Nghiên cứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh học của các Flavonoid từ cây an xoa (Helicteres Hirsuta Lour) Quảng Nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


HỒ THỊ HUYỀN TRÂN

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID
TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.)
QUẢNG NAM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
KĨ THUẬT

Đà Nẵng – Năm 2018


Công trình được hoàn thành tại
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Người hướng dẫn khoa học:
TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM
Phản biện 1:
PGS.TS. Trần Thị Xô
Phản biện 2:
TS. Bùi Xuân Đông

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt

nghiệp thạc sĩ Công nghệ Sinh học họp tại Trường Đại học
Bách khoa vào ngày 13 tháng 10 năm 2018.

Có thể tìm hiểu luận văn tại:
- Trung tâm Thông tin – Học liệu,Đại học Đà Nẵng
- Thư viện Trường Đại học Bách Khoa Đại học Đà Nẵng


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây An xoa (hay còn gọi là cây thâu kén cái, thâu kén lông, tổ
kén cái, dó lông) có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour. là một loài
thực vật thuộc họ Trôm (Sterculiaceae), là cây bụi, thân gỗ, mọc ở
nơi đất ẩm, lá thường to bằng bàn tay, có lông, hoa có màu hồng hay
đỏ, quả có hình như con sâu, có lông chạm vào thì ngứa [2]; [25].
Cây phân bố chủ yếu ở Nam Trung Quốc, khu vực Nam Á và các
nước Đông Nam Á như Lào, Indonesia, Campuchia, Thái Lan và
Việt Nam. Cây rất dễ trồng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiều điều
kiện sinh thái. Tại một số nước như Ấn Độ, Trung Quốc, cây An xoa
được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để điều trị các bệnh
như sốt rét và bệnh tiểu đường. Trong đó, cây An xoa chứa các hợp
chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác
nhau, do đó được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết các bộ
phận của cây đều được sử dụng để trị bệnh…. Cây An xoa được dùng
trong những trường hợp người hay nhức mỏi, đau lưng, mất ngủ, da
xanh, kể cả những người tim hay mệt cũng có thể cải thiện sức khỏe
một cách hiệu quả [2]; [6]. Lá cây An xoa có thể chữa trị được một
số bệnh thường gặp như ung nhọt, sưng lở. Phần rễ dùng làm dịu cơn

đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm, đái dắt và làm thuốc tiêu độc [2].
Ở Campuchia và ở tỉnh Bình Phước - Việt Nam, cây cũng được sử
dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị các bệnh về gan.
Hiện nay, tại Việt Nam cây An xoa được tìm thấy nhiều nơi ở
các tỉnh giáp biên giới Campuchia như Bình Phước và nhiều tỉnh
miền Trung. Trong đó, tỉnh Quảng Nam là một trong những nơi tìm


2

thấy nhiều cây An xoa, cây mọc hoang và chưa được trồng phổ biến.
Tại huyện Phú Ninh cây cũng được tìm thấy nhiều nhưng chưa được
trồng và sử dụng rộng rãi để làm thuốc.
Trên thế giới, cũng có một số công trình nghiên cứu đã xác
định được trong cây An xoa chứa các chất có hoạt tính sinh học có
tác dụng chữa được một số bệnh. Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về
cây An xoa vẫn còn hạn chế và chưa thực sự được quan tâm nhiều,
chỉ được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, chưa ứng dụng nhiều
vào công nghệ dược phẩm để chữa bệnh. Với những tác dụng to lớn
của loài cây này, đồng thời nhằm tìm hiểu để ứng dụng vào dược
phẩm và các loại thực phẩm chức năng chúng tôi quyết định chọn đề
tài: “Nghiên cứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh học của các
flavonoid từ cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Quảng Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng quy trình tách chiết để thu được dịch chiết và cao
chiết có chứa hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất từ cây An xoa.
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, và
hoạt tính gây độc tế bào từ cao chiết.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu

Các bộ phận của cây An xoa (thân, lá, rễ) được thu hái tại
huyện Phú Ninh - tỉnh Quảng Nam, Việt Nam.
* Phạm vi nghiên cứu
Các nghiên cứu được thực trên quy mô phòng thí nghiệm
thuộc khoa Hóa - Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
* Ý nghĩa khoa học


3

- Cung cấp thông tin khoa học về thành phần hóa học, hoạt tính
sinh học của dịch chiết và cao chiết flavonoid từ cây An xoa tại
huyện Phú Ninh, tỉnh Quảng Nam.
- Cung cấp thông số công nghệ của quá trình tách chiết bằng
các phương pháp phân tích khoa học và hiện đại.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng phương trình tối ưu hóa điều kiện chiết ở quy mô
phòng thí nghiệm, làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng ở quy
mô sản xuất công nghiệp.
- Cao chiết từ cây An xoa là nguồn sử dụng tạo ra sản phẩm
mới có giá trị dược liệu cao, góp phần đa dạng hóa sản phẩm và nâng
cao giá trị chữa bệnh từ cây An xoa.
5. Cấu trúc luận văn
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)
Cây An xoa có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour., được
biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: Cây dó lông, tổ kén lông,
thâu kén lông, thâu kén cái [6].

1.1.1. Phân loại
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây An xoa
1.1.3. Công dụng của cây An xoa
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY AN XOA
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước
1.3. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID


4

1.3.1. Định nghĩa
1.3.2. Phân loại các hợp chất flavonoid
1.3.3. Phân bố flavonoid trong thực vật
1.3.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoid
1.3.4.1. Tác dụng của flavonoid đối với đời sống của thực vật
1.3.4.2. Tác dụng sinh học
+ Tác dụng chống oxy hóa của flavonoid
+ Tác dụng đối với enzyme
+ Tác dụng chống độc
+ Tác dụng kháng sinh, chống viêm
+ Tác dụng trong hệ tim mạch
+ Tác dụng trên hệ thần kinh
+ Tác dụng chống ung thư và HIV
1.4. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT
FLAVONOID
1.4.1. Khái niệm phương pháp chiết tách
1.4.2. Phương pháp chiết tách các hợp chất flavonoid
1.4.2.1. Nguyên tắc lựa chọn dung môi
1.4.2.2. Chiết tách flavonoid

1.4.3. Các phương pháp chiết tách bằng dung môi
1.4.3.1. Phương pháp ngấm kiệt
1.4.3.2. Phương pháp ngâm dầm
1.4.3.3. Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
1.4.4. Một số phương pháp chiết tách khác
1.4.4.1. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
1.4.4.2. Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn
1.4.4.3. Chiết dưới áp suất cao


5

1.4.4.4. Phương pháp chiết hồi lưu
1.4.4.5. Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
1.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH CHIẾT
1.5.1. Dung môi
1.5.2. Những yếu tố về kỹ thuật
1.5.2.1. Nhiệt độ chiết
1.5.2.2. Thời gian chiết
1.5.2.3. Độ mịn của nguyên liệu
1.5.2.4. Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
1.5.2.5. pH dung môi
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Với các mục tiêu của đề tài đặt ra, chúng tôi tiến hành thực
hiện các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ sau:

Hình 2.1. Sơ đồ thực hiện đề tài

6

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
2.1.2. Thiết bị, hóa chất
2.1.2.1. Thiết bị
2.1.2.2. Hóa chất
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định một số thành phần hóa học trong lá, thân
và rễ cây An xoa
2.2.1.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu tươi bằng phương
pháp sấy đến khối lượng không đổi [5]
2.2.1.2. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet
[14]
2.2.1.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp
Kjeldahl [14]
2.2.1.4. Xác định hàm lượng tro tổng số [1]
Xác định tro toàn phần bằng phương pháp tro hóa ở nhiệt độ
550 - 6000C.
2.2.1.5. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng [10]; [11]
2.2.2. Phương pháp tách chiết và xác định hàm lượng
flavonoid toàn phần
2.2.2.1. Xây dựng đường chuẩn Catechin bằng phương pháp
đo quang
2.2.2.2. Khảo sát hàm lượng flavonoid trong các bộ phận
khác nhau của cây An xoa
2.2.2.3. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng
flavonoid toàn phần có trong cây An xoa
2.2.2.4. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng
flavonoid toàn phần có trong cây An xoa

7

2.2.2.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng trích ly
flavonoid toàn phần từ cây An xoa
a). Ảnh hưởng của thời gian chiết
b). Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
c). Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm
2.2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của một số yếu tố đến
hàm lượng flavonoid toàn phần
2.2.2.7. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết và
cao chiết
2.2.2.8. Phương pháp tinh sạch flavonoid từ cao chiết
2.2.2.9. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
2.2.2.10. Khảo sát khả năng gây độc tế bào
2.2.3. Xử lý số liệu
- Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần và xử lý bằng
phần mềm Statistix 10.
- Phương trình đường chuẩn và các biểu đồ được vẽ bằng phần
mềm Excel 2010.
- Mô hình tối ưu hóa được thiết kế bằng phần mềm Minitab 17.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG
CÂY AN XOA
Bảng 3.1. Một số thành phần hóa học có trong bột cây An xoa
STT
1
2

3
4
5
6

Tên chỉ tiêu
Độ ẩm bột khô
Hàm lượng tro tổng số
Hàm lượng kim loại Cu
Hàm lượng kim loại Pb
Hàm lượng kim loại Hg
Hàm lượng kim loại As

Đơn vị tính
%
%
mg/kg
mg/kg
μg/kg
μg/kg

Kết quả
5,24
6,03
KPH
0,003
KPH
KPH

8

STT
7
8

Tên chỉ tiêu
Hàm lượng protein
Hàm lượng lipid

Đơn vị tính
%
%

Kết quả
7,58
3,27

Ghi chú: KPH: không phát hiện
3.2. PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN CATECHIN
Xây dựng đường chuẩn bằng cách pha loãng thành dãy dung
dịch có nồng độ catechin khác nhau lần lượt là 45, 90, 180, 360, 450,
540 và 590 µg/ml dung môi. Kết quả đo mật độ quang hấp thu ở
bước sóng 510 nm (OD510 nm) của hàm lượng catechin qua các
dung môi khác nhau thể hiện ở hình 3.1. với hệ số tương quan R2
trong 3 dung môi khác nhau dao động từ 0,992 - 0,995 đạt độ tin cậy
cao, từ đó có thể tính toán hàm lượng flavonoid toàn phần dựa trên
catechin thông qua phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng cho
từng loại dung môi (hình 3.1. A, B, C).

Hình 3.1. Đồ thị phương trình đường chuẩn catechin. A: Dung môi
methanol 40%; B: Dung môi ethanol 40%; C: Dung môi chloroform 40%.


9

3.3. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN
CÓ TRONG CÁC BỘ PHẬN KHÁC NHAU CỦA CÂY AN
XOA
Kết quả thu được ở hình 3.2 cho thấy rằng, hàm lượng
flavonoid toàn phần phân bố trong cây An xoa ở các bộ phận khác
nhau thì có sự khác nhau. Trong đó, rễ là bộ phận có chứa hàm lượng
flavonoid toàn phần cao nhất (10,800 mgCE/g ± 0.106a), tiếp đến là
thân (5,014 mgCE/g ± 0,083b) và sau đó là lá (2,502 mgCE/g ±
0,113c), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất 95%. Như
vậy, rễ là bộ phận được chúng tôi lựa chọn để tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo (hình 3.2).

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các bộ phận khác nhau của cây
An xoa đến hàm lượng flavonoid toàn phần
3.4. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT
Kết quả cho thấy các phương pháp chiết khác nhau thì hàm
lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa thu được cũng khác
nhau. Phương pháp thích hợp nhất là siêu âm bằng điện cực, với hàm
lượng flavonoid toàn phần thu được tương ứng là 10,662 mgCE/g ±
0,146a, tiếp đến siêu âm bể (9,569 mgCE/g ± 0,034b) và phương pháp
ngâm dầm cho hiệu suất thu hồi flavonoid toàn phần thấp nhất (6,702
mgCE/g ± 0,124c) (hình 3.3), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở
mức xác suất 95%.

10

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các phương pháp chiết khác
nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần
3.5. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT
Sau khi lựa chọn được nguyên liệu và phương pháp chiết thích
hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát với các loại dung môi có độ phân
cực tương đối khác nhau: methanol 40%, ethanol 40% và chloroform
40%. Các thí nghiệm được tiến hành trong thời gian 50 phút, ở nhiệt
độ 60oC và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 g/ml.
Kết quả nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết với các điều kiện
được thể hiện ở và hình 3.4 cho thấy cùng một nguyên liệu khi chiết
flavonoid toàn phần bằng các dung môi khác nhau thì cho kết quả
khác nhau. Methanol là dung môi thu được hàm lượng flavonoid toàn
phần cao nhất (10,933 mgCE/g ± 0,101a), tiếp đến là ethanol (7,173
mgCE/g ± 0,040b) và thấp nhất là chloroform (6,596 mgCE/g ±
0,043c) (hình 3.4), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất
95%. Mặt khác, dựa vào nguyên tắc phân cực của dung môi, các
dung môi có độ phân cực khác nhau (methanol (5,1δP), ethanol
(5,2δP) và chloroform (4,1δP) thì khả năng hòa tan các hợp chất hữu
cơ có tính phân cực cũng khác nhau. Do vậy, kết quả nghiên cứu của
chúng tôi là phù hợp và methanol là dung môi được sử dụng để tiến
hành các nghiên cứu tiếp theo.


11

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các dung môi chiết khác nhau
đến hàm lượng flavonoid toàn phần

3.6. NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM
LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG QUÁ TRÌNH
CHIẾT
3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng flavonoid
toàn phần trong quá trình chiết
Sau khi lựa chọn được nguyên liệu, dung môi chiết là methanol
40% và phương pháp chiết thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát
ảnh hưởng của thời gian trích ly flavonoid toàn phần phù hợp. Các
mức thời gian được khảo sát là 10, 30, 50 và 70 phút. Kết quả ảnh
hưởng của thời gian đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá
trình chiết có trong rễ cây An xoa được thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các thời gian chiết khác nhau
đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Kết quả thể hiện ở hình 3.5 cho chúng ta thấy rằng, trong cùng
một điều kiện, nhưng ở các thời gian chiết khác nhau thì hàm lượng
flavonoid toàn phần thu được cũng khác nhau. Thời gian cho hàm


12

lượng flavonoid toàn phần cao nhất là ở 50 phút với giá trị tương ứng
là 10,356 mgCE/g ± 0,198a và thấp nhất là ở thời gian 10 phút (6,467
mgCE/g ± 0,135d) (hình 3.5), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở
mức xác suất 95%.
3.6.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm
lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết
Với thời gian chiết 50 phút, nguyên liệu là rễ cây An xoa, dung
môi methanol 40%, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ
nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng flavonoid toàn phần thu được

từ rễ cây An xoa. Các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi được khảo sát là
1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml).

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy tỷ lệ nguyên liệu/dung
môi thích hợp nhất để trích ly flavonoid toàn phần trong rễ cây An
xoa là 1/20, tương ứng với hàm lượng flavonoid toàn phần thu được
là 10,555 mgCE/g ± 0,057a. Khi chúng ta tăng tỷ lệ nguyên liệu/dung
môi lên 1/30 và 1/40 thì hàm lượng flavonoid toàn phần thu được
tăng lên không đáng kể, sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác
suất 95%. Vậy xét về hiệu quả kinh tế, chúng tôi chọn tỷ lệ nguyên
liệu/dung môi là 1/20 cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.6.3. Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm
lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết


13

Với nguyên liệu là rễ cây An xoa, dung môi methanol 40%,
chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm
đến hàm lượng flavonoid toàn phần thu được. Các cường độ sóng
siêu âm khảo sát là 15, 20, 25 và 30 kHz. Các thông số kỹ thuật khác
không thay đổi. Kết quả ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến
hàm lượng flavonoid toàn phần trong rễ cây An xoa được thể hiện ở
hình 3.7.

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các cường độ sóng siêu
âm chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần
Kết quả cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong rễ cây

An xoa thu được tăng dần theo cường độ sóng siêu âm và đạt giá trị
cao nhất ở cường độ 25 kHz, tương ứng với giá trị thu được là 10,942
mgCE/g ± 0,054a. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng cường độ sóng siêu
âm thì hàm lượng flavonoid toàn phần thu được có xu hướng giảm.
Nguyên nhân của hiện tượng này là do dưới tác động của cường độ
sóng siêu âm lớn làm cho một số flavonoid có cấu trúc không ổn định
bị biến tính, dẫn đến hàm lượng flavonoid toàn phần thu được có xu
hướng giảm (bảng 3.7). Do đó, cường độ sóng siêu âm thích hợp cho
quá trình trích ly flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa là 25 kHz.
3.7. TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID
TOÀN PHẦN TỪ RỄ CÂY AN XOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP


14

ĐÁP ỨNG BỀ MẶT RSM
Các thí nghiệm ở mục 3.6 nhằm khảo sát ảnh hưởng của một
số yếu tố như thời gian, cường độ sóng siêu âm, tỷ lệ nguyên
liệu/dung môi đến khả năng trích ly flavonoid toàn phần từ rễ cây An
xoa dưới sự hỗ trợ của phương pháp siêu âm điện cực trong dung môi
methanol 40% ở nhiệt độ 60ºC. Kết quả đã xác định được các điều
kiện tối ưu là: thời gian (50 phút), tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/20),
cường độ sóng siêu âm (25 kHz). Tuy nhiên, đây chưa phải là điều
kiện tối ưu nhất để thu được hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây
An xoa cao nhất. Với mục đích tìm ra được các điều kiện tối ưu nhất
cho quá trình chiết để thu được hàm lượng flavonoid toàn phần tối
đa, sau khi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến trích ly
flavonoid toàn phần, chúng tiến hành tối ưu hóa bằng phương pháp
đáp ứng bề mặt RSM theo mô hình Box- behnken bằng phần mềm
Minitab 17. Các yếu tố đơn biến được chúng tôi sử dụng để thục hiện

tối ưu hóa là thời gian chiết (X1), cường độ sóng siêu âm (X2) và tỷ lệ
nguyên liệu/dung môi (X3) với các mức độ khoảng biến thiên tương
ứng được trình bày ở bảng 3.8 với hàm lượng flavonoid toàn phần là
hàm mục tiêu. Phương trình toán học ứng với mô hình thí nghiệm
Box- behnken như được trình bày ở phần phương pháp.
Bảng 3.2. Nhân tố và các mức độ bố trí thí nghiệm theo mô hình Boxbehnken

Yếu tố ảnh hưởng
X1, Thời gian chiết (phút)
X2, Cường độ (kHz)
X3, Tỷ lệ dung môi (g/ml)

Mức dưới Mức cơ
sở
-1
0
30
50
20
25
100
200

Mức
trên
1
70
30
300

Khoảng biến
thiên
20
5
100


15

Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa

Thí
nghiệm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Thời

gian
(phút)
(X1)
30
70
30
70
30
70
30
70
50
50
50
50
50
50
50

thu được qua các thí nghiệm
Cường
độ
(kHz)
(X2)
20
20
30
30
25
25

25
25
20
30
20
30
25
25
25

Tỷ lệ nguyên
liệu/dung môi
(g/ml) (X3)

Hàm lượng flavonoid
toàn phần (mgCE/g)

200
200
200
200
100
100
300
300
100
100
300
300
200

200
200

9,507 ± 0,096
10,067 ± 0,098
9,188 ± 0,056
9,748 ± 0,060
9,791 ± 0,042
9,557 ± 0,066
9,643 ± 0,055
10,203 ± 0,059
9,539 ± 0,130
9,221 ± 0,136
10,185 ± 0,109
9,867 ± 0,152
10,529 ± 0,128
10,588 ± 0,043
10,689 ± 0,109

Bố trí thí nghiệm theo mô hình thí nghiệm Box- behnken với
12 thí nghiệm nhân tố với 3 thí nghiệm tại tâm. Dịch chiết thu được
từ 15 thí nghiệm được sử dụng để xác định hàm lượng flavonoid toàn
phần theo mô tả của Phạm Hồng Ngọc Thúy và cs. [23]. Kết quả
được trình bày ở bảng 3.9.
Từ bảng 3.9 cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần thu được
từ rễ cây An xoa có giá trị cao nhất, dao động từ 10,529 mgCE/g ±
0,128 đến 10,689 mgCE/g ± 0,109 và không sai khác nhiều giữa 3 thí
nghiệm. Sự sai khác nhỏ này có thể là sai khác trong tiến hành thí
nghiệm. Các kết quả này được sử dụng để xử lý trên phần mềm
Minitab 17, kết quả thể hiện ở bảng 3.10 cho thấy, các thành phần

tham gia vào mô hình đều thể hiện ở mức độ ý nghĩa cao, hầu hết các
giá trị p<0,05. Hai nhân tố tuyến tính (X1 và X3) và ba giá trị bậc 2


16

(X12, X22, X32) tham gia vào mô hình đều thể hiện ở mức độ tin cậy
cao trên 95%, ngoại trừ nhân tố X2 và 3 tương tác (X1X2, X1X3, X2X3)
có p>0,05 nên các giá trị này không có ý nghĩa hồi quy.
Bảng 3.4. Mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy
Nhân tố
β̥
X1
X2
X3
X 12
X 22
X 32
X 1X 2
X 1X 3
X 2X 3

Coef
10,620
0,1817
-0,1593
0,2237
-1,4395
-1,5351
-1,3640

0,000
0,1985
0,000

SE Coef
0,107
0,0653
0,0653
0,0653
0,0962
0,0962
0,0962
0,0924
0,0924
0,0924

T
99,38
2,77
-2,44
3,42
-4,57
-5,56
-3,78
0,00
2,15
0,00

P
0,000

0,040
0,059
0,019
0,006
0,003
0,013
1,000
0,084
1,000

Phương trình hồi quy biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng
flavonoid toàn phần và các biến độc lập cho mô hình bậc hai bề mặt
đáp ứng Box- behnken thu được như sau:
Y = -11.81 + 0.0991 X1 + 0.01183 X3 - 0.001099 X12 0.1338 X22 - 0.000036 X32 (9)
Trong đó:
Y: Hàm lượng flavonoid toàn phần
X1: Thời gian chiết (phút)
X2: Cường độ sóng siêu âm (kHz)
X3: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml)
Giá trị của mô hình Fisher F test (F = 9,74) và giá trị xác suất p
thấp (p = 0,011) ở bảng 3.11 đã cho thấy rằng phương trình hồi quy
thiết lập có ý nghĩa thống kê cao.
Mặt khác, sự phù hợp của mô hình được kiểm tra thông qua hệ
số xác định tương quan R2. Theo Guan và Yao (2008) cho biết rằng,


17

một mô hình phù hợp khi giá trị R2 đạt giá trị thấp nhất là 80% và
theo Zabeti và cs. (2009) thông số Adeq Precision lớn hơn 4 là cần

thiết [18]; [28]. Kết quả phân tích mô hình thể hiện ở bảng 3.11 cho
thấy giá trị R2 của mô hình bằng 94,60% và giá trị R2-(adj) = 84,89%
và tất cả các giá trị p đều thể hiện ở mức độ có ý nghĩa thống kê ở
mức độ cao chứng tỏ mô hình xây dựng dựa trên các đơn biến đã
được lựa chọn là phù hợp và thể hiện sự tương thích khá cao giữa các
giá trị thực nghiệm và các giá trị dự đoán.
Mặt khác, mức độ phù hợp của mô hình cũng được đánh giá
thông qua giá trị F của Lack of fit. Mô hình tương quan tốt cần sự
phù hợp giữa số liệu thực tế và lý thuyết, vì vậy mô hình thu được
với kiểm định Lack of fit (sự không phù hợp) không có ý nghĩa thống
kê là điều mong muốn [26]. Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy cả hai giá
trị F (8,03) và p (0,113)> 0,05 nên không có ý nghĩa thống kê, Vì vậy
khả năng phù hợp của mô hình là rất cao (bảng 3.11).
Tóm lại, chúng tôi có thể sử dụng phương trình hồi quy (9) để
dự đoán lý thuyết giá trị hàm lượng flavonoid toàn phần của mẫu
dịch chiết từ rễ cây An xoa.
Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện mối tương quan giữa các yếu tố
thời gian, cường độ sóng siêu âm, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến
hàm lượng flavonoid toàn phần từ dịch chiết rễ cây An xoa được thể
hiện ở hình 3.8. Kết quả cho thấy rằng, khi tăng thời gian chiết,
cường độ sóng siêu âm và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thì hiệu suất
chiết flavonoid toàn phần cũng tăng lên. Tuy nhiên, đến một giới hạn
nào đó hiệu suất chiết có xu hướng giảm nếu ta tiếp tục tăng các nhân
tố đó (hình 3.8).


18

Bảng 3.5. Phân tích phương sai (ANOVA) của phương trình hồi quy
cho quá trình chiết có hỗ trợ siêu âm điện cực

Tổng bình Độ tự
Trung bình
phương
do
bình phương
Mô hình (Model)
2,9921
9
0,3325
Không phù hợp (Lack-of-Fit)
0,1576
3
0,0526
Sai số thuần (Pure Error)
0,0131
2
0,0065
Tổng (Total)
3,1629
14
R-Sq = 94,60% R-Sq(adj) = 84,89%
Nguồn

Giá trị
F
9,74
8,03

Giá trị P

0,011
0,113

Hình 3.8. Biểu đồ chu tuyến 3D (A) và biểu đồ bề mặt 2D (B) xác
định vùng giá trị cho mỗi điều kiện
Các giá trị tối ưu của các biến được chọn lọc sẽ được xác định
bằng cách giải phương trình hồi quy dựa trên phần mềm Minitab 17.
Kết quả thu được các điều kiện tối ưu để đạt hiệu suất trích ly
flavonoid toàn phần cao nhất ở thời gian trích ly (55,86 phút), cường
độ sóng siêu âm (24,24 kHz) và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đạt
239,40 g/ml thu được hiệu suất trích ly cao nhất với giá trị tương ứng
là 10,6836 mgCE/g (hình 3.9).

Hình 3.9. Các điều kiện tối ưu của quá trình chiết flavonoid toàn
phần từ rễ cây An xoa bằng phương pháp siêu âm điện cực trong
dung môi methanol 40%.


19

3.8. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN
TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN
TỐI ƯU
Bảng 3.6. Hàm lượng flavonoid toàn phần có
trong dịch chiết và cao chiết

Tỷ lệ pha
loãng
1
1:25

1:50
1:100
1:200
1:400
1:600
1:800
1:1000
LSD0.05

Hàm lượng flavonoid toàn
phần trong dịch chiết
(mgCE/g)
10,053 ± 0,133a
8,850 ± 0,139b
7,338 ± 0,407c
5,180 ± 0,267d
3,657 ± 0,400e
2,127 ± 0,133f
0,784 ± 0,240g
0,174 ± 0,073h
0,054 ± 0,015h
0,404

Hàm lượng flavonoid toàn
phần có trong cao chiết
(mgCE/g)
13,031 ± 0,407a
11,028 ± 0,557b
8,671 ± 0,470c
6,069 ± 0,555d

3,746 ± 0,468e
2,749 ± 0,658f
1,539 ± 0,077g
0,485 ± 0,043h
0,214 ± 0,056h
0,726

3.9. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CÓ TRONG
DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY AN XOA
Dịch chiết rễ cây An xoa có chứa hàm lượng flavonoid toàn
phần là 10,053 mgCE/g ± 0,133a (bảng 3.13) được chúng tôi tiến
hành pha loãng thành các tỷ lệ khác nhau. Các độ pha loãng được
khảo sát từ 1 - 1/1000. Theo sự tăng dần của hệ số pha loãng thì hàm
lượng flavonoid toàn phần giảm theo hay nói cách khác hoạt tính bắt
gốc tự do DPPH cũng giảm theo. Chứng tỏ, khả năng kháng oxy hóa
tỷ lệ thuận theo chiều tăng dần hàm lượng flavonoid toàn phần.
Với dịch chiết ban đầu (hàm lượng flavonoid toàn phần =
10,053 mgCE/g ± 0,133a) cho tỷ lệ % bắt gốc tự do DPPH cao nhất
chiếm 94,193% (bảng 3.13). Phương trình hồi quy tuyến tính có được
từ dịch chiết rễ cây An xoa là: y = 0,167ln(x) + 0,465, với hệ số
tương quan R² = 0,955 (hình 3.10).


20

Tương tự đối với cao chiết hoạt tính bắt gốc tự do DPPH đạt
95,249% (bảng 3.14). Phương trình hồi quy tuyến tính có được từ cao
chiết rễ cây An xoa là y = 0,216ln(x) + 0,346, với hệ số tương quan
R² = 0,972 (hình 3.11).
Các phương trình hồi quy tuyến tính này được sử dụng để tính

giá trị IC50 của dịch chiết và cao chiết. Kết quả thể hiện ở hình 3.12.

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự do DPPH đối với các hàm
lượng flavonoid khác nhau có trong dịch chiết từ rễ cây An xoa

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự do DPPH đối với các hàm
lượng flavonoid khác nhau có trong cao chiết từ rễ cây An xoa

Hình 3.12. Ảnh thực hiện phản ứng khử gốc tự do DPPH ở các nồng
độ flavonoid toàn phần khác nhau
Ghi chú: 0: đối chứng dương; 1, 2, 3….,9 tương ứng với các nồng độ


21

flavonoid toàn phần pha loãng 1, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400,
1:600, 1:800, 1:1000.
Bảng 3.9. Giá trị IC50 của dịch chiết và cao chiết từ rễ cây An xoa
trong dung môi methanol 40% bằng phương pháp siêu âm điện cực
trong điều kiện tối ưu
Giá trị
IC50 (µg/mL)

Dịch chiết
302,850

Cao chiết
271,900

Trolox

8,210

Qua bảng 3.15 cho thấy rằng ở hàm lượng flavonoid toàn phần
ở cao chiết và dịch chiết lần lượt 271,900 µg/mL và 302,850 µg/mL
thì có khả năng khử được 50% gốc tự do DPPH trong điều kiện thí
nghiệm. Mặt khác, khả năng khử gốc tự do DPPH ở 50% của dịch
chiết và cao chiết cũng có sự khác nhau, trong đó cao chiết cho giá trị
khử gốc tự do cao hơn. Sở dĩ như vậy là do cao chiết trải qua quá
trình tinh sạch loại bỏ một số tạp chất nên khả năng ảnh hưởng của
tạp chất đến hoạt tính bắt gốc tự do giảm (bảng 3.15). Tuy nhiên khả
năng trung hòa gốc tự do DPPH cả cao chiết và dịch chiết đều thấp
hơn Trolox từ 33,118 - 36,894 lần vì cao chiết chưa được tinh sạch
hoàn toàn.
3.10. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG
PHÂN BÀO TỪ CAO CHIẾT CỦA RỄ CÂY AN XOA
3.10.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn từ cao chiết của rễ
cây An xoa
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Chủng vi
khuẩn

Cao chiết
(652 µg/ml)

E. coli
LSD0.05
Samonella
LSD0.05

20,667 ± 1,155a

16,667±1,1528a

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Đối chứng dương
Mẫu trắng
Tỷ lệ kháng khuẩn
Ampicilin
(Methanol
so với đối chứng
(100µg/ml)
40%)
dương (%)
11,667 ± 0,577b
0,000 ± 0,000c
177,14
1,489
11,667 ± 0,577b
0,000 ± 0,000c
142,86
1,884


22

Hình 3.13. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Cao flavonoid toàn phần thu được từ rễ cây An xoa được
chúng tôi lấy 0,05g cao hòa tan trong 1ml dung môi Methanol 40%
để đạt nồng độ 0,652 mg/ml (652µg/ml). Khả năng kháng khuẩn của
cao chiết được chúng tôi tiến hành khảo nghiệm trên hai chủng vi
sinh vật E.coli và Samonella typhi do Viện Công Nghệ Sinh Học Đại học Huế cung cấp. Kết quả kháng khuẩn thể hiện ở bảng 3.16

cho thấy, khả năng ức chế sinh trưởng E.coli và Samonella typhi của
cao chiết từ rễ cây An xoa là tương đối cao với đường kính vòng
kháng khuẩn tương ứng là 20,667mm ± 1,155a và 16,667mm ±
1,1528a và cao hơn so với đối chứng là kháng sinh ampicilin
(100µg/ml) (11,667mm ± 0,577b) . Tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn
đối với hai chủng E.coli và Samonella typhi có sự khác nhau, trong
đó E.coli cho khả năng kháng cao hơn so với Samonella (bảng 3.16
và hình 3.13).
3.10.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm gây độc tế bào ở dòng tế bào
ung thư gan Hep - G2 bằng thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) tại
phòng thí nghiệm sinh học phân tử-Bộ môn di truyền- Đại học Khoa
học Tự nhiên TP.HCM. Kết quả được chúng tôi thể hiện ở bảng 3.17.
Kết quả mẫu thể hiện tác động ức chế dòng tế bào ung thư gan Hep
G2 ở nồng độ 100 µg/mL, tuy nhiên do phần trăm ức chế không quá


23

cao nên không tiếp tục thực hiện xác định IC50.
Bảng 3.11 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết trên dòng tế bào
Mẫu
CPT
Mẫu

ung thư gan Hep - G2 ở nồng độ 100 µg/mL
Phần trăm gây độc tế bào (%)
Lần 1
Lần 2
Lần 3

TB ± ĐLC
50,65
50,91
50,21
50,59 ± 0,36
53,49
56,59
52,72
54,27 ± 2,05

Chú thích: - CPT: chứng dương cho tính ổn định của qui trình. Tế
bào được cảm ứng với Camptothecine nồng độ 0,07 µg/mL; - Nồng
độ thử nghiệm là nồng độ cuối của mẫu trong phản ứng; - TB, ĐLC:
trung bình, độ lệch chuẩn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đưa ra một số
kết luận như sau:
1. Thành phần hóa học của bột cây An xoa tại huyện Phú Ninh,
Quảng Nam như sau: độ ẩm bột khô (5,24%); tro tổng số (6,03%);
hàm lượng kim loại Pb (0,003 mg/kg); protein (7,58%); hàm lượng
lipid (3,27%); các kim loại Cu, Hg và As không phát hiện trong bột
cây An xoa.
2. Xác định được hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất thu
được trong rễ cây An xoa bằng phương pháp siêu âm điện cực với
cường độ sóng siêu âm thích hợp là 25 kHz ở nhiệt độ 60ºC trong
thời gian 50 phút với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 g/ml.
3. Xác định được điều kiện tách chiết tối ưu theo phương trình
hồi quy: Y = -11.81+ 0.0991 X1 + 0.01183 X3 - 0.001099 X12 0.1338 X22 - 0.000036 X32 (12). Với các điều kiện tối ưu tính toán