Nghiên cứu xác định đồng thời aspartame và saccharin trong một số loại đồ uống bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ASPARTAME
VÀ SACCHARIN TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐỒ UỐNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2020
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ASPARTAME
VÀ SACCHARIN TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐỒ UỐNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Ngành: Hoá Phân tích
Mã số: 8.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Dương Thị Tú Anh

THÁI NGUYÊN - 2020
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung
thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ một công trình nào. Tôi xin cam đoan rằng,
mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích
dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2020
Tác giả luận văn

Phạm Thanh Tùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Cô giáo PGS.TS Dương Thị Tú Anh, người
đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các Thày Cô giáo
Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã trang bị, chỉ bảo
cho em những kiến thức quý báu trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận
văn.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm, các cán bộ phòng

thí nghiệm - Trung tâm kiểm tra an toàn thực phẩm tỉnh Quảng Ninh, đã tạo điều kiện
cho em trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm và hoàn thiện luận văn.
Do thời gian có hạn và trình độ còn hạn chế, luận văn này không tránh khỏi
những thiếu sót. Em rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô để luận văn này
được hoàn thiện hơn.
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2020
Tác giả

Phạm Thanh Tùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỤC LỤC
Lời cam đoan .................................................................................................................. i
Lời cảm ơn .....................................................................................................................ii
Mục lục ........................................................................................................................ iii
Danh mục các từ viết tắt của luận văn ........................................................................... v
Danh mục các bảng ....................................................................................................... vi
Danh mục các hình ......................................................................................................vii
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN ......................................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về hợp chất nghiên cứu ...................................................................................... 3
1.1.1. Tổng quan về Aspartame ................................................................................................... 3
1.1.2. Tổng quan về Saccharine ................................................................................................... 5
1.2. Một số phương pháp xác định saccharin, và aspartame ..................................................... 7
1.2.1. Phương pháp chuẩn độ ....................................................................................................... 8
1.2.2. Phương pháp quang phổ..................................................................................................... 8

1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (CE) ................................................................................ 8
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................... 9
1.3. Tổng quan các công trình nghiên cứu xác định saccharin và aspartam ........................... 10
1.3.1. Ở Việt Nam ....................................................................................................................... 10
1.3.2. Trên thế giới ...................................................................................................................... 11
Chương 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 16
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .............................................................................................. 16
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất, thuốc thử .......................................................................................................... 17
2.2. Thực nghiệm ........................................................................................................................ 18
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu phân tích .............................................................. 18
2.2.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu xác định hàm lượng Aspartame và Saccharin bằng
phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao................................................................................... 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2.2.3. Xác định độ lặp, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của
phương pháp................................................................................................................................ 20
2.3. Quá trình phân tích .............................................................................................................. 22
2.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................................... 24
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................... 25
3.1. Kết quả nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu xác định Aspartame và Saccharin
bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................................................................... 25
3.1.1. Lựa chọn detector ............................................................................................................. 25
3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng ........................................................................................... 25
3.1.3. Lựa chọn cột tách............................................................................................................. 26
3.1.4. Lựa chọn pha động ........................................................................................................... 26

3.1.5. Khảo sát pH của pha động ............................................................................................... 27
3.2. Kết quả xác định độ lặp, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của
phương pháp................................................................................................................................ 30
3.2.1. Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của hệ thống .............................................................. 30
3.2.2. Độ đặc hiệu, tính chọn lọc của phương pháp.................................................................. 31
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đo ............................................. 32
3.2.4. Khoảng tuyến tính ............................................................................................................ 35
3.3. Áp dụng phân tích mẫu thực ............................................................................................... 38
3.3.1. Thời gian, địa điểm lấy mẫu ............................................................................................ 38
3.3.2. Kết quả phân tích mẫu ...................................................................................................... 39
3.3.3. Độ thu hồi chất phân tích của phương pháp ................................................................... 46
KẾT LUẬN................................................................................................................................ 52
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 53
PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN
ACN
ADI

AOAC
Asp
ATVSTP

Acetonitril

Acceptable daily intake (lượng ăn vào hằng ngày có thể
chấp nhận được)
Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các
nhà hóa phân tích chính thức)
Aspartam
An toàn vệ sinh thực phẩm

BYT

Bộ y tế

DAD

Diode Array Detector (Detector mảng diod)

ĐKTN
HPLC

Điều kiện thí nghiệm
High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao)

LOD

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

MeOH
ppm

Methanol
Nồng độ ppm (mg/kg; mg/L; mL/L)

R (%)

Độ thu hồi (đơn vị %)

RSD

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

S/N

Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)

Sac

Saccharin

TCVN
UV-VIS

Tiêu chuẩn Việt Nam.
Ultraviolet - Visible (Tử ngoại khả kiến)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1.

Tính chất của một số loại dung môi dùng làm pha động ...................... 19

Bảng 3.2.

Giá trị diện tích pic của saccharin và aspartame phụ thuộc vào pH của
dung dịch đệm ........................................................................................ 29

Bảng 3.3.

Các điều kiện thí nghiệm thích hợp cho phép phân tích xác định
saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC ................................ 30

Bảng 3.4.

Kết quả tính toán sự phù hợp của hệ thống ........................................... 30

Bảng 3.5.

Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích ........................... 32

Bảng 3.6.

Giá trị xác định LOD của thiết bị đo với Saccharin .............................. 33

Bảng 3.7.

Giá trị xác định LOD của thiết bị đo với Aspartame ............................. 34

Bảng 3.8.

Giá trị xác định LOQ của thiết bị đo với Saccharin .............................. 34

Bảng 3.9.

Giá trị xác định LOQ của thiết bị đo với Aspartame ............................. 35

Bảng 3.10.

Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với saccharin và aspartame ............ 35

Bảng 3.11.

Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích ................... 36

Bảng 3.12.

Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn ............... 37

Bảng 3.13.

Địa điểm, thời gian lấy mẫu ................................................................... 38

Bảng 3.14.

Kết quả phân tích hàm lượng saccharin trong mẫu thực (n=5) ............. 39

Bảng 3.15.

Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng aspartame trong mẫu thực (n=5)
................................................................................................................ 43

Bảng 3.16.

Kết quả xác định độ thu hồi Saccharin của phương pháp trên các mẫu
phân tích ................................................................................................. 47

Bảng 3.17.

Kết quả xác định độ thu hồi Aspartame của phương pháp trên các mẫu
phân tích ................................................................................................. 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.

Thời gian lưu của chất phân tích ..............................................................9

Hình 2.1.

Hệ thống HPLC của hãng SHIMADZU ................................................16

Hình 2.2.

Sơ đồ phân tích saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC ......24

Hình 3.1.

Sắc ký đồ xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại của saccharin
và aspartame ...........................................................................................25

Hình 3.2.

Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) ........26

Hình 3.3.

Sắc đồ phân tích hỗn hợp saccharin và aspartame ................................ 27

Hình 3.4.

Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 3,0 .................27

Hình 3.5.

Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 3,5 .................28

Hình 3.6.

Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 4,0 .................28

Hình 3.7.

Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 4,5 .................29

Hình 3.8.

Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B) ..................31

Hình 3.9.

Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin ............................................33

Hình 3.10.

Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam .............................................33

Hình 3.11.

Đường chuẩn của saccharin trong khoảng nồng độ 0,2 ÷ 200 ppm ......37

Hình 3.12.

Đường chuẩn của aspartam trong khoảng nồng độ 0,5 ÷ 100 ppm .......37

Hình 3.13.

Hàm lượng SCR và ASP trong các mẫu phân tích ................................ 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn thu hút được
sự quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên thế giới. Cùng với sự phát triển của
khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật mới, hiện đại đã và đang được áp dụng để tạo ra
những sản phẩm mới với chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu
dùng. Tuy nhiên để tạo ra nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người
tiêu dùng mà vẫn giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho đến khi sử dụng,
trong quá trình chế biến, nhà sản xuất đã sử dụng các phụ gia thực phẩm để tăng giá trị
thương phẩm và kéo dài thời gian sử dụng. Gần đây, liên tiếp xảy ra các vụ ngộ độc tại
nhiều địa phương trên toàn quốc, cũng như việc xuất hiện nhiều mặt hàng không rõ
nguồn gốc xuất xứ hoặc sử dụng những phụ gia ngoài danh mục cho phép hay sử dụng
quá hàm lượng cho phép. Tác hại do sử dụng phụ gia sai quy định có thể ảnh hưởng
đối với sức khỏe con người. Những tác động này thường không xảy ra cấp tính, rầm rộ
và nguy kịch mà diễn biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể. Theo báo cáo của Bộ Y tế,
trong tháng 5-2019, toàn quốc đã xảy ra 8 vụ ngộ độc thực phẩm làm 218 người nhập
viện, trong đó có 2 trường hợp tử vong.
Đường là loại gia vị vô cùng quen thuộc với mọi người, gần như mọi món ăn
hàng ngày đều không thể thiếu gia vị đường. Vì đường mang lại hương vị ngọt ngào,
hấp dẫn cho khứu giác. Nhưng bên cạnh đó, đường cũng làm tăng nguy cơ cho những
bệnh béo phì hay tiểu đường, vì thế do yêu cầu thực phẩm đặc biệt dành cho những
người mắc bệnh này thì từ lâu người ta đã thấy cần phải sản xuất thực phẩm với hàm
lượng đường thấp hơn. Tuy nhiên chỉ đơn thuần là giảm hàm lượng đường trong công
thức chế biến thì không thể cho hiệu quả mong muốn, vì thế người ta cần phải sử dụng
các chất tạo ngọt khác, đảm bảo vị ngọt cần thiết mà không làm tăng lượng calo của
thực phẩm. Từ đó một số chất tạo ngọt nhân tạo thay thế đã được tổng hợp và sử dụng

ngày càng phổ biến. Không chỉ thực phẩm dành cho người ăn kiêng mới sử dụng đường
hóa học, hiện nay nhiều loại thực phẩm và đồ uống bán trên thị trường được sử dụng
đường hóa học để tạo độ ngọt cao, chi phí sản xuất thấp và lợi nhuận cao. Nhưng chỉ
có một số chất tạo ngọt được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




đa và có quy định rõ ràng gồm: manitol, acesulfam kali, aspartame, cyclamate, isomalt,
saccharin, sorbitol, sucralose…
Tuy nhiên khi ăn uống, chỉ bằng cảm quan chúng ta khó mà biết được loại thực
phẩm nào có sử dụng chất tạo ngọt nhân tạo, đặc biệt là các chất đó được phép sử dụng
hay không. Trước tình hình này, để đảm bảo sức khỏe cho con người thì việc định
lượng các chất tạo ngọt nhân tạo trong trong thực phẩm nói chung và đồ uống nói riêng
là một vấn đề cần thiết.
Cùng với sự phát triển của khoa học, ngày càng có nhiều phương pháp hiện đại
xác định đồng thời các chất tạo ngọt nhân tạo nói chung, cũng như Aspartame và
Saccharin nói riêng. Trong đó phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được
ứng dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm, đặc biệt là trong ngành kiểm nghiệm thực
phẩm và dược phẩm. Nó hiện đang là công cụ đắc lực cho phân tích đa thành phần,
định tính và định lượng các chất.
Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài luận văn:
“Nghiên cứu xác định đồng thời Aspartame và Saccharin trong một số loại đồ uống
bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao”.
Mục đích của luận văn
Nghiên cứu xác định đồng thời Aspartame và Saccharin trong một số loại đồ
uống bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Từ đó có những so sánh
với hàm lượng Aspartame và Saccharin trong bảng liều lượng sử dụng trong thực phẩm

theo Tiêu chuẩn Việt Nam của Cục an toàn thực phẩm Việt Nam(VFA), cũng như hàm
lượng của chúng trong các mẫu phân tích khác nhau.
Nội dung nghiên cứu
* Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép phân tích xác định đồng thời
Aspartame và Saccharin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) như:
dung môi pha động, bước sóng, thời gian lưu, tốc độ dòng, nhiệt độ …
* Đánh giá độ đúng, độ chụm, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp thông qua việc phân tích mẫu chuẩn.
* Áp dụng phân tích mẫu nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về hợp chất nghiên cứu
Chất ngọt tổng hợp là những chất không có trong tự nhiên, vị ngọt rất cao so với
đường sucrose và không có giá trị dinh dưỡng, thường được sử dụng với nhiều mục
đích khác nhau. Chất ngọt tổng hợp bao gồm nhiều loại khác nhau, chủ yếu người ta
chia thành 2 loại: chất tạo ngọt không sinh năng lượng và chất tạo ngọt có sinh năng
lượng.
1.1.1. Tổng quan về Aspartame
Aspartame là một este methyl của axit aspartic/phenylalanine dipeptide, có
pKa = 4,5 -6,0. Giống như nhiều peptide khác, aspartame có thể bị thủy phân thành các
axit amin cấu thành trong điều kiện nhiệt độ cao hoặc độ pH cao. Điều này làm cho
aspartame không được ưa chuộng như các chất tạo ngọt khác. Sự ổn định của
Aspartame trong dung dịch nước phụ thuộc rất nhiều vào độ pH. Ở nhiệt độ phòng, nó
ổn định nhất ở pH 4,3, thời gian bán hủy của nó gần 300 ngày. Tuy nhiên, ở pH 7,0

thời gian bán hủy của nó chỉ là một vài ngày. Hầu hết các loại nước giải khát có pH từ
3 đến 5, trong đó aspartame ổn định một cách hợp lý. Trong các sản phẩm có thể cần
thời hạn sử dụng lâu hơn, chẳng hạn như xi-rô cho nước giải khát, aspartame đôi khi
được pha trộn với chất làm ngọt ổn định hơn, chẳng hạn như saccharin [29].
1.1.1.1. Danh pháp, công thức cấu tạo và tính chất vật lý của Aspartame
●Danh pháp IUPAC: Methyl L-α-aspartyl-L-phenylalaninate
Tên gọi khác: N-(L-α-Aspartyl)-L-phenylalanine,1-methyl ester [7], [10].
● Công thức phân tử: C14H18N2O5.
● Công thức cấu tạo:

● Tính chất vật lý [29]:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




- Aspartame có dạng tinh thể màu trắng, không mùi, có vị ngọt mạnh.
- Tan ít trong nước, tan nhẹ trong ethanol.
- Nhiệt độ sôi: 2470C.
- Khối lượng mol phân tử: 294,3g/mol.
1.1.1.2. Công dụng và độc tính của Aspartame
Hiện nay, aspartam là chất ngọt rất được ưa chuộng. Aspartame ngọt gấp 200
lần so với đường tự nhiên và có mặt trên thị trường với các tên NutraSweet, Equal
Spoonful, Benevia, NatraTaste, ước tính chiếm tới 62% thị trường chất siêu ngọt. Nó
đang được hơn 350 triệu người trên thế giới sử dụng thường xuyên. Ở Anh, chất này
phổ biến trong nước ngọt Cola và những nước uống ít calo, nước quả, kẹo, kẹo cao su,
ngũ cốc, sữa chua, đồ ăn nhanh, thuốc và vitamin bổ sung (gồm cả những loại dành
cho trẻ nhỏ) [29].
Một gam aspartame tạo ra bốn kcal năng lượng khi chuyển hóa nên lượng calo
là không đáng kể. Đa số người tiêu dùng có nhận xét là aspartam không để lại dư vị

khó chịu, tuy nhiên một số người nhạy cảm cho rằng đường này để lại trên lưỡi một
hậu vị không ngon. Điều này có thể khắc phục bằng cách trộn aspartam với các loại
đường khác (như acesulfame - K hay saccharin) [10], [29].
Aspartame được thủy phân nhanh chóng trong ruột non. Ngay cả khi ăn với liều
rất cao aspartam (trên 200 ppm), không có aspartame được tìm thấy trong máu do sự
suy giảm nhanh chóng. Khi ăn phải, aspartame phân hủy thành các thành phần còn sót
lại, bao gồm axit aspartic, phenylalanine, methanol, với tỷ lệ 4: 5: 1 theo khối lượng
và các sản phẩm phân hủy khác bao gồm formaldehyde và axit formic. Các nghiên cứu
trên người cho thấy axit formic được bài tiết nhanh hơn so với dạng được hình thành
sau khi ăn phải aspartame. Trong một số nước trái cây, có thể tìm thấy nồng độ
methanol cao hơn so với lượng chất aspartame trong đồ uống [7], [10], [29].
Methanol là một chất có độc tính thấp nhưng sau khi được đưa vào cơ thể,
methanol được ôxy hóa tạo nên formaldehyde, chất này lại tiếp tục được ôxy hóa tạo
nên axit formic (hoặc formate, tùy theo độ pH). Cuối cùng, axit formic được chuyển
hóa thành khí cacbonic CO2 và nước, hai chất này được thải qua phổi và thận. Quá
trình ôxy hóa xảy ra nhanh chóng khiến axit formic tích tụ trong huyết thanh. Sự tích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




tụ của axit formic trong huyết thanh gây nên tình trạng toan chuyển hóa. Sự chuyển
hóa methanol và tích tụ axit formic bên trong võng mạc mắt gây tổn thương võng mạc,
tổn thương thần kinh thị giác dẫn đến mù lòa.
Phenylalanine là một chất độc thần kinh. Cơ thể tiếp nhận quá nhiều phenylalanine
có thể gây động kinh, chậm phát triển trí óc, mất ngủ… Bệnh phenylceton
niệu (phenylketonuria - PKU) là nguyên nhân rối loạn di truyền gây mất chức năng
chuyển hóa phenylalanin. Người bị bênh này phải kiểm soát lượng phenylalanin trong
thức ăn được đưa vào để ngăn ngừa sự tích tụ của phenylceton trong cơ thể. Một dạng
hiếm của bệnh này là bệnh tăng phenylalanin máu do bị mất chức năng tổng hợp

một coenzym là biopterin. Phụ nữ mang thai bị bệnh tăng phenylalanin máu sẽ có triệu
chứng tăng phenylalanin trong máu nhưng triệu chứng này thường mất đi ở cuối kì
mang thai. Phenylalanin có trong chất làm ngọt aspartame. Chất này được chuyển hóa
trong cơ thể tạo ra nhiều chất, trong đó có phenylalanin. Do đó chất này cũng có ảnh
hưởng đến người bị PKU, mặc dù sự ảnh hưởng của nó ít hơn so với lượng proten ăn
vào. Tất cả các sản phẩm có chứa aspartame ở Úc, Mĩ và Canada đều được dán nhãn
"Chứa aspartame, cẩn thận đối với người bị PKU" [29].
Aspartic là chiếm khoảng 40% trong aspartam, một chất gây ra chứng đau đầu.
Axit Aspartic là một chất kích thích thần kinh, ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung
ương, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn giấc ngủ,
vấn đề về thị lực, trầm cảm, và bệnh suyễn, động kinh [10].
Không giống như một số chất làm ngọt khác, aspartame được chuyển hóa trong
cơ thể và do đó có một số giá trị dinh dưỡng, 1 g cung cấp khoảng 17 kJ (4 kcal). Tuy
nhiên, trong thực tế khi dùng một lượng nhỏ aspartame mang lại hiệu quả dinh dưỡng
tối thiểu.
1.1.2. Tổng quan về Saccharine
Saccharin là một axit với pKa = 2,0. Saccharin không ổn định khi đun nóng,
nhưng nó không phản ứng hóa học với các thành phần khác của thực phẩm.
Saccharin thường ở dạng bột kết tinh có màu màu trắng, tan ít trong nước và
ête, nhưng dạng muối natri và canxi của nó thì dễ tan. Saccharin ổn định trong môi
trường axit, nhưng lại không có phản ứng gì với các thành phần trong thực phẩm nên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




nó thường được dùng nhiều trong đồ uống, nước ngọt. Ở nhiệt độ cao saccharin vẫn
giữ được độ ngọt vốn có, có thể thay thế tối đa là 25% lượng đường saccharose nên
cũng được sử dụng trong sản xuất bánh, mứt, kẹo cao su, hoa quả đóng hộp, kẹo, bánh
tráng miệng….[10], [30].

1.1.2.1. Danh pháp, công thức cấu tạo và tính chất vật lý của Saccharine
●Danh pháp IUPAC: 1,1-Dioxo-1,2-benzothiazol-3-one
Tên gọi khác : Benzoic sulfimide Ortho sulphobenzamide
● Công thức phân tử: C7H5NO3S.
● Công thức cấu tạo:

● Tính chất vật lý:
- Saccharine tồn tại ở dạng tinh thể hoặc bột tinh thể trắng, không mùi.
- Ít tan trong nước, ethanol, tan trong dung dịch kiềm.
- Độ tan trong nước là 1g/270mL, trong ethanol (95%) là 1g/31mL.
- Nhiệt độ sôi: 229,70C.
- Khối lượng mol phân tử: 183,18g/mol.
- Tỷ trọng: 0.828g/cm3
- Nhiệt độ nóng chảy: 228,8 – 229,70C [30].
1.1.2.2. Công dụng và độc tính của saccharin
Saccharin (E954i) là một phụ gia tạo ngọt nhân tạo, còn được gọi với tên khác là
đường không sinh năng lượng; độ ngọt của saccharin cao hơn đường saccharose 300 lần,
nhưng ở nồng độ cao saccharin có dư vị của kim loại. Saccharin được sử dụng để làm ngọt
các sản phẩm như đồ uống giải khát, kẹo, bánh bích quy, thuốc chữa bệnh, kem đánh răng....
Cũng như nhiều chất ngọt thay thế khác saccharin không bị hấp thu bởi hệ tiêu hóa, không
gây ảnh hưởng tới hàm lượng insulin trong máu, không tạo năng lượng. Vì vậy saccharin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




được xếp vào nhóm chất ngọt không calo, còn được sử dụng trong cả những sản phẩm mỹ
phẩm, vitamin và dược phẩm [7], [10], [30].
Saccharin không cung cấp năng lượng vì nó không được chuyển hóa bởi con
người mà thay vào đó được bài tiết qua thận, khoảng 80% là saccharin và phần còn lại

là sản phẩm thủy phân.Saccharin, mặc dù vô hại đối với con người, đã được được báo
cáo là có độc tính tiềm tàng và do đó, đã bị cấm ở một số quốc gia xem xét có thể tác
dụng gây ung thư [7], [10].
Nhiều năm sau khi saccharin được tổng hợp và ứng dụng trong sản xuất như
một chất ngọt thay thế duy nhất lúc đó, thì đến năm 1977 một nghiên cứu của Canada
cho biết saccharin gây ung thư bàng quang ở chuột đã gây hoang mang lớn cho người
tiêu dùng. Khi đó FDA cũng đã phát lệnh cấm sử dụng saccharin trong thực phẩm và
dược phẩm, nhưng do vào thời điểm đó saccharin là chất ngọt nhân tạo duy nhất và
nhiều người vẫn muốn sử dụng những sản phẩm thực phẩm có chứa nó đặc biệt là
những bệnh nhân tiểu đường. Trước những sức ép của người dân và cả nhà sản xuất
Quốc hội Mỹ đã buộc phải cho sử dụng nhưng yêu cầu trên nhãn sản phẩm ghi rõ sản
phẩm có chứa saccharin có nguy cơ gây nguy hiểm cho sức khỏe [30].
Đến cuối năm 2000 FDA đã chính thức loại bỏ saccharin ra khỏi danh mục
những chất gây ung thư và cho phép gỡ bỏ những cảnh báo trên. Nhưng các chuyên gia
cũng cảnh báo tới khả năng gây dị ứng sunfonamid ở những người sử dụng thuốc sulfa.
Triệu chứng với dị ứng này là đau đầu, khó thở, phát ban, tiêu chảy. Saccharin được
tìm thấy trong sữa công thức còn có nguy cơ gây rối loạn chức năng cơ. Với những đối
tượng như phụ nữ có thai, trẻ nhỏ và đặc biệt là trẻ sơ sinh không nên sử dụng sản phẩm
chứa saccharin. Dùng nhiều lượng saccharin có thể sinh ra chứng béo phì. Tuy nhiên
tất cả những biến chứng do việc xử dụng saccharin vẫn còn là một tranh cãi và chưa có
kết luận nào có tình cách thuyết phục [30].
1.2. Một số phương pháp xác định saccharin, và aspartame
Hiện nay, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất mà các phòng thí nghiệm có
thể tiến hành phân tích đối tượng nghiên cứu theo các phương pháp khác nhau. Một số
phương pháp phổ biến có thể kể đến như quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, sắc ký
lỏng hiệu năng cao HPLC, điện di mao quản vùng CZE.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

1.2.1. Phương pháp chuẩn độ
Phương pháp này thường được áp dụng trong xác định saccharin: Cân khoảng
0,5g mẫu thử đã được làm khô, hòa tan trong 75 mL nước nóng. Làm nguội nhanh và
thêm dung dịch phenolphtalein, chuẩn độ với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M. Mỗi mL
natri hydroxyd 0,1N tương đương với 18,32 mg C7H5NO3S. Phương pháp này cần hóa
chất độc hại, chỉ phân tích được nếu hàm lượng chất lớn. Với các chất có hàm lượng
nhỏ, phương pháp này mắc sai số lớn [1], [7], [10].
1.2.2. Phương pháp quang phổ
Nếu mẫu là chất rắn: hòa tan lượng mẫu thích hợp và định mức 25 mL với nước
khử ion. Nếu là mẫu lỏng, pha loãng thể tích mẫu thích hợp thành 25 mL. Lấy 500 µL
dung dịch trên pha loãng thành 10 mL với dung dịch đệm Clark and Lubs (dung dịch
gồm KCl 0,2 M và HCl 0,2 M) pH = 1,3. Để xác định Saccharin trong các chất làm ngọt,
sử dụng bước sóng phát hiện saccharin là 206 nm. Độ thu hồi đối với cả hai chất phân
tích trên nền mẫu thực trong khoảng 93,5÷ 105,1%, sai số tương đối < 5%.
Để xác định đồng thời 3 chất ngọt nhân tạo (Saccharin, Aspartame, AcesulfameK) và vitamin C trong đồ uống bằng phương pháp PLS – UV, cân chính xác 0,05 g
mẫu, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 mL bằng dung dịch H3PO4 0,1N. Chất
phân tích được đo ở bước sóng từ 190 – 300 nm. Nếu mẫu có chứa màu thực phẩm,
các chất phân tích được chiết bằng dung dịch n - butanol và được đo ở bước sóng từ
190 – 300 nm. Phương pháp này được áp dụng cho đồ uống thương mại, đồ uống có
màu (dạng bột và chất lỏng).
Phương pháp này tương đối chính xác nhưng tốn dung môi, hóa chất độc hại,
không xác định được đồng thời các chất cần phân tích [7], [10], [14].
1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (CE)
Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion
nhưng có mối quan hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung
dịch đệm, đặt trong điện trường. Do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng
di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau.
Phương pháp này có độ nhạy cao, xác định được đồng thời các chất cần phân tích
nhưng thiết bị đắt tiền, quy trình phân tích phức tạp [10].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography- HPLC;
còn được gọi là Sắc ký lỏng cao áp) là một phương pháp phân tích hiện đại trong hóa
học phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp [1].
Nguyên tắc của phương pháp:
Phương pháp HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn
hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành
phần trong mẫu. Thành phần hoạt động của cột, chất hấp phụ, tiêu biểu là một vật liệu cấu
trúc hạt làm từ những hạt rắn như silica hay polymers, có kích thước trong khoảng 2-50
micro mét. Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương
tác khác nhau với các hạt hấp phụ. Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung môi ví dụ nước,
acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động". Thành phần và nhiệt độ của pha động
đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy
ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột.
Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay
đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký. Rửa giải đẳng dòng đặc biệt
hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của
chúng với pha động. Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ
thấp tới cao để tăng sức rửa giải. Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời
gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn.
C(nồng độ)

t0

t(thời gian)

Hình 1.1. Thời gian lưu của chất phân tích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Thời gian mà một chất phân tích rửa giải ra khỏi cột gọi là thời gian lưu. Thời
gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biết
của chất phân tích.
Dựa vào sắc ký đồ của chất phân tích để định lượng các chất phân tích đó [2], [3].
1.3. Tổng quan các công trình nghiên cứu xác định saccharin và aspartam
1.3.1. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu xác định saccharin và aspartam nói riêng và các
chất tạo ngọt nói chung bằng các phương pháp khác nhau đã được các nhà khoa học và
các tổ chức thực hiện. Đặc biệt phải kể đến nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Hóa học,
Trường Đại học Khoa học tự nhiên -Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trong “Nghiên cứu xác định một số chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm bằng
phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc” tác giả
Nguyễn Đức Thắng [6] đã tối ưu hóa các điều kiện phân tích đồng thời bốn chất tạo
ngọt: Ace - K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE-C 4D. Với các điều kiện tối ưu
như sau: Dung dịch đệm điện di: Tris 100 mM /His 10 mM (pH = 9,2), thế điện di là
15 kV, thời gian bơm mẫu là 15 s, chiều cao bơm mẫu là 10 cm. LOD cho Ace-K, Asp,
Cyc, Sac lần lượt là 0,7 ppm; 5,0 ppm; 1,0 ppm; 1,0 ppm.
Tác giả Trần Phúc Nghĩa [4] cũng đã “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao
quản phân tích acesulfame-k, saccharin, aspartame trong đồ uống”. Kết quả nghiên cứu
đã xây dựng được phương pháp định lượng Acesulfame-k, Saccharin, Aspartame trong
đồ uống, nước giải khát với các điều kiện điện di: bước sóng phát hiện các chất là 215,5
nm, sử dụng dung dịch đệm borat 20 mM pH = 9,5, điện thế đặt vào hai đầu mao quản
là 25kV, nhiệt độ 25oC, với áp suất bơm mẫu 50mbar trong thời gian 5s, dòng điện

100A.
Tác giả Bùi Thị Minh Thúy [12] đã tiến hành “Xác định một số đường hóa học
và chất bảo quản trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)”. Kết quả ngiên cứu cho thấy điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lƣợng
aspartam, axit sorbic, axit benzoic, acesulfam K, saccarin có trong mẫu thực phẩm bằng
kỹ thuật HPLC với detector PDA: cột tách anion, bƣớc sóng phát hiện các chất phân
tích khi sử dụng detector PDA đối với Aspartam, saccarin là 210 nm; Axit benzoic và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Acesulfam K là 225 nm; Axit sorbic là 254 nm; pha động: kênh A - dung dịch
NaH2PO4 5mM (pH=8,2), kênh B là acetonitril; chƣơng trình rửa giải gradient, tốc độ
dòng 1mL/phút.
Tác giả Nguyễn Thị Hồng Thúy [13] đã “Nghiên cứu phương pháp phân tích
axit benzoic, axit sorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng
thực phẩm”. Kết quả nghiên cứu khẳng định rằng đã khảo sát, xây dựng được phương
pháp phân tích đồng thời saccharin, aspartam, axit sorbic và axit benzoic theo phù hợp,
với với các điều kiện: nhiệt độ buồng cột: 300C; thể tích bơm mẫu: 20µl; Cột C18 (250
mm x 4,6 mm x 5µm); Nồng độ chuẩn bơm: 1ppm; Detector: DAD 210 nm, 26 nm, 254
nm; Tỷ lệ dung môi pha động tuân theo gradient. Áp dụng phân tích với các mẫu axit
benzoic, axit sorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng
thực phẩm cho độ thu hồi đối với saccharin, aspartam, axit sorbic và axit benzoic lần lượt
là 92,1 - 104,2%; 94,2 - 101,3%; 94,2 - 101,3% và 91,4 - 99,8%.
1.3.2. Trên thế giới
Trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về SCR, ASP nói riêng và
các chất tạo ngọt nói chung. Khi nghiên cứu xác định hàm lượng các chất tạo ngọt trong
một số loại đồ uống và thực phẩm dành cho người ăn kiêng bằng phương pháp HPLC
sử dụng detector DAD, Daniela de Queiroz Pane và các cộng sự [16] nhận thấy rằng

lượng chất làm ngọt nhân tạo trong các mẫu được phân tích dao động từ 0,3 đến 25,8
mg/100 mL đối với acesulfame-K; 1,3 đến 15,8 mg/100 mL 1 đối với saccharin; 36,7
đến 79,4 mg/100 mL đối với cyclamate và 2,7 đến 55,9 mg/100 mL đối với aspartame.
Tất cả các mẫu nước sốt cà chua và thịt nướng có chứa nồng độ vượt quá giới hạn cho
phép. Hơn nữa, một số mẫu chứa nồng độ cao hơn nồng độ ghi trên nhãn, cho thấy sự
cần thiết phải kiểm soát và kiểm tra hiệu quả hơn trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Tác giả Małgorzata Grembecka, Piotr Baran, Agata Błażewicz, Zbigniew
Fijałek & Piotr Szefer [20] đã phát triển phương pháp HPLC pha đảo để định lượng
đồng thời aspartame, acesulfame-K, saccharin, axit citric và natri benzoate trong nước
giải khát cola không đường. Việc tách sắc ký được thực hiện bởi sử dụng pha động là
đệm kali dihydrogen orthophosphate (pH = 4,3) và acetonitrile (88:12, v/v). Cột
Thermo Hypersil (150 mm x 4,6mm) và detector DAD với tín hiệu UV ở 210nm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




(aspartame và saccharin) và 220 nm (acesulfame-K và natri benzoate). Cột được cân
bằng ở 300C với tốc độ dòng với 0,8mL/phút. Thể tích tiêm là 20 μL. Việc xác nhận
giá trị sử dụng của phương pháp phân tích đã thực hiện về độ nhạy, khoảng tuyến tính,
độ tái lặp, độ lặp lại, độ thu hồi.
Ana Beatriz Bergamovà các cộng sự [16] đã ứng dụng phương pháp điện di mao
quản vào việc xác định đồng thời aspartame, cyclamate, saccharin và acesulfam - K
trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với detector độ dẫn. Phương
pháp sử dụng hỗn hợp đệm tris (hydroxymetyl) aminometan (TRIS) 100 mmol/L và 1
histidin (HIS) 10 mmol/L với thời gian phân tích là 6 phút, hiệu suất thu hồi các chất
trong khoảng từ 94% đến 108%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong khoảng 1,5 ÷
6,5%.
Tác giả Richard A. Frazier và các cộng sự đã xác định đồng thời các chất ngọt
nhân tạo acesulfam-K, aspartame, saccharin, chất bảo quản axit benzoic, axit sorbic và

7 phẩm màu quinolin yellow, sunset yellow FCF, carmoisin, ponceau 4R, brilliant lue
FCF, green S và black PN trong mẫu nước giải khát bằng phương pháp điện di mao quản.
Phương pháp sử dụng chế độ sắc ký điện động học mixen, dung dịch đệm cacbonat 20
mM ở pH 9,5 với dun dịch natri dodecyl sulfat 62 mM trong vòng 15 phút. Kết quả cho
thấy giới hạn định lượng đối với tất cả các chất là 0,01 mg/mL [26].
Một phương pháp sắc ký ion mới được Qing - Chuan Chen, Jing Wang [25] đề
xuất để xác định đồng thời các chất làm ngọt nhân tạo (natri saccharin, aspartam,
acesulfame - K ), chất bảo quản (axit benzoic, axit sorbic ), caffeine, theobromine và
theophylline. Mẫu được rung siêu âm, pha loãng, loại tạp bằng K4[Fe(CN)6 và ZnSO4
(mẫu sữa lên men) rồi cho qua cột chiết pha rắn C18. Việc tách được thực hiện trên
một cột trao đổi anion của máy HPLC, phân tích được tiến hành ở 40°C trong vòng 45
phút và giải hấp theo chế độ isocratic với dung môi là dung dịch NaH2PO4 5mM (pH
8,20) và acetonitrile theo tỉ lệ 4% (v/v), và detector UV. Các giới hạn phát hiện
(signal/noise = 3:1) cho tất cả các chất phân tích ở mức dưới µg/mL. Phương pháp này
đã được áp dụng cho các chế phẩm đồ uốngvà dược phẩm, và sự thu hồi trung bình cho
mẫu thật trong khoảng 85 -104%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Tác giả N. Dossi và các cộng sự [21] đã sử dụng phương pháp RP – LC để xác
định các chất phụ gia trong nước giải khát. Các chất ngọt nhân tạo (acesulfam,
aspartam, saccharin), chất bảo quản (axit benzoic, axit sorbic) và phẩm màu (Ponceau
4R, sunset yellow, tatrazin) được tách trên cột LiChrosorb RP 18. Pha động là dung
dịch đệm phosphat 0,1 M (pH = 4,0) với tốc độ dòng 1,2 mL/phút, thời gian phân tích
trong khoảng 20 phút. Pha động được chạy theo chế độ gradient như sau: trong 5 phút
đầu tỷ lệ dung môi là dung dịch đệm : MeOH = 95% : 5% (v/v), sau đó MeOH tăng
lên là 40% trong vòng 5 phút và được giữ ở tỷ lệ đó trong 10 phút rồi dung môi được

đưa về tỷ lệ ban đầu trong 5 phút. Bằng kỹ thuật chuyển đổi bước sóng, giới hạn phát
hiện của các chất phân tích trong khoảng 0,1 - 0,3 mg/l. Phương pháp này được áp
dụng để xác định một số mẫu nước ngọt, mẫu được siêu âm loại khí và lọc bằng 0,45 0,2 µm trước khi bơm mẫu vào cột.
Các tác giả Stroka, J., N. Dossi & E. Anklam [27] đã sử dụng hai phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tách và xác định chất làm ngọt nhân tạo
aspartame, acesulphame K, natri saccharin và natri cyclamate trong đồ uống và các sản
phẩm dinh dưỡng đặc biệt (thực phẩm đặc biệt dành cho các nhóm dân số đặc biệt).
Tất cả bốn hợp chất đều hòa tan trong dung dịch nước, có thể dễ dàng tách và xác định
bằng HPLC bằng detector DAD. Phương pháp thứ nhất liên quan đến việc tách aspartame,
acesulphame K và natri saccharin trên cột C18 bằng cách rửa giải đệm và acetonitril theo
phương pháp di động. Phương pháp thứ hai được sử dụng để tách natri cyclamate trên cột
C18 với pha động gồm metanol và nước. Trong điều kiện tối ưu, cả hai phương pháp đều
cho thấy hiệu suất phân tích tốt, chẳng hạn như độ tuyến tính, độ chính xác và độ thu hồi.
Các phương pháp đã được áp dụng thành công để phân tích các mẫu thực tế của nước ngọt
và các sản phẩm dinh dưỡng đặc biệt.
Một phương pháp phân tích liên quan đến chiết pha rắn (SPE) và sắc ký lỏng
hiệu năng cao đã được Zygler, A., A. Wasik, A. Kot-Wasik & J. Namiesnik [28] phát
triển để xác định các chất làm ngọt, như acesulfame-K (ACS-K), aspartame (ASP),
alitame (ALI), cyclamate (CYC), dulcin (DUL), neohesperidin dihydrochalcone
(NHDC), neotame (NEO), sacotarin (NEO) và một loạt các mẫu thực phẩm (ví dụ như
đồ uống, sữa và các sản phẩm cá). Sau khi chiết bằng dung dịch đệm gồm axit formic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




và N, Ndiisopropylethylamine ở pH 4,5 trong bể siêu âm, dịch chiết được làm sạch
bằng cột Strata-X 33 μm Polymeric SPE. Các chất phân tích được phân tách ở chế độ
rửa giải gradient trên cột C18 và được phát hiện bằng máy quang khối phổ làm việc
với nguồn điện âm ở chế độ ion âm. Để xác nhận rằng phương pháp phân tích phù hợp

với mục đích sử dụng của nó, một số tham số xác nhận, chẳng hạn như tuyến tính, giới
hạn phát hiện và định lượng, độ chính xác và độ lặp lại đã được đánh giá. Đường cong
hiệu chuẩn là tuyến tính trong phạm vi nồng độ được nghiên cứu (R2 ≥ 0.999) cho sáu
chất làm ngọt được nghiên cứu (CYC, ASP, ALI, DUL, NHDC, NEO). Ba hợp chất
(ACS-K, SAC, SCL) đã cho phản ứng phi tuyến tính trong phạm vi nồng độ được
nghiên cứu. Giới hạn phát hiện phương pháp (tương ứng với tỷ lệ nhiễu tín hiệu (S / N)
là dưới 0,25 g mL, trong khi giới hạn định lượng phương pháp (tương ứng với tỷ lệ S / N
là 10) dưới 2,5 μg mL 1 (μgg 1). Việc thu hồi ở nồng độ được kiểm tra (50%, 100% và
125% liều tối đa có thể sử dụng) cho tất cả các chất làm ngọt nằm trong khoảng 84,2
106,7%, với độ lệch chuẩn tương đối <10% với mỗi loại mẫu. Phương pháp đề xuất đã
được áp dụng thành công để xác định chín chất ngọt trong đồ uống, sữa chua và các sản
phẩm cá. Quy trình được mô tả ở đây là đơn giản, chính xác và phù hợp để phân tích kiểm
soát chất lượng thực phẩm thường xuyên.
Natali a E. Llamas và cộng sự [22] đã xây dựng quy trình xác định saccharin
(SAC) và acesulfame-K (ACK) dựa trên các phép đo UV-Vis. Quy trình đã được áp
dụng thành công để xác định đồng thời SAC và AC-K trong chất tạo ngọt và bột nước
ép trái cây, mà không cần bất kỳ bước tách nào để loại bỏ ASP. Các kết quả được xác
nhận bằng cách sử dụng các mẫu có gai, và các kết quả thu được là thỏa đáng.
Chang, C. S. & T. S. Yeh [17] cho rằng phương pháp phân tích chất tạo ngọt
trong các loại thực phẩm khác nhau là rất quan trọng để kiểm soát chất lượng thực
phẩm và thực thi quy định. Phương pháp đơn giản và nhanh chóng để xác định đồng
thời 10 chất làm ngọt [acesulfame kali (ACS-K), aspartame (ASP), cyclamate (CYC),
dulcin (DUL), glycyrrhizic axit (GA), neotame (NEO), neohame NHDC), saccharin
(SAC), sucralose (SCL) và stevioside (STV)] trong các loại thực phẩm khác nhau là
phương pháp sắc ký lỏng/sắc ký khối song song (LCeMS / MS) đã được phát triển.
Việc phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Phenomenex Luna PhenylHexyl (5 mm,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

4,6 mm 150 mm) với độ rửa giải gradient 10 mM ammonium acetate trong nước và 10
mM ammonium acetate trong metanol. Độ thu hồi của 10 chất ngọt là từ 75% đến
120%, và hệ số biến đổi nhỏ hơn 20%. Giới hạn của định lượng là 0,5 mg/ g đối với
NHDC và SCL. Đối với các chất làm ngọt khác, giới hạn định lượng là 0,1 mg/g. So
với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao truyền thống, phương pháp LCeMS / MS
có thể cung cấp độ nhạy tốt hơn, thành phần cụ thể được cải tiến và nhiều chất làm ngọt
được phân tích trong một lần chạy.
Như vậy qua quá trình nghiên cứu, tìm hiểu các tài liệu về phương pháp phân
tích saccharin, aspartame, chúng tôi nhận thấy: do aspartame không bền trong môi
trường nhiệt độ và pH cao nên không nên chiết chất này ra khỏi nền mẫu bằng NaOH
hay chưng cất lôi cuốn hơi nước. Mặt khác, theo TCVN 10992:20105 tuy chỉ để xác
định một số chất tạo ngọt nhưng lại cho thấy có khả năng ứng dụng để đồng thời xác
định hàm lượng saccharin, aspartam trong đa dạng nền mẫu. Do vậy, trong nghiên cứu
này chúng tôi cũng chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột
sắc ký pha đảo C18 và detector DAD (có thể đo được ở nhiều bước sóng khác nhau)
để xác định đồng thời chất tạo ngọt, tối ưu hóa các điều kiện cho phù hợp với điều kiện
phòng thí nghiệm hiện có với quy trình phân tích mẫu phù hợp sao cho vừa tiết kiệm
được thời gian lại vừa giảm được giá thành phân tích.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Chương 2
THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
+ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): SHIMADZU

Hình 2.1. Hệ thống HPLC của hãng SHIMADZU
- Cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm)
- Detector: DAD
Các thiết bị và dụng cụ khác
- Bộ lọc hút chân không thủy tinh, kích thước lỗ giấy lọc 0,45 µm
- Bể rung siêu âm (wise clean): Elma – P180/H
- Máy ly tâm: DLAB-DM0412S
- Cân phân tích (độ chính xác 0,0001g): METTLER TOLEDO JE1103CA
- Cân kĩ thuật (độ chính xác 0,01g): Shinko Denshin LN
- Máy đồng nhất mẫu: Miccra, D-9
- Máy đo pH: Seven Excellence
- Bình định mức thủy tinh loại A: 1000 mL, 500 mL, 200 mL và 100 mL, 25mL,
20mL, 10mL
- Pipet thủy tinh loại A: 100 mL, 25 mL, 20 mL, 10 mL, 5 mL và 1 mL.
- Micropipet: 100 - 1000µl, 10 - 100 µl.
- Ống đong thủy tinh chia độ loại A, dung tích 1000 mL.
- Ống ly tâm nhựa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN