Fidia (Ý) được ra đời [29], từ đó đến nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ
của ngành Dược, nhiều biệt dược của SH đã ra đời với nhiều dạng bào chế
khác nhau như: gel, kem, thuốc viên, thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt.

Trong cơ thể, HA được phân bố trong các mô mềm và dịch nội bào bao
gồm thủy dịch và thủy tinh dịch, hoạt dịch. Nó là một thành phần cơ bản của
chất nền hoặc chất kết dính xung quanh tế bào [19]. Do đó tác dụng của SH
cũng ngày càng được mở rộng trên nhiều cơ quan khác nhau cụ thể như sau:
Tác dụng trên mắt: SH được dùng hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh
thể, phẫu thuật khúc xạ (kính nội nhãn), phẫu thuật ghép giác mạc và tăng
nhãn áp [15]. Một dung dịch nhớt của SH được sử dụng trong quá trình phẫu
thuật mắt bằng cách cho dung dịch này trước hoặc sau một cái khoang thông
qua một ống thông nhỏ hoặc một đầu kim để các mô mềm có thể tách ra trong
quá trình phẫu thuật nhằm tránh bị tổn thương. Dung dịch nhỏ mắt SH 0,1%
hoặc 0,2% thông thường được sử dụng trong bệnh khô mắt, một nghiên cứu
cho thấy dung dịch SH này có tác dụng làm giảm nhẹ các triệu chứng và tăng
ổn định màng nước mắt so với dung dịch muối – dung dịch placebo. Tuy
nhiên, ở một nghiên cứu khác lại không chứng minh được tính vượt trội hơn
của dung dịch SH với dung dịch muối, mặc dù nghiên cứu cũng cho thấy rằng
SH có thể đóng vai trò trong việc duy trì thể trạng tốt của biểu mô giác mạc
[19].
Tác dụng trên xương khớp: Trong bệnh thoái hóa khớp, nồng độ và
kích thước của HA tự nhiên trong dịch khớp giảm, để điều trị bệnh này người
ta tiêm vào khớp gối dung dịch nhớt HA hoặc dẫn chất của chúng, dung dịch

5


này đóng vai trò như một dung dịch thẩm thấu tạm thời thay thế hoạt dịch,
liều dùng thay đổi, tuy nhiên thường tiêm liều 20 – 25 mg một lần 1 tuần,
trong vòng 5 tuần hoặc 30 mg một tuần trong 3 – 4 tuần. Liệu trình điều trị
thông thường không nên nhắc lại trong vòng 6 tháng, tác dụng giảm đau có
thể kéo dài từ 1 đến 6 tháng nhưng có thể kèm theo việc tăng viêm khớp trong
thời gian ngắn [5, 15]. Một vài nghiên cứu đã cho thấy việc tiêm dung dịch

thẩm thấu nhớt có thể hiệu quả đối với bệnh nhân không thể uống NSAIDs
hoặc thường xuyên tiêm corticosteroid vào khớp và những người không phù
hợp trong việc thay khớp mặc dù cần phải xem xét tới sự thay đổi trong đáp
ứng lâm sàng giữa các sản phẩm cũng như sự thay đổi, đánh giá và thời gian
điều trị [19]
Tác dụng làm lành vết thương: SH có thể kích thích sự di chuyển và
tăng sinh tế bào biểu mô giác mạc dẫn đến làm lành nhanh chóng v`ết thương
giác mạc. Kết quả từ nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng SH làm tăng tỷ lệ
làm lành, giảm diện tích vết thương và cải thiện tổn thương bề mặt nhãn cầu
[28]. Tác dụng thúc đẩy quá trình làm lành vết thương của HA còn được dùng
tại chỗ để chữa trị các tổn thương ở niêm mạc miệng, một màng mỏng chứa
SH và Carmellose được sử dụng để ngăn cản sự bám dính sau phẫu thuật [19].
Tác dụng trên bàng quang: SH được đưa vào bàng quang để thay thế
tạm thời lớp glycosaminoglycan trong bàng quang để chữa trị các triệu chứng
của viêm kẽ bọng đái [19].
Tác dụng trên da: HA được sử dụng làm mờ đi các nếp nhăn trên mặt
[15,19, 20], tiêm dưới da nhằm điều chỉnh thiếu hụt thể tích liên quan đến tuổi
tác ở má, nâng cơ mặt giữa ở người lớn trên 21 tuổi [15]. Ngoài ra, HA còn
được kết hợp với diclofenac ở dạng thuốc gel dùng bôi ngoài để chữa bệnh
dày sừng quang hóa [19].
1.1.3. Công thức bào chế của thuốc nhỏ mắt chứa SH
Một số thành phần chính của thuốc nhỏ mắt bao gồm:

6


Chất làm tăng độ nhớt
Làm tăng độ nhớt của các thuốc nhỏ mắt bằng các polymer tan trong nước có
tác dụng cản trở tốc độ rút và rửa trôi liều thuốc đã nhỏ vào mắt, kéo dài thời
gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc, giữ nước, tăng cường độ nhớt và duy

trì độ ẩm trên bề mặt nhãn cầu, tránh tình trạng khô mắt [2]. Ngoài ra, các
chất làm tăng độ nhớt còn có tác dụng thúc đẩy quá trình lành vết thương biểu
mô giác mạc và phòng ngừa bệnh khô giác mạc. Một số chất tăng độ nhớt
thường gặp là: Hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), carboxymethylcellulose (CMC), polyethylen glycol, propylen glycol, hyaluronic acid, carbomer,
glycerin…[2].
Chất sát khuẩn
Mặc dù nước mắt có men Lysozym có tác dụng sát khuẩn nhẹ, nhưng khả
năng ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn từ môi trường vào mắt cũng rất hạn chế. Nếu
nhỏ vào mắt một chế phẩm thuốc nhỏ mắt không vô khuẩn thì có thể gây ra
nhiều nhiễm khuẩn nghiêm trọng ở mắt. Để đảm bảo an toàn trong sử dụng,
các thuốc nhỏ mắt phải là các chế phẩm vô khuẩn, tuy nhiên do thuốc nhỏ mắt
thường được đóng gói với thể tích dùng nhiều lần mới hết một đơn vị đóng
gói. Chính do cách sử dụng đặc biệt này nên nguy cơ thuốc nhỏ mắt bị nhiễm
khuẩn từ môi trường sau mỗi lần nhỏ thuốc rất cao. Để giữ cho thuốc luôn vô
khuẩn, trong thành phần thuốc nhỏ mắt bao giờ cũng có thêm một hay nhiều
chất sát khuẩn (trừ các trường hợp chống chỉ định), chất sát khuẩn trong thuốc
có tác dụng diệt ngay các vi sinh vật ngẫu nhiên rơi vào thuốc sau mỗi lần nhỏ
thuốc [2]. Xét theo sự có mặt của chất sát khuẩn thì nước mắt nhân tạo có 3
loại: Nước mắt nhân tạo có chất sát khuẩn, nước mắt nhân tạo có chất sát
khuẩn có thể tự phân hủy thành các chất không độc với bề mặt nhãn cầu khi
nhỏ vào mắt và nước mắt nhân tạo không có chất sát khuẩn. Các chất sát
khuẩn thường gặp trong nước mắt nhân tạo là: Benzalkonium chloride (BAC)
0,005% - 0,01% (là chất bảo quản rất thông dụng).

7


Chất điều chỉnh pH: Có hai hệ hay được sử dụng trong nước mắt nhân
tạo chứa SH là hê đệm phosphate hay còn gọi là hệ đệm Sorensen được pha từ
muối natri dihydro phosphate và dinatri hydro phosphate hoặc được pha từ

muối natri dihydro phosphate và natri hydroxyd theo những tỷ lệ khác nhau
để tạo ra các dung dịch đệm có pH khác nhau (pH có thể thay đổi từ 5,9 – 8,0)
và hệ đệm citric – citrat được pha từ acid citric và muối citrat hoặc từ acid citric và natri hydroxyd với tỷ lệ khác nhau. Riêng với hệ đệm citric – citrat
ngoài tác dụng điều chỉnh pH, hệ đệm này còn có tác dụng khóa các ion kim
loại nặng nên thích hợp cho các thuốc nhỏ mắt có dược chất dễ bị oxy hóa [2].
Chất đẳng trương: Các chất đẳng trương thường dùng trong dung dịch
thuốc nhỏ mắt là: natri clorid, kali clorid [2].
Chất chống oxy hóa: Trong nước mắt nhân tạo chất chống oxy hóa hay
được dùng là muối dinatri edetat với nồng độ 0,01 – 0,3%. Dinatri edetat có
tác dụng khóa các ion kim loại hóa trị 2 hay 3 dưới dạng phức chelat, làm mất
tác dụng xúc tác của các ion này đối với quá trình oxy hóa dược chất. Ngoài
ra, sự phối hợp edetat trong thuốc nhỏ mắt còn có tác dụng tăng cường hiệu
quả sát khuẩn của các chất sát khuẩn như benzalkonium clorid [2].
1.1.4. Công thức một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH trên thị trường
Hiện nay, trên thị trường dược phẩm nước ta đang lưu hành một số chế
phẩm chứa SH với công thức bào chế khác nhau:
Bảng 1.1. Một số chế phẩm dung dịch thuốc nhỏ mắt trên thị trường
TT Tên thuốc

Nhà sản

Hàm

xuất

lượng

Santen
1

Tá dược

Acid Ɛ- Aminocaproic, dinatri

Sanlein

pharmaceut-

1,0

edetat hydrat, propylen glycol,

0.1

ical co.,Ltd.

mg/ml

natri clorid, benzalkonium clo-

(Nhật Bản)

rid, natri hydroxyd, acid hy-

8


drocloric loãng và nước tinh
khiết
Acid Ɛ- Aminocaproic, dinatri

2

Hylene

Binex

1,0

edetat, benzalkonium clorid, di-

Co.,Ltd.

mg/ml

natri hydrophosphat, natri dihy-

(Hàn Quốc)

drophosphat, natri clorid, kali
clorid, natri hydroxyd, acid hydrocloric và nước vô khuẩn

Thành phần tá dược chủ yếu có trong thuốc nhỏ mắt chứa SH là các hệ
đệm phosphate, hoặc hệ đệm citric- citrate, chất chống oxy hóa edetat, chất
sát khuẩn benzalkionium clorid, các chất đẳng trương natri clorid, kali clorid
vì vậy trong phương pháp định lượng SH phải lựa chọn phương pháp, hóa
chất, dung môi không tương tác với các thành phần có trong chế phẩm.
Hiện nay, một số công ty Dược Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu phát
triển sản phẩm nước mắt nhân tạo chứa SH như công ty Cổ phần Traphaco
đang nghiên cứu xây dựng công thức thuốc nhỏ mắt Samca với hàm lượng
hoạt chất SH là 5mg SH/5ml, tá dược bao gồm: Benzalkonium clorid, natri

clorid, Acid boric, natri borat, dinatri edetat, borneol, menthol, ethanol 96%,
nước cất). Thuốc nhỏ mắt Eskar tear do công ty Cổ phần Dược khoa nghiên
cứu với công thức: hoạt chất: SH (5mg/5ml), tá dược: Acid Ɛ- Aminocaproic,
dinatri edetat, acid boric, natri borat, benzalkonium clorid, natri clorid, kali
clorid, glycerin, natri hydroxyd hoặc acid hydrochloric (để điều chỉnh pH về
6,0 – 8,0) và nước tinh khiết vừa đủ.
1.1.5. Tình hình nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng natri
hyaluronat
Tình hình nghiên cứu trong nước
Võ Hoài Bắc và cộng sự đã xác định hàm lượng acid Hyaluronic trong
một số phế phụ liệu ba loại cá theo phương pháp của Reissig et al. (1955). HA

9


tách chiết từ các nguồn khác nhau được thủy phân bằng hyaluronidase. Dịch
màu sau phản ứng được đo quang phổ ở bước sóng 585 nm [8].
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Dược điển Anh 2018 [22], dược điển Châu Âu 2016 [23], Dược điển
Hàn Quốc X năm 2012 [25] chỉ có chuyên luận nguyên liệu SH, phương pháp
định lượng SH bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS, sản phẩm tạo
thành sau khi phản ứng với Carbazol ở bước sóng 530 nm.
Dược điển Nhật XVII năm 2016 [24] định lượng SH trong chuyên luận
nguyên liệu và thuốc tiêm cũng thông qua phản ứng giữa acid D - glucuronic
với carbazol, sản phẩm tạo thành đo độ hấp thụ ở bước sóng 530 nm. Tuy
nhiên, trong chuyên luận thuốc nhỏ mắt thì sử dụng phương pháp GFC với cột
kích thước 300 x 7,8 mm, cột nhồi porous polymethacrylat, thể tích tiêm 20
µl, detector UV ở 210 nm, nhiệt độ cột 40oC, pha động là 32,3g Na2SO4.10H2O

trong 1000 ml nước, tốc độ dòng điều chỉnh để thời gian lưu của SH

khoảng 5 phút .
Trong Dược điển Mỹ 41 năm 2018 chưa có chuyên luận nào về SH
[26].
Năm 2017, Zanelle viktor đã nghiên cứu định lượng SH bằng cột PSSSUPREMA (300mm x 8,0mm I.D.10µm, pha động: ACN : H2O (40:60) với
amoni acetat 0,02 M. Mẫu thử được pha trong pha động để được nồng độ
1mg/ml [27]. Ngoài ra, tác giả cũng đưa ra phương pháp định lượng SH bằng
phương pháp RP - HPLC sử dụng cột Agilent Zorbax C8-RX (150 x 2,1mm
i.d.) kích thước hạt 5µm, pha động gồm ACN và H2O chạy chương trình gradient trong 22,5 phút, mẫu thử cũng được pha trong dung dịch ACN : H2O
(40:60) với amoni acetat 0,02 M để được nồng độ 2mg/ml, thể tích tiêm 30 µl
[27].
Năm 2015, Kaisa Altaonen và cộng sự cũng sử dụng cột Zorbax eclipse
XDB-C18 (4,6nm x 25mm, 5µm) tốc độ dòng 1ml/phút, chương trình chạy

10


gradient gồm amoni acetat 100mM điều chỉnh pH 5,6 và methanol trong vòng
60 phút [11].
Năm 2014, K. Ruckmani và cộng sự đã xác định SH bằng phương pháp
chuẩn độ đo quang tự động sử dụng thiết bị DP5 phototrode. Dung dịch chuẩn
độ là chất hoạt động bề mặt cetylpyridinclorid (CPD) nồng độ 1 mg/ml. Tại
điểm tương đương, CPD sẽ tạo tủa với SH làm cho dung dịch mẫu thử trở nên
đục. Đo độ đục của dung dịch tạo thành ở bước sóng 520 nm. Nồng độ dung
dịch SH từ 0,5 – 1,2 mg/ml [20].
Năm 2014, Lianhui Chen , Shaopu Liu , Hongqun Luo and Xiaoli Hu
đã đưa ra phương pháp định lượng SH bằng cách cho SH phản ứng với các
chất nhuộm thuộc nhóm bisphenylnaphthylmethan như night blue (NB),
Victoria blue B (VBB) and Victoria blue 4R (VB4R) trong môi trường acid
yếu để tạo ra các phức hợp làm thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 612 nm

(NB), 616 nm (VBB), 585 nm (VB4R) từ đó xác định được lượng SH trong
mẫu thử. Nồng độ dung dịch mẫu thử đưa vào thử nghiệm là 0,5~2,0 mg/l
(NB) 0,1~2,5 mg/l (VBB), 0,1~0,6 mg/l (VB4R) [12].
Năm 2013, K. Ruckmani và cộng sự đã đưa ra phương pháp xác định
bằng cột BioSep SEC S2000, 300 mm x 7,8 mm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút,
bước sóng 205 nm, thể tích tiêm 10 µL, pha động: KH2PO4 0,05 M điều chỉnh
pH 7,0 bằng dung dịch KOH 10 % [21].
Năm 1993, N. Gassier và cộng sự đã xác định các hợp chất glycosaminoglycans không có nhóm sulfat bằng cột trao đổi ion âm Hypersil APS (4,6 x
250 mm, kích thước hạt 5 µm) nối với cột Hypersil ODS RP - C18, tốc độ
dòng 0,8 ml/phút, pha động gồm 2,5 mmol Na2HPO4 và 15 mmol NaCl được
điều chỉnh pH 3,0, detector: 232 nm [13].
Năm 1962, T Bitter và H.M.Muir tiến hành định lượng hyaluronat bằng
cách cho phản ứng với natri tetraborat trong acid sulfuric đặc, sau đó cho
phản ứng tiếp với carbazol, sản phẩm tạo thành đo quang ở bước sóng 530 nm

11


[9].
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đang lưu hành một số chế phẩm
thuốc nhỏ mắt chứa SH của các công ty Dược nước ngoài và một số công ty
Dược phẩm trong nước cũng bắt đầu nghiên cứu sản xuất dung dịch thuốc
nhỏ mắt chứa SH. Vì vậy, để đánh giá chất lượng sản phẩm trong phát triển
công thức, hoàn thiện hồ sơ đăng ký thuốc đồng thời giám sát chất lượng sản
phẩm trên thị trường đòi hỏi cần có phương pháp định lượng SH có độ chính
xác cao, độ nhạy tốt, đơn giản, thời gian phân tích ngắn, tốn ít hóa chất dung
môi, và phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của nhiều phòng thí nghiệm. Qua
tham khảo các kết quả nghiên cứu đã công bố, chúng tôi tiến hành khảo sát
phương pháp định lượng SH bằng kỹ thuật sắc ký (bao gồm GFC và RP HPLC sử dụng cột C8 và C18) và kỹ thuật đo quang sản phẩm tạo thành sau
khi phản ứng với Carbazol.

1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DÙNG
TRONG NGHIÊN CỨU
1.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS
Nguyên tắc
Khi chiếu một chùm tia đơn sắc có cường độ I0 qua một dung dịch màu có
chiều dày l (cm). Sau khi bị dung dịch hấp thụ, cường độ chùm tia còn lại là I.
Độ truyền qua T được tính theo công thức:
T = I/I0 x 100 (%)
Độ hấp thụ A được tính bằng công thức: A = lg (1/T) = lg (I0/I)
Giả sử tồn tại một môi trường đồng nhất có chiều dày là l cm chứa chất
màu có khả năng hấp thụ ánh sáng. Cho tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và
cường độ I0 đi qua môi trường đó và tia sáng này không bị phản xạ, khúc xạ
và tán xạ. Sau khi bị môi trường hấp thụ, dòng ánh sáng có cường độ I thì lg
(I0/I) = ε.l.C
Trong đó: ε là hệ số hấp thụ chỉ phụ thuộc vào bản chất chất màu và

12


bước sóng ánh sáng hấp thụ. Nếu nồng độ C tính bằng mol/lít thì ε là hệ số
hấp thụ phân tử gam. Nếu C tính bằng nồng độ % thì ε là hệ số hấp thụ %.
Như vậy độ hấp thụ quang của dung dịch hấp thụ màu tỷ lệ thuận với chiều
dày của tầng hấp thụ màu và nồng độ chất màu có trong tầng đó.
Điều kiện áp dụng định luật lambert – Berr
- Ánh sáng phải đơn sắc: Khi bước sóng thay đổi các hệ số hấp thụ cũng thay
đổi. Độ đơn sắc càng cao càng tốt.
- Khoảng nồng độ phải thích hợp: Do nhiều nguyên nhân vật lý (sự phản xạ,
sự khuếch tán ánh sang), hóa học (sự phân ly, ảnh hưởng của lực ion) mà
định luật lambert – Berr chỉ đúng trong một giới hạn nồng độ. Vì vậy, khi
xây dựng phương pháp định lượng cần phải khảo sát kỹ để tìm khoảng nồng

độ đó.
- Dung dịch phải trong suốt: Để hạn chế các hiện tượng quang học khác
- Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của ánh sáng UV –
VIS [1, 3].
Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ UV – VIS
- Các yếu tố thuộc về cấu trúc phân tử của chất tan: ảnh hưởng rất lớn đến
khả năng hấp thụ UV – VIS của phân tử. Các yếu tố ảnh hưởng của cấu trúc
lên độ hấp thụ của phân tử có thể là các hiệu ứng cảm ứng, liên hợp và cả hiệu
ứng không gian. Cấu trúc phân tử chất tan có nhóm mang màu (alken, dien,
carbonyl đơn giản, hợp chất enol và polyenon, dẫn chất thế hai lần của
benzene, dẫn chất carbonyl thơm, dẫn chất thơm đa vòng, và các dị vònglàm
cho phân tử có thể hấp thụ các bức xạ có bước sóng dài hơn trong UV – VIS
(>200nm). Các nhóm trợ màu ít có khả năng hấp thụ UV – VIS nhưng lại có
thể làm ảnh hưởng tới cường độ hấp thụ, nhóm trợ màu thường là các nguyên
tử hay nhóm mà có nhiều cặp electron tự do như: -OH, -OR, -NR2, các
halogen…Sự thay đổi cấu trúc phân tử của chất tan có thể làm dịch chuyển
cực đại hấp thụ. Ngoài ra, vị trí không gian của các liên kết bội đặc biệt là các

13


hệ liên hợp cũng ảnh hưởng nhiều đến sự hấp thụ phân tử, và cũng có thể làm
thay đổi vị trí cực đại hấp thụ
- Các yếu tố thuộc về môi trường:
+ Các dung môi được dùng để đo phổ UV – VIS có những bước sóng
giới hạn (λcutout) khác nhau mà dưới bước sóng đó dung môi hấp thụ đa phần
các bức xạ chiếu qua nó. Do đó, khi chọn dung môi để chuẩn bị dung dịch đo
phổ UV – VIS cần phải tính đến khả năng hấp thụ của chính dung môi. Sử
dụng các dung môi khác nhau có thể làm sai khác vị trí cực đại trên phổ hấp
thụ của các chất.

+ pH: pH của môi trường có thể gây hỗ biến làm thay đổi cấu trúc phân
tử do đó kéo theo sự thay đổi khả năng hấp thu của chất đó.
+ Nồng độ và các tương tác khác trong dung dịch: Khả năng hấp thụ
UV – VIS của dung dịch chỉ tỷ lệ tuyến tính với nồng độ trong một khoảng
thích hợp, do đó cần nghiên cứu xác định khoảng nồng độ mà khả năng hấp
thụ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ.
- Các yếu tố thuộc về thiết bị: Với một chất ở các bước sóng khác nhau các
hệ số hấp thụ thường khác nhau, vì vậy khả năng tạo chùm tia đơn sắc của
thiết bị ảnh hưởng đến độ hấp thụ của dung dịch, bước sóng càng đơn sắc thì
định luật càng đúng.
- Các hiện tượng quang học khác: Nếu dung dịch không đồng nhất về mặt
quang học thì sẽ xảy ra các hiện tượng quang học khác như phản xạ, khuếch
tán, tán xạ … do đó để hạn chế các hiện tượng quang học trên dung dịch đo
phải trong suốt [1].
Ứng dụng của kỹ thuật quang phổ hấp thụ UV - VIS
Định tính: Dựa vào bước sóng cực đại (λ max) và cực tiểu (λ min) hoặc tỷ lệ
mật độ quang giữa cực đại và cực tiểu [1].
Định lượng: Dựa vào độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử để xác định hàm
lượng của hoạt chất có trong mẫu thử. Có nhiều phương pháp để xác định

14


hàm lượng chất phân tích bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ. Tuy nhiên, trong
phạm vị đề tài này xin chỉ trình bày đến ứng dụng định lượng dung dịch có
một thành phần bằng kỹ thuật đường chuẩn. Để xây dựng đường chuẩn người
ta chuẩn bị một số dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, thường 5 - 8 dung
dịch chuẩn. Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn
mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn. Từ độ
hấp thụ của dung dịch thử, dựa vào phương trình đường chuẩn thiết lập được

có thể tính được nồng độ của chất phân tích trong dung dịch [1].
Đo so sánh với một dung dịch chuẩn là trường hợp riêng của đường
chuẩn: xác định hằng số K từ một dung dịch. Với việc xác định mật độ quang
của dung dịch thử chưa biết nồng độ và dung dịch chuẩn đã biết nồng độ
trong điều kiện thỏa mãn định luật lambert – Berr thì mật độ quang tỷ lệ thuận
với nồng độ dung dịch nên
Ax/Ac = Cx/Cc

Cx = Ax/Ac . Cc

1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha
động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân
chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay
một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, hay phân
loại theo kích cỡ [1, 3].
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc
ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ (pha
thuận). Pha tĩnh là các chất đã được liên kết với một nhóm chức khác ta có
sắc ký pha liên kết (pha thuận, pha đảo, trao đổi ion). Nếu pha tĩnh là gel thì
ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử. Cùng với pha tĩnh, để rửa giải các
chất phân tích ra khỏi cột cần có một pha động.

15


Nếu mẫu phân tích gồm các chất A, B, C …vào cột tách thì xảy ra 3
tương tác: tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh (lực giữ chất phân tích

trên cột), tương tác giữa chất phân tích với pha động (lực kéo nó ra khỏi cột),
tương tác giữa pha động và pha tĩnh. Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định
chất nào rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược
lại. Do tương tác giữa pha tĩnh và pha động là yếu tố ảnh hưởng không lớn
nên các chất phân tích khác nhau thì lực tương tác giữa chất phân tích với pha
động và pha tĩnh khác nhau nên kết quả là các chất di chuyển trong cột với tốc
độ khác nhau và tách hẳn nhau ra khi ra khỏi cột [3].
Phân loại sắc ký:
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình phân tách của sắc ký mà ta có những
kỹ thuật sắc ký khác nhau:
- Sắc ký phân bố
- Sắc ký hấp phụ
- Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký loại cỡ
- Sắc ký ái lực
- Sắc ký các đồng phân quang học [1].
Trong phạm vi của đề tài này, xin trình bày cụ thể về sắc ký phân bố
(sắc ký pha liên kết) và sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử),
Sắc ký pha liên kết: được ứng dụng rộng rãi phù hợp cho nhiều chất phân
tích từ không phân cực, phân cực yếu, phân cực vừa, đến phân cực lớn và các
chất bị ion hóa. Pha tĩnh được cải tiến, biến đổi nhờ liên kết với các nhóm
chức hóa học khác nhau để có thể tách được nhiều loại chất tan khác nhau, sử
dụng đơn giản và nhanh, độ lặp lại cao. Pha tĩnh trong sắc ký pha liên kết
được chế tạo từ silic dioxyd (silica). Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản
ứng với dẫn chất clorosilan tạo dẫn chất siloxane. Trong loại này, dựa vào cấu
tạo của pha liên kết mà người ta chia ra nhiều kiểu sắc ký khác nhau:

16