Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Thị Thơm

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CÓ HOẠT TÍNH
CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 2020


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Thị Thơm

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CÓ HOẠT TÍNH

CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:

8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: PGS TS. Đỗ Thị Huyền
Hƣớng dẫn 2:

ThS. Trần Băng Diệp

Hà Nội, 2020


i

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần
đã đƣợc công bố tại hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả;
Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả

Nguyễn Thị Thơm


ii

Lời cảm ơn
Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
nhất tới hai ngƣời thầy: PGS TS. Đỗ Thị Huyền, Trƣởng phòng Kỹ thuật di
truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã cho tôi những kiến thức quí báu, chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ tôi
trong quá trình hoàn thiện luận văn; ThS. Trần Băng Diệp, Trƣởng phòng
Công nghệ Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện năng lƣợng Nguyên tử
Việt Nam - ngƣời thầy luôn bên cạnh tôi, truyền cho tôi cảm hứng nghiên cứu
khoa học, cho tôi những ý tƣởng những định hƣớng đúng đắn, chỉ bảo tôi các
kỹ năng cần thiết và luôn tận tình, gần gũi, tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt
quá trình tôi thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các anh chị trong Phòng Công nghệ
Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện năng lƣợng Nguyên tử Việt Nam đã
giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp những ý kiến quý báu cũng nhƣ tận tình chỉ dạy,
tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến
Ban lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện năng lƣợng Nguyên tử Việt Nam
đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian để học tập trong thời gian công tác ở Viện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa
học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc
học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài KHCN cấp bộ, mã số
ĐTCB 01/18/TTCX: “Ứng dụng bức xạ gamma gây đột biến Trichoderma để
tạo chế phẩm phân giải nhanh rơm rạ trên đồng ruộng” do ThS Trần Băng
Diệp làm chủ nhiệm.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những ngƣời thân
trong gia đình và những ngƣời bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và
khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả
Nguyễn Thị Thơm


iii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

Tên tiếng việt

ADN

Axit deoxyribonucleic

ADN

ARN

Axit ribonucleic

ARN

CBD

Cellulose binding domain

Vùng liên kết cellulose

CMC

Carboxyl methyl cellulose

Cơ chất CMC

DNS

Axit 3,5- dinitrosalicylic

Thuốc thử DNS

FPase

Filter paper activity

Hoạt độ thủy phân giấy lọc

Gy

Gray

Gy

HC

Hydrolysis capacity

Khả năng thủy phân

kDa

Kilo Dalton

kDa

LET

Linear Energy Transfer

Hệ số truyền năng lƣợng
tuyến tính

MT

Môi trƣờng

Môi trƣờng

PDA

Potato destrose agar

Môi trƣờng khoai tây

TB

Tế bào

Tế bào

VSV

Vi sinh vật

Vi sinh vật


iv

Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Giá trị của LET trong MT nƣớc (nguồn: ICRU 1995) ................... 17
Bảng 2.1. Các chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp cellulase ....... 21
Bảng 3.1. Hình thái khuẩn lạc các chủng Trichoderma sau 5 ngày nuôi cấy
trên MT PDA ................................................................................................... 28
Bảng 3.2. Khả năng sinh cellulase của các chủng Trichoderma .................... 32
Bảng 3.3. Giá trị HC của chủng T. koningiopsis VTCC 31435 sau nuôi cấy
28oC trong 24 giờ và ủ ở 37oC trong 5 ngày ................................................... 34
Bảng 3.4. Khả năng thủy phân cellulose ở các khuẩn lạc T. koningiopsis xử lý
chiếu xạ liều khác nhau ................................................................................... 40
Bảng 3.5. Giá trị HC của 05 khuẩn lạc T. koningiopsis có khả năng sinh
cellulase cao tạo đƣợc bằng chiếu xạ .............................................................. 43
Bảng 3.6. Hoạt độ CMCase của 2 chủng sau chiếu xạ VTCC I-1 và VTCC I-3
sau 4 lần cấy truyền ......................................................................................... 50

v

Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Cấu trúc không gian các loại cellulase .............................................. 5
Hình 1.2. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose và phức hệ cellulosome ........... 6
Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc Trichoderma trên môi trƣờng PDA ................ 11
Hình 1.4. Bào tử của Trichoderma.................................................................. 13
Hình 1.5. Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới ADN ......... 16
Hình 3.1. Vòng phân giải CMC của một số chủng Trichoderma sau nuôi cấy
28oC trong 24 giờ và ủ ở 37oC trong 3 ngày. .................................................. 34
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của chủng T. koningiopsis VTCC 31435 trên
MT PDA sau 5 ngày nuôi cấy ......................................................................... 35
Hình 3.3. Hình thái cơ quan sinh sản của chủng T. koningiopsis VTCC 31435
......................................................................................................................... 36
Hình 3.4. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng bào tử T. koningiopsis VTCC 31435
sống sót trong dịch bào tử và liều xạ. ............................................................. 37
Hình 3.5. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng lƣợng bào tử T. koningiopsis VTCC
31435 sống sót và liều xạ ................................................................................ 38
Hình 3.6. Sàng lọc các khuẩn lạc sinh cellulase cao từ dung dịch bào tử T.
koningiopsis VTCC 31435 chiếu xạ liều 700 và 1500 Gy ............................. 42
Hình 3.7. Vòng phân giải CMC của một số khuẩn lạc T. koningiopsis sau nuôi
cấy 28oC trong 24 giờ và ủ ở 37oC trong 5 ngày ............................................ 43
Hình 3.8. Hoạt độ CMCase và FPase của 05 khuẩn lạc T. koningiopsis có khả
năng sinh cellulase cao tạo đƣợc bằng chiếu xạ ............................................. 44
Hình 3.9. Chủng thuần T. koningiopsis và 02 thể đột biến nuôi cấy trên MT
PDA ở 28oC .................................................................................................... 48


vi

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................ 3
1.1. CELLULASE ............................................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu chung .................................................................................................3
1.1.2. Phân loại ...............................................................................................................4
1.1.3. Cơ chế tác động của cellulase ...........................................................................5
1.1.4. Nguồn thu nhận cellulase..................................................................................6
1.1.4.1. Vi khuẩn..............................................................................................................7
1.1.4.2. Xạ khuẩn.............................................................................................................7
1.1.4.3. Nấm.....................................................................................................................8
1.1.5. Các ứng dụng của nhóm cellulase...................................................................8
1.1.5.1. Ứng dụng trong công nghiệp ...........................................................................8
1.1.5.2. Ứng dụng trong xử lí môi trường.....................................................................9
1.1.5.3. Ứng dụng trong sản xuất phân bón ...............................................................10
1.1.5.4. Ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học ...............................................10
1.1.5.5. Ứng dụng trong kĩ thuật di truyền .................................................................10
1.2. SƠ LƢỢC VỀ NẤM Trichoderma VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
CELLULOSE CỦA Trichoderma .................................................................. 10
1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo Trichoderma ...............................................10
1.2.2. Hình thức sinh sản của Trichoderma............................................................12
1.2.3. Khả năng thủy phân cellulose của Trichoderma ........................................13
1.3. BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VSV - TĂNG
CƢỜNG KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA Trichoderma .................. 14
1.3.1. Đột biến ngẫu nhiên tăng hoạt độ cellulase ở chi nấm Trichoderma .....14
1.3.1. Bức xạ gamma ..................................................................................................15
1.3.2. Ứng dụng bức xạ ion hóa trong gây tạo đột biến ở VSV .........................17
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 21
2.1. VẬT TƢ, THIẾT BỊ ................................................................................ 21
2.1.1. Nguyên vật liệu..................................................................................................21

vii

2.1.2. Hóa chất..............................................................................................................22
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................................22
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 23
2.2.1. Bảo quản và giữ giống .....................................................................................23
2.2.2. Xử lý chiếu xạ ....................................................................................................23
2.2.2.1. Thu dung dịch bào tử nấm..............................................................................23
2.2.2.2. Chiếu xạ dung dịch bào tử..............................................................................23
2.2.2.3. Chiếu xạ thạch đĩa...........................................................................................24
2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào .................................................................................24
2.2.4. Định tính và định lƣợng cellulase..................................................................24
2.2.4.1. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch .......................................................24
2.2.4.2. Phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic) ...............................................25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 28
3.1.TUYỂN CHỌN CHỦNG Trichoderma CÓ KHẢ NĂNG SINH
CELLULASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN ............ 28
3.1.1. Tốc độ phát triền và hình thái khuẩn lạc các chủng Trichoderma .........28
3.1.2. Tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt tính cellulase cao và ổn định .31
3.1.2.1. Khả năng sinh cellulase của các chủng Trichoderma.................................31
3.1.2.2. Một số đặc điểm của chủng T. koningiopsis VTCC 31435 .......................34
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG NẤM T.
koningiopsis VTCC 31435 .............................................................................. 36
3.2.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của chủng nấm T.
koningiopsis VTCC 31435 .........................................................................................36
3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh cellulase của chủng
nấm T. koningiopsis VTCC 31435 ...........................................................................39
3.3. CÁC CHỦNG Trichoderma ĐỘT BIẾN PHÓNG XẠ CÓ KHẢ NĂNG

SINH CELLULASE CAO .............................................................................. 42
3.3.1. Sàng lọc các khuẩn lạc Trichoderma kháng xạ có khả năng sinh
cellulase cao ..................................................................................................................42
3.3.2. Hoạt độ cellulase của các khuẩn lạc tiềm năng ..........................................44
3.3.2.1. Hoạt độ CMCase.............................................................................................44


viii

3.3.2.2. Hoạt độ FPase .................................................................................................46
3.3.2.3. Hình thái chủng sau chiếu xạ có khả năng sinh cellulase cao....................47
3.3.2.3. Tính ổn định của chủng sau chiếu xạ có khả năng sinh cellulase cao.......49
KẾT LUẬN .................................................................................................... 51
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52
DANH MỤC PHỤ LỤC................................................................................ 59
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 60


1

MỞ ĐẦU
Việt Nam là nƣớc nông nghiệp có sản lƣợng lúa gạo đứng hàng đầu
thế giới với hàng triệu tấn rơm rạ để lại sau thu hoạch mỗi năm. Đốt rơm rạ
đã trở thành thói quen từ lâu của nông dân nhiều nƣớc Đông Nam Á trong
đó có Việt Nam. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng đốt rơm rạ ngay
trên đồng ruộng sẽ làm mất chất dinh dƣỡng của đất. Đốt đồng nhiều lần và
lâu dài sẽ làm cho đất biến chất và trở nên chai cứng, dẫn đến phát sinh
nhiều bệnh dịch hại lúa [1]. Ngoài ra, khói đốt rơm rạ gây nguy hại tới sức
khỏe do ô nhiễm bụi mịn - một loại bụi độc hại khi chui sâu vào phổi gây

các bệnh về hô hấp, thậm chí ung thƣ [2]. Không những thế, việc đốt rơm rạ
còn khiến Việt Nam đang phải đối mặt với hiện tƣợng sƣơng mù quang hóa
- một loại ô nhiễm không khí đặc biệt do sự tƣơng tác giữa bức xạ tia cực
tím của mặt trời với khí thải từ động cơ xe máy, khí thải công nghiệp, khói
từ cháy rừng, đốt nƣơng rẫy, rơm rạ theo mùa vụ… [2]. Để giải quyết vấn đề
này, đồng thời giảm đƣợc lƣợng phân bón sử dụng trong nông nghiệp thì
thủy phân rơm rạ ngay trên đồng ruộng theo cách tự nhiên là một lựa chọn.
Việc bổ sung thêm các loài vi sinh vật (VSV) có khả năng thủy phân
cellulose mạnh nhƣ một số loài nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn… vào nguyên
liệu chứa cellulose hay rơm rạ trên đồng sau thu hoạch giúp việc thủy phân
đƣợc nhanh chóng, triệt để, mang lại hiệu quả lâu dài và không gây ô nhiễm
cho môi trƣờng mà các thuốc hóa học không thể sánh kịp.
Trichoderma spp. là loại nấm sợi hiện diện gần nhƣ trong tất cả các
loại đất và trong nhiều môi trƣờng sống khác nhau. Nhờ việc nuôi cấy dễ
dàng, không tốn kém cùng với khả năng tiết enzyme cellulase hoạt độ cao
gấp vài trăm lần so với vi khuẩn [3], Trichoderma đã thu hút đƣợc sự quan
tâm đặc biệt. Cellulase ngoại bào từ một số chủng Trichoderma thƣờng tồn
tại dƣới dạng phức hệ enzyme (cellulosome) nhờ vậy mà chúng thủy phân
hiệu quả ở cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose [4].
Các tia X, , tia notron có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và
khả năng xuyên sâu cao. Các tia phóng xạ này có thể gây đột biến bằng cách
làm đứt gãy ADN, thay đổi cấu trúc của ADN hoặc hình thành các hợp chất


2

có hoạt tính không ổn định làm biến đổi ADN. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra
đột biến tại những vị trí xác định nhờ đó hoạt tính của VSV đƣợc cải thiện
[5]. Ngoài ra, gây đột biến bằng bức xạ có nhiều ƣu điểm nhƣ phổ đột biến
rộng, tần suất đột biến cao… do đó sẽ làm tăng khả năng chọn đƣợc đột biến

mong muốn và rút ngắn thời gian sàng lọc [6].
Để cải thiện khả năng sinh cellulase của Trichoderma nhiều nghiên
cứu gây đột biến chủng nấm này bởi bức xạ tia gamma đã đƣợc thực hiện.
Trong nghiên cứu của Shahbazi và cộng sự, hoạt tính cellulase của T. reesei
đã đƣợc cải thiện tăng 1,5-1,99 lần nhờ tác nhân đột biến tia gamma [4]. Khả
năng tiết cellulase của T. reesei cũng tăng lên 1,8 lần bởi xử lý chiếu xạ
gamma liều 2 kGy trong khảo sát của Tamada và cộng sự [7]. Trên cơ chất là
bã mía, chủng T. viride đƣợc xử lý chiếu xạ liều 20 krad 2 lần liên tiếp có
hoạt tính sinh cellulase tăng 253,5% thay vì chỉ tăng 134,5% khi xử lý một
lần ở cùng liều chiếu [8].
Với mục đích sử dụng bức xạ gamma tạo chủng Trichoderma đột biến
có khả năng sinh cellulase cao dùng làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm
phân giải nhanh rơm rạ ngay trên đồng ruộng, chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh
cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ” với các nội dung chính sau:
1. Tuyển chọn một số chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase
cao (từ bộ chủng giống của các phòng thí nghiệm và ngân hàng giống trong
nƣớc);
2. Đánh giá mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ tới tỷ lệ sống sót đối với
chủng nấm Trichoderma tiềm năng trong dung dịch bào tử và thạch đĩa;
3. Khảo sát ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tới tỷ lệ đột biến sinh cellulase
cao ở chủng nấm Trichoderma;
4. Sàng lọc các chủng Trichoderma sau chiếu xạ có hoạt tính sinh
cellulase cao;
5. Đánh giá tính ổn định của chủng sau chiếu xạ có khả năng sinh
cellulase cao Trichoderma.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. CELLULASE
1.1.1. Giới thiệu chung
Cellulase là một phức hệ enzyme có khối lƣợng phân tử khoảng 30 đến
110 kDa [9], có khả năng phân cắt cellulose và một số loại polysaccharide
tƣơng tự thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glucoside thành các
oligosaccharide và đƣờng đơn [3, 10]. Cellulase có bản chất là protein, đƣợc
cấu tạo từ các đơn vị là axit amin đƣợc nối với nhau bằng liên kết peptide CO-NH-. Ngoài ra, trong cấu trúc còn có các thành phần phụ khác tùy thuộc
vào vị trí phân bố và chức năng của mỗi loại cellulase. Cellulase từ các nguồn
khác nhau có khối lƣợng phân tử, thành phần cấu tạo, cấu trúc và trật tự sắp
xếp các axit amin khác nhau dẫn đến sự khác nhau về tính đặc hiệu cơ chất,
nhiệt độ và pH tối ƣu.
Nhiệt độ và pH ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác của enzyme,
mỗi enzyme có nhiệt độ và pH thích hợp riêng. Nhiệt độ và pH tối ƣu cho
hoạt động của cellulase ở chủng Trichoderma IS-5 trong nghiên cứu của
Nascimento và cộng sự là 60oC và 3,0 [11], các giá trị này trên chủng T.
reesei lần lƣợt là 30oC và 4,5 trong nghiên cứu Silas và cộng sự [12]. Cùng
hƣớng nghiên cứu, Vân và cộng sự khi đánh giá hoạt tính CMCase trên chủng
T. asperellum nhận thấy nhiệt độ và pH tối thích lần lƣợt là 55 oC và 4,0,
enzyme bền ở nhiệt độ thấp 10-30oC và chỉ hoạt động ở vùng pH axit 3,5-4,5
[13]. pH tối ƣu của một số chủng Trichoderma trong nghiên cứu của Singh và
cộng sự nằm trong khoảng 5,5-7,5, nhiệt độ tối ƣu 25-30oC. Môi trƣờng pH
axit đƣợc chứng minh là tối ƣu hơn cho sinh trƣởng và phát triển của hầu hết
các chủng Trichoderma [14]. Ngoài ra, hoạt độ CMCase đƣợc đánh giá chính
xác trong môi trƣờng pH axit, điều này đã đƣợc chứng minh bởi Singh và
cộng sự trên chủng một số chủng Trichoderma điển hình [14].
Trong giới hạn nhiệt độ chƣa làm biến tính enzyme, hoạt tính của
chúng tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì
hoạt tính của enzyme lại giảm. Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao,
một số liên kết yếu trong phân tử protein enzyme bị đứt gãy làm thay đổi cấu

4

trúc của phân tử này, đặc biệt là trung tâm hoạt động của enzyme, từ đó ảnh
hƣởng tới hoạt tính xúc tác của chúng [12].
Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc định hình cấu trúc
và không gian của phân tử enzyme hoặc nó có thể là nhân tố cần thiết trong
trung tâm hoạt động của enzyme. Các ion kim loại Cu2+, Fe2+, EDTA làm tăng
hoạt tính β-glucanase ở A. niger từ 12% lên 52%. Trong khi đó, các ion kim
loại khác nhƣ Mn2+, Co+, Ni2+ lại làm giảm hoạt tính endoglucanase ngay ở
nồng độ thấp. Hiệu ứng này đƣợc Tao và cộng sự lý giải là do các ion kim
loại bám vào các vị trí hoạt động của enzyme (ví dụ nhóm thiol) làm enzyme
giảm hoặc mất hoạt tính [15].
1.1.2. Phân loại
Dựa vào tính đặc hiệu cơ chất và cơ chế phân cắt, cellulase đƣợc chia
thành 3 loại: β-1,4- D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-1,4- D-glucan4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) và β-D-glucoside glucohydrolase (EC
3.2.1.21) [10].
β-1,4-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) có nhiều tên gọi khác
nhƣ
exoglucanase,
exoβ-glucanase
cellobiohydrolase,
exocellobiohydrolase, exo-β-1,4- glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan
cellobiohydrolase, cellobiohydrolase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase. Chúng
thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose để
tạo thành cellobiose.
β-1,4-D-Glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) còn có tên gọi khác
nhƣ endoglucanase, endo-β-1,4-D-glucanase, endo-1,4-endoglucan hydrolase,
carboxymethyl cellulase, celludextrinase, cellulase A, cellulosin AP, alka

cellulase, cellulase A3, 9,5 cellulase, avicelase, pancellase SS. Enzyme này
thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của chuỗi
cellulose, chenin và các β-D-glucan của ngũ cốc.
β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tên gọi khác nhƣ là βglucosidase,
β-D-glucosidase,
β-1,6glucosidase,
βglucoside
glucohydrolase, p-nitrophenyl, aryl-β-glucosidase, gentiobiase, cellobiase,
emulsion, elaterase, arbutinase, amygdanase, primeeverosidase, amygdalase,


5

marase, sacinase. Enzyme này thủy phân gốc β-D-glucoside không khử ở đầu
tận cùng để giải phóng ra β-D-glucose.

Hình 1.1. Cấu trúc không gian các loại cellulase [10].
Các loại enzyme này phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể thu nhận từ
nhiều nguồn các nhau nhƣ động vật, thực vật và vi sinh vật (VSV) [16]. Tuy
nhiên enzyme từ động vật và thực vật thƣờng không đƣợc sử dụng nhiều bởi
quá trình thu nhận và bảo quản phức tạp. Nguồn thu cellulase phong phú và
hiệu quả nhất từ VSV nhƣ Bacillus, Trichoderma, Aspergillus…
1.1.3. Cơ chế tác động của cellulase
Để quá trình thủy phân cellulose nhanh và triệt để phải có sự tham gia
của cả ba loại enzyme cellulase (endoglucanases, exoglucanases và βglucosidases). Nếu thiếu một trong ba enzyme trên, quá trình thủy phân
không thể đến cùng. Từ những nghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme
đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme này, nhiều nhà khoa
học đƣa ra kết luận chung là các loại enzyme sẽ thay phiên nhau thủy phân
cellulose để tạo thành sản phẩm cuối là glucose. Có nhiều cách giải thích khác

6

nhau về cơ chế tác động của cellulase, trong đó cách giải thích của Singh và
cộng sự đƣợc nhiều ngƣời công nhận hơn cả. Theo các tác giả, cơ chế tác
động hiệp đồng của 3 loại cellulase nhƣ sau: đầu tiên endoglucanases tác
động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucoside
và tạo ra các đầu tự do. Tiếp đó, exoglucanases tấn công cắt từng đoạn
cellobiose từ đầu mạch đƣợc tạo thành. Kết quả tác động của endoglucanases
và exoglucanases tạo ra các celloligosaccharide mạch ngắn, cellobiose,
glucose. β-glucosidases thủy phân tiếp và tạo thành glucose [14].

Hình 1.2. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose và phức hệ cellulosome (A. Cơ
chế tác động riêng rẽ từng loại enzyme; B. Cơ chế tác động hiệp đồng của
cellulosome [16].
Cellulase từ một số chủng Trichoderma thƣờng tồn tại dƣới dạng phức
hệ đa enzyme (cellulosome). Các cellulosome phân cắt đồng thời và triệt để
cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose tạo sản phẩm cuối cùng
trong khoảng thời gian ngắn hơn so với tác động riêng rẽ từng loại enzyme.
1.1.4. Nguồn thu nhận cellulase
Cellulase là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng,
từ động vật, thực vật, tới VSV. Ở động vật, cellulase thƣờng có trong
dịch tiết dạ dày bò, động vật thân mềm [19]. Ở thực vật, cellulase có thể
tìm thấy trong hạt ngũ cốc nảy mầm nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch
đen [9]. Nhờ những ƣu điểm nổi bật về tốc độ sinh trƣởng và phát triển của
VSV mà nguồn enzyme của chúng đƣợc quan tâm đặc biệt. Mặt khác, đối


7

với VSV, việc cơ giới và tự động hóa quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi
cấy có thể kiểm soát mà không phụ thuộc vào các yếu tố bên ngoài [20]
nên hầu hết các cellulase thƣơng mại đều có nguồn gốc VSV.
Không ít chủng VSV sinh cellulase đã đƣợc phân lập và khả năng
phân giải cellulose của chúng cũng đƣợc nghiên cứu đánh giá. Các VSV
phân giải cellulose chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa của động vật ăn
cỏ nhƣ bò, cừu, dê hay từ côn trùng nhƣ bọ cánh cứng, mối... Ngoài ra
chúng còn đƣợc tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nƣớc thải… [21].
1.1.4.1. Vi khuẩn
Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm nhiều loài khác nhau, điển hình
nhƣ Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens,
Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter
aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans,
Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata,
Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella
zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các
loài này phần lớn thuộc nhóm VSV kị khí, chúng đƣợc phân lập chủ yếu từ
ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn [22].
Các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí sinh cellulase nhƣ Brevibacllus,
Paenibacillus, Bacillus và Geobacillus thƣờng đƣợc phân lập từ lòng đất.
Đối với các dòng ƣa ấm thì pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme
carbonmethyl cellulase (CMCase) của chúng hoạt động là 5,5 và 55oC, với
các dòng ƣa nhiệt thì các giá trị này là 5,0 và 75oC [23].
1.1.4.2. Xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) dạng sợi nhƣ nấm.
Chúng là VSV hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. ADN của xạ
khuẩn rất giàu G+C chiếm 57-75 %, chúng chiếm ƣu thế trong đất phèn
khô [24]. Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là VSV
sinh cellulase đƣợc đặc biệt quan tâm. Một số loài đáng chú ý thuộc giống
này nhƣ Streptomyces reticu, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces

vidans [25]. Xạ khuẩn Thermoactimnomyces đƣợc tìm thấy trong trầm tích


8

đại dƣơng, hay Streptosporangium có trong quặng apatit cũng là những
loài thủy phân cellulose mạnh [26].
1.1.4.3. Nấm
Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất
tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm đƣợc nghiên cứu nhiều
nhất trong lĩnh vực thủy phân cellulose [27]. Sản phẩm cellulase từ nấm
thƣờng có hoạt lực cao và dƣờng nhƣ không có các dạng vật lý phức tạp
nhƣ enzyme thu nhận từ vi khuẩn. Acremonium spp., Chaetomium spp.,
Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicilum pinophilum,
Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii,
Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger,
Aspergillus terreus và Rhizopus oryzae đều có vai trò quan trọng trong
quy trình thủy phân cellulose ở nhiều môi trƣờng khác nhau [27].
Cellulase đƣợc sản xuất từ các chủng nấm thƣờng có sản lƣợng cao hơn
so với vi khuẩn [13]. Hầu hết các sản phẩm cellulase thƣơng mại đƣợc sản
xuất bởi các loài nấm thuộc chi Trichoderma và Aspergillus. Điều này cho
thấy nấm mốc là nguồn VSV tiết enzyme mạnh và có thể nghiên cứu ứng
dụng để sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp [8, 21]. Việc phân lập, xác
định các tính chất lý - hóa của các loại cellulase từ nấm Trichoderma đã đƣợc
nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu chẳng hạn CMCase từ T. reesei [4, 7, 17],
từ T. viride [3, 8] hay từ T. asperellum [28].
Ở Việt Nam, các enzyme thủy phân cellulose hoạt tính cao thu đƣợc từ
nhiều nguồn khác nhau nhƣ các loại nấm Trichoderma, A. awamori,
Penicilum hay từ các loại xạ khuẩn… [1, 13].
1.1.5. Các ứng dụng của nhóm cellulase

1.1.5.1. Ứng dụng trong công nghiệp
Trong công nghiệp sản xuất giấy, các loại enzyme đƣợc bổ sung trong
khâu nghiền bột và tẩy trắng. Enzyme endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu
hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng
lƣợng cho quá trình nghiền cơ học. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng
endoglucanase và hemicellulase để tẩy trắng mực in trên giấy thay vì sử dụng


9

axit HCl. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng phƣơng pháp này giữ cho sợi
giấy không bị ăn mòn nhiều, không ảnh hƣởng đến môi trƣờng và gây hại đối
với sức khỏe con ngƣời khi thải ra môi trƣờng trong quá trình sản xuất [28].
Trong công nghiệp dệt, cellulase đƣợc sử dụng để giữ màu vải sáng,
bền và không bị sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase đƣợc sử dụng thay cho
việc sử dụng đá bọt chà lên vải tạo các vệt “stone washed”. Độ đậm nhạt của
các vệt “stone washed” đƣợc thay đổi bằng cách tăng hay giảm lƣợng
cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt [29].
Cellulase đƣợc bổ sung vào trong bột giặt và chất tẩy rửa để làm mềm
vải cotton; đồng thời, tẩy sạch một số các vết bẩn khó giặt nhƣ vết mực, vết
bẩn có nguồn gốc protein, các vết loang dầu mỡ,… [30].
Phế phụ phẩm nông và lâm nghiệp có bản chất lignocellulose là nguồn
nguyên liệu dồi dào cho sản xuất ethanol sinh học bằng cách phối trộn chúng
với các enzyme nhƣ: cellulase, hemicellulase,… có đƣợc từ quá trình nuôi cấy
các chủng nấm mốc A. niger, T. reesei, A. tereus… [31].
Cellulase đƣợc ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp chế biến thực
phẩm nhƣ công nghệ sản xuất bia, nƣớc hoa quả, agar agar, cà phê…Nghiên
cứu Thuần và cộng sự, sử dụng lên men vỏ cà phê bằng T.viride và A. niger
cho thấy hệ enzyme pectinase và cellulase từ hai chủng nấm mốc này có khả
năng thủy phân cao pectin và cellulose trong vỏ cà phê. Nghiên cứu này mở

ra hƣớng ứng dụng lên men phế phụ phẩm bằng các chủng nấm giúp tận dụng
nguồn phụ phế phẩm trong nông nghiệp, giảm khả năng ô nhiễm môi trƣờng
do các chất thải gây ra nhƣ vỏ cà phê, hèm bia sau khi lên men bia, mật rỉ
đƣờng, các loại trấu nhà máy xay xát,… [32].
1.1.5.2. Ứng dụng trong xử lí môi trường
Các chất thải hữu cơ chiếm khối lƣợng lớn trong tổng số chất thải hiện
nay ở các đô thị và khu công nghiệp; trong đó cellulose chiếm khoảng 50%
các chất thải hữu cơ có nguồn gốc thực vật. Các chất thải này rất khó thủy
phân trong điều kiện tự nhiên. Tuy nhiên, khi bổ sung VSV giàu cellulase vào
phân giải rác sẽ rút ngắn thời gian thủy phân chỉ còn khoảng 1 tháng so với
khoảng 8 tháng trong điều kiện tự nhiên [33].


10

VSV đƣợc sử dụng khá phổ biến hiện nay trong xử lí môi trƣờng ví dụ
nhƣ xử lí nƣớc thải từ các nhà máy giấy, xí nghiệp xay xát,… Các chế phẩm vi
sinh có chứa các VSV sinh cellulase đã đƣợc nghiên cứu, phát triển và sản xuất
đại trà nhƣ chế phẩm sinh học cellulase (Công ty Cổ phần Xử lí Môi trƣờng
Việt Nam), chế phẩm Emuniv (Công ty Cổ phần Vi sinh Ứng dụng)… [31].
1.1.5.3. Ứng dụng trong sản xuất phân bón
Việc sử dụng chế phẩm enzyme cellulase xử lý rơm rạ tạo thành phân
bón hữu cơ đã đƣợc nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi và chuyển giao công nghệ
cho nhiều địa phƣơng nhƣ; Hòa Bình, Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Thái
Bình, Nam Ðịnh, Bạc Liêu... [31].
1.1.5.4. Ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học
Nhiên liệu sinh học là loại nhiên liệu tái tạo, đƣợc tạo ra từ sản phẩm
của ngành nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm hay quá trình tái chế các sản
phẩm dầu ăn và dầu thực vật. Bioethanol và biodiesel là hai loại nhiên liệu
sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi nhất cho ngành giao thông vận tải; trong đó,

biodiesel là một ester của axit béo và ankyl, đƣợc tạo ra từ dầu mỡ thực vật,
động vật hoặc mỡ tái chế, còn bioethanol đƣợc sản xuất nhờ cellulase thủy
phân sinh khối cellulose.
1.1.5.5. Ứng dụng trong kĩ thuật di truyền
Việc sử dụng các chế phẩm cellulase tinh khiết trong kĩ thuật di truyền
có xu hƣớng ngày càng tăng thay thế phƣơng pháp cơ học và hóa học do
enzyme này có thể phá vỡ thành tế bào thực vật mà không gây tổn thƣơng tới
các cơ quan bên trong tế bào, nhờ đó sự nguyên vẹn của các nhân tố di truyền
đƣợc đảm bảo [34].
1.2. SƠ LƢỢC VỀ NẤM Trichoderma VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
CELLULOSE CỦA Trichoderma
1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo Trichoderma
Trichoderma spp. thuộc giới nấm, ngành
Euascormycete, bộ Hypocreales, họ Hyporealease.

Ascomycota,

lớp


11

Trichoderma spp. là loại vi nấm xuất hiện nhiều trong các loại đất
nông nghiệp, đồng ruộng, đất rừng, gỗ đang phân rã, trong nguồn nƣớc bị ô
nhiễm, đầm lầy, đầm nƣớc mặn, các phế thải giàu hữu cơ đặc biệt trong đất
nông nghiệp Trichoderma phân bố rất nhiều ở vùng rễ cây.
Trichoderma có đặc điểm hệ sợi phát triển nhanh, phân nhánh trong
suốt tạo hệ sợi điển hình có đƣờng kính 5-10 m [35]. Trichoderma cũng sinh
sắc tố nhƣng sắc tố của Trichoderma không biến đổi nhiều. Những chủng liên
quan đến nhóm T. longibrachiatum có sắc tố điển hình nhất là màu vàng xanh

nhạt, màu vàng nhạt đục là sắc tố thƣờng gặp chủ yếu ở nhiều chủng [36].
Trichoderma thuộc nhóm nấm đa bào, sợi nấm có vách ngăn và trên
vách ngăn có một hoặc nhiều lỗ thông để cho nhân và tế bào chất đi qua.

Hình 1.3. Hình thái Trichoderma trên môi trƣờng PDA (7 ngày), (T.
atroviride; T. longibrachiatum; T. virens; T. harzianum từ trái sang phải trừ
trên xuống dƣới [37].
Khuẩn lạc Trichoderma spp. có dạng vòng tròn đồng tâm, đƣờng kính
> 5 cm sau 5 ngày nuôi cấy (T. hamatum > 7 cm, T. haziatum > 9 cm, T.
koningii > 5 cm). Khuẩn lạc có dạng nhƣ len xốp, hệ sợi dày đặc. Ban đầu hệ
sợi có màu trắng, khi bào tử hình thành (khoảng sau 5 ngày) hệ sợi chuyển
màu xanh ánh vàng sang màu xanh lá cây. Môi trƣờng thích hợp cho sự phát
triển của Trichoderma là glucoza, agar, pepton, belgan rose B [38], nhiệt độ


12

thích hợp là 20- 30oC, pH từ 3-6,5. Ở những chủng nuôi cấy lâu ngày thì dịch
trong thƣờng tồn tại trong hệ sợi của chủng [38].
Hiện nay, có khoảng 86 loài Trichoderma spp. đã đƣợc phân loại. Các
chủng khác nhau thì khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc nhiễm sắc thể [36].
Trong tự nhiên, nấm Trichoderma spp. là một loại vi nấm có lợi cho
cây trồng. Chúng không những có khả năng phân giải các chất hữu cơ, cung
cấp dinh dƣỡng mà còn là tác nhân sinh học đối kháng, kháng lại nhiều loại
nấm gây bệnh cho cây tồn tại trong đất nhƣ các loài thuộc chi Rhizoctonia
solani, Fusarium, Sclecrotium rolfsii, Verticilum, Botrytis... [39].
Việc nuôi cấy dễ dàng, không tốn kém cùng với những đặc tính quý nhƣ
khả năng kích thích tăng trƣởng cho cây trồng, khả năng đối kháng với các loài
nấm bệnh [39], khả năng tiết ra các loại enzyme thủy phân [4], các loài
Trichoderma spp. đã thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học.

Ở Việt Nam, chi nấm Trichoderma hiện xác định có ít nhất 33 loài.
Những nghiên cứu về ứng dụng loài nấm này đặc biệt trong sản xuất nông
nghiệp đang ngày càng phát triển. Trong các hƣớng nghiên cứu khác nhau
về chi Trichoderma thì khả năng phân giải cellulose của chúng đƣợc quan
tâm đặc biệt.
1.2.2. Hình thức sinh sản của Trichoderma
Phần lớn các chủng của Trichoderma spp. không có giai đoạn sinh sản
hữu tính mà chỉ sinh sản bằng bào tử vô tính. Các bào tử có cuống đính thành
khóm vào nhánh sợi nấm. Bào tử trong suốt hoặc xanh xám thành phẳng,
nhẵn hoặc xù xì [38]. Bào tử đính có kích thƣớc trung bình từ 3 đến 5 m
hình tròn hoặc hình bầu dục, vỏ trơn hoặc sần tập trung ở đầu đính của đỉnh
thể bình (dạng bình phồng lên ở gốc). Thể bình có thể sắp xếp đều thành các
vòng tròn hoặc kết đôi, so le hoặc bố trí không đều. Dạng thể bình là đặc
trƣng cho từng loài. Loài T. pachybasium có thể bình ngắn còn loài T.
longibrachiatum có thể bình thuôn dài và bầu nậm tới gần hình trụ tròn [36].
Bào tử đính đƣợc phóng ra với số lƣợng lớn, xen kẽ các bào tử đính là
các bào tử nghỉ có vách dày (bào tử áo). Chúng có dạng đơn bào. Tuy nhiên,


13

có thể có hai hoặc nhiều bào tử vách dày kết hợp với nhau [40]. Bào tử có
vách dày thƣờng gặp ở loài T. longibrachiatum và T. viride.

Hình 1.4. Bào tử của Trichoderma spp [40].
1.2.3. Khả năng thủy phân cellulose của Trichoderma
Cellulose "kháng" mạnh với các enzyme thủy phân chúng tuy nhiên
một số loài VSV lại có khả năng thủy phân cellulose mạnh mẽ nhờ phức hệ
enzyme cellulase hoạt tính cao mà chúng tạo ra trong quá trình sinh trƣởng,
gọi là celullosome. Cellulosome là tổ hợp đa enzyme (gổm cả 3 loại endo,

exo và β-glucanase), đƣợc phát hiện thấy ở nhiều chủng vi nấm nhƣ
Aspergillus (A. niger, A. fumigatus), Chaetomium (Ch. thermophilum),
Fusarium (F. oxysporum, F. solani), Humicola (H. insolens, H. grisea var.
thermoidea), Melanocarpus (M. albomyces), Penicillium (P. echinulatum, P.
purpurogenum, P. pinophilum), Rhizopus (R. oryzae), Scytalidium (S.
thermophillum), Talaromyces (T. Emersonii, Thermoascus (T. aurantiacus)
và Trichoderma spp.
Trichoderma đƣợc xem là một trong các chi nấm mốc có khả năng sinh
hệ enzyme ngoại bào lớn nhất, đặc biệt là loài T. reesei [41]. Ngoài T. reesei,
một số loài khác thuộc chi nấm này nhƣ T. harzianum, T. koningii, T.
longibrachiatum và T. viride đều đƣợc chứng minh có khả năng sinh phức hệ
cellulosome. Thành phần các enzyme thuộc phức hệ cellulosome khác nhau
phụ thuộc từng loài có số lƣợng cũng nhƣ loại gen mã hóa tƣơng ứng. Chẳng


14

hạn, hệ thống cellulase ngoại bào của T. reesei bao gồm 60-80%
cellobiohydrolases hoặc exoglucanases, 20-36% endoglucanases và 1% βglucosidases, tất cả đều hoạt động đồng bộ trong việc chuyển đổi cellulose
thành glucose [4].Tỉ lệ % các enzyme thành phần trong phức hệ cellulosome
ở các loài thuộc chi nấm Trichoderma cũng có sự khác nhau đáng kể. Theo
nghiên cứu Li và cộng sự, tỉ lệ enzyme β-glucosidases ở loài T. viride cao
hơn nhiều so với ở loài T. reesei. Khi đánh giá và định lƣợng các enzyme
thành phần trong phức hệ cellulosome ở chủng T. viride GSICC 62010 các
tác giả nhận thấy phức hệ cellulosome của chủng này gồm 14,15 %
exoglucanases, 26,07% endoglucanases và 59,77% β-glucosidases [8]. Nhờ
vậy, phức hệ cellulase ngoại bào của nấm Trichoderma thủy phân hiệu quả
cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose. Trong khi đó, các
enzyme đơn lẻ hoặc kể cả hỗn hợp của chúng không thực hiện đồng thời cả
hai chức năng trên [4].

Ở Việt Nam, tập quán đốt bỏ rơm rạ và dùng phân hóa học để bổ sung
những thứ lấy từ đất vừa bị đốt đi để chuẩn bị đất cho vụ mùa tiếp theo.
Trong khi đó, theo ƣớc tính nếu đốt 1 tấn rơm thì sẽ thải ra 36,32 kg khí CO,
4,54 kg hydrocarbon, 3,18 kg bụi tro và 56,00 kg CO2 [34], đây là các chất
gây ô nhiễm, ảnh hƣởng xấu đến môi trƣờng sống. Để hạn chế sự bất lợi
này, rơm rạ trƣớc khi hoàn trả lại cho vụ mùa tiếp theo cần đƣợc trải qua quá
trình thủy phân của những VSV thích hợp nhằm rút ngắn thời gian thủy
phân. Nấm Trichoderma với phức hệ enzyme cellulase hoạt tính cao có khả
năng thủy phân cellulose nhanh [34], đồng thời hạn chế đƣợc sự phát triển
của nấm bệnh khô vằn lƣu tồn trong rơm rạ [42] do vậy ngoài việc sử dụng
trực tiếp chế phẩm Trichoderma để thủy phân nhanh cellulose ngay trên
đồng cũng có thể sử dụng chúng để tạo phân rơm hữu cơ giúp cung cấp dinh
dƣỡng cho cây, cải tạo độ phì của đất.
1.3. BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VSV - TĂNG
CƢỜNG KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA Trichoderma
1.3.1. Đột biến ngẫu nhiên tăng hoạt độ cellulase ở chi nấm Trichoderma
Mặc dù có khả năng tiết cellulase hoạt tính cao gấp vài trăm lần so với
vi khuẩn [3] song sản lƣợng cellulase tạo ra từ các chủng Trichoderma trong


15

tự nhiên không đủ đáp ứng nhu cầu hiện nay. Vì vậy, tạo ra các thể đột biến
có khả năng sinh cellulase cao là yêu cầu cấp thiết đối với ngành công nghiệp
sản xuất enzyme. Có hai loại đột biến thực nghiệm là đột biến ngẫu nhiên và
đột biến định hƣớng. Đột biến ngẫu nhiên thƣờng đƣợc tạo ra bằng các
phƣơng pháp vật lý và hóa học nhƣ tia UV, N – methyl – N – nitro – N –
nitrosoguanidine, ethyl ethanesulphonate,…
Đột biến ngẫu nhiên cho phép sàng lọc đƣợc các thể đột biến ƣu việt
hơn so với chủng thuần về một thuộc tính nào đó. Phƣơng pháp này khá

đơn giản, không yêu cầu trang thiết bị hiện đại, hạn chế thao tác kỹ thuật
phức tạp tuy nhiên rất tốn thời gian, công sức và khó bền [6]. Để khắc phục
hạn chế này, nhiều nghiên cứu đã thành công khi sử dụng các tác nhân đột
biến phổ rộng (ví dụ nhƣ bức xạ ion hóa) hoặc kết hợp nhiều tác nhân gây đột
biến làm tăng sản lƣợng và hoạt độ cellulase trên chi nấm Trichoderma.
Nghiên cứu của Gadgil và cộng sự tạo ra chủng đột biến T. reesei QM9414 có
khả năng sinh cellulase cao hơn chủng gốc 1,5 đến 1,75 lần bằng xử lí UV kết
hợp hóa chất sodium nitrite (45 phút, 0,5mg/ml) [43]. Chủng T. reesei sau xử
lý UV và gamma trong nghiên cứu của Shabazi và cộng sự có khả năng sinh
cellulase cao hơn chủng ban đầu 30% [4]. Trên một loài khác T. viride thuộc
chi Trichoderma, Li và cộng sự kết hợp hai tác nhân bức xạ electron và ion
beam 12C6+ đã tạo ra chủng đột biến có khả năng phân hủy mùn cƣa tăng
40% so với chủng ban đầu; đồng thời, phát hiện sự sai khác trên các gen mã
hóa enzyme cellulase [8]. Kết quả này tƣơng đồng nghiên cứu của
Nascimento và cộng sự khi sử dụng UV và hóa chất NTG tạo ra chủng đột
biến có khả năng sinh cellulase cao hơn 70-83% so với chủng ban đầu. Giải
trình tự genome cho thấy chủng sau xử lí sai khác 184 vị trí đơn nucleotide
trên gen, 40 đột biến mất và thêm đoạn so với chủng ban đầu [11]. So sánh
hiệu quả giữa các tác nhân đột biến, Shabazi và cộng sự cho rằng gamma ƣu
việt hơn UV và là một trong những tác nhân đột biến đơn giản, hiệu quả cao
đặc biệt tăng khả năng sinh cellulase trên chi nấm Trichoderma [4].
1.3.2. Bức xạ gamma
Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia , neutron có bƣớc sóng ngắn nên
có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao. Các loại bức xạ ion hóa này
có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định giúp cải thiện hoạt tính của