Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện để tách và xác định một số vitamin B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) : Đề tài NCKH. QT.09.21

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
*********

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÁP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỬU TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIÈU KIỆN ĐỂ TÁCH VÀ
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VITAMIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

MẢ SỐ: QT-09-21

CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: TS. CHU NGỌC CHÂU

HÀ NỘI - 2009


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
*********

BÁO CÁO TÓM TẮT
KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u ĐỀ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC
CÁP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

r f i A __

4 Ã

i i #

Tên đẽ tài:

NGHIÊN CỬU TÓI ƯU HÓA CÁC ĐIÈU KIỆN ĐỂ TÁCH VÀ
XÁC ĐỊNH MỘT SÓ VITAMIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

MÃ SÓ: QT-09-21

CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI:

TS. Chu Ngọc Châu

CÁC CÁN B ộ THAM GIA: PGS.TS. Tạ Thị Thảo
•

•

m

s v . Nguyễn Thị Cúc
HVCH. Vũ Thị Thu Hương

!

ĐẠI H O C Q U Ộ C
TRUNG TÂM

t h ô n g

D ĩ/ 9 %

HÀ NỘI - 2009

GIA HA N Ọ l
tin t h ư v i ề n


BAO CÁO TÓM TẮT
a. Tên đề tài: Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định một số
vitamin B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
b. Chủ tri đề tài: TS. Chu Ngọc Châu
c. Các cán bộ tham gia: PGS.TS. Tạ Thị Thảo

sv . Nguyễn Thị Cúc
HVCH. Vũ Thị Thu Hương
d. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

Mục tiêu: Nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định một số
vitamin nhóm B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nội dung:
- Khảo sát độ hấp thụ quang cực đại tương ứng với từng vitamin Bl, B2, B3, B6 ,
và BI2.
- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới q trình tách và phân tích một so vitamin
B (Bl, 2, 3, 6 , 12): nghiên cứu tìm và chọn những điều kiện tối ưu các thông số cột tách,
pha động (thành phần pha động, chế độ rửa giải, pH, tác nhân tạo cặp...) để tách và xác
định một so vitamin nhóm B bằng phương pháp HPLC.
- Khảo sát ảnh hưởng của các vitamin nhóm khác (vitamin C) đến kết quả phân
tích các vitamin nhóm B.

- Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích tách và xác định đồng thời các
vitamin Bl, 2, 3, 6 , 12 bàng phương pháp HPLC: xây dựng đường chuẩn, giới hạn phát
hiện, giới hạn định lượng, độ lặp, đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp.
- Nghiên cứu lựa chọn các qui trình xử lý mẫu thích hợp: xử lý mẫu thuốc và sữa
bột.
- ứng dụng các điều kiện thu được để xác định hàm lượng một so vitamin nhóm B
trong mẫu thuốc và sữa bột.
e. Các kết quả đạt được:
1) Nghiên cứu lựa chọn phương pháp sắc ký lóng hiệu năng cao cột đảo pha (RPHPLC) với detector PDA đặt ở các bước sóng đặc trưng của từng vitamin B. Cụ thể : A.=
246; 268; 261; 290; 361 nm tương ứng với Bl, B2, B3, B6 , B12 . Quá trình phân tích
được tiến hành trên cột Supelco C18, chiều dài cột 250mm. đường kính cột 6,1 mm, cỡ
hạt 5 |im. Nhiệt độ cột: 40°c.
2) Thành phần pha động: Axetonitril/dung dịch đệm photphat được điều chỉnh đến
pH = 3 bằng axit H3PO4, với chế độ rửa giải gradient theo thời gian. Sử dụng chất tạo căp
ion muối natri heptansunfonat (SHS). Tốc độ pha động f = 1 ml/phút.
3) Xây dựng đường chuẩn đối với từng vitamin B, xác định các giá trị giới hạn
phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), và kháo sát độ lặp lại đối với từng vitamin
B. Khảo sát, đánh giá được độ tin cậy của phương pháp thông qua các đại lượng: độ lặp
lại (RSD < 5%), độ thu hồi (80 % - 98% đối với mẫu sữa và 89 - 103% đối với mẫu
thuốc).
4) Đưa ra được quy trình xử lý mẫu sữa bằng dung dịch TCA 4% phù hợp với điều
kiện của phịng thí nghiệm, hiệu suất thu hồi đạt 80 -98%. Đối với mẫu thuốc, axit axetic
2,4% được chọn là dung môi chiết tốt nhất (hiệu suất thu hồi 89 - 103%).


5) ứ n g dụng phương pháp phân tích để xác định đồng thời các vitamin
B l, B2, B3, B 6 , B I2 trong mẫu thuốc và thực phẩm chức năng.
6)

Bài báo khoa học: 01

Chu Ngọc Châu, Nguyễn Thị Cúc, Tạ Thị Thảo, “Xác định một số vitamin
nhỏm B trong dược phẩm và thực phẩm bằng phương pháp R P -H P L C Gửi
đăng tuyển tập báo cáo tóm tắt các cơng trình khoa học Hội nghị các nhà
Khoa học trẻ trong lĩnh vực Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ lần thứ nhất.
Tháng 5/2010. Đăng tồn văn tại Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ (Viện Khoa
học & Cơng nghệ Việt Nam).
7) Hướng dẫn 01 khố luận tốt nghiệp.
f. Tình hình kinh phí của đề tài:
Tổng kinh phí được cấp : 25.000.000đ
Đã c h i: 25.000.000đ bao gồm:
Thanh tốn dịch vụ cơng cộng: 1.000.000
Vật tư văn phịng: 400.000
Hội nghị: 2.000.000
Th mướn: 7.500.000
Chi phí nghiệp vụ chun mơn của từng ngành: 14.100.000
KHOA QUẢN LÝ

CHỦ TRÌ ĐẺ TÀI

PGS.TSKH. Lưu Văn Bơi

TS. Chu Ngọc Châu

C ơ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

:


SUMMARY REPORT OF THE SCIENTIFIC

RESEARCH SUBJECT
a.

Title of subject: Optimization study of separation conditions and

determination of several vitamin group B using high performance liquid
chromatography method (HPLC)
b. Code No: Q T -09-21
c. Head of project: Dr. Chu Ngoc Chau
Participants:

Assoc. Prof. Dr. Ta Thi Thao
Student. Nguyen Thi Cue
MSc. Vu Thi Thu Huong

d. Aim and contents of the subject:
Aim: To optimize the separation conditions and the analysis procedures for
the high performance liquid chromatography (HPLC) determination of
various vitamin group B.
Contents:
- Investigation o f the maximum absorbance wavelength for each
vitamin B l, B2, B3, B 6 and B12.
- To investigate some important parameters affecting the separation as
well as the analysis of several vitamin group B (B l, B2, B3, B 6 , B12):
selection and optimization the most suitable parameters for the separation
column, the mobile phase (e.g., the component o f mobile phase, elution
procedure, pH value, couple agent, etc.) in order to determine such vitamins
by using HPLC system.
- To do some investigating to select the suitable conditions for sample
preparation: medicine sample and food sample.

- To determine the content of several vitamin group B drug sample and
powder milk.

e. The obtained results:
1)
The Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography
method (RP-HPLC) using PDA detector was selected. The absorbance wave
length (A.) was found to be 246; 268; 261; 290 and 361 nm for vitamin B l,


B2, B3, B 6 and B12, respectively. The analysis was carried out by using a
Supelco C l 8 column (250 mm in length, internal diameter o f 6.1 mm, and
particle size o f 5 I^m). The column temperature was maintained at 40°c.
2) Mobile phase: acetonitrile/phosphate buffer solution was used as
mobile phase with the gradient elution over time. The sodium heptane
sulfonate (SHS) was also added as the ion-couple agent. The flow rate of
mobile phase was set as f = 1 ml/min.
3) The standard curve, the low limit of detection (LOD), the low limit of
quantification (LOQ), and the relative standard deviation (RSD) were
investigated for each vitamin group B. The reliability o f analysis method was
confirmed since the relative standard deviation (RSD) was less than 5%, and
the recovery reached up to 80-98% for powder milk samples and 89-103% for
drug samples.
4) The sample preparation procedures that are suitable with laboratory
facilities were suggested. For powder milk samples, the recovery o f 80-98%
was gained when sample preparation was conducted with 4% TCA solution.
For drug samples, the highest recoveries (89-103%) were achieved by using
acetic acid solution of 2.4% as elution solvent.
5) These optimum parameters were applied to determine the contents of
several vitamin group B (B l, B2, B3, B 6 and B12) in real medicine (drug)

and food samples (powder milk).
6)

Publication: 01

Chu Ngoc Chau, Nguyen Thi Cue, Vu Thi Thu Hương, Ta Th Thao,
“Determination o f some vitamins group B (Bl, B2, B3, B6, BỈ2) in drug and
milk samples by using reversed-phase high performance liquid
chromatography (R P - H P L C Accepted the short communication in the
Proceeding o f the 1st Science and Technology Conference for Young Scientist
(May, 2010), and Submitted to publication in the Journal of Science and
Technology (Vietnamese Academy of Science and Technology publisher).
7) 01 student defended successfully her Bachelor thesis on this research topic.


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
*********

BÁO CÁO TOÀN VĂN
KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u ĐỀ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC
CÁP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỬU TÓI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN ĐẺ TÁCH VÀ
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VITAMIN B BẢNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

MÃ SĨ: QT-09-21

CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI:

TS. Chu Ngọc Châu

CÁC CÁN B ộ THAM GIA: PGS. TS. Tạ Thị Thảo

s v . Nguyễn Thị Cúc
HVCH. Vũ Thị Thu Hương

HÀ NỘI - 2009


MỤC LỤC
A. MỞ ĐẦU
B. NỘI DƯNG CHÍNH

I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

V itam in nhóm B và vai trị của chúng

1.1.1.

Tên gọi, cẩu trúc, cơng thức cẩu tạo của các vitamin nhóm B

1.1.2.

Tính chất và vai trị của các vitamin nhóm B

1.1.3. Độc tỉnh của các vitamin nhóm B
1.2.

Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.

Tổng quan các phương pháp xác định các vitamin nhóm B
bằng phương pháp HPLC

1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược sử dụng detector PDA
1.3.2.

Phương pháp sắc kỷ lỏng cặp ion sử dụng cột tách pha ngược,
detector UV- VIS

1.3.3.

Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang

Ií.

MỤC TIÊU VÀ NỘI DƯNG NGHIÊN c ứ u

III,

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.

Thiết bị và hóa chất

3.2.

Xử lý mẫu phân tích

IV. KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ THẢO LUẬN
4.1.

Tối ưu hóa các điều kiện tách và xác định một số vitamin
nhóm B bằng phương pháp HPLC

4.1.1

Khảo sát độ hấp thụ quang của các vitamin B nghiên cứu

4.1.2

Chọn pha tĩnh và cột tách

4.1.3

Nghiên cứu chọn hệ dung môi pha động

4. 1 .3.1 Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động
4. 1 .3.2 Khảo sát ảnh hưởng của p H
4. 1 .3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động
4 .1.4

Tổng hợp các điều kiện phân tích với hệ thống RP-HPLC

4.2.

Đánh giá phương pháp phân

4.2.1.

Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và khoảng tuyến tính

tích


V.

4.2.2.

Đánh giá độ chính xác của phương pháp phân tích

29

4.3.

Phân tích mẫu thực tế

32

4.5.

Kết quả cơng bố

34

KẾT LUẬN

c . TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

35
37


A. MỞ ĐẦU
Các vitamin rất cần thiết cho việc duy trì sức khỏe con người, đặc biệt là
khả năng tăng trưởng ở trẻ. Trong số 13 loại vitamin rất quan trọng đối với cơ
thể, các vitamin nhóm B tan trong nước như: thiamin (B l), riboflavin (B2),
niacin (B3), pyridoxin (B 6 ), cyanocobamine (B12)... đặc biệt quan trọng cho
quá trình trao đổi chất cũng như tái tạo năng lượng và tổng hợp các tế bào máu
cho cơ thể. Vitamin B l, B6 , B I2, ... trong tế bào sống như là thành phần cần
thiết cho sự phát triển. Bất cứ sự thiếu hụt nào các thành phần này trong chế độ
dinh dưỡng sẽ gây ra những ảnh hưởng tiêu cực. Rất nhiều trường hợp do bệnh
lý và chế độ dinh dưỡng kém dẫn tới thiếu viatmin B và khi đó thường được bổ
sung bàng các thực phẩm chức năng như sữa, bột dinh dưỡng... hoặc hỗ trợ
bằng thuốc dưới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn hợp các vitamin. Xác định
chính xác hàm lượng các vitamin được bổ sung rất có ý nghĩa trong việc đảm
bảo quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng.
Để xác định hàm lượng các vitamin B trong dược phẩm và thực phẩm, có
rất nhiều phương pháp phân tích đã được nghiên cứu và áp dụng để phân tích
riêng rẽ hoặc đồng thời các vitamin nhóm B như phương pháp điện hóa [1],
động học huỳnh quang [2 ], phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi

qui đa biến hoặc đạo hàm [3, 4], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [5-7].
Trong các phương pháp này, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao RP-HPLC,
detector ƯV với cột tách c 18 [8 , 9] được sử dụng một cách rộng rãi do khả năng
tách rất tốt các vitamin và đáp ứng được cả u cầu cho phân tích đồng thời
lượng khơng nhỏ các vitamin nhóm B trong dược phẩm và lượng vet vitamin
trong thực phẩm, đồng thời có thể phát hiện trực tiếp sau khi tách mà khơng phải
dẫn xuất hóa như phương pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang [10],
Dựa trên tình hình thực tế, chúng tơi nghiên cứu xây dựng qui trình phân
tích hàm lượng các vitamin Bỉ, B2, B3, B6, B ỉ 2 bằng phương pháp sắc kỷ lỏng
hiệu năng cao pha đảo, chế độ rửa giải gradient để góp phần kiểm tra đánh giá,
hàm lượng các vitamin trong dược phẩm và thực phẩm, từ đó có thơng tin chính
xác về hàm lượng thành phần các vitamin so với các giá trị công bô trên nhãn
sản phâm.

1


Nội dung quá trình thực nghiệm bao gồm:
- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tách và phân tích một số
vitamin B (B l, 2, 3, 6 , 12): nghiên cứu tìm và chọn những điều kiện tối ưu các
thông số cột tách, pha động (thành phần pha động, chế độ rửa giải, pH, tác nhân
tạo cặp...) để tách và xác định một số vitamin nhóm B bằng phương pháp HPLC.
- Khảo sát các điều kiện phân tích một số vitamin B khi có mặt các
vitamin nhóm khác (vitamin C).
- Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích tách và xác định đồng thời
các vitamin B l, 2, 3, 6 , 12 bằng phương pháp HPLC: xây dựng đường chuẩn,
giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp, đánh giá hiệu suất thu hồi của
phương pháp.
- Nghiên cứu lựa chọn các qui trình xử lý mẫu thích hợp: xử lý mẫu thuốc
và sữa bột.

- ứ n g dụng các điều kiện thu được để xác định hàm lượng một số vitamin
nhóm B trong mẫu thuốc và sữa bột.

2


B. NỘI DUNG CHÍNH
I. TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vitamin nhóm B và vai trò của chúng
1.1.1. Tên gọi, cấu trúc, cơng thức cấu tạo của các vitamin nhóm B
Một số vitamin nhóm B tan trong nước có các tính chất vật lý, cấu trúc
hóa học, cơng thức cấu tạo được trình bày trong bảng 1. ỉ dưới đây.
Bảng 1.1: Thơng tin chung về một sổ vitamin nhóm B
Vitamin

Tên

Vitamin

Cơng thức

M

phân tử

(g/mol)

Cẩu trúc hóa học

n

Thiamin

c 12 H

,7

N 4 OS

265.35

Bỉ

'^ V

^ ' n- ^ 5

t í ' H ,c

HlC

Vitamin
Riboflavin

C17H20N4O0

376.36

Nicacin

C6H5NO,

123.11

B2
Vitamin
B3

OH

(hay PP)
H OH

Vitamin
B5
Vitamin

Axit

C9H,7NO s

219.23

Pyridoxine

c 8h „ n o 3

169.0

Axit folic

C 19H,9N706

441.40

Cobalamin

C igH ssC oN u O^P

1355.37

Pantothenic

B6

Vitamin
B9

Vitamin
B12

HO

V

/

V

NH / V

OH
V


1.2.2. Tính chất và vai trị của các vitamin nhóm B [11]
Vitamin nhóm B bao gồm các loại: B l, B2, B3, B5, B 6 , B7, B 8 , B9, B12.
Nhìn chung, vitamin nhóm B đều có tác dụng hỗ trợ quá trình sản xuất năng
lượng trong cơ thể cũng như trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng trong tế
bào.
Các vitamin rất càn thiết cho việc duy trì sức khỏe của con người và tăng
trường ở trẻ, việc thiếu đáng kể một trong các vitamin có thể gây ra các bệnh
nghiêm trọng [ 1 1 ], vì vậy sự có mặt đầy đủ các vitamin trong các sản phẩm sữa
và các thực phẩm dinh dưỡng khác là rất quan trọng.
Mặt khác, trong chế độ ăn của con người khơng phải lúc nào cũng có một
lượng vitamin cần thiết cho sự phát triển bình thường và duy trì các chức năng
hoạt động của cơ thể. Vì lý do này một số sản phẩm thực phẩm được bổ sung
thêm các vitamin, đặc biệt được bổ sung trực tiếp vào thực phẩm cho trẻ em,
hơn nữa quá trình chế biến thực phẩm và quá trình bảo quản thực phẩm kéo dài
cũng làm mất đi một lượng các vitamin. Các vitamin nhóm B tan trong nước bao
gồm nhiều họp chất có cấu trúc hóa học khác nhau và giữ vai trị sinh học, rất
quan trọng đối với sức khỏe. Vitamin nhóm B cịn góp phần điều hịa tâm sinh
lý, giúp chổng lại những tâm trạng tiêu cực, mệt mỏi, ủ rũ và căng thẳng. Có thể
nói vitamin nhóm B đóng vai trị to lớn đối với sự phát triển của trẻ em cả về thể
chất lẫn trí tuệ, trên thực tế vitamin nhóm B khơna tồn tại nhiều trong thực phẩm
tự nhiên và dễ bị phân hủy trong nước, do đó khơng dễ dàng bổ sung vitamin
nhóm B cho trẻ, nhất là với trẻ biếng ăn hoặc gặp rấc rối với đường tiêu hóa.
Bên cạnh chức năng chung của nhóm, mỗi loại vitamin B có những vai trị
riêng trong q trình sinh trưởng và phát triển của con người.
1.2.2.1. Thiamin (vitamin B ỉ)
Vitamin BI đóng vai trị quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết

cho các hoạt động chức năng của con người, đồng thời cũng là một nhân tổ
enzym liên quan đến cơ chế trao đổi chất của cacbohydrat và các amino axit
mạch nhánh. Nó giữ vai trị hàng đầu trong chức năng của hệ thần kinh trung
ương và ngoại biên. Đối với hệ thần kinh: Vitamin BI là một chất chuyển vận
thần kinh có dẫn truvền xung động thần kinh tại hệ thần kinh trung ương (não,
tủy sống) cũng như hệ thần kinh neoại biên (mạng lưới thần kinh nổi liền hệ
4


thần kinh trung ương với cơ và các nội tạng). Vai trò của B 1 cũng rất quan trọng
trong chức năng của cơ nói chung và tim nói riêng, cũng như đối với trí nhớ.
Đối với tế bào: Vitamin BI giữ vai trị chủ đạo trong chuyển hóa năng lượng,
nhất là chuyển hóa glucid, vitamin BI cho phép và điều hòa khả năng sử dụng
glucid. Nếu tổ chức thiếu vitamin BI thì khả năng chuyển hóa glucid sẽ khơng
đủ và glucose, thức ăn chính của tế bào thần kinh cũng bị thiếu.
Phần lớn thức ăn đều mang lại Vitamin B l, nhưng với hàm lượng thấp.
Trước đây, Vitamin BI được cung cấp bởi bánh mì, mà nhu cầu tiêu thụ bánh mì
ngày nay giảm nhiều. Ngồi ra, Vitamin BI bị mất đi trong q trình chế biến:
có 0,25mg Vitamin BI trong lOOg bánh mì tồn phần và chi 0,08mg BI trong
bánh mì trắng.
1.2.2.2. Riboflavin ịvitamin B2)
Riboflavin (vitamin B2) mặc dù được xếp vào nhóm vitamin tan trong
nước nhưng tính tan trong nước của vitamin B2 rất yếu, nó ổn định trong môi
trường axit, rất không ổn định trong môi trường kiềm. Dị hóa axit béo và một
vài axit amin. Những phản ứng khử ôxi dẫn đến tổng hợp ATP cho phép con
người cất giữ năng lượng. Ngoài ra, vitamin B2 với magie rất cần thiết q trình
hoạt hóa vitamin B6 và B3. Điều này có nghĩa Ịà thiếu magie hoặc B2 có thể
đưa đến thiếu B 6 và B3 thứ phát. Cuối cùne, vitamin B2 còn cần thiết để khử
glutathion, chất khử độc quan trọng của cơ thể. Vitamin B2 bền vững với nhiệt
nhưng dễ bị phân hủy dưới tác dụng của tia cực tím. Nêu phần lớn thực phẩm,

người ta thấy vitamin B2 được kết hợp với protein thì 90% vitamin B2 được tìm
thấy ở dạng tự do trong sữa. Vitamin B2 được tìm thấy nhiều trong gan, trứng,
nấm, sữa chua...
1.2.2.3. Niacin (vitamin PP)
Nicacin (vitamin B3) được xem như một vitamin mà con người có thể
tổng hợp từ tryptophan. Đó là vitamin ổn định nhất, tan trong nước và ancol. Nó
bền vững với sự ơxi hóa, mơi trường kiềm cũng như nhiệt độ và ánh sáng. Nó có
trong tất cả các tổ chức, rất nhiều ở gan. Vitamin pp là tiền chất của hai
coenzym chủ yếu trone nhiều phản ứne sinh hóa cho phép tơng họp năng lượng
và gen.

5


Nguồn cung cấp vitamin B3 trong tự nhiên chủ yếu từ gan, thịt gà, cá hồi,
cá ngừ, nấm, rau xanh đã nấu...
1.2.2.4. Axit Pantothenic (vitamin B5)
Axit pantothenic (vitamin B5) là một vitamin tan trong nước, đồng thời
cũng là một nhân tố enzym liên quan đến cơ chế trao đổi chất của các axit béo,
và sữa là nguồn cung cấp quan trọng axit pantothenic.
1.2.2.5. Pyridoxin (vitamin B6)
Pyridoxin (vitamin B 6 ) là một vitamin tan trong nước có liên quan đến cơ
chế trao đổi chất của protein và glycogen (năng lượng tích trữ trong gan và cơ)
và trong cơ chế trao đổi chất của sphingolipit trong hệ thần kinh. Phàn lớn B 6 có
trong gan vì những tế bào gan tổng hợp coenzym hoạt động được xuất phát từ
pyridoxin và các dẫn xuất của chúng, trước khi mang đến hệ tuần hồn. Người ta
cịn tìm thấy vitamin B 6 trong não, huyết tương và hồng cầu. Vitamin B6 ổn
định với nhiệt độ và bền vững trong mơi trường ơxi hóa, nhưng bị phân hóa bởi
nhiệt độ trong dung mơi trung tính hay kiềm. Ngồi ra, q trình tiến hành đơng
lạnh nhanh thực phẩm khơng làm biến đổi tính chất của vitamin này. Vitamin

B6 , giống như coenzym, tham gia hơn 100 phản ứng chủ yếu của q trình
chuyển hóa axit amin. Trong số những phản ứng khác từ cuộc sống, nó được sử
dụng trong : tổng hợp một thành phần khử độc của muối mật, chất này đóng vai
trị làm dịu não, tổng hợp chất trung gian thần kinh quan trọng, giống như
serotonin và GABA, những chất này cần thiết cho tiến trình kiểm sốt lo lắng,
tính miễn dịch, tổng hợp hemoglobin, cầu nối( tạo keo) cần thiết để làm chắc
xương. Vai trị của nó cũne quan trọng và phức tạp. Neu thiếu B6 sẽ gây ra
những ảnh hưởng trầm trọng trong nhiều lãnh vực: tâm thần, giảm miễn dịch.
Người ta tìm thấy B 6 trone nhiều thực phẩm, đặc biệt, trong nhóm thực
phẩm giàu những vitamin nhóm B khác như: gan. cá, thịt, rau xanh, cải bông,
đậu haricot, chuối.
1.2.2.6. M uốifo la t (vitamin B9)
Năm 1940, thuật ngữ axit folic được đặt cho một chất cần thiết trong quá
trình tăng trưởng của liên cầu khuẩn, nó được tìm thấy trong lá rau bí na. Thuật
ngữ folat là chune và đặt tên cho một họ hợp chất mà axit folic để xem là phức
hợp cơ bản. Axit folic là cơ sở chính của nhiều coenzyme. Folat tham gia quá
6


trình tạo ra tế bào mới và duy trì sự tồn tại của chúng, nó đặc biệt quan trọng
trong giai đoạn phân chia và lớn lên nhanh của tế bào như ở trẻ sơ sinh và phụ
nữ mang thai. Chất này cần thiết trong việc nhân đôi ADN và giúp tránh quá
trình đột biến ADN (vốn là một yếu tố gây ung thư). Trong nhiều phản ứng tổng
hợp, những coenzyme này tham dự vào quá trình trưởng thành và phân chia tế
bào. Nó có vai trị quan trọng ở nhiều mức khác nhau: Tạo ra những tế bào máu,
thiếu axit folic dẫn đến thiếu máu. Hệ thần kinh trung ương, vì folat tham gia
vào quá trình tổng hợp nhiều chất dẫn truyền thần kinh như: Dopamin,
adrenalin, noradrenalin. Rối loạn thái độ, tinh thần chậm chạp xảy ra là do sai
lầm của chuyển hóa folat. Nguồn gốc của những rối loạn này vẫn chứa được
sáng tỏ, nhưng người ta biết rằng tính tồn bộ của các phản ứng mà vitamin B9

là cơ sở rất cần thiết cho quá trình phát triển bình thường cũng như cho hoạt
động nhịp nhàng của tất cả hệ thần kinh. Nó cần thiết trong nhiều trường hợp :
Tổng hợp axit nucleic (AND, ARN) tạo nên gen. Trong metyl hóa axit nucleotit,
điều này dường như quan trọng trong ngăn ngừa ung thư. Tổng hợp methionin,
axit amin đồng thời lọc homocystein làm giảm huyết khối và xơ vữa động mạch.
Tổng hợp protein.
Trong thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật, vitamin B9 bị phá
hủy nhanh bởi ôxi hóa và nhiệt. Vi khuẩn đường một tạo nguồn gốc cung cấp
phụ thêm nhưng rất ít. B 6 được tìm thấy nhiều trong nấm, cà rốt, khoai tây,
sữa...
1.2.2.7. Cyanocobalamìn (vitamin B I2)
Vitamin B12 là một phân tử lớn chứa ở trung tâm một hạt nhân cobalt.
Trong cơ thể, nó tồn tại dưới dạng bốn dẫn xuất mà người ta gọi là cobalamin và
hoạt động như các yếu tố enzyme. B 1 2 rất nhạy cảm với ánh sáng, và tương đối
ổn định với nhiệt độ (cho đến 1200°C), bền vững với q trình ơxi hóa. B12 ít
tan trong rượu và dịch hữu cơ, nhưng dễ hòa tan trong nước. B 1 2 sẽ bị mất đi
trong thức ăn khi thức ăn được rửa và nấu trong nước. Dự trữ toàn bộ của tổ
chức về vitamin B12 vào khoảng 3 đến 4mg, chủ yếu được chứa ở trong gan.
Mức độ dự trữ này đủ bảo đảm lượng vitamin B12 cần thiết trong 5 năm.
Vitamin B12 là đồng yếu tố của hai loại phản ứng men thiết yếu: đồng phân
hóa, vận chuyển nhỏm metyl (transmethyl hóa). Hai loại phản ứng này có những
vai

trị

quan

trọng

liên

quan
7

đến

những

vấn

đề

sau:


Tạo máu: Trong tủy xương, vitamin B12 can dự vào cùng một lúc quá trình
trưởng thành và sự nhân lên của hồng cầu. Trường hợp thiếu vitamin B I2, suy
nhiều dịng tế bào dẫn đến tăng kích thước của các tế bào được sinh ra.
Tính tồn vẹn của hệ thần kinh: Thiếu vitamin B12 đưa đến thoái biến dây thần
kinh ngoại biên, tủy sống và đôi khi não. Điều này bắt đầu bởi tổn thương vỏ
bảo vệ của các đầu tận cùng dây thần kinh, myéline.
Tính hiệu quả của hệ miễn dịch, và đặc biệt tiết ra kháng thể. Quá trình nhân đơi
của ADN trong tế bào. Tổng hợp methionin.
Nhìn chung, vitamin B12 rất cần thiết cho quá trình nhân lên của tế bào.
Thiếu B12 ảnh hưởng một cách đặc biệt đến tất cả các mơ mà trong đó q trình
nhân đơi xảy ra nhanh chẳng hạn ở máu, niêm mạc ruột non, nội mạc tử cung.
Vitamin B12 tham gia vào chức năng của hệ thống thần kinh (trí nhớ, khả năng
học...) và q trình phát triển hài hịa ở trẻ em. Nó cịn có tác dụng chống mệt
mỏi và kích thích.
Nguồn cung cấp chủ yếu vitamin B12 là động vật, đặc biệt ở gan, bò, heo,

cá, thịt, thức ăn biển, trứng.
1.2.3. Độc tính của các vitamin nhóm B
Mặc dù các vitamin nhóm B là tan trone nước và thường xuyên được thải
qua đường nước tiểu, tuy nhiên một số vitamin sẽ có hại cho cơ thể nếu được sử
dụng với một lượng lớn [12, 13]. Bảng 1.2 dưới đây liệt kê mức độ hấp thụ cho
phép đối với một số vitamin:

8


Bảng 1.2: Mức hấp thụ cho phép đối với một sổ vitamin
Vitamin

Mức hấp thụ tối đa

Tác dụng phụ

trong 01 ngày

Không gây độc cấp khi sử dụng qua
đường uống. Có một số bài báo đề cập
Vitamin BI
Thiamin

đến hiện tượng anaphylaxis xảy ra do
Không giới hạn

tiêm trực tiếp thiamin liều cao vào
thành mạch hoặc bắp. Tuy nhiên, liều
lượng này lớn hơn lượng cơ thể có thể

hấp thụ cơ học qua đường uống [13].

Vitamin B2
Riboflavin
Vitamin B3
(hay PP)
Nicacin

Không giới hạn

Không gây độc cấp

35 mg/ngày từ thuôc Mân đỏ (nôi đỏ da, mân ngứa)
bổ sung vtamin hoặc Hấp thụ 3000 mg/ ngày nicotinamide
từ thực phẩm chức và 1500 mg/ ngày gây buồn nơn, nơn
mửa, có triệu trứng ngộ độc gan [13].

năng

Vitamin B5
Ax it

Không gây độc cấp

Không giới hạn

Pantothenic
100

mg/ ngày từ

Vitamin B 6

thuốc bổ sung

Giác quan thần kinh, tổn thương da

Pyridoxine

vitamin hoặc từ thực

[1 2 ]

phẩm chức năng
1

Vitamin B7
Biotin
Vitamin B9

Không gây độc cấp

Không eiới hạn
1
1

thế dẫn đến tổn thương hệ thần kinh ở

mg/ ngày

Axit folic
--------------------—

ị-

Vitamin B12
Cyanocoba-

Thiêu hụt trườne diên vitamin B I2, có
phụ nữ mans thai [13].
Chưa có

Khơng giới hạn

thơng tin

lamin

9


1.2. Cơ sở lỷ thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [14-16]
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân
tích lên hai pha : pha thường đứng yên, có khả năng hấp thụ chất phân tích, gọi
là pha tĩnh; pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động. Dựavào ái

lực khác

nhau của các chất phân tích với pha tĩnh, chúng di chuyển vớitốc độkhác nhau
và tách ra khỏi nhau.

Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha động
khi tiến hành sắc ký. Đó là kỹ thuật sắc ký khí (pha động là chất khí) và kỹ thuật
sắc ký lỏng (pha động là chất lỏng). Trong sắc ký ỉỏng hiệu năng cao với pha
động lỏng bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng tùy theo bản chất của
quá trình sắc ký pha tĩnh trong cột tách như :
-

sắc ký hấp phụ : gồm 2 loại : pha thường (normal phase NP), và pha

ngược hay pha đảo (reverse phase RP)
-

sắc ký phân bố (partition chromatography PC)

-

sắc ký trao đổi ion (IE) và cặp ion (IP)

-

sắc ký rây phân tử FG

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu chủ yếu bằng phương
pháp sắc ký lỏng pha ngược. Đây là một trong các phương pháp được áp dụng
rộng rãi nhất trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. Đối tượng phân tích của phương
pháp rất đa dạng: các mẫu phân tích trong nông nghiệp (các chất dinh dưỡng,
các loại độc tố...), các sản phẩm trong công nghiệp (poỉyme thiên nhiên, tổng
hợp, thuốc nhuộm...), các mẫu nước (phân tích hàm ỉượng các hidrocacbon
thơm, sản phẩm chuyển hóa các q trình clo hóa...), các mẫu phân tích trong
dược phẩm...

Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của thiết bị HPLC
Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC gồm 3 phần chính:
-

Phần đầu vào cung cấp pha động và mẫu phân tích. Trong sắc ký pha

thường, pha động là các dung mơi khơng phân cực, cịn trong sắc ký pha đảo,
ngược lại, dung môi phân cực như nước, metanol và axetonitrin rất hay được sử
dụng. Người ta thường sử dụng hỗn hợp các dung mơi để có độ phân cực phù
hợp với phép phân tích. Đây là một trong các ưu điểm của sắc ký pha đảo. Pha

10


động phải thỏa mãn các điều kiện như: trơ với pha tĩnh, bền vững trong thời gian
chạy sắc ký, có độ tinh khiết cao, phù hợp với detector và không quá đắt.
-

Phần tách, là phần trung tâm của phép sắc ký bao gồm cột tách, và có thể

kèm theo các phần phụ trợ khác. Ba yếu tố chính : đường kính cột, kích cỡ hạt,
và chất nhồi cột (pha tĩnh) ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng phân tích mẫu.
Pha tĩnh thơng dụng nhất là silicagen có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân
cực, thông dụng nhất là -C i 8H37. Khoảng 61% các cơng trình sủ dụng loại cột
chứa pha tĩnh này. Nó được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa
dạng, từ khơng phân cực đến rất phân cực.
-

Phần phát hiện và sử lý số liệu bao gồm các detector và hệ thống máy tính

ghi và sử lý số liệu. Các loại detector dùng trong HPLC dựa theo các tính chất
khác nhau của chất:
Bảng 1.3: Các loại detector và phạm vi ứng dụng trong HPLC
Tính chất để phát hiện

Tên detector

Phạm vi sử dụng (%)

Sự phát xạ nguyên tử

Đo phổ phát xạ nguyên tử

~

Hấp thụ quang UV-VIS

Đo phổ ƯV hay UV-VIS

-4 0

Huỳnh quang

Đo phổ huỳnh quang

-1 5

Tính chất điện hóa

Đo dịng, điện trở, đo thế

~

Chi số chiết suất

Đo chiết suất

~2

Độ dẫn nhiệt

Đo độ dẫn nhiệt

~5

về khối lượng ion chất

Khối phổ

~ 18

10

8

1.3. Tổng quan các phương pháp xác định vitamin nhóm B bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trên thực tế, trong vòng 20 năm trở lại đây phương pháp HPLC đã được
sử dụng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong nước, trong các loại thực
phẩm và thực phẩm giàu dinh dưỡng. Phương pháp HPLC sử dụng detector u v

đã được sử dụne thành cơng trong việc phân tích thiamin BI và riboflavin trong
các mẫu ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc [5] và thiamin, riboflavin, niacin


trong gạo và sản phẩm gạo [7]. Trong đối tượng thực phẩm là thịt, thiamin và
riboflavin được xác định bằng việc sử dụng detector huỳnh quang [17]. Các loại
thực phẩm khác nhau rất quan trọng đối với quá trình phân tích do bản chất và
hàm lượng của các thành phần khác nhau trong các đối tượng thực phẩm sẽ ảnh
hưởng đến tính hiệu quả của phương pháp tách. Esva Barma và cộng sự đã thiết
lập một phương pháp HPLC phù họp với detector u v sau một quá trình rửa cột
để xác định thiamin và riboflavin trong các mẫu thịt và gan, hay F.Arella và
cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược sử dụng detector huỳnh
quang để xác định thiamin và riboflavin trong thực phẩm.
Năm 1979, Toma và Tabekhia [7], áp dụng phương pháp phân tích RPLC với sắc ký lỏng sử dụng cặp ion trong pha động và cột tách pha ngược, đã
thu được các kết quả tốt trong việc phân tích thiamin, riboflavin và niacin. Kể từ
đó, nhiều phương pháp sắc ký lỏng pha ngược (RP-LC) sử dụng cặp ion đã
được triển khai để xác định các vitamin tan trong nước, áp dụng cho nhiều đối
tượng thực phẩm khác nhau, như gạo [27], tách các hỗn hợp khoáng vitamin
[18], sữa [6 ], trứng [19]. Tuy nhiên, phương pháp sắc ký cột tách pha ngược với
thuốc thử cặp ion có nhược điểm do sự phức tạp của pha động dẫn đến thời gian
ổn định cột lâu hơn và tổng thời gian phân tích lên tới hơn 50 phút [20].
Ngoài ra, từ năm 1987 phương pháp sắc ký lỏng pha ngược sử dụng cặp
ion cũng được xem là một phương pháp chính thức được áp dụng trong việc xác
định vitamin B 1 và B2, trong đó bao gồm cả bước thực hiện dẫn xuất trước cột
cho thiamin thành thiochrome và sử dụng ánh sáng huỳnh quang để phát hiện,
phương pháp này được sử dụng rộng rãi tại các phịng thí nghiệm kiểm nghiệm
thực phẩm tại Pháp. Cùng với thời gian, người ta nhận thấy phương pháp này
cho hệ số thu hồi thấp, đặc biệt trong xác định vitamin BI trong thực phẩm có
mặt socola. Giải thích cho lý do này, người ta cho rằng cần phải hiệu chỉnh lại
phương pháp bằng cách kiểm nghiệm trên phạm vi rộng các đối tượng thực

phẩm khác nhau thông qua các nghiên cứu hợp tác giữa nhiều phịng thí nghiệm
khác nhau [2 1 ].

12


1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược (RP-HPLC) sử dụng detector
PDA (Photo diode array)
Trong các nghiên cứu gần đây, kỹ thuật tách 9 vitamin nhóm B: thiamin B l; Riboflavin - B2; nicacin - B3; pyridoxine-B 6 ; pyridoxal (PL); folic axit-B9;
cyanocobalamine-B12 đã được tối ưu hóa bàng việc sử dụng detector PDA
(photo-diode - array). Kỹ thuật tách pha ngược khơng có cặp ion tạo thành kết
hợp với một pha tĩnh amit mới với nhóm chức đi kèm của chất trimethylsilyl
cũng đã được thực hiện. Phương pháp này dựa trên việc kết hợp hai bước: loại
bỏ axit và tách enzyme để giải phóng ra protein và xác định các vitamin bằng
phương pháp sắc ký lỏng HPLC. Phương pháp này đã rất thành công trong việc
áp dụng xác định các vitamin nhóm B trong các sản phẩm thực phẩm cho trẻ em
như sữa bột trẻ em, sản phẩm nguồn gốc đậu nành, ngũ cốc, các sản phẩm nguồn
gốc từ hoa quả. Quá trình tách sử dụng cột tách amide là một tiến bộ mới so với
các phương pháp đã có do hình dáng của pic khá hẹp và tuổi thọ của cột thì dài
hơn do áp dụng pha động đơn giản.
Pilar và các cộng sự [9] đã thực hiện tách một số vitamin tan trong nước
trong sữa bột trẻ em bằng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược. Quá trình phân
tích sử dụng dựa trên pha tĩnh amide mới, việc sử dụng này nhằm tránh phải sử
dụng kỹ thuật tách cặp ion, giúp cho chân pic được thu hẹp lại và một pha động
đơn giản. Kỹ thuật phân tích sử dụng chế độ tách gradient với pha động ACNđệm photphat sử dụng detector PDA (photo - diode- aưay). Kết quả cho thấy
phương pháp cho độ tuyén tính, độ chính xác, độ nhạy và hệ số thu hồi tin cậy.
Phương pháp này áp dụng thành công cho việc xác định các vitamin: thiamin,
riboflavin, nicotinamide, pyridoxine, folic axit, cyanobalamine trong các thực
phẩm trẻ em khác nhau như: sữa bột trẻ em, ngũ cốc và các sản phẩm hoa quả.
Theo Alberto Zafra-Gomez và cộng sự [8 ] đã phát triển phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định đồng thời 08 vitamin tan trong nước
trong các mẫu sữa bột và sữa tươi. Các vitamin này là các vitamin thường có
mặt trong nhiều loại thực phẩm bổ sung (sữa bột trẻ em, sữa trẻ em, sữa giàu
vitamin). Các vitamin bao gồm: thiamin, riboflavin, pantothenic axit, pyridoxin,
folic axit, cyanocobalamin và axit ascobic. Quá trình tách các vitamin sử dụng
hệ thống HPLC 2695 Alliance (Waters, Milford, MA), detector PDA 2996, cột
tách C18 Waters Spherisorb ODS-2 (25 cm

13

X

4.6 mm, 3 |im); nhiệt độ cột 40°c,


tốc độ dịng lml/phút. Q trình chạy pha động sử dụng hai kênh A và B với
đệm photphat và dung mơi ethanol. Q trình chạy gradient tổng cộng là 30 phút
với tỉ lệ thành phần hai kênh được đặt thay đổi theo thời gian: 94/6 sau 4 phút;
70/30 sau 12 phút; 60/40 sau 17 phút và quay trở lại điều kiện ban đầu sau 22
phút và giữ trong

8

phút để đưa điều kiện cột về trạng thái ban đầu.

Gần đây, Maria và các cộng sự [24] cũng sử dụng phương pháp HPLC với
detector PDA để xác định đồng thời 5 vitamin B tan trong nước, với cột phân
tích Restek Ultra Aqueous C l 8 (250 mm X 4.6 mm, 5 |im). Quá trình chạy pha
động sử dụng hai kênh A (CH 3COONH 4/CH 3O H : 99/1) và kênh B
(CH 3OH/H 2O : 50/50).

1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion sử dụng cột tách pha ngược RP-LC,
detector u v -VIS
Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector UV-Vis được ứng dụng
nhiều hơn cả [7, 18, 19, 25], mặc dù detector u v vốn đã có độ nhạy thấp hơn so
với sử dụng detector huỳnh quang, tuy nhiên quá trình xử lý mẫu cho detector
u v thì đơn giản hơn nhiều so với sử dụng detector huỳnh quang do khi sử dụng
detector huỳnh quang cần phải thực hiện dẫn xuất cho các vitamin để thu được
dẫn xuất ánh sáng huỳnh quang tương ứne [2 1 ,

2 2 ],

ngoại trừ trường hợp của

vitamin pyridoxine và riboflavin, hai vitamin vốn có sẵn đáp ứng huỳnh quang
tự nhiên. Hơn nữa ưu điểm của việc xác định nhiều hợp chất trong chạy sắc ký
đơn mang lại cho các nhà phân tích thực phẩm một sức hút khác đối với việc xác
định các vitamin.
Năm 1997, Soledad Albalá-Hurtado và cộng sự [23] đã phát triển phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để xác định đồng thời 06 vitamin tan
trong nước (nicotinamit, thiamin, riboflavin, pyridoxin, pyridoxal, pyridoxamin,
cyanocobalamine và axit folic) trong mẫu sữa bột và sữa tươi. Sử dụng phương
pháp sắc ký cặp ion với cột tách pha ngược Ci8 - Tổng thời gian phân tích cho
các vitamin này là 55 phút; pha động metanol-nước (15:85), 5 mM
octanesulfonic axit với 0.5 % triethylamine tại pH = 3; tốc độ dòng 1.0 ml/phút;
detector ƯV tại các bước sóng khác nhau. Với các điều kiện sắc ký như trên đã
cho kết quả tách có độ tin cậy cao về: độ tuyến tính, độ chính xác và độ nhạy
của phương pháp. Giới hạn phát hiện nằm trong khoảng từ 0.02 đến 0.1 mg/1.
Giới hạn định lượng năm trong khoảng từ 0.03 đên 0.25 mg/ì.

14

Năm 2005, Amizic và cộng sự [25] nghiên cứu xác định các vitamin B l,
3, 6 , 9 và 12 trong thuốc đa vitamin. B12 được phân tích riêng biệt vì hàm lượng
thấp hơn hẳn so với các vitamin B khác. Cột phân tích Suplex pKb-100 (150
mm X 4.6 mm, 5 |im) với hệ dung môi pha động MeOH/H2() (22/78 V/V). Bốn
vitamin cịn lại được phân tích trên cột Supelcosil ABZ+ (150 mm X 4.6 mm, 5
ịim) với hệ dung môi pha động MeOH - 5mM natriheptasunfonat và 0,1% TEA,
pH = 2,8. Độ thu hồi của phương pháp đạt giá trị từ 90,4 đến 108,5%, với độ
lệch chuẩn RSD từ 0,5 đến 4,1%.
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang
Phương pháp này chủ yếu dùng để tách các ion có sẵn ánh sáng tự nhiên
huỳnh quang do đa số các vitamin khơng có ánh sáng huỳnh quãng nên muốn
thực hiện tách các vitamin này thì cần thực hiện dẫn xuất trước cột cho các
vitamin này.
Nhiều bài báo đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng
detector huỳnh quang để xác định hàm lượng của vitamin B 6 và vitamin B2 là
hai vitamin có ánh sáng huỳnh quang tự nhiên.
Theo M. Bergaentzle và cộng sự [10], quá trình tách vitamin B6 trong các
mẫu sữa bột, bột dinh dưỡng trẻ em, ngũ cốc... được thực hiện bằng phương
pháp sắc ký cặp ion/detector huỳnh quang; pha động sử dụng kali hidro photphat
có chứa sodium octane sulfonat/acetone nitrile, detector huỳnh quang được sử
dụng ở bước sóng kích thích là 290 nm và ở bước sóng phát xạ là 395 nm. Kết
quả phân tích cho thấy: độ lặp lại của phương pháp nằm trong khoảng từ 3 - 18
% và phụ thuộc vào nồng độ của vitamin trong các mẫu khác nhau.
Theo F. Arella và cộng sự [21], quá trình tách vitamin BI và B2 trong các
mẫu sữa bột, ngũ cốc, sữa chua, bột dinh dưỡng trẻ em ...được thực hiện bằng
phương pháp sắc ký lỏng pha ngược/detector huỳnh quang; pha động metanol
0.05M/natri axetat (30: 70, v/v); tốc độ dòng 1 ml/phút; detector huỳnh quang
được sử dụng ở bước sóng kích thích là 366nm và ở bước sóng phát xạ là 435

nm cho vitamin BI và 422 - 522 nm cho vitamin B2. Ket quả phân tích cho
thấy: hệ số thu hồi của phương pháp luôn đạt trên 89%.

15


II. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
2.1. Muc tiêu
m

Đe xác định hàm lượng các vitamin B trong dược phẩm và thực phẩm, có
rất nhiều phương pháp phân tích đã được nghiên cứu và áp dụng để phân tích
riêng rẽ hoặc đồng thời các vitamin nhóm B như phương pháp điện hóa [1],
động học huỳnh quang [2 ], phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi
qui đa biến hoặc đạo hàm [3, 4], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [5-7].
Trong các phương pháp này, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao RP-HPLC,
detector u v với cột tách c 18 [8 , 9] được sử dụng một cách rộng rãi do khả năng
tách rất tốt các vitamin và đáp ứng được cả yêu cầu cho phân tích đồng thời
lượng khơng nhỏ các vitamin nhóm B trong dược phẩm và lượng vết vitamin
trong thực phẩm, đồng thời có thể phát hiện trực tiếp sau khi tách mà khơng phải
dẫn xuất hóa như phương pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang [10].
Dựa trên tình hình thực tế, chúng tơi nghiên cứu xây dựng qui trình phân
tích hàm lượng các vitamin Bl, B2, B3, B6, B I2 bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao pha đảo, chế độ rửa giải gradient để góp phần kiểm tra đánh giá,
hàm lượng các vitamin trong dược phẩm và thực phẩm, từ đó có thơng tin chính
xác về hàm lượng thành phần các vitamin so với các giá trị công bố trên nhãn
sản phẩm.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Đẻ đạt được mục tiêu đề ra, một số vấn đề nghiên cứu cần được thực hiện:
- Khảo sát độ hấp thụ quang cực đại tương ứng với từng vitamin B l, B2,

B3, B 6 , và B12.
- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới q trình tách và phân tích một số
vitamin B (B l, 2, 3, 6 , 12): nghiên cứu tìm và chọn những điều kiện tối ưu các
thơng số cột tách, pha động (thành phần pha động, chế độ rửa giải, pH, tác nhân
tạo cặp...) để tách và xác định một số vitamin nhóm B bằng phương pháp HPLC.
- Khảo sát các điều kiện phân tích một số vitamin B khi có mặt các
vitamin nhóm khác (vitamin C).
- Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích tách và xác định đồng thời
các vitamin B l, 2, 3,

6

, 12 bàng phương pháp HPLC: xây dựng đường chuẩn,

giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp, đánh giá hiệu suất thu hồi cùa
phương pháp.
16