Nghiên cứu xác định một số thuốc chống viêm giảm đau trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
THUỐC CHỐNG VIÊM GIẢM ĐAU TRỘN
LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG
CAO VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
THUỐC CHỐNG VIÊM GIẢM ĐAU TRỘN
LẪN TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG

CAO VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. TS.ThS. Đào Thị Cẩm Minh

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng cám ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Kiều Anh, người đã hướng dẫn và chỉ bảo tơi tận tình trong suốt q trình
nghiên cứu, hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths. Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên
khoa Dược trường đại học Y - Dược Huế, người đã động viên, giúp đỡ tơi
trong q trình thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo Sau đại học,
Bộ mơn Hóa Phân tích – Độc chất, Viện Cơng nghệ dược phẩm quốc gia đã
tạo điều kiện cho tơi trong q trình học tập và làm luận văn.
Cuối cùng tôi xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
ln khích lệ, tạo động lực cho tơi trong q trình học tập và nghiên cứu vừa
qua.
Hà Nội, tháng 3 năm 2016
Học viên
Nguyễn Thị Hà


MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN………………………………………………3

1.1 Tổng quan về tình hình chất lượng sử dụng chế phẩm đơng dược,
thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ở trong nước và trên thế giới. ................. 3
1.1.1

Trên thế giới ...................................................................................... 3

1.1.2

Tại Việt Nam ..................................................................................... 4

1.2

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ...................................................... 6

1.2.1

Cấu trúc, tính chất lý hóa của paracetamol, diclofenac ................. 6

1.2.2 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc thuộc
nhóm chống viêm khơng steriod. ................................................................. 7
1.3

Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ................................................ 9

1.3.1

Sắc kí lớp mỏng. ............................................................................... 9

1.3.2

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao ...................................................... 10

1.3.3

Sắc kí lỏng hiệu năng cao .............................................................. 11

1.4 Một số nghiên cứu định tính, định lượng nhóm thuốc chống viêm
khơng steroid ................................................................................................... 15
1.5 Một số quy trình xử lý mẫu thuốc tân dược dạng viên nén, viên nang
chiết từ thuốc đông dược ................................................................................ 18
CHƯƠNG 2
2.1

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………..19

Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu ............................. 19

2.1.1

Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ........................................ 19

2.1.2

Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ......................................................... 20

2.1.3

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 20

2.2

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 21

2.2.1

Phương pháp HPTLC ..................................................................... 21

2.2.2

Phương pháp HPLC ........................................................................ 23


2.2.3
2.3

Ứng dụng phân tích mẫu chế phẩm đơng dược trên thị trường .. 24

Phương pháp xử lí số liệu ..................................................................... 24

CHƯƠNG 3
3.1

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ…………………………25

Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC ................................... 25

3.1.1

Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC ....................................... 25

3.1.2

Khảo sát điều kiện xử lí mẫu HPTLC ........................................... 30

3.1.3

Thẩm định phương pháp HPTLC .................................................. 34

3.2

Xây dựng phương pháp HPLC ............................................................. 44

3.2.1

Khảo sát điều kiện sắc kí ................................................................ 44

3.2.2

Thẩm định quy trình ....................................................................... 46

3.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC và HPLC để phân tích mẫu chế
phẩm thuốc đơng dược trên thị trường. ........................................................ 49
3.3.1

Kết quả phân tích mẫu bằng phương pháp HPTLC ..................... 49

3.3.2

Kết quả phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC ........................... 52

CHƯƠNG 4
4.1

BÀN LUẬN………………………………………………55

Xây dựng quy trình kĩ thuật ................................................................. 55

4.1.1

Lựa chọn phương pháp phân tích .................................................. 55

4.1.2

Lựa chọn xử lí mẫu ......................................................................... 55

4.2

Xây dựng phương pháp định lượng ..................................................... 56

4.2.1

Xây dựng phương pháp định lượng HPTLC ................................ 56

4.2.2

Xây dựng phương pháp định lượng HPLC ................................... 57

4.3

Thẩm định phương pháp ....................................................................... 58

4.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC và HPLC để phân tích mẫu chế
phẩm thuốc đông dược trên thị trường. ........................................................ 59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

CTAB

Cetyltrimethyl amoni bromid

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin
Layer Chromatography)

MeOH

Methanol

NSAIDs

Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs ( thuốc chống viêm
khơng steroid)

A

Diện tích pic

TFA

Acid trifloracetic

TB

Trung bình

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức
(Association of Official Analytical Chemists)

COX

Cyclooxygenase


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết paracetamol, diclofenac natri trong
mẫu chế phẩm đông dược theo dung môi chiết .................................................. 31
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống của phương pháp HPTLC
............................................................................................................................. 37
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của paracetamol, diclofenac natri..... 39
Bảng 3.4 Kết quả xác định LOD của paracetamol, diclofenac natri................. 42
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi của paracetamol.................... 43
Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi của diclofenac natri ............. 44
Bảng 3.7 Kết quả phân tích giới hạn phát hiện của paracetamol, diclofenac
natri ...................................................................................................................... 48
Bảng 3.8 Kết quả phân tích 6 mẫu chế phẩm bằng phương pháp HPLC .......... 54

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 1 (cloroform :
methanol : amoniac 25% (18 :15 :5) ................................................................... 25
Hình 3.2 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 2 (Toluen : npropanol : acid formic (5 : 4 : 1)) ........................................................................ 26
Hình 3.3 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 3 ................... 26
Hình 3.4 Kết quả khảo sát pha động đối với sắc kí lớp mỏng hệ 4 ................. 27
Hình 3.5 Kết quả khảo sát thành phần tỉ lệ pha động của HPTLC ..................... 29
Hình 3.6 Kết quả khảo sát lựa chọn dung mơi chiết .......................................... 32
Hình 3.7 Sơ đồ xử lí mẫu phân tích ................................................................... 33
Hình 3.8 Sắc kí đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC .............................................. 34
Hình 3.9 Sắc kí đồ xác định tính chọn lọc của phương pháp HPTLC với
paracetamol ......................................................................................................... 35
Hình 3.10 Sắc kí đồ xác định tính chọn lọc của phương pháp HPTLC với
diclofenac natri .................................................................................................... 36
Hình 3.11. Sắc kí đồ 3D khoảng tuyến tính ........................................................ 38
Hình 3.12 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của
paracetamol (phương pháp HPTLC) ................................................................... 39
Hình 3.13 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của
paracetamol (phương pháp HPTLC) ................................................................... 40
Hình 3.14 Sắc kí đồ LOD của paracetamol trên 4 nền mẫu .............................. 41
Hình 3.15 Sắc kí đồ analog xác định LOD của paracetamol trên nền HC06 ... 41
Hình 3.16 Sắc kí đồ xác định LOD của diclofenac natri trên 4 nền mẫu .......... 41
Hình 3.17 Sắc kí đồ analog xác định LOD của diclofenac natri trên nền HC0642
Hình 3.18 Sắc kí đồ đánh giá độ chọn lọc của paracetamol, diclofenac natri. 47


Hình 3.19 Sắc kí đồ kết quả mẫu chế phẩm đơng dược trên thị trường bằng
HPTLC ................................................................................................................ 50

Hình 3.20 Sắc kí đồ kết quả phân tích mẫu VN07, HC03, HC08 (phương pháp
HPLC) ................................................................................................................. 52
Hình 3.21 Hình ảnh chồng phổ chuẩn paracetamol và mẫu thử HC03, HC08... 53


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, do những tác dụng bất lợi khi sử dụng thuốc hóa dược, con
người có xu hướng quay về tìm kiếm thuốc có nguồn gốc tự nhiên. Do đó,
các thuốc đơng dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc tự nhiên đang là
mục tiêu mà các nhà sản xuất và người tiêu dùng trong nước cũng như trên
thế giới quan tâm. Thuốc đông dược, thực phẩm chức năng và thuốc theo
đơn của lương y được sử dụng để bổ trợ hoặc điều trị bệnh thần kinh-cơ,
bệnh tiêu hóa-gan mật, hơ hấp, tiết niệu, tim mạch, ngồi ra cịn có tác dụng
điều kinh, bổ dưỡng, bổ sung vitamin, khoáng chất. Tuy nhiên, những năm
gần đây hệ thống Kiểm nghiệm cũng như các cơ quan công an, quản lý thị
trường và thanh tra đã phát hiện khá nhiều thuốc đơng dược, thực phẩm
chức năng có nguồn gốc từ dược liệu trộn trái phép thuốc tân dược (thành
phần có hoạt chất tân dược nhưng không công bố trên nhãn). Các tân dược
được trộn lẫn gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau, trong đó các nhóm được
sử dụng nhiều là nhóm thuốc glucocorticoid [9]; thuốc chống viêm không
steroid (Nonsteroidal anti-inflammatory drugs: NSAIDs)[6][13]; thuốc hạ
glucose máu [20], [31]; thuốc hạ huyết áp [16]; thuốc giảm béo [21]; thuốc
ức chế phosphodiestarase-5 [8]. Những tác hại do thuốc đơng dược có trộn
tân dược gây ra có thể là: loét dạ dày, gây xốp xương, phù, tăng huyết áp,
rậm lơng (nếu thuốc có các hoạt chất chống viêm corticoid), loét đường tiêu
hoá, xuất huyết, dị ứng (thuốc có hoạt chất chống viêm khơng steroid), suy
gan (thuốc có paracetamol).
Hiện nay đã có một số nghiên cứu phát hiện các thuốc tân dược trộn lẫn
trong thuốc đông dược, thực phẩm chức năng được triển khai như sắc ký lớp
mỏng [32]; sắc ký lỏng hiệu năng cao [7], [9]; sắc ký lỏng khối phổ [13]; ...

Trong đó, phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng để phát hiện nhanh và
có thể định lượng các thuốc tân dược trộn trong đơng dược [19], cịn phương

1


pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được sử dụng để xác nhận lại kết quả tìm
được.
Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong
thuốc đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định một số
thuốc chống viêm giảm đau trộn lẫn trong chế phẩm thuốc đông dược
bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc kí lỏng hiệu năng cao”.
Với mục tiêu:
1. Xây dựng qui trình định tính, định lượng paracetamol, diclofenac
natri trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng hiệu năng cao.
2. Ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao để xác định
paracetamol, diclofenac natri trộn lẫn trong các chế phẩm đơng dược.
Từ đó, so sánh khả năng ứng dụng của phương pháp sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao với phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao trong phân
tích các đối tượng này.

2


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về tình hình chất lượng sử dụng chế phẩm đơng dược,

thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ở trong nước và trên thế giới.
1.1.1 Trên thế giới
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở
các nước đang phát triển vẫn dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống
để chăm sóc sức khỏe của họ. Ví dụ như dân số sử dụng thuốc đông dược để
điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của Ethiopia, chiếm 75% dân số của
Mali, chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở Rawanda, chiếm 60% ở
Tanzania, chiếm 60% ở Uganda [20]. Mặc dù thuốc đông dược đã sử dụng
từ lâu, nhưng người sử dụng có rất ít kiến thức về an tồn và hiệu quả của
nó. Thuốc đơng dược được tự do bán trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe,
trong siêu thị, và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng. Do quy định ít
chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với
thuốc tổng hợp (tân dược) không khai báo. Tuy nhiên một số hướng dẫn của
WHO đóng một vai trị quan trọng trong việc giám sát sự an toàn của các
loại thuốc thảo dược và củng cố cơ quan quản lý thuốc của các nước thành
viên khác nhau.
Ở Châu Âu, nước Anh đã ghi nhận các trường hợp người bệnh nhập viện
điều trị các tác dụng phụ của thuốc đơng dược có trộn lẫn hydrocortison,
clobetason butyrat, betamethason valerat, clobetasol propionat trong các sản
phẩm kem dược liệu [17]. Tuy nhiên, trong nhiều năm gần đây có nhiều báo
cáo cho thấy tình trạng trộn lẫn các thuốc tân dược trong đông dược ở các
nước này khá nhiều và đã gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm cho người
sử dụng. Trong đó, các nhóm thuốc tân dược trộn lẫn trong đơng dược bao
gồm

nhóm

corticoid,

nhóm

NSAIDs

(Paracetamol,

Diclofenac,

Indomethacin, Aspirin), thuốc chống co giật, thuốc rối loạn chức năng
3


cương dương, thuốc hạ đường huyết [15]. Do đó, tại các nước này đã phát
triển khá mạnh các phương pháp định tính, định lượng và phát hiện được rất
nhiều các nhóm thuốc tân dược được trộn lẫn trong thuốc đơng dược, thực
phẩm chức năng như LC-MS/MS, UPLC-MS/MS. Đặc biệt khu vực Đông
Nam Á, các nước như Thái Lan, Indonesia cũng tích cực trong việc xây
dựng phương pháp phát hiện các thuốc tân dược được trộn lẫn [18]. Ngay cả
nước phát triển là Nhật Bản vẫn phát hiện trộn lẫn các thuốc trị tiểu đường
nhóm sulfylure trong thực phẩm chức năng [20].
Các hoạt chất tân dược được dùng để trộn lẫn bao gồm nhiều nhóm hợp
chất khác nhau, trong đó đáng chú ý là: Nhóm hoạt chất tăng cường khả
năng sinh lý (Sildenafil và dẫn chất) [7]. Nhóm Corticoid (Dexamethason,
Prednisolon,

Betamethason)

[13].

Nhóm

thuốc

kháng

Histamin

(Clopheniramin,...). Nhóm thuốc chống viêm phi Steroid (Diclofenac,
Ibuprofen,

Indomethacin)

[13].

Nhóm

thuốc

hạ

nhiệt

giảm

đau

(Paracetamol, Piroxicam) [32]. Nhóm thuốc an thần gây ngủ (Diazepam).
Nhóm thuốc giảm béo (Sibutramin) [6], [21]. Nhóm thuốc hạ glucose-huyết
(Metformin, Gliclazide,...) [20]. Nhóm thuốc hạ huyết áp (Nifedipine,
Amlodipine,...) [26].
1.1.2 Tại Việt Nam

Do nhận thức được tính an tồn của các sản phẩm có nguồn gốc từ tự
nhiên nên nhu cầu về sản xuất và sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thảo
dược trong nước ngày càng tăng. Mặt khác, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi
dào và nền y học cổ truyền lâu đời của nước ta cũng là một trong những yếu
tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng chiếm ưu thế so
với các thuốc tân dược. Hiện nay, các chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược
được phát triển theo nhiều hướng khác nhau như các bài thuốc gia truyền
được sản xuất tại các cơ sở sản xuất của các lương y, lương dược; các chế
phẩm thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược.
4


Các chế phẩm này thường được sử dụng để điều trị hoặc hỗ trợ phòng và
điều trị các bệnh gan, thận, tim-mạch…Nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu,
thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu (Đông dược) sử dụng trong phòng
và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản chỉ đạo tăng cường
công tác quản lý chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược
liệu (Đông dược), đặc biệt là Chỉ thị số 03/CT-BYT ngày 24/02/2012 về
việc tăng cường quản lý cung ứng, sử dụng dược liệu, thuốc Y học cổ
truyền, thuốc từ dược liệu trong các cơ sở khám chữa bệnh bằng y học cổ
truyền với nhiều giải pháp đồng bộ. Kết quả kiểm tra đánh giá chất lượng
thuốc năm 2013, tồn quốc có 56.179 mẫu thuốc đã được kiểm tra đánh giá
chất lượng (cả thuốc tân dược và đông dược), trong đó phát hiện 1004 mẫu
thuốc (1,79 %) khơng đạt chỉ tiêu chất lượng và 08 (0,014%) mẫu thuốc giả;
tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng là (1,8%). Tỷ lệ thuốc giả và thuốc
kém chất lượng năm 2013 (1,8%) giảm so với năm 2012 (3,09%) [11].
Một trong những vấn đề làm thuốc kém chất lượng, thuốc giả đặc biệt với
đối tượng là thuốc, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu là việc
trộn lẫn nhiều nhóm thuốc tân dược, gây những tác dụng phụ nguy hiểm khi
người bệnh sử dụng thuốc lâu dài. Các thuốc tân dược thường được trộn lẫn

trong đông dược và cả trong thực phẩm chức năng, được phát hiện đơn lẻ
hoặc kết hợp nhiều thành phần trong cùng một nhóm hoặc nhiều nhóm có
tác dụng dược lý khác nhau nhằm tạo việc tăng tác dụng.
Điều đáng nói, việc trộn các tân dược vào đơng dược rất khó phát hiện, vì
trong đơng dược có rất nhiều thành phần, các phương pháp phát hiện địi hỏi
máy móc kiểm nghiệm hiện đại mới chiết tách được thành phần và tốn chi
phí nhiều. Viện kiểm nghiệm TW và mạng lưới trung tâm kiểm nghiệm
(tỉnh, thành) cần có một hệ thống phương pháp phát hiện nhanh chóng, hiệu
quả cao và dễ dàng ứng dụng ngay tại các trung tâm kiểm nghiệm trên toàn

5


quốc vì thuốc đơng y từ nhập khẩu cho đến sản xuất trong nước nhan nhản,
thậm chí cả thực phẩm chức năng, mỹ phẩm.
1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.2.1 Cấu trúc, tính chất lý hóa của paracetamol, diclofenac
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn đối tượng nghiên cứu là
paracetamol và diclofenac natri trộn trong chế phẩm thuốc đơng dược.
1.2.1.1 Paracetamol
Cơng thức hóa học

Tên khoa học

C8H9NO2

N-(4-hydroxyphenyl) acetamid
Tính chất

Bột kết tinh trắng, không mùi. Hơi tan trong nước, rất khó tan cloroform,

ether, methylen clorid, dễ tan trong dung dịch kiềm, ethanol 96%.
Liều dùng
Liều dùng cho người lớn và trẻ em trên 11 tuổi, uống hoặc đưa vào trực
tràng là 325 - 650 mg, cứ 4 - 6 giờ một lần, nhưng không quá 4g một ngày
[2], [3].
1.2.1.2 Diclofenac natri
Công thức hóa học

C14H10CI2NNaO2

6


Tên khoa học

natri 2-[(2,6-dichlorophenyl)amino]-phenyl] acetat

Tính chất
Bột kết tinh trắng hay hơi vàng, hút ẩm nhẹ. Dễ tan trong methanol,
ethanol 96%, hơi tan trong nước, khó tan trong aceton.
Liều dùng
Uống 100 -150 mg/ ngày [2], [3].
1.2.2 Tác dụng và tác dụng khơng mong muốn của các thuốc thuộc
nhóm chống viêm khơng steriod.
1.2.2.1 Tác dụng và cơ chế tác dụng
Nhóm thuốc này có tác dụng giảm đau, hạ sốt chống viêm ở những mức
độ khác nhau. Thuốc ức chế cyclo-oxygenase (COX) là enzym xúc tác việc
sản xuất một số chất trung gian, đặc biệt là prostaglandin, một chất gây ra
phản ứng đau, sốt, viêm. Có hai dạng enzym COX là COX-1 có ở thành dạ
dày, thành mạch, thận và COX-2 có ở tổ chức viêm hay tổn thương. Do đó

thuốc ức chế COX-2 thì có tác dụng điều trị, thuốc tác dụng lên COX- 1 thì
gây ra tác dụng phụ. Các thuốc chống viêm không chọn lọc ức chế cả hai
loại COX-1 và COX-2, bao gồm ibuprofen, indomethacin, naproxen,
piroxicam, diclofenac, ketoprofen. Sự khác nhau giữa các thuốc chống viêm
không steroid chủ yếu là các biểu hiện của tác dụng không mong muốn. Các
thuốc có tính chọn lọc ít gây các tác dụng phụ, còn tác dụng chống viêm,
giảm đau giống như các thuốc không chọn lọc. Các thuốc ức chế chọn lọc
7


COX-2 có thể gây các tác dụng phụ ở thận giống như các thuốc khơng chọn
lọc. Ngồi ra các thuốc ức chế chọn lọc khơng có tác dụng ức chế tiểu cầu
kết dính, cịn các thuốc ức chế khơng chọn lọc có tác dụng ức chế kết dính
tiểu cầu nhưng có thể hồi phục được, trái với acid acetylsalicylic.
Tác dụng hạ nhiệt còn do ức chế trung tâm điều hòa nhiệt ở vùng dưới
đồi, gây giãn mạch ngoại biên, tăng tỏa nhiệt và tăng tiết mồ hôi.
Tác dụng giảm đau của nhóm thuốc này chỉ đối với triệu chứng đau nhẹ
do viêm như đau đầu, đau răng, đau dây thần kinh, đau khớp, đau cơ [4].
1.2.2.2 Tác dụng không mong muốn
Các tác dụng phụ do ức chế tổng hợp prostaglandin
Rối loạn dạ dày-ruột: Thuốc chống viêm không steroid với mức độ khác
nhau ức chế COX -1 làm giảm tổng hợp prostaglandin ở dạ dày dẫn đến ức
chế sản sinh ra chất mucin (yếu tố bảo vệ dạ dày), tạo điều kiện cho HCl và
pepsin của dịch vị gây tổn thương cho niêm mạc. Ngồi ra các thuốc chống
viêm khơng steroid còn tác động trực tiếp hủy hoại các tế bào biểu mơ tiêu
hóa, gây thủng ổ lt do phần lớn chúng đều là những acid.
Trên hệ tiết niệu: Ức chế prostaglandin ở thận làm tưới máu nuôi thận,
giảm mức lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển
ion và trao đổi nước, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm
thận mô kẽ, suy thận cấp.

Trên hệ huyết học: Tăng nguy cơ chảy máu, kéo dài thời gian đơng máu,
có thể gây ra hiện tượng xuất huyết dưới da do ức chế ngưng kết tiểu cầu.
Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, ở 3 tháng cuối có thể làm
tăng thời gian mang thai, có thể gây đóng sớm ống động mạch, chảy máu
trong tử cung, nguy hiểm cho sản phụ.
Với những người bị phù hoặc có xu hướng phù như suy tim, suy thận mạn,
suy gan có thể gây tình trạng giữ nước nặng nếu điều trị bằng nhóm thuốc
này.
8


Các tác dụng phụ không do ức chế tổng hợp prostaglandin
Trên hệ thần kinh: có thể gây ù tai, điếc thống qua, say thuốc. Ngồi ra
thuốc có thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX nên làm tăng
các chất chuyển hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien). Rối loạn
chức năng gan, rối loạn về máu theo kiểu nhiễm độc tế bào (mất bạch cầu
hạt).
Trên hệ tim mạch: các thuốc ức chế COX-2 và liều cao các thuốc chống
viêm khơng steroid truyền thống có nguy cơ gây nhồi máu cơ tim [4].
1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu
1.3.1 Sắc kí lớp mỏng.
Sắc kí lớp mỏng (TLC) trong kiểm nghiệm dược phẩm đã được phát triển
từ lâu. Q trình tách bằng sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên một lớp
mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết dính trên một giá đỡ bằng
thủy tinh, nhơm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Pha động là
chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi, pha động di chuyển qua pha tĩnh
nhờ lực mao dẫn. Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy
thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng có vị trí
khác nhau trên bản mỏng. Cơ chế tách có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi
ion.

Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan,
cellulose, nhôm oxid, gel sephadex…trong đó được dùng phổ biến nhất là
silica (SiO2) và nhôm oxid. Pha động trong TLC thay đổi tùy thuộc vào cơ
chế sắc kí. Để tăng cường sức rửa giải thường kết hợp 2-3 dung môi.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf và nó được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất
phân tích và quãng đường dịch chuyển của pha động. Trị số này dao động từ
0-1.

9


Rf = d R /dM
dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích
dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều thành
lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ được chế tạo từ các vật
liệu như kim loại, thủy tinh, nhựa và có thể có thêm chất huỳnh quang để dễ
dàng khi phát hiện chất phân tích. Chất hấp phụ thường dùng nhất là
silicagel. Thành phần pha động dùng cho TLC thay đổi tùy theo cơ chế sắc
kí, bản chất của chất phân tích [8], [13].
TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm
như: Chi phí cho thiết bị khơng q cao, vận hành khá dễ dàng, khơng địi
hỏi nhiều thao tác quá khó. Phương pháp này cho phép bán định lượng
nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất
lượng của thuốc. Bên cạnh đó, TLC có thể phân tích nhiều mẫu cùng 1 thời
điểm, cùng điều kiện phân tích, tiết kiệm được thời gian phân tích và giảm
sai số trong q trình phân tích. Phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh
sắc kí đồ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra
độ tinh khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả.

1.3.2 Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức nâng cao của
TLC. HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng
dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra. Trong đó, các
thơng số của q trình phân tích được ghi lại và kiểm sốt chặt chẽ, do đó có
độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện
vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa
sai số có thể gặp trong q trình phân tích. Q trình phun mẫu được tiến
hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng
10


thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxi hóa đối với chất phân tích dễ bị
oxy hóa. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm
soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân
tích khác nhau và tại các phịng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV
tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng
trong định tính và định lượng.
Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng
bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates). Bản này được tráng lớp
pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt
5µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giải
được tăng cường vì vết sắc kí nhỏ, thời gian sắc kí ngắn hơn và lượng dung
mơi ít hơn so với TLC.
Ưu điểm của HPTLC
-

Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng.

-

Trong một lần khai triển sắc kí có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu
cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.

-

Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản
mỏng sắc kí, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt
độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường
giữa các lần phân tích.

Do những ưu điểm trên nên chúng tơi lựa chọn kỹ thuật HPTLC cho
nghiên cứu.
1.3.3 Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Khái niệm chung

11


Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid ChromatographyHPLC) là kĩ thuật sắc kí trong đó các chất phân tích hịa tan trong pha động
là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực
của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất phân tích di chuyển
với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động
đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời
gian hợp lý.
Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao

Hình1.1. Sơ đồ hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao
 Hệ thống cung cấp pha động: pha động trong sắc kí lỏng thường là 2

dung mơi hịa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù
hợp.
 Bơm dung môi pha động
 Bộ phận tiêm mẫu: tiêm qua vỏng tiêm mẫu (injection loop) hoặc bộ
phận tiêm mẫu tự động. Cho phép tiêm chính xác thể tích mẫu vào hệ
thống sắc kí.
 Cột sắc kí: Cột sắc kí thường được chế tạo bằng thép không gỉ hoặc
thủy tinh, chất dẻo. Hạt nhồi thường có kích thước 5-10µm, chiều dài
cột khoảng 10-30cm, đường kính trong 1-10mm.

12


 Detector: Có nhiều loại detector được sử dụng trong HPLC như:
-

Detector hấp thụ UV-VIS

-

Detector huỳnh quang

-

Detector chỉ số khúc xạ

-

Detector tán xạ bay hơi

-

Detector đo độ dẫn

Trong nghiên cứu này, để quy trình có khả năng ứng dụng rộng rãi, chúng
tôi lựa chọn detector UV-PDA, là loại detector phổ biến trong cấu tạo tiêu
chuẩn của thiết bị HPLC hiện nay. Ưu điểm của loại detector này là tạo
được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm
tra độ tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so
sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc kí với phổ của ngân hàng dữ liệu hoặc với
phổ của chất chuẩn đã biết trước.

Hệ thống xử lí dữ liệu: Là phần mềm máy tính có khả năng ghi nhận,
lưu giữ, xử lí các thơng tin hiệu quả.
Lựa chọn điều kiện sắc kí
Để có kết quả phân tích tốt nhất, cần phải tìm được các điều kiện sắc kí
phù hợp với chất cần phân tích. Các điều kiện đó bao gồm:
 Loại pha tĩnh: thơng thường dùng 02 loại cột pha thuận và cột pha
đảo.
- Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính. Loại cột này thường dùng để
tách các chất khá phân cực. Trên bề mặt của chất tạo cột có chứa các
nhóm OH phân cực ưa nước. Pha động dùng cho loại cột này là các
dung mơi khơng phân cực hay ít phân cực như: n- hexan, isopropanol,
cloroform.

13


- Cột pha đảo (RP): (Silicagel đã alkyl hóa). Loại cột này dùng để tách
các chất khơng phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp

ion. Trên bề mặt chất tạo cột có các nhóm OH đã bị alkyl hóa tức là
thay thể H bằng các mạch carbon thẳng (C8 hay C18) hay các mạch
carbon vòng (phenyl) vì nó ít phân cực hay phân cực rất ít. Pha động
dùng trong loại này là các dung môi phân cực như: methanol,
acetonitril, nước hay các dung dịch đệm, hỗn hợp dung môi - dung
dịch đệm. Sự tách của chất nhồi cột loại này có độ lặp lại cao và được
ứng dụng chủ yếu trong phân tích dược phẩm. Hiện nay sử dụng loại
này là chủ yếu.
 Loại pha động: Cần lựa chọn pha động phù hợp để quá trình tách hồn
tồn các chất có trong mẫu, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn của pic, có thời
gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm dung mơi, hóa chất, thời gian
tiêm mẫu. Pha động cần có yêu cầu như phải trơ với pha tĩnh, hịa tan
được các chất phân tích, bền về mặt hóa học nhất là trong thời gian
phân tích, có độ tinh khiết cao.
 Loại detector: Cần chọn detector phù hợp với chất phân tích. Ví dụ sử
dụng detector UV cho các chất phân tích có khả năng hấp thụ UV tốt.
1.3.3.1 Các thông số đặc trưng
Thời gian lưu t R
Thời gian lưu t R là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
phân tích đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian
lưu của mỗi chất là hằng định. Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện
định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
-

Bản chất của pha tĩnh

-

Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

14


-

Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

-

Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH pha động.

Hiệu lực cột và số đĩa lí thuyết N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột.
 t 
t 
N  16 R   5,54 R 
W 
W1 / 2 
2

Trong đó:

2

W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh,
W là độ rộng đáy pic.

Độ phân giải

Độ phân giải đánh giá khả năng tách trên sắc ký đồ của 2 pic liền kề.
RS 

2(t RB  t RA ) 1,18(t RB  t RA )

WB  WA
W1/ 2 B  W1/ 2 A

Trong đó :
tRA, t RB: Thời gian lưu pic của chất A và chất B (2 pic liền kề)
WA, WB: Độ rộng của pic đo ở các đáy pic của chất A và chất B.

W1/2A, W1/2B: Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic của chất A
và chất B.
Yêu cầu RS  1,5 [1], [5].

1.4 Một số nghiên cứu định tính, định lượng nhóm thuốc chống viêm
khơng steroid
Tại Indonessia, đã phát hiện nhiều nhóm thuốc tân dược trộn trái phép
trong Jamu (thuốc cổ truyền từ thảo dược của Indonesia). Wisnuwardhani
[32] tiến hành tối ưu hóa phương pháp TLC đối với 05 chất là paracetamol,
dexamethason, prednisolon, acid mefenamic và piroxicam được thực hiện
trên pha tĩnh silicagel GF254. Tối ưu hóa pha động như sau: dicloromethan
100%, sau đó thêm dần methanol với các tỉ lệ khác nhau, thay thế
15


dicloromethan bằng ethyl acetat và cloroform. Dung dịch chuẩn có nồng độ
từ 0,04-0,24mg/ml. Các mẫu Jamu được xử lí bằng cách lắc 500mg bột mẫu

với 10ml ethanol trong 30 phút, lọc qua màng lọc Whatman No1, pha loãng
5 lần sau đó tiến hành sắc kí. Sử dụng thiết bị phân tích là CAMAG TLC
Scanner tại λ 254 nm. Kết quả cho thấy với hệ pha động cloroformmethanol (9:1) có khả năng tách riêng 05 chất phân tích.
Wensheng Pang [31] tiến hành phân tích thuốc tân dược trộn trái phép
trên thực phẩm chức năng và các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu bằng
phương pháp LC-MS/MS, phân tích theo chế độ MRM. Mẫu phân tích ở
dạng viên nang, viên nén và dung dịch. Mẫu được xử lí bằng cách thêm
10ml dung mơi chiết, siêu âm 10 phút, ly tâm 8000 vịng trong 10 phút, thu
dịch trong pha loãng 1000 lần rồi tiến hành sắc kí. Sử dụng cột C18 (50 mm
× 2,1 mm, 5µm), pha động methanol : nước : TFA (78 :22 :0,1), thể tích
tiêm là 20 µl. Kết quả đã phát hiện 09 chất trong đó có sildenafil (Viagra),
ibuprofen, diazepam. Giới hạn phát hiện (LOD) của các chất phân tích dao
động trong khoảng 0,05-1,5ng/ml. Trong đó, LOD của ibuprofen là
0,2ng/ml.
Johannes Wiest [19] tiến hành phát hiện và định lượng các thành phần
trong thuốc đông dược của Việt Nam bằng phương pháp LC-MS với cột
Nucleodur Sphinx RP (150 × 4,6 mm, 5µm). Các mẫu được xử lý và ly tâm
13000 vòng trong 10 phút. Pha động là Gradient nước (A) và acetonitril (B)
đều có acid acetic 0,1%, bước sóng phát hiện 254 nm. Chương trình rửa giải
là 85:15 (A:B) trong 3 phút, 70:30 (A:B) trong 7 phút và từ 70:30 đến 10:90
(A:B) trong 20 phút, thể tích tiêm là 5µl. Kết quả cho thấy đã phát hiện
indomethacin, paracetamol trong chế phẩm thuốc đông dược.
Kenichi Kumasaka [23] tiến hành phát hiện đồng thời paracetamol,
indomethacin, diclofenac, ketoprofen, ibuprofen, aspirin trong huyết tương
người bằng HPLC với hệ pha động là methanol : dung dịch đệm phosphat

16